Summary
Bu çalışmada, Candidatus Liberibacter asiaticus için CRISPR-Cas12a ile kombine rekombinaz polimeraz amplifikasyonuna dayanan hızlı, hassas ve taşınabilir bir tespit yöntemi geliştirilmiştir.
Abstract
Candidatus Liberibacter asiaticus'un (CLas) narenciye yetiştiricileri tarafından erken tespiti, erken müdahaleyi kolaylaştırır ve hastalığın yayılmasını önler. Hızlı ve taşınabilir Huanglongbing (HLB) tanısı için rekombinaz polimeraz amplifikasyonunu ve kümelenmiş düzenli aralıklarla aralıklı kısa palindromik tekrarlar / CRISPR ile ilişkili 12a (CRISPR-Cas12a) sisteminin nükleaz aktivitesini kullanan bir floresan muhabiri birleştiren basit bir yöntem sunulmaktadır. Bu tekniğin duyarlılığı PCR'den çok daha yüksektir. Ayrıca, bu yöntem yaprak örnekleri kullanıldığında qPCR'ye benzer sonuçlar göstermiştir. Geleneksel CLas algılama yöntemleriyle karşılaştırıldığında, burada sunulan algılama yöntemi 90 dakikada tamamlanabilir ve PCR makinelerinin kullanılmasını gerektirmeyen izotermal bir durumda çalışır. Ek olarak, sonuçlar sahadaki bir el tipi floresan algılama cihazı aracılığıyla görselleştirilebilir.
Introduction
Huanglongbing (HLB), dünya çapında en sorunlu narenciye hastalıklarından biridir1. HLB, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus ve Ca. L. americanus2 dahil olmak üzere floem kolonize edici ve titiz bakteriler Candidatus Liberibacter spp.'den kaynaklanır. Çin ve ABD'de HLB ile ilişkili en yaygın tür, Asya narenciye psyllidleri (Diaphorina citri) veya aşılama yoluyla bulaşan CLas'tır3. CLas tarafından enfekte edildikten sonra, narenciye ağaçları ölüm2'ye kadar büyüme düşüşü gösterir. CLas ile enfekte olmuş narenciye yapraklarının yaygın semptomları lekeli benek, yeşil adalar (küçük dairesel koyu yeşil noktalar), daha kalın ve kösele yapraklar üzerinde yükseltilmiş mantarlı damarlar ve düzgün olmayan sararma sürgünleridir2. Ek olarak, CLas ile enfekte olmuş meyveler küçük ve orantısız görünür2.
Hiçbir narenciye çeşidi HLB'ye dirençli olmadığından ve HLB için terapötik bir tedavi olmadığından, HLB'nin önlenmesi CLas pozitif narenciye ağaçlarının karantinaya alınmasını ve izolasyonunu gerektirir 2,3. Bu nedenle, CLas'ın yayılmasını önlemek ve ekonomik kayıpları en aza indirmek için erken teşhis izleme ve karantinaya almak için kritiköneme sahiptir 3. Ek olarak, enfeksiyonun erken evresinde bitkilerde CLas'ın düşük titresi nedeniyle hassas CLas tespiti gereklidir3. Çin'de, CLas tespiti genellikle belirli sertifikalı test merkezleri tarafından gerçekleştirilir. Bununla birlikte, algılama işlemi genellikle en az 1 hafta sürer ve tespit ücreti pahalıdır. Bu nedenle, HLB insidansını izlemeye yardımcı olmak için
HLB 4,5,6,7,8,9 tanısında çeşitli teknolojiler uygulanmıştır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve kantitatif PCR (qPCR), yüksek duyarlılıkları ve özgüllükleri nedeniyle CLas tespiti için en çok kullanılan araçlardır 4,5. Bununla birlikte, bu teknolojiler büyük ölçüde pahalı araçlara ve yüksek vasıflı personele dayanmaktadır. Ek olarak, döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) gibi çeşitli izotermal amplifikasyon yöntemleri, basitlikleri, hızları ve düşük maliyetleri nedeniyle geleneksel PCR yöntemlerine cazip alternatifler olarak geliştirilmiştir 8,9,10. Bununla birlikte, yanlış pozitif sonuçlara neden olabilecek spesifik olmayan amplifikasyon sinyalleri nedeniyle CLas'ı doğru bir şekilde tespit etmek için bunları uygulamak zordur.
