I dette arbeidet ble det utviklet en rask, sensitiv og bærbar deteksjonsmetode for Candidatus Liberibacter asiaticus basert på rekombinasepolymeraseforsterkning kombinert med CRISPR-Cas12a.
Tidlig påvisning av Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) av sitrusdyrkere letter tidlig intervensjon og forhindrer spredning av sykdom. En enkel metode for rask og bærbar Huanglongbing (HLB) diagnose presenteres her som kombinerer rekombinase polymeraseforsterkning og en fluorescerende reporter som benytter nukleaseaktiviteten til det grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner / CRISPR-assosiert 12a (CRISPR-Cas12a) system. Følsomheten til denne teknikken er mye høyere enn PCR. Videre viste denne metoden lignende resultater som qPCR når bladprøver ble brukt. Sammenlignet med konvensjonelle CLas-deteksjonsmetoder, kan deteksjonsmetoden som presenteres her fullføres på 90 minutter og fungerer i en isotermisk tilstand som ikke krever bruk av PCR-maskiner. I tillegg kan resultatene visualiseres gjennom en håndholdt fluorescerende deteksjonsenhet i feltet.
Huanglongbing (HLB) er en av de mest problematiske sitrussykdommene i verden1. HLB er forårsaket av de floemkoloniserende og kresne bakteriene Candidatus Liberibacter spp., inkludert Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus og Ca. L. americanus 2. Den mest utbredte HLB-assosierte arten i Kina og USA er CLas, som overføres av asiatiske sitruspsyllider (Diaphorina citri) eller gjennom podning3. Etter å ha blitt smittet av CLas, viser sitrustrær vekstnedgang tildøden 2. De vanlige symptomene på sitrusblader infisert med CLas er flekkete mottle, grønne øyer (små sirkulære mørkegrønne prikker), hevede korketårer på tykkere og skinnende blader og nonuniform gulningsskudd2. I tillegg virker frukt smittet med CLas liten og skjev2.
Siden ingen sitrussort er motstandsdyktig mot HLB og det ikke finnes noen terapeutisk kur for HLB, krever forebygging av HLB karantene og isolering av CLas-positive sitrustrær 2,3. Derfor er tidlig deteksjon avgjørende for overvåking og karantene for å forhindre spredning av CLas og minimere økonomiske tap3. I tillegg er sensitiv CLas-deteksjon nødvendig på grunn av den lave titeren av CLas i planter i det tidlige infeksjonsstadiet3. I Kina utføres CLas-deteksjon vanligvis av visse sertifiserte testsentre. Imidlertid tar deteksjonsprosessen vanligvis minst 1 uke, og deteksjonsgebyret er dyrt. Derfor, for å bidra til å overvåke forekomsten av HLB
Ulike teknologier har blitt brukt til å diagnostisere HLB 4,5,6,7,8,9. Polymerasekjedereaksjon (PCR) og kvantitativ PCR (qPCR) er de mest brukte verktøyene for CLas-deteksjon på grunn av deres høye følsomhet og spesifisitet 4,5. Imidlertid er disse teknologiene avhengige av dyre instrumenter og høyt kvalifisert personell. I tillegg har flere isotermiske amplifikasjonsmetoder, som sløyfemediert isotermisk forsterkning (LAMP), blitt utviklet som attraktive alternativer til konvensjonelle PCR-metoder på grunn av deres enkelhet, hurtighet og lave kostnader 8,9,10. Det er imidlertid utfordrende å bruke dem til å nøyaktig oppdage CLas på grunn av de ikke-spesifikke forsterkningssignalene, noe som kan forårsake falske positive resultater.
RNA-guidet CRISPR / Cas (gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner / CRISPR-assosiert) endonukleasebasert nukleinsyredeteksjon er utviklet som en neste generasjons molekylær diagnostikkteknologi på grunn av sin høye følsomhet, spesifisitet og pålitelighet11,12,13,14. Disse CRISPR / Cas-diagnostikkteknologiene er avhengige av sikkerhetskjerneaktiviteten til Cas-proteiner for å spalte enkeltstrenget DNA (ssDNA) modifisert med en fluorescerende reporter og en fluorescensslukker i hver ende av oligonukleotidene, samt en fluorescensdeteksjonsenhet for å fange den frigjorte fluorescerende reporteren11,12 . Nukleaseaktiviteten til flere Cas-effektorer aktivert av CRISPR RNA (crRNA) måldupleks kan ukritisk spalte det omkringliggende ikke-mål ssDNA11. CRISPR-Cas12a (også kalt Cpf 1), et klasse 2 type V-A CRISPR/Cas-system, demonstrerer flere fordeler sammenlignet med Cas9, for eksempel lavere mismatchtoleranse og større spesifisitet13. Cas12a / crRNA-systemet har blitt brukt for sensitiv og spesifikk påvisning av nukleinsyrene til humane patogener og fytopatogener 14,15,16,17,18. Derfor bør bruk av Cas12a / crRNA-systemet muliggjøre nøyaktig og sensitiv deteksjon av nukleinsyren av CLas.
Cas12a alene er ikke teoretisk følsomt nok til å oppdage lave nivåer av nukleinsyrer. Derfor, for å forbedre deteksjonsfølsomheten, kombineres CRISPR-Cas12a-deteksjon vanligvis med et isotermisk forsterkningstrinn14,15. Rekombinase polymeraseforsterkning (RPA) muliggjør sensitiv og rask isotermisk DNA-amplifisering i et temperaturområde fra 37 °C til 42 °C19.
En deteksjonsplattform kalt DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) som kombinerer DNase-aktiviteten til Cas12a med RPA og en fluorescensavlesning, er nylig utviklet12 og har vist seg å oppdage nukleinsyre med høyere følsomhet20. Videre kan fluorescenssignalet som sendes ut fra de positive prøvene observeres gjennom en håndholdt fluorescensdeteksjonsanordning i feltet.
Siden vi forsterket DNA med RPA, designet crRNA rettet mot fem-kopi nrdB (ribonukleotidreduktase β– subenhet) -genet spesifikt for CLas21, og benyttet DNase-aktiviteten til Cas12a-proteinet, kalte vi denne CLas-deteksjonsmetoden CLas-DETECTR. Sammenlignet med eksisterende CLas-deteksjonsmetoder er CLas-DETECTR rask, nøyaktig, sensitiv og distribuerbar.
Denne studien presenterer en rask og bærbar metode for å oppdage CLas kalt CLas-DETECTR, som kombinerer RPA- og CRISPR-Cas12a-systemene. Arbeidsflyten er illustrert i figur 1. CLas-DETECTR detekterer CLas med spesifisitet og følsomhet (figur 2 og figur 3). Ved bruk av Newhall-bladprøver detekterer CLas-DETECTR CLas med samme følsomhet som qPCR (figur 4). Spesielt kan deteksjonsresu…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble økonomisk støttet av National Key R &D Program of China (2021YFD1400805), Major Science and Technology R &&D-programmet i Jiangxi-provinsen (20194ABC28007), Prosjekter av Jiangxi Education Department (GJJ201449), og Collaborative Innovation of Modern Agricultural Scientific Research i Jiangxi-provinsen (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).
AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China | |
Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China | |
EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China | |
Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China | |
Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China | |
Hole puncher | Deli | 114 | China | |
Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK | |
NaOH | SCR | 10019718 | China | |
NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA | |
PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China | |
PEG 200 | Sigma | P3015 | USA | |
PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China | |
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA | |
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China | |
TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |