Summary
В этой работе был разработан быстрый, чувствительный и портативный метод обнаружения Candidatus Liberibacter asiaticus на основе амплификации полимеразы рекомбиназы в сочетании с CRISPR-Cas12a.
Abstract
Раннее выявление Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) производителями цитрусовых облегчает раннее вмешательство и предотвращает распространение заболевания. Здесь представлен простой метод быстрой и портативной диагностики Huanglongbing (HLB), который сочетает в себе амплификацию полимеразы рекомбиназы и флуоресцентный репортер, использующий нуклеазную активность кластеризованной регулярно интерраспространенной короткой палиндромной системы / CRISPR-ассоциированных 12a (CRISPR-Cas12a). Чувствительность этой методики намного выше, чем ПЦР. Кроме того, этот метод показал результаты, аналогичные qPCR, когда использовались образцы листьев. По сравнению с обычными методами обнаружения CLas, метод обнаружения, представленный здесь, может быть завершен за 90 мин и работает в изотермическом состоянии, не требующем использования аппаратов ПЦР. Кроме того, результаты могут быть визуализированы с помощью портативного флуоресцентного устройства обнаружения в полевых условиях.
Introduction
Хуанлунбин (HLB) является одним из самых проблемных цитрусовых заболеваний во всем мире1. HLB вызывается флоэмно-колонизирующими и привередливыми бактериями Candidatus Liberibacter spp., включая Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus и Ca. L. americanus2. Наиболее распространенным HLB-ассоциированным видом в Китае и США является CLas, который передается азиатскими цитрусовыми псиллидами (Diaphorina citri) или через прививку3. После заражения CLas цитрусовые деревья демонстрируют снижение роста до смерти2. Общими симптомами листьев цитрусовых, инфицированных CLas, являются пятнистая пятнистость, зеленые островки (маленькие круглые темно-зеленые точки), приподнятые пробковые прожилки на более толстых и кожистых листьях и неоднородные желтеющие побеги2. Кроме того, плоды, зараженные КЛА, кажутся мелкими и однобокими2.
Поскольку ни один сорт цитрусовых не устойчив к HLB и нет терапевтического лечения HLB, профилактика HLB требует карантина и изоляции CLas-положительных цитрусовых деревьев 2,3. Поэтому раннее выявление имеет решающее значение для мониторинга и карантина, чтобы предотвратить распространение CLas и минимизировать экономические потери3. Кроме того, необходимо обнаружение чувствительных CLas из-за низкого титра CLas у растений на ранней стадии инфекции3. В Китае обнаружение CLas обычно проводится определенными сертифицированными испытательными центрами. Тем не менее, процесс обнаружения обычно занимает не менее 1 недели, а плата за обнаружение стоит дорого. Таким образом, чтобы помочь контролировать заболеваемость HLB
Для диагностики HLB 4,5,6,7,8,9 были применены различные технологии. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и количественная ПЦР (qPCR) являются наиболее используемыми инструментами для обнаружения CLas из-за их высокой чувствительности и специфичности 4,5. Однако эти технологии в значительной степени зависят от дорогостоящих инструментов и высококвалифицированного персонала. Кроме того, несколько методов изотермической амплификации, таких как петлевая изотермическая амплификация (LAMP), были разработаны в качестве привлекательных альтернатив традиционным методам ПЦР из-за их простоты, быстроты и низкой стоимости 8,9,10. Тем не менее, трудно применить их для точного обнаружения CA из-за неспецифических сигналов усиления, которые могут привести к ложноположительным результатам.
РНК-управляемый CRISPR/Cas (кластеризованный регулярно чередующийся короткие палиндромные повторы/CRISPR-ассоциированный) обнаружение нуклеиновых кислот на основе эндонуклеазы было разработано как технология молекулярной диагностики следующего поколения благодаря своей высокой чувствительности, специфичности и надежности 11,12,13,14. Эти технологии диагностики CRISPR/Cas основаны на коллатеральной нуклеазной активности белков Cas для расщепления одноцепочечной ДНК (ssDNA), модифицированной флуоресцентным репортером и флуоресцентным гасителем на каждом конце олигонуклеотидов, а также на устройстве обнаружения флуоресценции для захвата выпущенного флуоресцентного репортера11,12 . Нуклеазная активность нескольких эффекторов Cas, активированных дуплексом-мишенью CRISPR РНК (crRNA), может без разбора расщеплять окружающую нецелевую ssDNA11. CRISPR-Cas12a (также называемая Cpf 1), система V-A CRISPR/Cas типа класса 2, демонстрирует несколько преимуществ по сравнению с Cas9, таких как более низкий допуск на несоответствие и большая специфичность13. Система Cas12a/crRNA была применена для чувствительного и специфического обнаружения нуклеиновых кислот патогенов человека и фитопатогенов 14,15,16,17,18. Поэтому использование системы Cas12a/crRNA должно обеспечить точное и чувствительное обнаружение нуклеиновой кислоты CLas.