RNA rehberliğinde CRISPR / Cas (düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar / CRISPR ile ilişkili kümelenmiş) endonükleaz bazlı nükleik asit tespiti, yüksek hassasiyeti, özgüllüğü ve güvenilirliği nedeniyle yeni nesil bir moleküler tanı teknolojisi olarak geliştirilmiştir11,12,13,14. Bu CRISPR / Cas teşhis teknolojileri, oligonükleotidlerin her iki ucunda bir floresan muhabir ve bir floresan söndürücü ile modifiye edilmiş tek sarmallı DNA'yı (ssDNA) parçalamak için Cas proteinlerinin kollateral nükleaz aktivitesine ve ayrıca serbest bırakılan floresan muhabirini yakalamak için bir floresan tespit cihazına dayanır11,12 . CRISPR RNA (crRNA) hedef dubleks tarafından aktive edilen birkaç Cas efektörünün nükleaz aktivitesi, çevredeki hedef olmayan ssDNA11'i ayrım gözetmeksizin parçalayabilir. Sınıf 2 tip V-A CRISPR/Cas sistemi olan CRISPR-Cas12a (Cpf 1 olarak da adlandırılır), Cas9 ile karşılaştırıldığında, daha düşük uyumsuzluk toleransı ve daha fazla özgüllük13 gibi çeşitli avantajlar gösterir. Cas12a/crRNA sistemi, insan patojenlerinin ve fitopatojenlerin nükleik asitlerinin hassas ve spesifik tespiti için uygulanmıştır 14,15,16,17,18. Bu nedenle, Cas12a / crRNA sisteminin kullanılması, CLas'ın nükleik asidinin doğru ve hassas bir şekilde algılanmasını sağlamalıdır.
Cas12a tek başına teorik olarak düşük nükleik asit seviyelerini tespit edecek kadar hassas değildir. Bu nedenle, algılama hassasiyetini artırmak için, CRISPR-Cas12a algılama tipik olarak bir izotermal amplifikasyon adımı14,15 ile birleştirilir. Rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA), 37 °C ila 42 °C19 sıcaklık aralığında hassas ve hızlı izotermal DNA amplifikasyonu sağlar.
Cas12a'nın DNaz aktivitesini RPA ve floresan okuması ile birleştiren DETECTR (DNA Endonükleaz Hedefli CRISPR Trans Reporter) adlı bir tespit platformu yakın zamanda12 geliştirilmiştir ve nükleik asidi daha yüksek hassasiyetle tespit ettiği gösterilmiştir20. Ayrıca, pozitif numunelerden yayılan floresan sinyali, sahadaki bir el tipi floresan algılama cihazı aracılığıyla gözlemlenebilir.
DNA'yı RPA ile güçlendirdiğimizden, CLas 21'e özgü beş kopyalı nrdB (ribonükleotid redüktaz β- alt birim) genini hedefleyen crRNA'yı tasarladığımızdan veCas12a proteininin DNaz aktivitesini kullandığımızdan, buna CLas tespit yöntemini CLas-DETECTR adını verdik. Mevcut CLas algılama yöntemleriyle karşılaştırıldığında, CLas-DETECTR hızlı, doğru, hassas ve konuşlandırılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. CLas-DETECTR'ın yapımı
NOT: CLas-DETECTR'ın yapımı dört adımlı bir işlemdir: çözelti hazırlama, narenciye toplam DNA izolasyonu, izotermal DNA amplifikasyonu ve sonuç görselleştirme. CLas-DETECTR testinin şeması Şekil 1A'da gösterilmiştir.
- Çözelti hazırlama
- Arabellek A'yı hazırlayın: %6 PEG 200'de 20 mM NaOH. 100 mL için, bir şişede 80 mL H2 O içine 113 mg NaOH ve 6 g PEG200ekleyin. Tüm PEG 200 çözülene kadar şişeyi 60 ° C'de bir su banyosunda inkübe edin. Ardından, 100 mL'lik bir hacme H2O ekleyin.
- B çözeltisini hazırlayın: Her reaksiyon için, 15,5 μL'lik son hacme 10 μL RPA tamponu, 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL R-RPA-RNRr ve 3,9 μL ddH2O ekleyin.
