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Biology

सीआरआईएसपीआर-सीएएस 12 ए के साथ संयुक्त रिकोम्बिनेस पोलीमरेज़ एम्प्लीफिकेशन का उपयोग करके फील्ड-तैनाती योग्य कैंडिडाटस लिबेरिबैक्टर एशियाटिकस डिटेक्शन

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64070
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1China-USA Citrus Huanglongbing Joint Laboratory, National Navel Orange Engineering Research Center, Gannan Normal University, 2Department of Biological Sciences, Gannan Normal University, 3Citrus Research and Education Center, Department of Microbiology and Cell Science, University of Florida - Institute of Food and Agricultural Sciences
* These authors contributed equally

Summary

इस काम में, सीआरआईएसपीआर-सीएएस 12 ए के साथ संयुक्त रिकोम्बिनेस पोलीमरेज़ प्रवर्धन के आधार पर कैंडिडाटस लिबेरिबैक्टर एशियाटिकस के लिए एक तेजी से, संवेदनशील और पोर्टेबल पहचान विधि विकसित की गई थी।

Abstract

साइट्रस उत्पादकों द्वारा कैंडिडाटस लाइबेरिबैक्टर एशियाटिकस (सीएलएएस) का प्रारंभिक पता लगाने से प्रारंभिक हस्तक्षेप की सुविधा मिलती है और बीमारी के प्रसार को रोका जा सकता है। तेजी से और पोर्टेबल हुआंगलोंगबिंग (एचएलबी) निदान के लिए एक सरल विधि यहां प्रस्तुत की गई है जो रिकोम्बिनेस पोलीमरेज़ प्रवर्धन और एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को जोड़ती है जो नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट / सीआरआईएसपीआर-संबद्ध 12 ए (सीआरआईएसपीआर-सीएएस 12 ए) प्रणाली की न्यूक्लियस गतिविधि का उपयोग करती है। इस तकनीक की संवेदनशीलता पीसीआर की तुलना में बहुत अधिक है। इसके अलावा, इस विधि ने क्यूपीसीआर के समान परिणाम दिखाए जब पत्ती के नमूनों का उपयोग किया गया था। पारंपरिक सीएलएएस डिटेक्शन विधियों की तुलना में, यहां प्रस्तुत पहचान विधि 90 मिनट में पूरी की जा सकती है और एक इज़ोटेर्मल स्थिति में काम करती है जिसे पीसीआर मशीनों के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, परिणामों को क्षेत्र में एक हैंडहेल्ड फ्लोरोसेंट डिटेक्शन डिवाइस के माध्यम से देखा जा सकता है।

Introduction

हुआंगलोंगबिंग (एचएलबी) दुनिया भर में सबसे अधिक समस्याग्रस्त साइट्रस रोगों में से एक है। एचएलबी फ्लोएम-कोलोनाइजिंग और फास्टिड बैक्टीरिया कैंडिडाटस लिबेरिबैक्टर एसपीपी के कारण होता है, जिसमें कैंडिडाटस लिबेरिबैक्टर एशियाटिकस (सीएलएएस), सीए एल अफ्रीकनस और सीए एल अमेरिकनस2 शामिल हैं। चीन और संयुक्त राज्य अमेरिका में सबसे प्रचलित एचएलबी से जुड़ी प्रजाति सीएलएएस है, जो एशियाई साइट्रस साइलिड्स (डायफोरिना सिट्री) या ग्राफ्टिंग3 के माध्यम से प्रेषित होती है। क्लैस से संक्रमित होने के बाद, साइट्रस पेड़ मृत्यु तक विकास में गिरावट का प्रदर्शन करतेहैं। क्लैस से संक्रमित साइट्रस पत्तियों के सामान्य लक्षण हैं धब्बेदार मोटल, हरे द्वीप (छोटे गोलाकार गहरे हरे बिंदु), मोटी और चमड़े की पत्तियों पर उभरी हुई कॉर्की नसें, और गैर-समान पीले रंग के अंकुर2। इसके अलावा, क्लैस से संक्रमित फल छोटे और एकतरफा2 दिखाई देते हैं।

चूंकि कोई साइट्रस किस्म एचएलबी के लिए प्रतिरोधी नहीं है और एचएलबी के लिए कोई चिकित्सीय इलाज नहीं है, इसलिए एचएलबी की रोकथाम के लिए सीएलएएस-पॉजिटिव साइट्रस पेड़ों के संगरोध और अलगाव की आवश्यकता होती है। इसलिए, सीएएस के प्रसार को रोकने औरआर्थिक नुकसान को कम करने के लिए निगरानी और संगरोध के लिए प्रारंभिक पहचान महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, संक्रमण के प्रारंभिक चरण के दौरान पौधों में सीएलएएस के कम टिटर के कारण संवेदनशील सीएलएएस का पता लगाने की आवश्यकता होती है। चीन में, CLas का पता लगाना आमतौर पर कुछ प्रमाणित परीक्षण केंद्रों द्वारा आयोजित किया जाता है। हालांकि, पहचान प्रक्रिया में आमतौर पर कम से कम 1 सप्ताह लगते हैं, और पहचान शुल्क महंगा है। इसलिए, एचएलबी घटनाओं की निगरानी में मदद करने के लिए