Cas12a сам по себе недостаточно теоретически чувствителен для обнаружения низких уровней нуклеиновых кислот. Поэтому, чтобы улучшить чувствительность обнаружения, обнаружение CRISPR-Cas12a обычно сочетается с изотермической стадией усиления14,15. Амплификация рекомбиназы полимеразы (RPA) обеспечивает чувствительную и быструю изотермическую амплификацию ДНК в диапазоне температур от 37 °C до 42 °C19.
Недавно была разработана платформа обнаружения под названием DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter), которая сочетает в себе активность ДНКазы Cas12a с RPA и флуоресцентным считыванием12 и, как было показано, обнаруживает нуклеиновые кислоты с более высокой чувствительностью20. Кроме того, флуоресцентный сигнал, излучаемый положительными образцами, можно наблюдать через портативное устройство обнаружения флуоресценции в полевых условиях.
Поскольку мы амплировали ДНК с помощью RPA, разработали crRNA, нацеленную на пятикопийный ген nrdB (рибонуклеотидредуктаза β-субъединица), специфичный для CLas21, и использовали активность ДНКазы белка Cas12a, мы назвали этот метод обнаружения CLas CLas-DETECTR. По сравнению с существующими методами обнаружения CA, CLas-DETECTR является быстрым, точным, чувствительным и развертываемым.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Конструкция CLas-DETECTR
ПРИМЕЧАНИЕ: Построение CLas-DETECTR представляет собой четырехэтапный процесс: приготовление раствора, полная изоляция ДНК цитрусовых, изотермическая амплификация ДНК и визуализация результатов. Схема анализа CLas-DETECTR проиллюстрирована на рисунке 1А.
- Приготовление раствора
- Подготовьте буфер A: 20 мМ NaOH в 6% PEG 200. На 100 мл добавить 113 мг NaOH и 6 г ПЭГ 200 в 80 млH2Oво флаконе. Инкубируйте бутылку на водяной бане при 60 °C до тех пор, пока весь ПЭГ 200 не растворится. Затем добавьтеH2O к объему 100 мл.
- Приготовить раствор B: Для каждой реакции добавляют 10 мкл буфера RPA, 0,8 мкл F-RPA-RNRf, 0,8 мкл R-RPA-RNRr и 3,9 мкл ddH2Oк конечному объему 15,5 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: F-RPA-RNRf и R-RPA-RNRr являются праймерами, используемыми в анализе против гена nrdB . Последовательность см. в таблице 1 . - Приготовить раствор С: Для каждой реакции добавляют 1 мкл репортера ssDNA, 3 мкл буфера NEB 3,1, 1 мкл crRNA, 4 мкл Cas12a и 11 мкл ddH2O к конечному объему 20 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть много образцов для обнаружения, сделайте большой объем раствора В и раствора С, аликвоту позже.
- Полная изоляция ДНК цитрусовых
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сэкономить время и сделать этот метод пригодным для обнаружения полевых CLas, для получения сырых растительных экстрактов для амплификации ДНКбыл использован подход на основе щелочного полиэтиленгликоля (ПЭГ)- В этом протоколе использовались цитрусовые листья. Сначала выбивайте из листа пять листовых дисков. Затем поместите листовые диски в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и добавьте 200 мкл буфера А.
ПРИМЕЧАНИЕ: В полевых условиях сначала очистите листья, если их покрывает пыль. Листовые диски могут быть обрезаны с помощью крышки трубки объемом 1,5 мл, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Другие цитрусовые ткани, такие как корни, стебли, плоды и цветы, также могут быть использованы в этом протоколе. - Измельчите листовые диски вручную до однородной массы с помощью пластикового стержня.