NOT: F-RPA-RNRf ve R-RPA-RNRr, nrdB genine karşı tahlilde kullanılan primerlerdir. Dizi için Tablo 1'e bakın. - C çözeltisini hazırlayın: Her reaksiyon için, 20 μL'lik son hacme 1 μL ssDNA raporlayıcı, 3 μL NEB tamponu 3.1, 1 μL crRNA, 4 μLCas12ave 11 μL ddH 2 O ekleyin.
NOT: Algılanacak çok sayıda örnek varsa, büyük miktarda B ve C çözeltisi yapın ve daha sonra aliquot yapın.
- Narenciye toplam DNA izolasyonu
NOT: Zamandan tasarruf etmek ve bu yöntemi alan CLas tespitine uygun hale getirmek için, DNA amplifikasyonu için ham bitki özleri elde etmek üzere alkali polietilen glikol (PEG) tabanlı yaklaşım kullanılmıştır22,23- Bu protokolde narenciye yaprakları kullanılmıştır. İlk olarak, bir yapraktan beş yaprak diski delin. Ardından, yaprak disklerini 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne koyun ve 200 μL tampon A ekleyin.
NOT: Tarlada, yaprakları kaplayan toz varsa önce yaprakları temizleyin. Yaprak diskler, çapraz kontaminasyonu önlemek için 1,5 mL tüpün kapağı kullanılarak kırpılabilir. Kökler, saplar, meyveler ve çiçekler gibi diğer narenciye dokuları da bu protokolde kullanılabilir. - Yaprak diskleri plastik bir çubukla pürüzsüz olana kadar manuel olarak öğütün.
- Tüpü 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Ardından, DNA amplifikasyonu için süpernatantı kullanın.
NOT: Tahlil burada duraklatılabilir ve alkali-PEG yöntemiyle ekstrakte edilen ham bitki ekstraktları en az 1 yıl boyunca -20 ° C'de saklanabilir. Videoda gösterilen Newhall tatlı portakal (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) ağaçları, 9/3/1 (v / v / v) turba toprağı / vermikülit / perlit karışımı ile doldurulmuş bir tencerede yetiştirildi ve Gannan Normal Üniversitesi, Jiangxi, Çin kampüsünde bulunan bir serada muhafaza edildi. HLB ile enfekte olmuş ağaçlar, CLas pozitif Newhall tomurcukları ile aşılama ile aşılandı. HLB-enfekte ve HLB-enfekte olmamış ağaçlar PCR ile doğrulandı. CLas, CLas'a özgü belirteç geni nrdB'yi hedefleyen primer çifti (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) kullanılarak tespit edildi. Öte yandan, karakteristik HLB semptomları, lekeli benek ve sararmış yapraklar CLas pozitif ağaçlarda bulunabilir, ancak CLas negatif ağaçlarda bulunamaz.
- Bu protokolde narenciye yaprakları kullanılmıştır. İlk olarak, bir yapraktan beş yaprak diski delin. Ardından, yaprak disklerini 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne koyun ve 200 μL tampon A ekleyin.
- İzotermal DNA amplifikasyonu
- Adım 1.2.3'ten 1 μL süpernatantın 1 μL'sini ve 1 μL MgOAc'yi (14 mM nihai konsantrasyon) B çözeltisine ekleyin ve iyice karıştırın.
- Laboratuvarda, 15 dakika boyunca 37 ° C'de basit bir inkübatörde inkübe edin.
NOT: Sahada, tüpleri 15 dakika boyunca elinizde tutun. Ayrıca, koşullar izin veriyorsa, tüplerin 37 ° C'de basit bir inkübatörde 15 dakika boyunca inkübe edilmesi önerilir.
- Sonuç görselleştirme
- Karışımın 1.3.2 adımından C çözeltisine 10 μL ekleyin ve iyice karıştırın.
- Onları 60 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin.
- Gözlük takın ve 5' 6-Floresein ile etiketlenmiş ssDNA muhabirinden 5' ve floresan söndürücü 3' ile etiketlenmiş yeşil floresan sinyalini bir el tipi floresan algılama cihazı aracılığıyla gözlemleyin (uyarma dalga boyu: 440 nm, emisyon dalga boyu: 500 nm).