एचएलबी 4,5,6,7,8,9 के निदान के लिए विभिन्न तकनीकों को लागू किया गया है। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) और मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) उनकी उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता 4,5 के कारण सीएलएएस का पता लगाने के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले उपकरण हैं। हालांकि, वे प्रौद्योगिकियां महंगे उपकरणों और अत्यधिक कुशल कर्मियों पर बहुत अधिक निर्भर करती हैं। इसके अलावा, कई इज़ोटेर्मल प्रवर्धन विधियाँ, जैसे लूप-मध्यस्थता इज़ोटेर्मल प्रवर्धन (एलएएमपी), को उनकी सादगी, तेजी और कम लागत 8,9,10 के कारण पारंपरिक पीसीआर विधियों के आकर्षक विकल्पके रूप में विकसित किया गया है। हालांकि, गैर-विशिष्ट प्रवर्धन संकेतों के कारण सीएलएएस का सटीक रूप से पता लगाने के लिए उन्हें लागू करना चुनौतीपूर्ण है, जो गलत-सकारात्मक परिणाम पैदा कर सकता है।

आरएनए-निर्देशित सीआरआईएसपीआर/सीएएस (नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट/सीआरआईएसपीआर-संबद्ध) एंडोन्यूक्लिज़-आधारित न्यूक्लिक एसिड डिटेक्शन को इसकी उच्च संवेदनशीलता, विशिष्टता और विश्वसनीयता 11,12,13,14 के कारण अगली पीढ़ी की आणविक निदान तकनीक के रूप में विकसित किया गया है। ये CRISPR/Cas निदान प्रौद्योगिकियां CAS प्रोटीन की संपार्श्विक न्यूक्लियस गतिविधि पर भरोसा करती हैं ताकि ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के प्रत्येक छोर पर एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और एक फ्लोरेसेंस बुझाने वाले के साथ संशोधित एकल-फंसे हुए डीएनए (ssDNA) को छोड़ दिया जा सके, साथ ही जारी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर11,12 को पकड़ने के लिए एक फ्लोरेसेंस डिटेक्शन डिवाइस भी। . सीआरआईएसपीआर आरएनए (सीआरआरएनए) टारगेट डुप्लेक्स द्वारा सक्रिय कई कैस प्रभावकों की न्यूक्लियस गतिविधि अंधाधुंध रूप से आसपास के गैर-लक्ष्य एसएसडीएनए11 को छोड़ सकती है। CRISPR-Cas12a (जिसे Cpf 1 भी कहा जाता है), एक वर्ग 2 प्रकार V-A CRISPR / Cas प्रणाली, Cas9 की तुलना में कई फायदे प्रदर्शित करती है, जैसे कि कम बेमेल सहिष्णुता और अधिक विशिष्टता13। कैस 12 ए / सीआरआरएनए प्रणाली को मानव रोगजनकों और फाइटोपैथोजेन्स 14,15,16,17,18 के न्यूक्लिक एसिड की संवेदनशील और विशिष्ट पहचान के लिए लागू किया गया है। इसलिए, Cas12a / crRNA प्रणाली का उपयोग करने से CLas के न्यूक्लिक एसिड का सटीक और संवेदनशील पता लगाने में सक्षम होना चाहिए।

अकेले Cas12a सैद्धांतिक रूप से न्यूक्लिक एसिड के निम्न स्तर का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं है। इसलिए, इसकी पहचान संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए, CRISPR-Cas12a का पता लगाने को आमतौर पर एक इज़ोटेर्मल प्रवर्धन चरण14,15 के साथ जोड़ा जाता है। रिकोम्बिनेस पोलीमरेज़ प्रवर्धन (आरपीए) संवेदनशील और तेजी से इज़ोटेर्मल डीएनए प्रवर्धन को 37 डिग्री सेल्सियस से 42 डिग्री सेल्सियस19 तक के तापमान सीमा में सक्षम बनाता है।

डिटेक्टर (डीएनए एंडोन्यूक्लिज़ टारगेटेड सीआरआईएसपीआर ट्रांस रिपोर्टर) नामक एक डिटेक्शन प्लेटफॉर्म जो सीएएस 12 ए की डीएनएस गतिविधि को आरपीए और फ्लोरेसेंस रीडआउट के साथ जोड़ता है, हाल ही में12 तैयार किया गया है और इसे उच्च संवेदनशीलता20 के साथ न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, सकारात्मक नमूनों से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति संकेत को क्षेत्र में एक हैंडहेल्ड फ्लोरेसेंस डिटेक्शन डिवाइस के माध्यम से देखा जा सकता है।

चूंकि हमने आरपीए के साथ डीएनए को प्रवर्धित किया, सीएलएस21 के लिए विशिष्ट पांच-कॉपी एनआरडीबी (राइबोन्यूक्लियोटाइड रिडक्टेस β-सबयूनिट) जीन को लक्षित करने वाले सीआरआरएनए को डिजाइन किया, और कैस 12 ए प्रोटीन की डीनेस गतिविधि को नियोजित किया, इसलिए हमने इस क्लैस डिटेक्शन विधि को सीएलएएस-डिटेक्टर कहा। मौजूदा CLas डिटेक्शन विधियों की तुलना में, CLas-DETECTR तेज, सटीक, संवेदनशील और तैनात करने योग्य है।

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Protocol

1. CLas-DETECTR का निर्माण

नोट: CLas-DETECTR का निर्माण एक चार-चरण यी प्रक्रिया है: समाधान तैयार करना, साइट्रस कुल डीएनए अलगाव, इज़ोटेर्मल डीएनए प्रवर्धन, और परिणाम विज़ुअलाइज़ेशन। CLas-DETECTR परख की योजनाबद्धता चित्रा 1 ए में चित्रित की गई है।

