Summary
En este trabajo, se desarrolló un método de detección rápido, sensible y portátil para Candidatus Liberibacter asiaticus basado en la amplificación de la polimerasa recombinasa combinada con CRISPR-Cas12a.
Abstract
La detección temprana de Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) por los productores de cítricos facilita la intervención temprana y previene la propagación de la enfermedad. Aquí se presenta un método simple para el diagnóstico rápido y portátil de Huanglongbing (HLB) que combina la amplificación de la polimerasa recombinasa y un reportero fluorescente que utiliza la actividad nucleasa del sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas / 12a asociado a CRISPR (CRISPR-Cas12a). La sensibilidad de esta técnica es mucho mayor que la PCR. Además, este método mostró resultados similares a la qPCR cuando se utilizaron muestras de hojas. En comparación con los métodos de detección de CLas convencionales, el método de detección presentado aquí se puede completar en 90 minutos y funciona en una condición isotérmica que no requiere el uso de máquinas de PCR. Además, los resultados se pueden visualizar a través de un dispositivo de detección fluorescente portátil en el campo.
Introduction
Huanglongbing (HLB) es una de las enfermedades de los cítricos más problemáticas en todo el mundo1. El HLB es causado por la bacteria colonizadora de floemas y fastidiosa Candidatus Liberibacter spp., incluyendo Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus y Ca. L. americanus2 . La especie asociada al HLB más prevalente en China y los EE.UU. es CLas, que se transmite por psílidos asiáticos de los cítricos (Diaphorina citri) o a través de injertos3. Después de ser infectados por CLas, los árboles de cítricos muestran una disminución del crecimiento hasta la muerte2. Los síntomas comunes de las hojas de cítricos infectadas con CLas son moteado con manchas, islas verdes (pequeños puntos circulares de color verde oscuro), venas corchosas elevadas en hojas más gruesas y coriáceas, y brotes amarillentos no uniformes2. Además, las frutas infectadas con CLas aparecen pequeñas y desequilibradas2.
Dado que ninguna variedad de cítricos es resistente al HLB y no existe cura terapéutica para el HLB, la prevención del HLB requiere la cuarentena y el aislamiento de los cítricos CLas-positivos 2,3. Por lo tanto, la detección temprana es crítica para el monitoreo y la cuarentena para prevenir la propagación de CLas y minimizar las pérdidas económicas3. Además, se necesita la detección sensible de CLas debido al bajo título de CLas en las plantas durante la etapa temprana de la infección3. En China, la detección de CLas generalmente es realizada por ciertos centros de prueba certificados. Sin embargo, el proceso de detección generalmente toma al menos 1 semana, y la tarifa de detección es costosa. Por lo tanto, para ayudar a monitorear la incidencia de HLB
Se han aplicado diversas tecnologías para diagnosticar HLB 4,5,6,7,8,9. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR cuantitativa (qPCR) son las herramientas más utilizadas para la detección de CLas debido a su alta sensibilidad y especificidad 4,5. Sin embargo, esas tecnologías dependen en gran medida de instrumentos costosos y personal altamente calificado. Además, varios métodos de amplificación isotérmica, como la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), han sido desarrollados como alternativas atractivas a los métodos convencionales de PCR debido a su simplicidad, rapidez y bajo costo 8,9,10. Sin embargo, es difícil aplicarlos para detectar con precisión CLas debido a las señales de amplificación no específicas, que pueden causar resultados falsos positivos.
La detección de ácidos nucleicos basada en endonucleasa basada en CRISPR/Cas (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas regularmente / asociadas a CRISPR) se ha desarrollado como una tecnología de diagnóstico molecular de próxima generación debido a su alta sensibilidad, especificidad y confiabilidad11,12,13,14. Estas tecnologías de diagnóstico CRISPR/Cas se basan en la actividad nucleasa colateral de las proteínas Cas para escindir ADN monocatenario (ssDNA) modificado con un reportero fluorescente y un extintor de fluorescencia en cada extremo de los oligonucleótidos, así como un dispositivo de detección de fluorescencia para capturar el reportero fluorescente liberado11,12 . La actividad nucleasa de varios efectores Cas activados por el dúplex diana de ARN CRISPR (crRNA) puede escindir indiscriminadamente el ssDNA11 circundante no diana. CRISPR-Cas12a (también llamado Cpf 1), un sistema CRISPR/Cas de clase 2 tipo V-A, demuestra varias ventajas en comparación con Cas9, como una menor tolerancia al desajuste y una mayor especificidad13. El sistema Cas12a/crRNA ha sido aplicado para la detección sensible y específica de los ácidos nucleicos de patógenos humanos y fitopatógenos 14,15,16,17,18. Por lo tanto, la utilización del sistema Cas12a / crRNA debería permitir la detección precisa y sensible del ácido nucleico de CLas.