NOT: yeşil floresan sinyali birkaç gün sürebilir, daha iyidir
DİKKAT: Floresan algılama cihazı tarafından yayılan ışık gözlere zararlıdır. Sonuçları gözlemlemeden önce gözlük taktığınızdan emin olun.
2. Özgüllük testi
NOT: CLas-DETECTR'ın özgüllüğünü test etmek için, lizosfer bakterisi Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) ve laboratuvar 24'te izole edilen Burkholderia stabilis suşu 1440 CLas-DETECTR testine tabi tutulmuştur.
NOT: Candidatus Liberibacter (CLas) kültürlenemez. CLas DNA'sı sadece CLas ile enfekte olmuş narenciye dokularından genomik DNA'nın ekstraksiyonundan elde edilebilir. Xcc , bir başka önemli narenciye hastalığı olan narenciye konservesinin nedensel ajanıdır. Burkholderia stabilis suşu 1440, laboratuvarda izole edilmiş bir anti-Xcc bakterisidir. Bu nedenle, bu üç bakteri için saf suşlar kullanılmıştır.
- Üreticinin protokolünü izleyerek bakteriyel genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanarak bakteriyel genomik DNA'yı (gDNA) çıkarın. Suyu negatif kontrol olarak kullanın.
- 1 μL F-RPA-RNRf, 1 μL R-RPA-RNRr, 12,5 μL Ex Taq Sürüm 2.0 artı boya, 1 μL DNA şablonu ve 9,5 μL H2 O içeren 25 μL reaksiyon karışımında optik kapaklı0,2mL PCR tüp şeritleri kullanarak PCR gerçekleştirin.
- Aşağıdaki termal döngü reaksiyon koşullarını kullanın: 98 °C'de 1 dakika; bunu 98 °C'de 10 sn, 55 °C'de 30 sn, 72 °C'de 15 sn'lik 35 döngü izledi; daha sonra 72 ° C'de 10 dakika; ve 16 ° C'de tutun.
- PCR ürünlerini 15 dakika boyunca 120 V'ta %1 agaroz jel üzerinde çalıştırın.
- 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL R-RPA-RNRr, 10 μL 2x TB Yeşil Premiks Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), DNA şablonunun 1 μL ve 7,4 μLH2 O içeren 20μL reaksiyon karışımında qPCR gerçekleştirin.
- Aşağıdaki termal döngü reaksiyon koşullarını kullanın: 95 °C'de 30 sn; bunu 95 °C'de 5 sn ve 60 °C'de 32 s'lik 45 döngü izledi; ve daha sonra 95 ° C'de 15 s, 60 ° C'de 1 dakika ve 95 ° C'de 15 s'lik bir erime eğrisi aşaması.
- Her tekrara üç teknik tekrar ekleyin.
- 1.1–1.4 arasındaki adımları izleyerek CLas-DETECTR yöntemini gerçekleştirin.
3. Hassasiyet karşılaştırması
- CLas DETECTR'ın duyarlılığını test etmek için, yukarıda açıklandığı gibi PCR, CLas-DETECTR ve qPCR kullanarak bir dizi CLas DNA parçası seyreltmesini tespit edin.
- 4 μL F-RNR, 4 μL R-RNR, 50 μL PrimeSTAR Max Premiks, 2 μL DNA şablonu ve 40 μLH2O içeren 100 μL reaksiyon karışımında F-RNR ve R-RNR primer setini kullanarak nrdB'den 1.060 bp uzunluğunda bir DNA segmentini yükseltin (98 ° C'de 30 s; ardından 98 ° C'de 35 s'lik 10 sn döngü, ardından 98 ° C'de 35 döngü, 55 °C'de 15 sn, 72 °C'de 30 sn; daha sonra 72 ° C'de 10 dakika; ve 16 ° C'de tutun).
NOT: nrdB (ribonükleotid redüktaz β- alt birim) geni CLas21'e özgüdür. NrdB amplikonu, F-RNR ve R-RNR primer setini kullanarak CLas-pozitif narenciye gDNA'sından kolayca elde edilebilir. Astar seti F-RNR ve R-RNR, 1.060 bp nrdB fragmanını yükseltirken, primer set F-RPA-RNR ve R-RPA-RNR, 1.060 bp nrdB fragmanının bir parçası olan nrdB geninin 104 bp'lik bir parçasını güçlendirir. - PCR ürünlerini, üreticinin kılavuzunu izleyerek bir DNA jel ekstraksiyon kiti ile saflaştırın.