  1. समाधान तैयार करना
    1. बफर ए तैयार करें: 6% पीईजी 200 में 20 एमएम एनएओएच। 100 एमएल के लिए, एक बोतल में 80 एमएल एच 2 ओ में 113 मिलीग्राम एनएओएच और 6 ग्राम पीईजी200जोड़ें। बोतल को 60 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि सभी पीईजी 200 भंग न हो जाएं। फिर, 100 एमएल की मात्रा में एच2ओ जोड़ें।
    2. समाधान बी तैयार करें: प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, आरपीए बफर का 10 μL, F-RPA-RNRf का 0.8 μL, R-RPA-RNRr का 0.8 μL, और ddH2O का 3.9 μL 15.5 μL की अंतिम मात्रा में जोड़ें।
      नोट: एफ-आरपीए-आरएनएफ और आर-आरपीए-आरएनएआर एनआरडीबी जीन के खिलाफ परख में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर हैं। अनुक्रम के लिए तालिका 1 देखें।
    3. समाधान C: प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, SsDNA रिपोर्टर का 1 μL, NEB बफर 3.1 का 3 μL, CRRNA का 1 μL, Cas12a का 4 μL, और ddH2O का 11 μL 20 μL की अंतिम मात्रा में जोड़ें।
      नोट: यदि पता लगाने के लिए कई नमूने हैं, तो समाधान बी और समाधान सी की एक बड़ी मात्रा बनाएं, और बाद में एलिकोट करें।
  2. साइट्रस कुल डीएनए अलगाव
    नोट: समय बचाने और इस विधि को फील्ड सीएलएएस का पता लगाने के लिए उपयुक्त बनाने के लिए, डीएनए प्रवर्धन22,23 के लिए कच्चे पौधे के अर्क प्राप्त करने के लिए क्षारीय पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) आधारित दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था
    1. इस प्रोटोकॉल में साइट्रस पत्तियों का उपयोग किया गया था। सबसे पहले, एक पत्ती से पांच पत्ती डिस्क पंच करें। इसके बाद, पत्ती डिस्क को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें, और बफर ए के 200 μL जोड़ें।
      नोट: खेत में, पत्तियों को पहले साफ करें यदि उन्हें धूल है। क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए लीफ डिस्क को 1.5 एमएल ट्यूब के ढक्कन का उपयोग करके दबाया जा सकता है। अन्य खट्टे ऊतक, जैसे जड़ें, तने, फल और फूल, इस प्रोटोकॉल में भी इस्तेमाल किए जा सकते हैं।
    2. पत्ती डिस्क को मैन्युअल रूप से पीसें जब तक कि प्लास्टिक रॉड के साथ चिकना न हो।
    3. ट्यूब को 10 मिनट के लिए अबाधित छोड़ दें। फिर, डीएनए प्रवर्धन के लिए सतह पर तैरने वाले का उपयोग करें।
      नोट: परख को यहां रोका जा सकता है, और क्षारीय-पीईजी विधि द्वारा निकाले गए कच्चे पौधे के अर्क को कम से कम 1 वर्ष के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। वीडियो में दिखाए गए न्यूहॉल स्वीट ऑरेंज (साइट्रस साइनेंसिस ओसबेक वर न्यूहॉल) के पेड़ों को 9/3/1 (v/v/v) पीट मिट्टी/वर्मीक्यूलाइट/परलाइट के मिश्रण से भरे एक बर्तन में उगाया गया था और चीन के जियांग्शी के गन्नान नॉर्मल यूनिवर्सिटी के परिसर में स्थित एक ग्लासहाउस में बनाए रखा गया था। एचएलबी संक्रमित पेड़ों को सीएलएएस पॉजिटिव न्यूहॉल बड्स के साथ ग्राफ्टिंग करके टीका लगाया गया था। एचएलबी संक्रमित और एचएलबी-असंक्रमित पेड़ों की पुष्टि पीसीआर द्वारा की गई थी। CLas का पता CLas-विशिष्ट मार्कर जीन nrdB को लक्षित करने वाली प्राइमर जोड़ी (F-RPA-RNRF/ R-RPA-RNRR) का उपयोग करके लगाया गया था। दूसरी ओर, विशिष्ट एचएलबी लक्षण, धब्बेदार मोटल, और पीले पत्ते सीएलएएस-पॉजिटिव पर पाए जा सकते हैं लेकिन क्लैस-नकारात्मक पेड़ों पर नहीं।
  3. इज़ोटेर्मल डीएनए प्रवर्धन
    1. समाधान B में चरण 1.2.3 से सतह पर तैरने वाले का 1 μL और MgOAc (14 mM अंतिम सांद्रता) का 1 μL जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं।
    2. प्रयोगशाला में, उन्हें 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक साधारण इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
      नोट: मैदान में, ट्यूबों को 15 मिनट के लिए हाथ में पकड़ें। यह भी सुझाव दिया जाता है कि यदि परिस्थितियां अनुमति देती हैं तो 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक साधारण इनक्यूबेटर में ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
  4. परिणाम विज़ुअलाइज़ेशन
    1. चरण 1.3.2 से मिश्रण का 10 μL घोल C में डालें और अच्छी तरह मिलाएँ।
    2. उन्हें 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
    3. चश्मे पहनें और हैंडहेल्ड फ्लोरोसेंट डिटेक्शन डिवाइस (उत्तेजना तरंग दैर्ध्य: 440 एनएम, उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य: 500 एनएम) के माध्यम से 5 '6-फ्लोरेसिन और 3 ' पर फ्लोरेसेंस बुझाने वाले एसएसडीएनए रिपोर्टर से जारी हरे रंग के फ्लोरेसेंस सिग्नल का निरीक्षण करें।
      नोट: ग्रीन फ्लोरेसेंस सिग्नल कई दिनों तक रह सकता है, यह बेहतर है
      सावधानी: फ्लोरेसेंस डिटेक्शन डिवाइस द्वारा उत्सर्जित प्रकाश आंखों के लिए हानिकारक है। परिणामों को देखने से पहले चश्मे पहनना सुनिश्चित करें।