- Оставьте тюбик нетронутым в течение 10 минут. Затем используйте супернатант для амплификации ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь анализ может быть приостановлен, а сырые растительные экстракты, которые были извлечены щелочно-ПЭГ-методом, могут храниться при -20 °C в течение не менее 1 года. Деревья сладкого апельсина Ньюхолла (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall), показанные в видео, были выращены в горшке, наполненном смесью торфяной почвы 9/3/1 (v/v/v) торфяной почвы/вермикулита/перлита, и содержались в теплице, расположенной в кампусе Gannan Normal University, Цзянси, Китай. Зараженные HLB деревья были привиты путем прививки CLas-положительными почками Ньюхолла. Деревья, инфицированные HLB, и деревья, не инфицированные HLB, были подтверждены с помощью ПЦР. CA были обнаружены с использованием пары праймеров (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr), нацеленной на ген маркера CLas nrdB. С другой стороны, характерные симптомы HLB, пятнистая пятнистость и пожелтение листьев можно найти на CLas-положительных, но не на CLas-отрицательных деревьях.
- В этом протоколе использовались цитрусовые листья. Сначала выбивайте из листа пять листовых дисков. Затем поместите листовые диски в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и добавьте 200 мкл буфера А.
- Изотермическая амплификация ДНК
- Добавьте 1 мкл супернатанта со стадии 1.2.3 и 1 мкл MgOAc (конечная концентрация 14 мМ) в раствор B и хорошо перемешайте.
- В лаборатории инкубируют их в простом инкубаторе при 37 °C в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: В полевых условиях держите трубки в руке в течение 15 минут. Также рекомендуется инкубировать трубки в простом инкубаторе при 37 °C в течение 15 мин, если позволяют условия.
- Визуализация результатов
- Добавьте 10 мкл смеси со стадии 1.3.2 в раствор С и хорошо перемешайте.
- Инкубируйте их в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 60 минут.
- Носите очки и наблюдайте за зеленым флуоресцентным сигналом, выпущенным репортером ssDNA, помеченным 5'6-флуоресцеином на 5' и флуоресцентным гасителем на 3' через портативное флуоресцентное устройство детектирования (длина волны возбуждения: 440 нм, длина волны излучения: 500 нм).
ПРИМЕЧАНИЕ: зеленый флуоресцентный сигнал может длиться несколько дней, лучше
ВНИМАНИЕ: Свет, излучаемый устройством обнаружения флуоресценции, вреден для глаз. Обязательно наденьте очки, прежде чем наблюдать за результатами.
2. Тест на специфичность
ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки специфичности CLas-DETECTR ризосферная бактерия Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) и штамм Burkholderia stabilis 1440, выделенные в лаборатории24 , были подвергнуты тесту CLas-DETECTR.
ПРИМЕЧАНИЕ: Candidatus Liberibacter (CLas) не может быть культивирован. Получить ДНК CLas можно только путем извлечения геномной ДНК из цитрусовых тканей, инфицированных CLas. Xcc является возбудителем другого важного заболевания цитрусовых, цитрусовой язвы. Штамм Burkholderia stabilis 1440 представляет собой анти-Xcc бактерию, выделенную в лаборатории. Поэтому использовались чистые штаммы для всех этих трех бактерий.
- Извлеките бактериальную геномную ДНК (гДНК) с помощью набора для экстракции бактериальной геномной ДНК в соответствии с протоколом производителя. Используйте воду в качестве негативного контроля.
- Выполняют ПЦР с использованием полосок ПЦР 0,2 мл с оптическими колпачками в реакционной смеси 25 мкл, содержащей 1 мкл F-RPA-RNRf, 1 мкл R-RPA-RNRr, 12,5 мкл Ex Taq версии 2.0 плюс краситель, 1 мкл шаблона ДНК и 9,5 мклH2O.
- Используйте следующие условия реакции теплового цикла: 1 мин при 98 °C; затем 35 циклов по 10 с при 98 °C, 30 с при 55 °C, 15 с при 72 °C; затем 10 мин при 72 °C; и удерживать при температуре 16 °C.
- Запускайте препараты ПЦР на 1% агарозном геле при 120 В в течение 15 мин.
- Выполняют qPCR в реакционной смеси 20 мкл, содержащей 0,8 мкл F-RPA-RNRf, 0,8 мкл R-RPA-RNRr, 10 мкл 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 мкл шаблона ДНК и 7,4 мклH2O.