- NrdB amplikonlarını içeren PCR ürünlerini sterilize ddH2O ile seyreltin.
- Ticari olarak temin edilebilen çevrimiçi DNA kopya numarasını ve seyreltme hesaplayıcısını kullanarak nrdB geninin kopya numarasını hesaplayın.
- 2.01 × 106 kopya/μL, 2.01 × 105 kopya/μL, 2.01 × 104 kopya/μL, 2.01 × 103 kopya/μL, 2.01 × 10 2 kopya/μL,2.01 × 101 kopya/μL, 2.01 × 100 kopya/μL ve 2.01 × 10−1 kopya/μL CLas DNA fragmanı içeren DNA seyreltmeleri hazırlayın.
4. Örnek algılama
NOT: Özgüllük ve duyarlılık testinden sonra, CLas-DETECTR yöntemi, Gannan Normal Üniversitesi, Jiangxi, Çin kampüsündeki germplazma kaynak fidanlığında yetiştirilen Newhall tatlı portakal ağaçlarından toplanan tarla yaprağı örneklerinde CLas'ın varlığını tespit etmek için kullanılmıştır. Sonuçları doğrulamak için bir qPCR gerçekleştirildi.
- Toplam 15 ağacı test edin. Suyu negatif kontrol olarak kullanın.
- CLas-DETECTR ve qPCR yöntemlerini yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
NOT: CLas'ın narenciyedeki eşit olmayan dağılım özellikleri nedeniyle, HLB semptomları gösteren yapraklar öncelikli olarak toplanmıştır. Bir ağaç sağlıklı görünüyorsa, yapraklar rastgele toplandıCLas-DETECTR sistemi doğru çalışıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, sahada HLB'yi teşhis etmek için RPA ve CRISPR-Cas12a sistemlerini tarayan taşınabilir bir platform olan CLas-DETECTR'ı tanımladık. CLas-DETECTR şeması Şekil 1A'da gösterilmiştir.
CLas-enfekte olmuş ve HLB-enfekte olmamış Newhall ağaçlarından (Şekil 1B), CLas-DETECTR testine tabi tutulduğunda, HLB-enfekte olmuş numunede yeşil bir floresan sinyali görüldü, ancak HLB-enfekte olmamış numunede ve negatif kontrolde görülmedi (Şekil 1D).
CLas-DETECTR'ın özgüllüğünü, diğer bakterilerden ekstrakte edilen nükleik asitleri kullanarak belirledik. CLas-DETECTR testinde kullanılan F-RPA-RNRf ve R-RPA-RNRr primer seti PCR ve qPCR'de de kullanılmıştır. CLas-pozitif narenciye yaprağı gDNA'sı kullanılarak çoğaltıldığında agaroz jel elektroforezinde bir bant görülebilir, ancak PCR testlerinde diğer bakteriyel gDNA'lar görülemez (Şekil 2A). qPCR tahlillerinde, CLas'ın ortalama eşik döngüsü (Ct) değeri 24 ± 0.7 iken, A. tumefaciens GV3101, Xcc ve B. stabilis suşu 1440'ın ortalama Ct değerleri sırasıyla 38 ± 0.7, 39 ± 1.4 ve 39 ± 0.7 idi (Şekil 2B). Genellikle, Ct değeri 38'den yüksek olduğunda sonuç negatif olarak kabul edilir. Bu sonuçlar, F-RPA-RNRf ve R-RPA-RNRr primer çiftinin CLas'a özgü olduğunu göstermektedir. CLas-DETECTR testinde, sadece CLas gDNA yeşil floresan sinyalleri gösterdi; A. tumefaciens GV3101, Xcc ve B. stabilis suşu 1440'tan ekstrakte edilen gDNA (Şekil 2C), yani CLas-DETECTR CLas'ı spesifik olarak tespit edebilir.