2. विशिष्टता परीक्षण

नोट: सीएलएएस-डिटेक्टर की विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए, राइजोस्फीयर जीवाणु एग्रोबैक्टीरियम टुमेफेसिएन्स जीवी 3101, ज़ैंथोमोनास सिट्री सबएसपी सिट्री (एक्ससीसी), और बर्कहोल्डरिया स्टेबलाइज़िंग स्ट्रेन 1440 को लैब24 में अलग किया गया था।

नोट: कैंडिडाटस लिबेरिबैक्टर (सीएलएएस) को सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है। कोई केवल सीएलएएस से संक्रमित साइट्रस ऊतकों से जीनोमिक डीएनए के निष्कर्षण से सीएलएएस डीएनए प्राप्त कर सकता है। एक्ससीसी एक और महत्वपूर्ण साइट्रस रोग, साइट्रस कैंकर का कारण एजेंट है। बर्कहोल्डरिया स्टेबलाइज़ स्ट्रेन 1440 लैब में अलग किया गया एक एंटी-एक्ससीसी जीवाणु है। इसलिए, इन तीनों बैक्टीरिया के लिए शुद्ध उपभेदों का उपयोग किया गया था

  1. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए बैक्टीरियल जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके बैक्टीरियल जीनोमिक डीएनए (जीडीएनए) निकालें। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में पानी का उपयोग करें।
  2. 25 μL प्रतिक्रिया मिश्रण में ऑप्टिकल कैप के साथ 0.2 mL PCR ट्यूब स्ट्रिप्स का उपयोग करके PCR निष्पादित करें, जिसमें F-RPA-RNRf का 1 μL, R-RPA-RNRr का 1 μL, Ex Taq संस्करण 2.0 प्लस डाई का 12.5 μL, DNA टेम्पलेट का 1 μL, औरH2Oका 9.5 μL होता है।
    1. निम्नलिखित थर्मल साइक्लिंग प्रतिक्रिया स्थितियों का उपयोग करें: 98 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट; इसके बाद 98 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेकंड के 35 चक्र, 55 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड, 72 डिग्री सेल्सियस पर 15 चक्र; फिर 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट; और 16 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
    2. पीसीआर उत्पादों को 15 मिनट के लिए 120 वोल्ट पर 1% एगारोस जेल पर चलाएं।
  3. QPCR को F-RPA-RNRf के 0.8 μL, R-RPA-RNRr के 0.8 μL, 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) के 10 μL, DNA टेम्पलेट के 1 μL औरH2O के 7.4 μL वाले मिश्रण में QPCR निष्पादित करें।
    1. निम्नलिखित थर्मल साइक्लिंग प्रतिक्रिया स्थितियों का उपयोग करें: 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस; इसके बाद 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 सेकंड और 60 डिग्री सेल्सियस पर 32 सेकंड के 45 चक्र हैं; और फिर 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड, 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट और 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड का पिघला हुआ वक्र चरण।
    2. प्रत्येक दोहराव में तीन तकनीकी दोहराव शामिल करें।
  4. चरण 1.1-1.4 के बाद CLas-DETECTR विधि निष्पादित करें।

3. संवेदनशीलता तुलना

  1. CLas DETECTR की संवेदनशीलता का परीक्षण करने के लिए, पीसीआर, CLas-DETECTR और QPCR का उपयोग करके CLas DNA टुकड़े कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला का पता लगाएं, जैसा कि ऊपर वर्णित है।
  2. प्राइमर सेट एफ-आरएनआर और आर-आरएनआर का उपयोग करके एनआरडीबी से 1,060 बीपी की लंबाई वाले डीएनए खंड को 100 μL प्रतिक्रिया मिश्रण में बढ़ाएं, जिसमें F-RNR का 4 μL, R-RNR का 4 μL, PrimeSTAR Max Premix का 50 μL, और H2 O का 40 μL, औरH2O का 40 μL थर्मल साइक्लिंग प्रतिक्रिया स्थितियों (98 °C पर 30 s; इसके बाद 98 °C पर 30 s; 30 s से 35 चक्र) शामिल हैं। 55 डिग्री सेल्सियस पर 15 एस, 72 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस; फिर 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट; और 16 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो)।
    नोट: एनआरडीबी (राइबोन्यूक्लियोटाइड रिडक्टेस β-सबयूनिट) जीन सीएलएएस21 के लिए विशिष्ट है। प्राइमर सेट एफ-आरएनआर और आर-आरएनआर का उपयोग करके आसानी से सीएलएएस-पॉजिटिव साइट्रस जीडीएनए से एनआरडीबी एम्प्लिकॉन प्राप्त किया जा सकता है। प्राइमर सेट एफ-आरएनआर और आर-आरएनआर 1,060 बीपी एनआरडीबी टुकड़े को बढ़ाता है, जबकि प्राइमर सेट एफ-आरपीए-आरएनआर और आर-आरपीए-आरएनआर एनआरडीबी जीन के 104 बीपी टुकड़े को बढ़ाता है, जो 1,060 बीपी एनआरडीबी टुकड़े का हिस्सा है।
  3. निर्माता के मैनुअल के बाद डीएनए जेल निष्कर्षण किट के साथ पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें।
  4. स्टरलाइज़ किए गए डीडीएच2ओ के साथ एनआरडीबी एम्प्लिकॉन युक्त पीसीआर उत्पादों को पतला करें।
  5. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऑनलाइन डीएनए कॉपी नंबर और कमजोर पड़ने कैलकुलेटर का उपयोग करके एनआरडीबी जीन की कॉपी संख्या की गणना करें।
  6. डीएनए तनुकरण तैयार करें जिसमें 2.01 × 106 प्रतियां /10 × 10 5 प्रतियां / 105 प्रतियां / 10 × 104 प्रतियां / 1 एल, 2.01 × × 10 0 प्रति ×यां × × /