- Используйте следующие условия реакции теплового цикла: 30 с при 95 °C; затем 45 циклов по 5 с при 95 °C и 32 с при 60 °C; а затем стадия кривой расплава 15 с при 95 °C, 1 мин при 60 °C и 15 с при 95 °C.
- Включите три технических повтора в каждый повтор.
- Выполните метод CLas-DETECTR, выполнив шаги 1.1–1.4.
3. Сравнение чувствительности
- Чтобы проверить чувствительность CLas DETECTR, обнаружите серию разведений фрагментов ДНК CLas с помощью ПЦР, CLas-DETECTR и qPCR, как описано выше.
- Амплифицировать сегмент ДНК длиной 1060 bp от nrdB с помощью праймерного набора F-RNR и R-RNR в реакционной смеси 100 мкл, содержащей 4 мкл F-RNR, 4 мкл R-RNR, 50 мкл PrimeSTAR Max Premix, 2 мкл шаблона ДНК и 40 мклH2O, следуя условиям реакции теплового цикла (30 с при 98 °C; с последующим 35 циклами 10 с при 98 °C, 15 с при 55 °C, 30 с при 72 °C; затем 10 мин при 72 °C; и удерживать при температуре 16 °C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ген nrdB (рибонуклеотидредуктаза β-субъединица) специфичен для CLas21. Можно легко получить ампликон nrdB из CLas-положительной цитрусовой гДНК, используя набор праймеров F-RNR и R-RNR. Набор праймеров F-RNR и R-RNR усиливает фрагмент nrdB 1060 bp, в то время как набор праймеров F-RPA-RNR и R-RPA-RNR усиливает фрагмент гена nrdB 104 bp, который является частью фрагмента nrdB 1060 bp. - Очистите продукты ПЦР с помощью набора для экстракции ДНК-геля в соответствии с руководством производителя.
- Препараты ПЦР, содержащие ампликоны nrdB , разбавляют стерилизованным ddH2O.
- Рассчитайте номер копии гена nrdB , используя коммерчески доступный онлайн-калькулятор числа копий ДНК и разбавления.
- Подготовьте разведения ДНК, содержащие 2,01 × 106 копий/мкл, 2,01 × 105 копий/мкл, 2,01 × 104 копий/мкл, 2,01 × 103 копий/мкл, 2,01 × 102 копий/мкл, 2,01 × 101 копий/мкл, 2,01 × 100 копий/мкл и 2,01 × 10−1 копий/мкл фрагмента ДНК CLas.
4. Обнаружение образцов
ПРИМЕЧАНИЕ: После теста на специфичность и чувствительность метод CLas-DETECTR был использован для обнаружения присутствия CLas в полевых образцах листьев, собранных из сладких апельсиновых деревьев Ньюхолла, выращенных в питомнике ресурсов зародышевой плазмы в кампусе Gannan Normal University, Цзянси, Китай. Для проверки результатов была выполнена qPCR.
- Протестируйте в общей сложности 15 деревьев. Используйте воду в качестве негативного контроля.
- Выполните методы CLas-DETECTR и qPCR, как описано выше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за неравномерных характеристик распределения CLas в цитрусовых листья, проявляющие симптомы HLB, были собраны в приоритетном порядке. Если дерево выглядело здоровым, листья собирались случайным образом, система CLas-DETECTR работает правильно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы описали портативную платформу CLas-DETECTR, объединяющую системы RPA и CRISPR-Cas12a для диагностики HLB в полевых условиях. Схема CLas-DETECTR проиллюстрирована на рисунке 1A.
Когда образцы листьев из деревьев Ньюхолла, инфицированных HLB и HLB-неинфицированных (Рисунок 1B), для которых наличие CLas было подтверждено ПЦР (Рисунок 1C), подвергались тесту CLas-DETECTR, сигнал зеленой флуоресценции был замечен в образце, инфицированном HLB, но не в образце, не инфицированном HLB, и отрицательном контроле (Рисунок 1D).