Cas12a solo no es teóricamente lo suficientemente sensible como para detectar niveles bajos de ácidos nucleicos. Por lo tanto, para mejorar su sensibilidad de detección, la detección de CRISPR-Cas12a se combina típicamente con un paso de amplificación isotérmica14,15. La amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) permite la amplificación isotérmica sensible y rápida del ADN en un rango de temperatura de 37 °C a 42 °C19.
Una plataforma de detección llamada DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) que combina la actividad DNasa de Cas12a con RPA y una lectura de fluorescencia ha sido ideada recientemente12 y se ha demostrado que detecta ácido nucleico con mayor sensibilidad20. Además, la señal de fluorescencia emitida por las muestras positivas se puede observar a través de un dispositivo portátil de detección de fluorescencia en el campo.
Dado que amplificamos el ADN con RPA, diseñamos crRNA dirigido al gen nrdB (ribonucleonucleotide reductase β- subunidad) de cinco copias específico para CLas21, y empleamos la actividad DNasa de la proteína Cas12a, llamamos a este método de detección CLas CLas-DETECTR. En comparación con los métodos de detección de CLas existentes, CLas-DETECTR es rápido, preciso, sensible e implementable.
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Protocol
1. Construcción del CLas-DETECTR
NOTA: La construcción de CLas-DETECTR es un proceso de cuatro pasos: preparación de la solución, aislamiento de ADN total cítrico, amplificación isotérmica del ADN y visualización de resultados. El esquema del ensayo CLas-DETECTR se ilustra en la Figura 1A.
- Preparación de la solución
- Preparar el tampón A: 20 mM NaOH en 6% PEG 200. Para 100 ml, agregue 113 mg de NaOH y 6 g de PEG 200 en 80 ml deH2Oen una botella. Incubar el frasco en un baño maría a 60 °C hasta que se disuelva todo el PEG 200. Luego, agregueH2Oa un volumen de 100 ml.
- Preparar la solución B: Para cada reacción, añadir 10 μL de tampón RPA, 0,8 μL de F-RPA-RNRf, 0,8 μL de R-RPA-RNRr y 3,9 μL deddH2Oa un volumen final de 15,5 μL.
NOTA: F-RPA-RNRf y R-RPA-RNRr son los cebadores utilizados en el ensayo contra el gen nrdB . Consulte la Tabla 1 para la secuencia. - Preparar la solución C: Para cada reacción, añadir 1 μL de ssDNA reporter, 3 μL de tampón NEB 3.1, 1 μL de crRNA, 4 μL de Cas12a y 11 μL deddH2Oa un volumen final de 20 μL.
NOTA: Si hay muchas muestras para detectar, haga un gran volumen de solución B y solución C, y alícuota más tarde.
- Aislamiento de ADN total de cítricos
NOTA: Para ahorrar tiempo y hacer que este método sea adecuado para la detección de CLas de campo, se utilizó el enfoque basado en polietilenglicol alcalino (PEG) para obtener extractos de plantas crudas para la amplificación de ADN22,23- Las hojas de cítricos se utilizaron en este protocolo. Primero, perfore cinco discos de hojas de una hoja. A continuación, coloque los discos de hoja en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y agregue 200 μL de tampón A.
NOTA: En el campo, limpie las hojas primero si hay polvo cubriéndolas. Los discos de las hojas se pueden recortar utilizando la tapa del tubo de 1,5 ml para evitar la contaminación cruzada. Otros tejidos cítricos, como raíces, tallos, frutas y flores, también se pueden usar en este protocolo. - Moler los discos de hojas manualmente hasta que queden suaves con una varilla de plástico.