4. नमूना का पता लगाना

नोट: विशिष्टता और संवेदनशीलता परीक्षण के बाद, चीन के जियांग्शी के गन्नान नॉर्मल यूनिवर्सिटी के परिसर में जर्मप्लाज्म संसाधन नर्सरी में उगाए गए न्यूहॉल मीठे नारंगी पेड़ों से एकत्र किए गए क्षेत्र पत्ती के नमूनों में सीएलएएस की उपस्थिति का पता लगाने के लिए क्लैस-डिटेक्टर विधि का उपयोग किया गया था। परिणामों को सत्यापित करने के लिए एक qPCR किया गया था।

  1. कुल 15 पेड़ों का परीक्षण करें। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में पानी का उपयोग करें।
  2. ऊपर वर्णित CLas-DETECTR और QPCR विधियों का प्रदर्शन करें।
    नोट: साइट्रस में सीएलएएस की असमान वितरण विशेषताओं के कारण, एचएलबी लक्षण दिखाने वाली पत्तियों को प्राथमिकता के रूप में एकत्र किया गया था। यदि कोई पेड़ स्वस्थ दिखता है, तो पत्तियों को यादृच्छिक रूप से एकत्र किया गया था CLas-DETECTR प्रणाली सही ढंग से काम करती है।

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Representative Results

यहां, हमने एक पोर्टेबल प्लेटफॉर्म, CLas-DETECTR का वर्णन किया है, जो क्षेत्र में एचएलबी का निदान करने के लिए आरपीए और CRISPR-Cas12a सिस्टम को कंघी करता है। CLas-DETECTR की स्कीमा चित्रा 1 ए में चित्रित की गई है।

जब एचएलबी-संक्रमित और एचएलबी-असंक्रमित न्यूहॉल पेड़ों (चित्रा 1 बी), जिसके लिए पीसीआर (चित्रा 1 सी) द्वारा सीएलएएस की उपस्थिति की पुष्टि की गई थी, के पत्तों के नमूने को सीएलएएस-डिटेक्टर परीक्षण के अधीन किया गया था, तो एचएलबी-संक्रमित नमूने में एक हरा प्रतिदीप्ति संकेत देखा गया था, लेकिन एचएलबी-असंक्रमित नमूने और नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 1 डी) में नहीं।

हमने अन्य बैक्टीरिया से निकाले गए न्यूक्लिक एसिड का उपयोग करके क्लैस-डिटेक्टर की विशिष्टता निर्धारित की। सीएलएस-डिटेक्टर परख में उपयोग किए जाने वाले एफ-आरपीए-आरएनआरएफ और आर-आरपीए-आरएनएआर के प्राइमर सेट का उपयोग पीसीआर और क्यूपीसीआर में भी किया गया था। एक बैंड को एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन में देखा जा सकता है जब सीएलएएस-पॉजिटिव साइट्रस लीफ जीडीएनए का उपयोग करके प्रवर्धित किया जाता है, लेकिन पीसीआर परख में अन्य बैक्टीरियल जीडीएनए नहीं (चित्रा 2 ए)। क्यूपीसीआर परख में, सीएलएएस का औसत थ्रेशोल्ड चक्र (सीटी) मूल्य 24 ± 0.7 था, जबकि ए. टुमेफेसिएन्स जीवी 3101, एक्ससीसी और बी स्टेबलाइजिंग स्ट्रेन 1440 का औसत सीटी मान क्रमशः 38 ± 0.7, 39 ± 1.4, और 39 ± 0.7 था (चित्रा 2 बी)। आमतौर पर, परिणाम को नकारात्मक माना जाता है जब सीटी मान 38 से अधिक होता है। इन परिणामों से पता चलता है कि एफ-आरपीए-आरएनएफ और आर-आरपीए-आरएनएआर प्राइमर जोड़ी सीएलएएस के लिए विशिष्ट हैं। CLas-DETECTR परख में, केवल CLas gDNA ने हरे प्रतिदीप्ति संकेतों का प्रदर्शन किया; ए. टुमेफेसिएन्स जीवी3101 , एक्ससीसी और बी. स्टेबलाइजिंग स्ट्रेन 1440 से निकाले गए जीडीएनए ने ऐसा नहीं किया (चित्रा 2सी), जिसका अर्थ है कि क्लैस-डिटेक्टर विशेष रूप से सीएलएएस का पता लगा सकता है।

