Feltimplementerbar Candidatus Liberibacter asiaticus detektion ved hjælp af rekombinasepolymeraseforstærkning kombineret med CRISPR-Cas12a
Summary
I dette arbejde blev der udviklet en hurtig, følsom og bærbar detektionsmetode til Candidatus Liberibacter asiaticus baseret på rekombinasepolymeraseforstærkning kombineret med CRISPR-Cas12a.
Abstract
Citrusavlernes tidlige påvisning af Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) letter tidlig indgriben og forhindrer spredning af sygdomme. En simpel metode til hurtig og bærbar Huanglongbing (HLB) diagnose præsenteres her, der kombinerer rekombinasepolymeraseforstærkning og en fluorescerende reporter ved hjælp af nukleaseaktiviteten af det grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser / CRISPR-associerede 12a (CRISPR-Cas12a) system. Følsomheden af denne teknik er meget højere end PCR. Desuden viste denne metode lignende resultater som qPCR, når bladprøver blev brugt. Sammenlignet med konventionelle CLas-detektionsmetoder kan detektionsmetoden, der præsenteres her, afsluttes på 90 minutter og fungerer i en isotermisk tilstand, der ikke kræver brug af PCR-maskiner. Derudover kan resultaterne visualiseres gennem en håndholdt fluorescerende detektionsanordning i marken.
Introduction
Huanglongbing (HLB) er en af de mest problematiske citrussygdomme på verdensplan1. HLB er forårsaget af de phloem-koloniserende og kræsne bakterier Candidatus Liberibacter spp., herunder Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus og Ca. L. americanus 2. Den mest udbredte HLB-associerede art i Kina og USA er CLas, som overføres af asiatiske citruspsyllider (Diaphorina citri) eller gennem podning3. Efter at være blevet inficeret af CLas viser citrustræer vækstfald indtil døden2. De almindelige symptomer på citrusblade inficeret med CLas er plettet mottle, grønne øer (små cirkulære mørkegrønne prikker), hævede korkede vener på tykkere og læderagtige blade og ikke-ensartede gulningsskud2. Derudover forekommer frugter inficeret med CLas små og skæve2.
Da ingen citrussort er resistent over for HLB, og der ikke findes nogen terapeutisk kur mod HLB, kræver forebyggelse af HLB karantæne og isolering af CLas-positive citrustræer 2,3. Derfor er tidlig påvisning afgørende for overvågning og karantæne for at forhindre spredning af CLas og minimere økonomiske tab3. Derudover er følsom CLas-detektion nødvendig på grund af den lave titer af CLas i planter i det tidlige stadium af infektion3. I Kina udføres CLas-detektion normalt af visse certificerede testcentre. Detektionsprocessen tager dog normalt mindst 1 uge, og detektionsgebyret er dyrt. Derfor for at hjælpe med at overvåge HLB-forekomsten
Forskellige teknologier er blevet anvendt til at diagnosticere HLB 4,5,6,7,8,9. Polymerasekædereaktion (PCR) og kvantitativ PCR (qPCR) er de mest anvendte værktøjer til CLas-detektion på grund af deres høje følsomhed og specificitet 4,5. Disse teknologier er imidlertid stærkt afhængige af dyre instrumenter og højt kvalificeret personale. Derudover er flere isotermiske forstærkningsmetoder, såsom loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP), blevet udviklet som attraktive alternativer til konventionelle PCR-metoder på grund af deres enkelhed, hurtighed og lave omkostninger 8,9,10. Det er dog udfordrende at anvende dem til nøjagtigt at detektere CLas på grund af de ikke-specifikke forstærkningssignaler, hvilket kan forårsage falske positive resultater.
RNA-guidet CRISPR / Cas (grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser / CRISPR-associerede) endonukleasebaseret nukleinsyredetektion er udviklet som en næste generations molekylær diagnostikteknologi på grund af dens høje følsomhed, specificitet og pålidelighed11,12,13,14. Disse CRISPR/Cas-diagnosticeringsteknologier er afhængige af cas-proteiners sikkerhedsnukleaseaktivitet til at spalte enkeltstrenget DNA (ssDNA) modificeret med en fluorescerende reporter og en fluorescensquencher i hver ende af oligonukleotiderne samt en fluorescensdetekteringsanordning til at fange den frigivne fluorescerende reporter11,12 . Nukleaseaktiviteten af flere Cas-effektorer aktiveret af CRISPR RNA (crRNA) target duplex kan vilkårligt spalte det omgivende ikke-mål ssDNA11. CRISPR-Cas12a (også kaldet Cpf 1), et klasse 2 type V-A CRISPR/CAS-system, viser flere fordele sammenlignet med Cas9, såsom en lavere mismatchtolerance og større specificitet13. Cas12a /crRNA-systemet er blevet anvendt til følsom og specifik påvisning af nukleinsyrer af humane patogener og phytopathogener 14,15,16,17,18. Derfor bør anvendelse af Cas12a / crRNA-systemet muliggøre nøjagtig og følsom påvisning af nukleinsyren af CLas.