- Deje el tubo sin molestias durante 10 minutos. Luego, use el sobrenadante para la amplificación del ADN.
NOTA: El ensayo se puede pausar aquí, y los extractos de plantas crudas que se extrajeron por el método alcalino-PEG se pueden almacenar a -20 ° C durante al menos 1 año. Los árboles de naranja dulce Newhall (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) que se muestran en el video se cultivaron en una maceta llena de una mezcla de tierra de turba / vermiculita / perlita 9/3/1 (v / v / v) y se mantuvieron en un invernadero ubicado en el campus de la Universidad Normal de Gannan, Jiangxi, China. Los árboles infectados con HLB fueron inoculados por injerto con brotes de Newhall positivos para CLas. Los árboles infectados con HLB y no infectados con HLB fueron confirmados por PCR. CLas se detectó utilizando el par de cebadores (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) dirigido al gen marcador específico de CLas nrdB. Por otro lado, los síntomas característicos de HLB, moteado con manchas y hojas amarillentas se pueden encontrar en árboles CLas-positivos pero no en CLas-negativos.
- Las hojas de cítricos se utilizaron en este protocolo. Primero, perfore cinco discos de hojas de una hoja. A continuación, coloque los discos de hoja en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y agregue 200 μL de tampón A.
- Amplificación isotérmica del ADN
- Añadir 1 μL del sobrenadante de la etapa 1.2.3 y 1 μL de MgOAc (concentración final de 14 mM) en la solución B y mezclar bien.
- En el laboratorio, incubarlos en una incubadora simple a 37 °C durante 15 min.
NOTA: En el campo, sostenga los tubos en la mano durante 15 minutos. También se sugiere incubar tubos en una incubadora simple a 37 °C durante 15 min si las condiciones lo permiten.
- Visualización de resultados
- Añadir 10 μL de la mezcla del paso 1.3.2 en la solución C y mezclar bien.
- Incubarlos en una incubadora a 37 °C durante 60 min.
- Use gafas y observe la señal de fluorescencia verde liberada por el reportero ssDNA etiquetado con 5' 6-fluoresceína a 5' y el apagador de fluorescencia a 3' a través de un dispositivo de detección fluorescente portátil (longitud de onda de excitación: 440 nm, longitud de onda de emisión: 500 nm).
NOTA: la señal de fluorescencia verde puede durar varios días, es mejor
PRECAUCIÓN: La luz emitida por el dispositivo de detección de fluorescencia es perjudicial para los ojos. Asegúrese de usar gafas antes de observar los resultados.
2. Prueba de especificidad
NOTA: Para probar la especificidad de CLas-DETECTR, la bacteria de la rizosfera Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) y Burkholderia stabilis cepa 1440 aislada en el laboratorio24 se sometieron a la prueba CLas-DETECTR.
NOTA: Candidatus Liberibacter (CLas) no se puede cultivar. Solo se puede obtener ADN CLas a partir de la extracción de ADN genómico de tejidos cítricos infectados con CLas. Xcc es el agente causal de otra importante enfermedad de los cítricos, el cancro de los cítricos. Burkholderia stabilis cepa 1440 es una bacteria anti-Xcc aislada en el laboratorio. Por lo tanto, se utilizaron cepas puras para estas tres bacterias.
- Extraiga el ADN genómico bacteriano (ADNg) utilizando un kit de extracción de ADN genómico bacteriano siguiendo el protocolo del fabricante. Use el agua como un control negativo.
- Realizar PCR utilizando tiras de tubo de PCR de 0,2 ml con tapas ópticas en una mezcla de reacción de 25 μL que contiene 1 μL de F-RPA-RNRf, 1 μL de R-RPA-RNRr, 12,5 μL de Ex Taq Versión 2.0 más colorante, 1 μL de plantilla de ADN y 9,5 μL deH2O.
- Utilice las siguientes condiciones de reacción de ciclo térmico: 1 min a 98 °C; seguido de 35 ciclos de 10 s a 98 °C, 30 s a 55 °C y 15 s a 72 °C; luego 10 min a 72 °C; y mantener a 16 °C.