हमने सीएलएएस डीएनए कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला का उपयोग करके क्लैस-डिटेक्टर की संवेदनशीलता का भी परीक्षण किया। पीसीआर 2.01 × 102 प्रतियों / μL (चित्रा 3 ए) का पता लगा सकता है। दूसरी ओर, CLas-DETECTR 2.01 × 100 प्रतियों / μL का पता लगा सकता है, जो बताता है कि यह एक संवेदनशील क्षेत्र निदान (चित्रा 3 बी) के रूप में व्यवहार्य है। QPCR 2.01 × 10−1 प्रतियों / μL का पता लगा सकता है, लेकिन Ct मान 36 से अधिक था (चित्रा 3C)। इसलिए, CLas-DETECTR पारंपरिक पीसीआर की तुलना में अधिक संवेदनशील परिमाण के दो आदेश हैं और पतला एम्प्लिकॉन का उपयोग किए जाने पर QPCR की तुलना में परिमाण का एक क्रम कम संवेदनशील है (चित्रा 3)।

अंत में, हमने क्षेत्र के नमूनों के लिए सीएलएएस-डिटेक्टर की व्यवहार्यता की जांच की और क्यूपीसीआर, एक स्थापित, संवेदनशील न्यूक्लिक एसिड डिटेक्शन दृष्टिकोण21 के साथ इसकी संवेदनशीलता की तुलना की। आमतौर पर, 36 से अधिक क्यूपीसीआर द्वारा सीएलएएस का पता लगाने का सीटी मान मतलब है कि सीएलएएस एकाग्रता 2.01 × 10-1 प्रतियों / 1 एल से कम है, जो बहुत कम सांद्रता है (चित्रा 3 सी)। 15 नमूनों में से, क्यूपीसीआर द्वारा पता लगाए गए नमूने 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 और 14 का सीटी मान 36 से कम था, और स्पष्ट हरे प्रतिदीप्ति संकेत देखे गए (चित्रा 4)। दूसरी ओर, जब क्यूपीसीआर द्वारा पता लगाए गए नमूने 6, 7, 9, 12 और 15 के सीटी मान अनिर्धारित थे, तो कोई हरे रंग के प्रतिदीप्ति संकेत नहीं देखे गए (चित्रा 4)। इसके अलावा, कमजोर हरे प्रतिदीप्ति संकेत तब देखे गए जब क्यूपीसीआर द्वारा पता लगाए गए नमूना 5 और नमूना 11 के सीटी मान 36 से अधिक थे (चित्रा 4)। परिणाम बताते हैं कि हमारा मंच क्षेत्र में एचएलबी निदान के लिए एक तेज़, मजबूत और संवेदनशील उपकरण है।

नहीं नाम अनुक्रम (5' से 3')
1 crRNA1-nrdB जी.आर
2 एसएसडीएनए-एफक्यू FAM-TTTATTT-BHQ1
3 F-RPA-RNRF AAAAGTCGCACCATGCTCCATGAAGCTACC
4 R-RPA-RNRR TGTTCACATGAGGGAGCATTAACCACCACA
5 F-RNR ATGGCAATAACAGGATTAAGCC
6 R-RNR TTAATCCCATTTCAACCCTGCTCC

तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले न्यूक्लिक एसिड। एसएसडीएनए-एफक्यू एकल-फंसे हुए डीएनए है जिसे 5 '6-एफएएम (फ्लोरेसिन) के साथ 5' पर लेबल किया गया है और फ्लोरेसेंस बुझाने वाला ब्लैक होल बुझाने वाला 1 (बीएचक्यू 1) 3 ' पर है। संक्षेप: एफ = फ्लोरोसेंट रिपोर्टर; Q = प्रतिदीप्ति बुझाने वाला।