Ayrıca bir dizi CLas DNA seyreltmesi kullanarak CLas-DETECTR'ın duyarlılığını test ettik. PCR 2.01 × 102 kopya/μL saptayabilir (Şekil 3A). Öte yandan, CLas-DETECTR 2.01 × 100 kopya / μL'yi tespit edebilir, bu da bunun hassas bir alan teşhisi olarak uygulanabilir olduğunu düşündürmektedir (Şekil 3B). qPCR 2.01 × 10−1 kopya/μL tespit edebildi, ancak Ct değeri 36'dan yüksekti (Şekil 3C). Bu nedenle, CLas-DETECTR, seyreltilmiş amplikonlar kullanıldığında geleneksel PCR'den iki büyüklük sırası daha hassastır ve qPCR'den daha az hassas bir büyüklük sırasıdır (Şekil 3).
Son olarak, CLas-DETECTR'ın saha örnekleri için fizibilitesini inceledik ve duyarlılığını, yerleşik, hassas bir nükleik asit algılama yaklaşımı olan qPCR ile karşılaştırdık21. Genellikle, qPCR ile CLas tespitinin Ct değerinin 36'dan yüksek olması, CLas konsantrasyonunun 2.01'den az olduğu × 10−1 kopya / μL'den az olduğu anlamına gelir ve bu da çok düşük bir konsantrasyondur (Şekil 3C). 15 örneklem arasında, qPCR ile tespit edilen 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 ve 14 numaralı örneklerin Ct değeri 36'dan azdı ve görünür yeşil floresan sinyalleri gözlendi (Şekil 4). Öte yandan, qPCR ile saptanan 6, 7, 9, 12 ve 15 numaralı örneklerin Ct değerleri belirlenmediğinde, yeşil floresan sinyalleri gözlenmemiştir (Şekil 4). Ayrıca, qPCR ile saptanan örnek 5 ve örnek 11'in Ct değerleri 36'dan yüksek olduğunda zayıf yeşil floresan sinyalleri gözlenmiştir (Şekil 4). Sonuçlar, platformumuzun sahada HLB teşhisi için hızlı, sağlam ve hassas bir araç olduğunu göstermektedir.
| Hayır | Ad | Sıra (5' - 3') | ||||||||||||
| 1 | crRNA1-nrdB | rUrArArUrUrUrCrUrArCrUrArGrUrUrArGrUrArGrCrArGrUrCrArGrGrArGrArR | ||||||||||||
| 2 | ssDNA-FQ | SSS-TTTATTT-BHQ1 | ||||||||||||
| 3 | F-RPA-RNRf | AAAAGTCGCACCATGCTCCATGAAGCTACC | ||||||||||||
| 4 | R-RPA-RNRr | TGTTCACATGAGGGAGCATTTAACCCCACGAA | ||||||||||||
| 5 | F-RNR | ATGGCAAATAACACAGGATTAAGCCC | ||||||||||||
| 6 | R-RNR | TTAATCCCATTTCAACCCTGCTCC | ||||||||||||
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan nükleik asit. ssDNA-FQ, 5'te 5' 6-FAM (Floresein) ve 3'te floresan söndürücü Kara Delik Quencher 1 (BHQ1) ile etiketlenmiş tek sarmallı DNA'dır. Kısaltmalar: F = floresan reporter; Q = floresan söndürücü.
Şekil 1: CLas-DETECTR'ın tasarımı ve doğrulanması. (A) CLas-DETECTR testinin şeması. 1. Adım: Hızlı gDNA ekstraksiyonu için% 6 PEG 200'de 20 mM NaOH içeren tampon A hazırlayın; izotermal DNA amplifikasyonu için her reaksiyonda 10 μL RPA tamponu, 0.8 μL F-RPA-RNRf, 0.8 μL F-RPA-RNRr ve 3.9 μL ddH2O içeren B çözeltisi; floresan muhabir salınımı için her reaksiyonda 1 μL ssDNA raporlayıcı, 3 μL NEB tamponu 3.1, nrdB'yi hedefleyen 1 μL crRNA, 4 μL Cas12a ve 11 μL ddH2O içeren C çözeltisi. Adım 2: 200 μL tampon A ile narenciye toplam DNA'sını çıkarmak için yapraklardan delinmiş beş yaprak diski kullanıldı. Adım 3: CLas'a özgü nükleik asitler, 15 dakika boyunca 37 ° C'de 37 ° C'de 1 μL süpernatant ve 1 μL MgOAc ile B çözeltisindeki CLas'a özgü belirteç geni nrdB'yi hedefleyen F-RPA-RNRf ve R-RPA-RNRr primerleri kullanılarak güçlendirildi. Adım 4: Adım 3'teki karışımın 10 μL'si ile C çözeltisi, 60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edildi