- Ejecute los productos de PCR en gel de agarosa al 1% a 120 V durante 15 min.
- Realizar qPCR en una mezcla de reacción de 20 μL que contiene 0,8 μL de F-RPA-RNRf, 0,8 μL de R-RPA-RNRr, 10 μL de 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL de la plantilla de ADN y 7,4 μL deH2O.
- Utilice las siguientes condiciones de reacción de ciclo térmico: 30 s a 95 °C; seguido de 45 ciclos de 5 s a 95 °C y 32 s a 60 °C; y luego una etapa de curva de fusión de 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C y 15 s a 95 °C.
- Incluye tres repeticiones técnicas en cada repetición.
- Realice el método CLas-DETECTR siguiendo los pasos 1.1–1.4.
3. Comparación de sensibilidad
- Para probar la sensibilidad de CLas DETECTR, detecte una serie de diluciones de fragmentos de ADN de CLas utilizando PCR, CLas-DETECTR y qPCR, como se describió anteriormente.
- Amplificar un segmento de ADN con una longitud de 1.060 pb a partir de nrdB utilizando el conjunto de cebadores F-RNR y R-RNR en una mezcla de reacción de 100 μL que contenga 4 μL de F-RNR, 4 μL de R-RNR, 50 μL de PrimeSTAR Max Premix, 2 μL de plantilla de ADN y 40 μL deH2O, siguiendo las condiciones de reacción de ciclo térmico (30 s a 98 °C; seguido de 35 ciclos de 10 s a 98 °C), 15 s a 55 °C, 30 s a 72 °C; luego 10 min a 72 °C; y mantener a 16 °C).
NOTA: El gen nrdB (ribonucleotide reductase β- subunidad) es específico de CLas21. Se puede obtener fácilmente el amplicón nrdB del ADNg cítrico positivo para CLas utilizando el conjunto de cebadores F-RNR y R-RNR. El conjunto de cebadores F-RNR y R-RNR amplifica un fragmento nrdB de 1.060 pb, mientras que el conjunto de cebadores F-RPA-RNR y R-RPA-RNR amplifica un fragmento de 104 pb del gen nrdB, que es la parte del fragmento nrdB de 1.060 pb. - Purificar los productos de PCR con un kit de extracción de gel de ADN siguiendo el manual del fabricante.
- Diluir los productos de PCR que contienen los amplicones nrdB conddH2Oesterilizado.
- Calcule el número de copias del gen nrdB utilizando el número de copia de ADN en línea disponible comercialmente y la calculadora de dilución.
- Preparar diluciones de ADN que contengan 2,01 × 106 copias/μL, 2,01 × 105 copias/μL, 2,01 × 104 copias/μL, 2,01 × 103 copias/μL, 2,01 × 10 2 copias/μL, 2,01 × 101 copias/μL, 2,01 × 100 copias/μL y2,01 × 10−1 copias/μL de fragmento de ADN CLas.
4. Detección de muestras
NOTA: Después de la prueba de especificidad y sensibilidad, se utilizó el método CLas-DETECTR para detectar la presencia de CLas en las muestras de hojas de campo recolectadas de naranjos dulces Newhall cultivados en el vivero de recursos de germoplasma en el campus de la Universidad Normal de Gannan, Jiangxi, China. Se realizó una qPCR para verificar los resultados.
- Prueba un total de 15 árboles. Use el agua como un control negativo.
- Realice los métodos CLas-DETECTR y qPCR como se describió anteriormente.
NOTA: Debido a las características de distribución desigual de CLas en cítricos, las hojas que mostraban síntomas de HLB se recolectaron como prioridad. Si un árbol parecía saludable, las hojas se recogían aleatoriamenteEl sistema CLas-DETECTR funciona correctamente.
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Representative Results
Aquí, hemos descrito una plataforma portátil, CLas-DETECTR, que peina los sistemas RPA y CRISPR-Cas12a para diagnosticar HLB en el campo. El esquema de CLas-DETECTR se ilustra en la figura 1A.