Figure 1
चित्रा 1: CLas-DETECTR का डिजाइन और सत्यापन। (ए) सीएलएएस-डिटेक्टर परख का योजनाबद्ध। चरण 1: त्वरित जीडीएनए निष्कर्षण के लिए 6% पीईजी 200 में 20 एमएम एनएओएच युक्त बफर ए तैयार करें; समाधान बी में इज़ोटेर्मल डीएनए प्रवर्धन के लिए प्रत्येक प्रतिक्रिया में आरपीए बफर का 10 μL, F-RPA-RNRf का 0.8 μL, और ddH2O का 3.9 μL होता है; समाधान C में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर रिलीज के लिए प्रत्येक प्रतिक्रिया में SsDNA रिपोर्टर का 1 μL, NEB बफर 3.1 का 3 μL, nrdB को लक्षित करने वाले crRNA का 1 μL, Cas12a का 4 μL और ddH 2 O का11μL होता है। चरण 2: पत्तियों से पंच किए गए पांच पत्ती डिस्क का उपयोग बफर ए के 200 μL के साथ साइट्रस कुल डीएनए को निकालने के लिए किया गया था। चरण 3: CLas-विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड को प्राइमर F-RPA-RNRF और R-RPA-RNRR का उपयोग करके प्रवर्धित किया गया था, जो समाधान B में CLas-विशिष्ट मार्कर जीन nrdB को लक्षित करता है। चरण 3 से मिश्रण के 10 μL के साथ समाधान C को 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था, और हरे रंग के फ्लोरेसेंस सिग्नल को हैंडहेल्ड फ्लोरोसेंट डिटेक्शन डिवाइस के माध्यम से देखा गया था। एसएसडीएनए-एफक्यू को 5'6-एफएएम (फ्लोरेसिन) के साथ 5' पर और एक फ्लोरेसेंस बुझाने वाले ब्लैक होल बुझाने वाले ब्लैक होल 1 (बीएचक्यू 1) के साथ 3' पर लेबल किया गया था। संक्षेप: एफ = फ्लोरोसेंट रिपोर्टर; Q = प्रतिदीप्ति बुझाने वाला। (बी) एचएलबी संक्रमित पेड़ (बाएं) धब्बेदार मोटल और पीले पत्ते दिखाता है, लेकिन एचएलबी-असंक्रमित पेड़ (दाएं) हरे रंग का दिखता है। (ग) सीएलए की उपस्थिति की पुष्टि प्राइमर जोड़ी एफ-आरपीए-आरएनआरएफ और आर-आरपीए-आरएनएआर का उपयोग करके की गई थी। (डी) एचएलबी-संक्रमित नमूना हरे प्रतिदीप्ति संकेतों को प्रदर्शित करता है, जबकि एचएलबी-असंक्रमित और एच2ओ क्लैस-डिटेक्टर परख में नहीं हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: CLas-DETECTR की विशिष्टता का परीक्षण। (ए) पीसीआर परिणामों का अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन, (बी) क्यूपीसीआर परिणामों का सीटी मान, और (सी) सीएलएएस-पॉजिटिव न्यूहॉल पत्तियों और तीन अन्य बैक्टीरिया से निकाले गए जीडीएनए का उपयोग करके सीएलएस-डिटेक्टर परिणाम एफ-आरपीए-आरएनआर और आर-आरपीए-आरएनएआर की प्राइमर जोड़ी के साथ प्रवर्धित होते हैं। फिर, एच2ओ ने एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया। एम: डीएनए सीढ़ी; ग्लोना को क्लैस-पॉजिटिव न्यूहॉल पत्तियों (1), एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेसियंस जीवी 3101 (2), ज़ैंथोमोनास सिट्री सबएसपी सिट्री (एक्ससीसी, 3), और बर्कहोल्डरिया स्टेबलाइज़ स्ट्रेन 1440 से निकाला गया है। सीटी मान मानक त्रुटि के ± तीन तकनीकी दोहराव के औसत सीटी मान का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: पीसीआर और क्यूपीसीआर के साथ सीएलएएस-डिटेक्टर की संवेदनशीलता तुलना। (ए) पीसीआर, (बी) सीएलएएस-डिटेक्टर, और (सी) क्यूपीसीआर का उपयोग करके विशिष्ट सीएलएएस डीएनए एम्प्लिकॉन कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला का पता लगाने का विश्लेषण। (ए) पीसीआर उत्पादों के 25 μL से, 5 μL जेल में लोड किए गए थे। (बी) तस्वीरों को हैंडहेल्ड फ्लोरोसेंट डिटेक्शन डिवाइस (उत्तेजना तरंग दैर्ध्य: 440 एनएम, उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य: 500 एनएम) द्वारा उत्सर्जित प्रकाश के तहत सुरक्षात्मक चश्मे के माध्यम से स्मार्टफोन कैमरे के साथ कैप्चर किया गया था। सभी परखों में एक ही प्राइमर का उपयोग किया गया था। सीएलएएस-विशिष्ट एनआरडीबी जीन को लक्षित करने वाले प्राइमर सेट एफ-आरएनआर और आर-आरएनआर के साथ प्रवर्धित 1,060 बीपी की लंबाई वाले शुद्ध पीसीआर उत्पादों को एच 2 ओ का उपयोग करके 2.01 × 106 प्रतियों / 1 एल (1), 2.01 × 105 प्रतियों / 1 एल × × (2), 2.01 × 104 प्रतियों × / 2.01 × 100 प्रतियां / μL (7), और 2.01 × 10−1 प्रतियां / H2O ने एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया। एम: डीएनए सीढ़ी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: फील्ड नमूने का उपयोग करके सीएलएएस का पता लगाना। न्यूहॉल मीठे नारंगी पेड़ों से एकत्र किए गए 15 पत्ती के नमूनों में सीएलएएस का परीक्षण ऊपर वर्णित सीएलएएस-डिटेक्टर और क्यूपीसीआर परख द्वारा किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह अध्ययन CLas-DETECTR नामक CLas का पता लगाने के लिए एक तेज़ और पोर्टेबल विधि प्रस्तुत करता है, जो RPA और CRISPR-Cas12a सिस्टम को जोड़ता है। वर्कफ़्लो चित्र 1 में चित्रित किया गया है। CLas-DETECTR विशिष्टता और संवेदनशीलता के साथ CLas का पता लगाता है (चित्रा 2 और चित्रा 3)। इसके अलावा, न्यूहॉल पत्ती के नमूनों का उपयोग करके, सीएलएएस-डिटेक्टर क्यूपीसीआर (चित्रा 4) के समान संवेदनशीलता के साथ सीएलएएस का पता लगाता है। विशेष रूप से, पता लगाने के परिणामों को प्रयोगशाला-आधारित उपकरणों से स्वतंत्र एक हैंडहेल्ड पोर्टेबल डिवाइस के माध्यम से सीधे देखा जा सकता है, जो वास्तविक समय एचएलबी निदान के लिए महत्वपूर्ण है।

