सीआरआईएसपीआर-सीएएस 12 ए के साथ संयुक्त रिकोम्बिनेस पोलीमरेज़ एम्प्लीफिकेशन का उपयोग करके फील्ड-तैनाती योग्य कैंडिडाटस लिबेरिबैक्टर एशियाटिकस डिटेक्शन
Summary
इस काम में, सीआरआईएसपीआर-सीएएस 12 ए के साथ संयुक्त रिकोम्बिनेस पोलीमरेज़ प्रवर्धन के आधार पर कैंडिडाटस लिबेरिबैक्टर एशियाटिकस के लिए एक तेजी से, संवेदनशील और पोर्टेबल पहचान विधि विकसित की गई थी।
Abstract
साइट्रस उत्पादकों द्वारा कैंडिडाटस लाइबेरिबैक्टर एशियाटिकस (सीएलएएस) का प्रारंभिक पता लगाने से प्रारंभिक हस्तक्षेप की सुविधा मिलती है और बीमारी के प्रसार को रोका जा सकता है। तेजी से और पोर्टेबल हुआंगलोंगबिंग (एचएलबी) निदान के लिए एक सरल विधि यहां प्रस्तुत की गई है जो रिकोम्बिनेस पोलीमरेज़ प्रवर्धन और एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को जोड़ती है जो नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट / सीआरआईएसपीआर-संबद्ध 12 ए (सीआरआईएसपीआर-सीएएस 12 ए) प्रणाली की न्यूक्लियस गतिविधि का उपयोग करती है। इस तकनीक की संवेदनशीलता पीसीआर की तुलना में बहुत अधिक है। इसके अलावा, इस विधि ने क्यूपीसीआर के समान परिणाम दिखाए जब पत्ती के नमूनों का उपयोग किया गया था। पारंपरिक सीएलएएस डिटेक्शन विधियों की तुलना में, यहां प्रस्तुत पहचान विधि 90 मिनट में पूरी की जा सकती है और एक इज़ोटेर्मल स्थिति में काम करती है जिसे पीसीआर मशीनों के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, परिणामों को क्षेत्र में एक हैंडहेल्ड फ्लोरोसेंट डिटेक्शन डिवाइस के माध्यम से देखा जा सकता है।
Introduction
हुआंगलोंगबिंग (एचएलबी) दुनिया भर में सबसे अधिक समस्याग्रस्त साइट्रस रोगों में से एक है। एचएलबी फ्लोएम-कोलोनाइजिंग और फास्टिड बैक्टीरिया कैंडिडाटस लिबेरिबैक्टर एसपीपी के कारण होता है, जिसमें कैंडिडाटस लिबेरिबैक्टर एशियाटिकस (सीएलएएस), सीए एल अफ्रीकनस और सीए एल अमेरिकनस2 शामिल हैं। चीन और संयुक्त राज्य अमेरिका में सबसे प्रचलित एचएलबी से जुड़ी प्रजाति सीएलएएस है, जो एशियाई साइट्रस साइलिड्स (डायफोरिना सिट्री) या ग्राफ्टिंग3 के माध्यम से प्रेषित होती है। क्लैस से संक्रमित होने के बाद, साइट्रस पेड़ मृत्यु तक विकास में गिरावट का प्रदर्शन करतेहैं। क्लैस से संक्रमित साइट्रस पत्तियों के सामान्य लक्षण हैं धब्बेदार मोटल, हरे द्वीप (छोटे गोलाकार गहरे हरे बिंदु), मोटी और चमड़े की पत्तियों पर उभरी हुई कॉर्की नसें, और गैर-समान पीले रंग के अंकुर2। इसके अलावा, क्लैस से संक्रमित फल छोटे और एकतरफा2 दिखाई देते हैं।
चूंकि कोई साइट्रस किस्म एचएलबी के लिए प्रतिरोधी नहीं है और एचएलबी के लिए कोई चिकित्सीय इलाज नहीं है, इसलिए एचएलबी की रोकथाम के लिए सीएलएएस-पॉजिटिव साइट्रस पेड़ों के संगरोध और अलगाव की आवश्यकता होती है। इसलिए, सीएएस के प्रसार को रोकने औरआर्थिक नुकसान को कम करने के लिए निगरानी और संगरोध के लिए प्रारंभिक पहचान महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, संक्रमण के प्रारंभिक चरण के दौरान पौधों में सीएलएएस के कम टिटर के कारण संवेदनशील सीएलएएस का पता लगाने की आवश्यकता होती है। चीन में, CLas का पता लगाना आमतौर पर कुछ प्रमाणित परीक्षण केंद्रों द्वारा आयोजित किया जाता है। हालांकि, पहचान प्रक्रिया में आमतौर पर कम से कम 1 सप्ताह लगते हैं, और पहचान शुल्क महंगा है। इसलिए, एचएलबी घटनाओं की निगरानी में मदद करने के लिए
एचएलबी 4,5,6,7,8,9 के निदान के लिए विभिन्न तकनीकों को लागू किया गया है। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) और मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) उनकी उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता 4,5 के कारण सीएलएएस का पता लगाने के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले उपकरण हैं। हालांकि, वे प्रौद्योगिकियां महंगे उपकरणों और अत्यधिक कुशल कर्मियों पर बहुत अधिक निर्भर करती हैं। इसके अलावा, कई इज़ोटेर्मल प्रवर्धन विधियाँ, जैसे लूप-मध्यस्थता इज़ोटेर्मल प्रवर्धन (एलएएमपी), को उनकी सादगी, तेजी और कम लागत 8,9,10 के कारण पारंपरिक पीसीआर विधियों के आकर्षक विकल्पके रूप में विकसित किया गया है। हालांकि, गैर-विशिष्ट प्रवर्धन संकेतों के कारण सीएलएएस का सटीक रूप से पता लगाने के लिए उन्हें लागू करना चुनौतीपूर्ण है, जो गलत-सकारात्मक परिणाम पैदा कर सकता है।