Cuando las muestras de hojas de los árboles Newhall infectados con HLB y no infectados con HLB (Figura 1B), para los cuales la presencia de CLas se confirmó mediante PCR (Figura 1C), se sometieron a la prueba CLas-DETECTR, se observó una señal de fluorescencia verde en la muestra infectada con HLB pero no en la muestra no infectada con HLB y control negativo (Figura 1D).
Se determinó la especificidad de CLas-DETECTR utilizando ácidos nucleicos extraídos de otras bacterias. El conjunto de cebadores de F-RPA-RNRf y R-RPA-RNRr utilizado en el ensayo CLas-DETECTR también se utilizó en PCR y qPCR. Se pudo ver una banda en la electroforesis en gel de agarosa cuando se amplificó utilizando ADNg de hoja de cítrico positivo para CLas, pero no otro ADNg bacteriano en los ensayos de PCR (Figura 2A). En los ensayos de qPCR, el valor promedio del ciclo umbral (Ct) de CLas fue de 24 ± 0,7, mientras que los valores promedio de Ct de A. tumefaciens GV3101, Xcc y B. stabilis cepa 1440 fueron 38 ± 0,7, 39 ± 1,4 y 39 ± 0,7, respectivamente (Figura 2B). Por lo general, el resultado se considera negativo cuando el valor de Ct es superior a 38. Estos resultados demuestran que el par de cebadores F-RPA-RNRf y R-RPA-RNRr son específicos de CLas. En el ensayo CLas-DETECTR, solo CLas gDNA demostró señales de fluorescencia verde; el ADNg extraído de A. tumefaciens GV3101, Xcc y B. stabilis cepa 1440 no lo hizo (Figura 2C), lo que significa que CLas-DETECTR puede detectar CLas específicamente.
También probamos la sensibilidad de CLas-DETECTR utilizando una serie de diluciones de ADN CLas. La PCR pudo detectar 2,01 × 102 copias/μL (Figura 3A). Por otro lado, CLas-DETECTR pudo detectar 2,01 × 100 copias/μL, lo que sugiere que esto es viable como diagnóstico de campo sensible (Figura 3B). La qPCR pudo detectar 2,01 × 10−1 copias/μL, pero el valor de Ct fue superior a 36 (Figura 3C). Por lo tanto, CLas-DETECTR es dos órdenes de magnitud más sensible que la PCR tradicional y un orden de magnitud menos sensible que la qPCR cuando se utilizan amplicones diluidos (Figura 3).
Finalmente, examinamos la viabilidad de CLas-DETECTR para muestras de campo y comparamos su sensibilidad con qPCR, un enfoque de detección de ácidos nucleicos establecidoy sensible 21. Por lo general, un valor de Ct de detección de CLas por qPCR superior a 36 significa que la concentración de CLas es inferior a 2,01 × 10−1 copias/μL, que es una concentración muy baja (Figura 3C). Entre las 15 muestras, el valor de Ct de las muestras 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 y 14 detectadas por qPCR fue inferior a 36, y se observaron señales de fluorescencia verde aparente (Figura 4). Por otro lado, cuando los valores de Ct de las muestras 6, 7, 9, 12 y 15 detectados por qPCR fueron indeterminados, no se observaron señales de fluorescencia verde (Figura 4). Además, se observaron señales de fluorescencia verde débiles cuando los valores de Ct de la muestra 5 y la muestra 11 detectados por qPCR fueron superiores a 36 (Figura 4). Los resultados sugieren que nuestra plataforma es una herramienta rápida, robusta y sensible para el diagnóstico de HLB en el campo.
| No | Nombre | Secuencia (5' a 3') | ||||||||||||
| 1 | crRNA1-nrdB | rUrArArUrUrUrCrUrArCrUrArGrUrGrUrArGrArUrUrUrGrCrArGrGrGrArCrGrArUrUrCrGrArGrArGrArG | ||||||||||||
| 2 | ssDNA-FQ | FAM-TTTATTT-BHQ1 | ||||||||||||
| 3 | F-RPA-RNRf | AAAAGTCGCACCATGCTCCATGAAGCTACC | ||||||||||||
| 4 | R-RPA-RNRr | TGTTCACATGAGGGAGCATTTAACCCCACGAA | ||||||||||||
| 5 | F-RNR | ATGGCAAATAACACAGGATTAAGCCC | ||||||||||||
| 6 | R-RNR | TTAATCCCATTTCAACCCTGCTCC | ||||||||||||
Tabla 1: Ácido nucleico utilizado en este estudio. El ssDNA-FQ es ADN monocatenario marcado con 5' 6-FAM (fluoresceína) a 5' y el enfriador de fluorescencia Black Hole Quencher 1 (BHQ1) a 3'. Abreviaturas: F = reportero fluorescente; Q = apagador de fluorescencia.