प्रोटोकॉल के लिए कई महत्वपूर्ण विचार हैं। सबसे पहले, नमूना प्रक्रिया में क्रॉस-संदूषण से सख्ती से बचा जाना चाहिए, क्योंकि सीएलएएस-डिटेक्टर क्यूपीसीआर के रूप में संवेदनशील है। प्रतिक्रिया अभिकर्मकों को तीव्र सूर्य के प्रकाश के संपर्क में नहीं लाया जाना चाहिए। इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए सभी चरणों का ठीक से पालन किया जाना चाहिए। एक सकारात्मक नियंत्रण, एक प्लास्मिड जिसमें सीएलएएस-विशिष्ट जीन टुकड़े होते हैं, को यह सुनिश्चित करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए कि सीएलएएस-डिटेक्टर सिस्टम क्षेत्र में सही ढंग से काम करता है। अंत में, सभी सीएलएएस से संबंधित प्रयोगात्मक कचरे को निपटान से पहले बायोहैजार्ड और आटोक्लेव के रूप में माना जाना चाहिए।

यदि सकारात्मक नियंत्रण के लिए कोई प्रतिदीप्ति संकेत नहीं पाए जाते हैं, तो प्रतिक्रिया मिश्रण में अवरोधक मौजूद हो सकते हैं, और अभिकर्मकों को बदलने की आवश्यकता होती है। अन्यथा, यदि प्रतिदीप्ति अंतर करने के लिए बहुत कमजोर है, तो इनक्यूबेशन समय को लंबे समय तक बढ़ाया जा सकता है इनक्यूबेशन समय गलत सकारात्मकता का कारण बन सकता है।

मौजूदा सीएलएएस का पता लगाने के तरीकों के लिए महंगी पीसीआर मशीनों, निश्चित संचालन स्थलों और प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता होती है। हालांकि, यहां प्रस्तुत विधि एचएलबी को साइट्रस उत्पादकों सहित लोगों की एक विस्तृत श्रृंखला द्वारा क्षेत्र में सटीक और संवेदनशील रूप से निदान करने की अनुमति देती है।

हालांकि, CLas-DETECTR की कुछ सीमाएँ हैं। सबसे पहले, साइट्रस नमूने सीधे प्रोटोकॉल में उपयोग नहीं किए जा सकते हैं, और साइट्रस जीडीएनए को निकालने की आवश्यकता है। दूसरा, आरपीए के लिए एक सरल इनक्यूबेटर और लगातार परिणामों के लिए कैस 12 ए की न्यूक्लियस गतिविधि के सक्रियण की आवश्यकता होती है। तीसरा, परिणामों को हैंडहेल्ड फ्लोरोसेंट डिटेक्शन डिवाइस के माध्यम से देखने की आवश्यकता है। हालांकि पार्श्व प्रवाह स्ट्रिप्स को सीधे परिणाम दिखाने के लिए नियोजित किया जा सकता है, यह बढ़ेगा

इस प्रोटोकॉल में पत्ती के नमूनों का परीक्षण किया गया था। भविष्य में, पेरिसविंकल्स और साइलिड नमूनों में सीएलएएस की उपस्थिति का पता लगाने के लिए सीएलएएस-डिटेक्टर लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, सीआरआरएनए और प्राइमरों को बदलकर, इस आणविक नैदानिक तकनीक का उपयोग अन्य साइट्रस रोगों के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि साइट्रस कैंकर, साइट्रस क्षय वायरस और साइट्रस पत्ती विखंडन वायरस। जबकि हम CLas-DETECTR पर काम कर रहे हैं, इस दृष्टिकोण का उपयोग दूसरों द्वारा समानांतर में CLas का पता लगाने के लिए भी किया गयाहै।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय कुंजी आर एंड डी कार्यक्रम (2021वाईएफडी 1400805), जियांग्शी प्रांत के प्रमुख विज्ञान और प्रौद्योगिकी आर एंड डी कार्यक्रम (20194 एबीसी 28007), जियांग्शी शिक्षा विभाग की परियोजनाओं (जीजेजे 201449), और जियांग्शी प्रांत में आधुनिक कृषि वैज्ञानिक अनुसंधान के सहयोगी नवाचार (जेएक्सएक्सटीसीएक्स 2015002 (3 + 2) -003 द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AxyPrep DNA Gel Extraction Kit Corning 09319KE1 China
Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Solarbio D1600 China
EnGen LbCas12a  TOLOBIO 32104-01 China
Ex Taq Version 2.0 plus dye TaKaRa RR902A China
Handheld fluorescent detection device  LUYOR 3415RG China
Hole puncher  Deli 114 China
Magnesium acetate, MgOAc TwistDx TABAS03KIT UK
NaOH SCR 10019718 China
NEB buffer 3.1  NEB B7203 USA
PCR strip tubes LABSELECT PST-0208-FT-C China
PEG 200  Sigma P3015 USA
PrimeSTAR Max DNA Polymeras TaKaRa R045A China
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder  New England Biolabs N0550S USA
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) TaKaRa RR820B China
TwistAmp Basic TwistDx TABAS03KIT UK

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References

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सीआरआईएसपीआर-सीएएस 12 ए के साथ संयुक्त रिकोम्बिनेस पोलीमरेज़ एम्प्लीफिकेशन का उपयोग करके फील्ड-तैनाती योग्य <em>कैंडिडाटस</em> लिबेरिबैक्टर एशियाटिकस डिटेक्शन
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