आरएनए-निर्देशित सीआरआईएसपीआर/सीएएस (नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट/सीआरआईएसपीआर-संबद्ध) एंडोन्यूक्लिज़-आधारित न्यूक्लिक एसिड डिटेक्शन को इसकी उच्च संवेदनशीलता, विशिष्टता और विश्वसनीयता 11,12,13,14 के कारण अगली पीढ़ी की आणविक निदान तकनीक के रूप में विकसित किया गया है। ये CRISPR/Cas निदान प्रौद्योगिकियां CAS प्रोटीन की संपार्श्विक न्यूक्लियस गतिविधि पर भरोसा करती हैं ताकि ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के प्रत्येक छोर पर एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और एक फ्लोरेसेंस बुझाने वाले के साथ संशोधित एकल-फंसे हुए डीएनए (ssDNA) को छोड़ दिया जा सके, साथ ही जारी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर11,12 को पकड़ने के लिए एक फ्लोरेसेंस डिटेक्शन डिवाइस भी। . सीआरआईएसपीआर आरएनए (सीआरआरएनए) टारगेट डुप्लेक्स द्वारा सक्रिय कई कैस प्रभावकों की न्यूक्लियस गतिविधि अंधाधुंध रूप से आसपास के गैर-लक्ष्य एसएसडीएनए11 को छोड़ सकती है। CRISPR-Cas12a (जिसे Cpf 1 भी कहा जाता है), एक वर्ग 2 प्रकार V-A CRISPR / Cas प्रणाली, Cas9 की तुलना में कई फायदे प्रदर्शित करती है, जैसे कि कम बेमेल सहिष्णुता और अधिक विशिष्टता13। कैस 12 ए / सीआरआरएनए प्रणाली को मानव रोगजनकों और फाइटोपैथोजेन्स 14,15,16,17,18 के न्यूक्लिक एसिड की संवेदनशील और विशिष्ट पहचान के लिए लागू किया गया है। इसलिए, Cas12a / crRNA प्रणाली का उपयोग करने से CLas के न्यूक्लिक एसिड का सटीक और संवेदनशील पता लगाने में सक्षम होना चाहिए।
अकेले Cas12a सैद्धांतिक रूप से न्यूक्लिक एसिड के निम्न स्तर का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं है। इसलिए, इसकी पहचान संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए, CRISPR-Cas12a का पता लगाने को आमतौर पर एक इज़ोटेर्मल प्रवर्धन चरण14,15 के साथ जोड़ा जाता है। रिकोम्बिनेस पोलीमरेज़ प्रवर्धन (आरपीए) संवेदनशील और तेजी से इज़ोटेर्मल डीएनए प्रवर्धन को 37 डिग्री सेल्सियस से 42 डिग्री सेल्सियस19 तक के तापमान सीमा में सक्षम बनाता है।
डिटेक्टर (डीएनए एंडोन्यूक्लिज़ टारगेटेड सीआरआईएसपीआर ट्रांस रिपोर्टर) नामक एक डिटेक्शन प्लेटफॉर्म जो सीएएस 12 ए की डीएनएस गतिविधि को आरपीए और फ्लोरेसेंस रीडआउट के साथ जोड़ता है, हाल ही में12 तैयार किया गया है और इसे उच्च संवेदनशीलता20 के साथ न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, सकारात्मक नमूनों से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति संकेत को क्षेत्र में एक हैंडहेल्ड फ्लोरेसेंस डिटेक्शन डिवाइस के माध्यम से देखा जा सकता है।
चूंकि हमने आरपीए के साथ डीएनए को प्रवर्धित किया, सीएलएस21 के लिए विशिष्ट पांच-कॉपी एनआरडीबी (राइबोन्यूक्लियोटाइड रिडक्टेस β-सबयूनिट) जीन को लक्षित करने वाले सीआरआरएनए को डिजाइन किया, और कैस 12 ए प्रोटीन की डीनेस गतिविधि को नियोजित किया, इसलिए हमने इस क्लैस डिटेक्शन विधि को सीएलएएस-डिटेक्टर कहा। मौजूदा CLas डिटेक्शन विधियों की तुलना में, CLas-DETECTR तेज, सटीक, संवेदनशील और तैनात करने योग्य है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह अध्ययन CLas-DETECTR नामक CLas का पता लगाने के लिए एक तेज़ और पोर्टेबल विधि प्रस्तुत करता है, जो RPA और CRISPR-Cas12a सिस्टम को जोड़ता है। वर्कफ़्लो चित्र 1 में चित्रित किया गया है। CLas-DETECTR विशिष्टता और संवेदनशीलत?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय कुंजी आर एंड डी कार्यक्रम (2021वाईएफडी 1400805), जियांग्शी प्रांत के प्रमुख विज्ञान और प्रौद्योगिकी आर एंड डी कार्यक्रम (20194 एबीसी 28007), जियांग्शी शिक्षा विभाग की परियोजनाओं (जीजेजे 201449), और जियांग्शी प्रांत में आधुनिक कृषि वैज्ञानिक अनुसंधान के सहयोगी नवाचार (जेएक्सएक्सटीसीएक्स 2015002 (3 + 2) -003 द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था।
Materials
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China | |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China | |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China | |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China | |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China | |
| Hole puncher | Deli | 114 | China | |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK | |
| NaOH | SCR | 10019718 | China | |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA | |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China | |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA | |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China | |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA | |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China | |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
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