Figura 1: Diseño y validación del CLas-DETECTR. (A) Esquema del ensayo CLas-DETECTR. Paso 1: Preparar el tampón A que contenga 20 mM de NaOH en PEG 200 al 6% para la extracción rápida de ADNg; solución B que contiene 10 μL de tampón RPA, 0,8 μL de F-RPA-RNRf, 0,8 μL de F-RPA-RNRr y 3,9 μL deddH2Oen cada reacción para amplificación isotérmica del ADN; solución C que contiene 1 μL de ssDNA reporter, 3 μL de tampón NEB 3.1, 1 μL de crRNA dirigido a nrdB, 4 μL de Cas12a y 11 μL deddH2Oen cada reacción para la liberación fluorescente del reportero. Paso 2: Se utilizaron cinco discos foliares perforados de hojas para extraer el ADN total cítrico con 200 μL de tampón A. Paso 3: Los ácidos nucleicos específicos de CLas se amplificaron utilizando los cebadores F-RPA-RNRf y R-RPA-RNRr dirigidos al gen marcador específico de CLas nrdB en solución B con 1 μL de sobrenadante del paso 2 y 1 μL de MgOAc a 37 °C durante 15 min. Paso 4: La solución C con 10 μL de la mezcla del paso 3 se incubó a 37 °C durante 60 min, y la señal de fluorescencia verde se observó a través de un dispositivo de detección fluorescente portátil. El ssDNA-FQ fue marcado con 5' 6-FAM (fluoresceína) a 5' y un enfriador de fluorescencia Black Hole Quencher 1 (BHQ1) a 3'. Abreviaturas: F = reportero fluorescente; Q = apagador de fluorescencia. (B) El árbol infectado con HLB (izquierda) muestra moteado con manchas y hojas amarillas, pero el árbol no infectado con HLB (derecha) se ve verde. (C) La presencia de CLas se confirmó utilizando el par de cebadores F-RPA-RNRf y R-RPA-RNRr. (D) La muestra infectada con HLB muestra señales de fluorescencia verde, mientras que la no infectada con HLB yH2Ono lo hacen en el ensayo CLas-DETECTR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Prueba de la especificidad del CLas-DETECTR. (A) electroforesis en gel de agarosa de los resultados de PCR, (B) el valor de Ct de los resultados de qPCR, y (C) los resultados de CLas-DETECTR amplificados con el par de cebadores de F-RPA-RNRf y R-RPA-RNRr utilizando gDNA extraído de hojas de Newhall positivas para CLas y otras tres bacterias. Una vez más, H2O sirvió como un control negativo. M: escalera de ADN; ADNg extraído de hojas de Newhall positivas para CLas (1), Agrobacterium tumefaciens GV3101 (2), Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc, 3) y Burkholderia stabilis cepa 1440 aisladas en nuestro laboratorio (4). El valor Ct representa el valor medio de Ct de tres repeticiones técnicas ± error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comparación de sensibilidad de CLas-DETECTR con PCR y qPCR. Análisis de detección de una serie de diluciones específicas de amplicones de ADN de CLas utilizando (A) PCR, (B) CLas-DETECTR y (C) qPCR. (A) De 25 μL de los productos de PCR, se cargaron 5 μL en el gel. (B) Las imágenes fueron capturadas con la cámara de un teléfono inteligente a través de gafas protectoras bajo la luz emitida por un dispositivo portátil de detección fluorescente (longitud de onda de excitación: 440 nm, longitud de onda de emisión: 500 nm). Se utilizaron los mismos cebadores en todos los ensayos. Los productos de PCR purificados con una longitud de 1.060 pb amplificados con el conjunto de cebadores F-RNR y R-RNR dirigidos al gen nrdB específico de CLas se diluyeron utilizando H2O en concentraciones de 2,01 × 106 copias/μL (1), 2,01 × 105 copias/μL (2), 2,01 × 104 copias/μL (3), 2,01 × 103 copias/μL (4), 2,01 × 102 copias/μL (5), 2,01 × 101 copias/μL (6), 2,01 × 100 copias/μL (7) y 2,01 × 10−1 copias/μL (8). H2O sirvió como un control negativo. M: Escalera de ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Detección de CLas utilizando muestras de campo. CLas en 15 muestras de hojas recolectadas de naranjos dulces de Newhall se probó mediante ensayos CLas-DETECTR y qPCR descritos anteriormente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este