ve yeşil floresan sinyali, elde taşınan bir floresan algılama cihazı aracılığıyla gözlemlendi. ssDNA-FQ, 5'te 5' 6-FAM (Floresein) ve 3'te bir floresan söndürücü Kara Delik Quencher 1 (BHQ1) ile etiketlendi. Kısaltmalar: F = floresan reporter; Q = floresan söndürücü. (B) HLB ile enfekte olmuş ağaç (solda) lekeli benekli ve sarı yapraklar gösterir, ancak HLB-enfekte olmamış ağaç (sağda) yeşil görünür. (C) CLas'ın varlığı F-RPA-RNRf ve R-RPA-RNRr primer çifti kullanılarak doğrulanmıştır. (D) HLB ile enfekte olmuş numune yeşil floresan sinyalleri gösterirken, HLB-enfekte olmamış veH2O CLas-DETECTR testinde yoktur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: CLas-DETECTR'ın özgüllüğünü test etme. (A) PCR sonuçlarının agaroz jel elektroforezi, (B) qPCR sonuçlarının Ct değeri ve (C) CLas-DETECTR sonuçları, CLas-pozitif Newhall yapraklarından ve diğer üç bakteriden ekstrakte edilen gDNA kullanılarak F-RPA-RNRf ve R-RPA-RNRr primer çifti ile güçlendirilmiştir. Yine, H2O negatif bir kontrol görevi gördü. M: DNA merdiveni; CLas-pozitif Newhall yapraklarından ekstrakte edilen gDNA (1), Agrobacterium tumefaciens GV3101 (2), Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc, 3) ve Burkholderia stabilis suşu 1440 laboratuvarımızda izole edilmiştir (4). Ct değeri, standart hata ± üç teknik tekrarın ortalama Ct değerini temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: CLas-DETECTR'ın PCR ve qPCR ile duyarlılık karşılaştırması. (A) PCR, (B) CLas-DETECTR ve (C) qPCR kullanılarak bir dizi spesifik CLas DNA amplikon seyreltmesinin tespit analizi. (A) PCR ürünlerinin 25 μL'sinden 5 μL, jele yüklendi. (B) Resimler, elde taşınan bir floresan algılama cihazı (uyarma dalga boyu: 440 nm, emisyon dalga boyu: 500 nm) tarafından yayılan ışığın altında koruyucu gözlükler aracılığıyla bir akıllı telefon kamerasıyla yakalanmıştır. Tüm tahlillerde aynı primerler kullanılmıştır. CLas'a özgü nrdB genini hedefleyen primer set F-RNR ve R-RNR ile güçlendirilmiş 1.060 bp uzunluğundaki saflaştırılmış PCR ürünleri, H2O kullanılarak 2.01 × 106 kopya / μL (1), 2.01 × 105 kopya / μL (2), 2.01 × 104 kopya / μL (3), 2.01 × 103 kopya / μL (4), 2.01 × 102 kopya / μL (5), 2.01 × 101 kopya / μL (6) konsantrasyonlarında seyreltildi. 2,01 × 100 kopya/μL (7) ve 2,01 × 10−1 kopya/μL (8). H2O negatif bir kontrol görevi gördü. M: DNA merdiveni. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Saha örnekleri kullanılarak CLas tespiti. Newhall tatlı portakal ağaçlarından toplanan 15 yaprak örneğindeki CLas, yukarıda açıklanan CLas-DETECTR ve qPCR testleri ile test edilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, RPA ve CRISPR-Cas12a sistemlerini birleştiren CLas-DETECTR adlı CLas'ı tespit etmek için hızlı ve taşınabilir bir yöntem sunmaktadır. İş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. CLas-DETECTR, CLas'ı özgüllük ve hassasiyetle algılar (Şekil 2 ve Şekil 3). Ayrıca, Newhall yaprak örneklerini kullanan CLas-DETECTR, CLas'ı qPCR ile aynı hassasiyetle algılar (Şekil 4). Özellikle, algılama sonuçları, gerçek zamanlı HLB teşhisi için kritik olan laboratuvar tabanlı cihazlardan bağımsız olarak elde taşınabilir bir cihaz aracılığıyla doğrudan görselleştirilebilir.