Cas12a alene er ikke teoretisk følsom nok til at detektere lave niveauer af nukleinsyrer. For at forbedre detektionsfølsomheden kombineres CRISPR-Cas12a-detektion derfor typisk med et isotermisk forstærkningstrin14,15. Rekombinasepolymeraseamplifikation (RPA) muliggør følsom og hurtig isotermisk DNA-amplifikation i et temperaturområde fra 37 °C til 42 °C19.
En detektionsplatform kaldet DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter), der kombinerer DNase-aktiviteten af Cas12a med RPA og en fluorescensaflæsning, er for nylig blevet udtænkt12 og har vist sig at detektere nukleinsyre med højere følsomhed20. Desuden kan fluorescenssignalet, der udsendes fra de positive prøver, observeres gennem en håndholdt fluorescensdetektionsanordning i marken.
Da vi amplificerede DNA med RPA, designede crRNA rettet mod det fem-kopierede nrdB (ribonukleotidreduktase β– underenhed) gen, der er specifikt for CLas21, og anvendte DNase-aktiviteten af Cas12a-proteinet, kaldte vi denne CLas-detektionsmetode CLas-DETECTR. Sammenlignet med eksisterende CLas-detektionsmetoder er CLas-DETECTR hurtig, præcis, følsom og kan implementeres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne undersøgelse præsenterer en hurtig og bærbar metode til at detektere CLas ved navn CLas-DETECTR, som kombinerer RPA- og CRISPR-Cas12a-systemerne. Arbejdsgangen er illustreret i figur 1. CLas-DETECTR registrerer CLas med specificitet og følsomhed (figur 2 og figur 3). Ved hjælp af Newhall-bladprøver registrerer CLas-DETECTR desuden CLas med samme følsomhed som qPCR (figur 4)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet økonomisk af Kinas nationale centrale F & U-program (2021YFD1400805), det store F & U-program for videnskab og teknologi i Jiangxi-provinsen (20194ABC28007), projekter fra Jiangxi Education Department (GJJ201449) og samarbejdsinnovation inden for moderne landbrugsvidenskabelig forskning i Jiangxi-provinsen (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).
Materials
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China | |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China | |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China | |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China | |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China | |
| Hole puncher | Deli | 114 | China | |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK | |
| NaOH | SCR | 10019718 | China | |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA | |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China | |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA | |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China | |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA | |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China | |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
References
- Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Wang, N., et al. The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control. Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).
- Kim, J. S., Wang, N. Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR. BMC Research Notes. 2, 37 (2009).
- Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. Multiplex detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus" and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR. PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).
- Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. Nested-PCR detection and sequence confirmation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ from Murraya paniculata in Guandong, China. Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).
- Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. Serological detection of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens. Scientific Reports. 6, 29272 (2016).
- Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing. The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).
- Ghosh, D. K., et al. Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus". PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).
- Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of ‘Candidatus Liberibacter solanacearum’ in potatoes and psyllids. Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).
- Chertow, D. S. Next-generation diagnostics with CRISPR. Science. 360 (6387), 381-382 (2018).
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
- Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).
- Qian, W., et al. Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics. Virus Research. 305, 198568 (2021).
- Marques, M. C., et al. Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13. ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).
- Lu, X., et al. A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay. Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).
- Lobato, I. M., O’Sullivan, C. K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).
- Liang, M., et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).
- Zheng, Z., et al. Unusual five copies and dual forms of nrdB in "Candidatus Liberibacter asiaticus": Biological implications and PCR detection application. Scientific Reports. 6, 39020 (2016).
- Chomczynski, P., Rymaszewski, M. Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood. BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).
- Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).
- Long, Y., et al. A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri. Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).
- Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen (‘Candidatus Liberibacter asiaticus’) using Cas12a-based methods. Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).