estudio presenta un método rápido y portátil para detectar CLas denominado CLas-DETECTR, que combina los sistemas RPA y CRISPR-Cas12a. El flujo de trabajo se ilustra en la figura 1. CLas-DETECTR detecta CLas con especificidad y sensibilidad (Figura 2 y Figura 3). Además, utilizando muestras de hojas de Newhall, CLas-DETECTR detecta CLas con la misma sensibilidad que la qPCR (Figura 4). En particular, los resultados de la detección se pueden visualizar directamente a través de un dispositivo portátil de mano independiente de los instrumentos basados en el laboratorio, lo cual es fundamental para el diagnóstico de HLB en tiempo real.
Hay varias consideraciones importantes para el protocolo. En primer lugar, la contaminación cruzada debe evitarse estrictamente en el proceso de muestreo, ya que CLas-DETECTR es tan sensible como la qPCR. Los reactivos de reacción no deben exponerse a la luz solar intensa. Todos los pasos deben seguirse con precisión para lograr resultados óptimos. Se debe incluir un control positivo, un plásmido que contenga fragmentos de genes específicos de CLas, para garantizar que el sistema CLas-DETECTR funcione correctamente en el campo. Por último, todos los residuos experimentales relacionados con CLas deben tratarse como un riesgo biológico y esterilizarse en autoclave antes de su eliminación.
Si no se detectan señales de fluorescencia para el control positivo, pueden existir inhibidores en la mezcla de reacción y es necesario cambiar los reactivos. De lo contrario, si la fluorescencia es demasiado débil para distinguirla, el tiempo de incubación puede extenderse más tiempo de incubación puede conducir a falsos positivos.
Los métodos de detección de CLas existentes requieren costosas máquinas de PCR, sitios de operación fijos y personal capacitado. Sin embargo, el método presentado aquí permite que el HLB sea diagnosticado con precisión y sensibilidad en el campo por una amplia gama de personas, incluidos los productores de cítricos.
Sin embargo, CLas-DETECTR tiene algunas limitaciones. En primer lugar, las muestras de cítricos no se pueden utilizar directamente en el protocolo, y el ADNg de los cítricos debe extraerse. En segundo lugar, se requiere una incubadora simple para la RPA y la activación de la actividad nucleasa de Cas12a para obtener resultados consistentes. En tercer lugar, los resultados deben visualizarse a través de un dispositivo portátil de detección fluorescente. Aunque se podrían emplear tiras de flujo lateral para mostrar los resultados directamente, esto aumentaría
Las muestras de hojas se analizaron en este protocolo. En el futuro, CLas-DETECTR podría aplicarse para detectar la presencia de CLas en bígaros y muestras de psílidos. Además, al cambiar el ARNcr y los cebadores, esta tecnología de diagnóstico molecular también podría usarse para otras enfermedades de los cítricos, como el cancro de los cítricos, el virus de la descomposición de los cítricos y el virus de fragmentación de la hoja de los cítricos. Mientras trabajamos en CLas-DETECTR, este enfoque también ha sido utilizado para detectar CLas en paralelo por otros25.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado financieramente por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2021YFD1400805), el Programa Principal de Investigación y Desarrollo de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Jiangxi (20194ABC28007), Proyectos del Departamento de Educación de Jiangxi (GJJ201449) y la Innovación Colaborativa de Investigación Científica Agrícola Moderna en la Provincia de Jiangxi (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China |
| Hole puncher | Deli | 114 | China |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
| NaOH | SCR | 10019718 | China |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
References
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