Protokolde dikkat edilmesi gereken birkaç önemli husus vardır. İlk olarak, CLas-DETECTR qPCR kadar hassas olduğu için numune alma işleminde çapraz kontaminasyondan kesinlikle kaçınılmalıdır. Reaksiyon reaktifleri yoğun güneş ışığına maruz bırakılmamalıdır. Optimum sonuçlar elde etmek için tüm adımlar tam olarak takip edilmelidir. CLas-DETECTR sisteminin sahada doğru çalışmasını sağlamak için CLas'a özgü gen fragmanları içeren bir plazmid olan pozitif bir kontrol dahil edilmelidir. Son olarak, CLas ile ilgili tüm deneysel atıklar biyolojik tehlike olarak ele alınmalı ve bertaraf edilmeden önce otoklavlanmalıdır.
Pozitif kontrol için floresan sinyalleri tespit edilmezse, reaksiyon karışımında inhibitörler bulunabilir ve reaktiflerin değiştirilmesi gerekir. Aksi takdirde, floresan ayırt edilemeyecek kadar zayıfsa, kuluçka süresi uzatılabilir ve kuluçka süresi yanlış pozitiflere yol açabilir.
Mevcut CLas algılama yöntemleri pahalı PCR makineleri, sabit çalışma sahaları ve eğitimli personel gerektirir. Bununla birlikte, burada sunulan yöntem, HLB'nin narenciye yetiştiricileri de dahil olmak üzere çok çeşitli insanlar tarafından sahada doğru ve hassas bir şekilde teşhis edilmesini sağlar.
Ancak, CLas-DETECTR'ın bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, narenciye örnekleri doğrudan protokolde kullanılamaz ve narenciye gDNA'sının çıkarılması gerekir. İkincisi, RPA için basit bir inkübatör ve tutarlı sonuçlar için Cas12a'nın nükleaz aktivitesinin aktivasyonu gereklidir. Üçüncüsü, sonuçların elde taşınan bir floresan algılama cihazı aracılığıyla görselleştirilmesi gerekir. Sonuçları doğrudan göstermek için yanal akış şeritleri kullanılabilse de, bu artacaktır.
Yaprak örnekleri bu protokolde test edilmiştir. Gelecekte, CLas-DETECTR, periwinkles ve psyllid örneklerinde CLas varlığını tespit etmek için uygulanabilir. Ek olarak, crRNA ve primerleri değiştirerek, bu moleküler tanı teknolojisi, narenciye konservesi, narenciye çürüme virüsü ve narenciye yaprağı parçalanma virüsü gibi diğer narenciye hastalıkları için de kullanılabilir. CLas-DETECTR üzerinde çalışırken, bu yaklaşım CLas'ı diğerleri25 tarafından paralel olarak tespit etmek için de kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2021YFD1400805), Jiangxi Eyaleti Büyük Bilim ve Teknoloji Ar-Ge Programı (20194ABC28007), Jiangxi Eğitim Departmanı Projeleri (GJJ201449) ve Jiangxi Eyaletindeki Modern Tarımsal Bilimsel Araştırmaların İşbirlikçi İnovasyonu (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003) tarafından finansal olarak desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China |
| Hole puncher | Deli | 114 | China |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
| NaOH | SCR | 10019718 | China |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
References
- Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Wang, N., et al. The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control. Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).
- Kim, J. S., Wang, N. Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR. BMC Research Notes. 2, 37 (2009).
- Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. Multiplex detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus" and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR. PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).
- Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China. Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).
- Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens. Scientific Reports. 6, 29272 (2016).
- Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing. The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).
- Ghosh, D. K., et al. Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus". PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).
- Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids. Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).
- Chertow, D. S. Next-generation diagnostics with CRISPR. Science. 360 (6387), 381-382 (2018).
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
- Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).
- Qian, W., et al. Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics. Virus Research. 305, 198568 (2021).
- Marques, M. C., et al. Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13. ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).
- Lu, X., et al. A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay. Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).
- Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).
- Liang, M., et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).
- Zheng, Z., et al. Unusual five copies and dual forms of nrdB in "Candidatus Liberibacter asiaticus": Biological implications and PCR detection application. Scientific Reports. 6, 39020 (2016).
- Chomczynski, P., Rymaszewski, M. Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood. BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).
- Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).
- Long, Y., et al. A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri. Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).
- Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods. Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).