Мы определили специфичность CLas-DETECTR с помощью нуклеиновых кислот, извлеченных из других бактерий. Набор праймеров F-RPA-RNRf и R-RPA-RNRr, используемый в анализе CLas-DETECTR, также использовался в ПЦР и qPCR. Полоса может быть замечена в электрофорезе агарозного геля при амплификации с использованием CLas-положительной гДНК цитрусовых листьев, но не других бактериальных гДНК в анализах ПЦР (рисунок 2A). В анализах qPCR среднее значение порогового цикла (Ct) CLas составляло 24 ± 0,7, в то время как средние значения Ct A. tumefaciens GV3101, Xcc и B. stabilis strain 1440 составляли 38 ± 0,7, 39 ± 1,4 и 39 ± 0,7 соответственно (рисунок 2B). Обычно результат считается отрицательным, когда значение Ct выше 38. Эти результаты показывают, что пара праймеров F-RPA-RNRf и R-RPA-RNRr специфична для CA. В анализе CLas-DETECTR только CLas gDNA продемонстрировала зеленые флуоресцентные сигналы; гДНК, извлеченная из A. tumefaciens GV3101, Xcc и B. stabilis штамма 1440, этого не сделала (рисунок 2C), что означает, что CLas-DETECTR может специфически обнаруживать CLas.
Мы также проверили чувствительность CLas-DETECTR с использованием серии разведений ДНК CLas. ПЦР может обнаружить 2,01 × 102 копий/мкл (рисунок 3А). С другой стороны, CLas-DETECTR может обнаруживать 2,01 × 100 копий / мкл, что говорит о том, что это жизнеспособно в качестве диагностики чувствительного поля (рисунок 3B). qPCR мог обнаруживать 2,01 × 10−1 копий/мкл, но значение Ct было выше 36 (рисунок 3C). Таким образом, CLas-DETECTR на два порядка более чувствителен, чем традиционная ПЦР, и на один порядок менее чувствителен, чем qPCR, когда используются разбавленные ампликоны (рисунок 3).
Наконец, мы изучили осуществимость CLas-DETECTR для полевых образцов и сравнили его чувствительность с qPCR, установленным, чувствительным подходом обнаружения нуклеиновых кислот21. Обычно значение Ct обнаружения CLas с помощью qPCR выше 36 означает, что концентрация CLas составляет менее 2,01 × 10−1 копий/мкл, что является очень низкой концентрацией (рисунок 3C). Среди 15 образцов значение Ct образцов 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 и 14, обнаруженных qPCR, было менее 36, и наблюдались явные зеленые флуоресцентные сигналы (рисунок 4). С другой стороны, когда значения Ct образцов 6, 7, 9, 12 и 15, обнаруженные qPCR, были неопределенными, не наблюдалось зеленых флуоресцентных сигналов (рисунок 4). Кроме того, слабые зеленые флуоресцентные сигналы наблюдались, когда значения Ct образца 5 и образца 11, обнаруженные qPCR, были выше 36 (рисунок 4). Результаты показывают, что наша платформа является быстрым, надежным и чувствительным инструментом для диагностики HLB в полевых условиях.
| Нет | Имя | Последовательность (от 5' до 3') | ||||||||||||
| 1 | crRNA1-nrdB | rUrArArUrUrUrCrUrArCrArGrUrUrGrUrArArGrArUrUrGrCrArArGrCrAr | ||||||||||||
| 2 | ssDNA-FQ | ФАМ-ТТТАТТТ-БХК1 | ||||||||||||
| 3 | Ф-РПА-РНРФ | AAAAGTCGCACCATGCTCCATGAAGCTACC | ||||||||||||
| 4 | Р-РПА-РНРР | TGTTCACATGAGGGAGCATTTAACCCCACGAA | ||||||||||||
| 5 | Ф-РНР | ATGGCAAATAACACAGGATTAAGCCC | ||||||||||||
| 6 | Р-РНР | ТТААТКККАТТТКААККЦЦГЦТКЦЦ | ||||||||||||
Таблица 1: Нуклеиновая кислота, используемая в данном исследовании. SsDNA-FQ представляет собой одноцепочечную ДНК, меченую 5' 6-FAM (флуоресцеин) при 5' и флуоресцентным гасителем Black Hole Quencher 1 (BHQ1) на 3'. Сокращения: F = флуоресцентный репортер; Q = флуоресцентный гаситель.
Рисунок 1: Проектирование и валидация CLas-DETECTR. (A) Схема анализа CLas-DETECTR. Шаг 1: Готовят буфер А, содержащий 20 мМ NaOH в 6% ПЭГ 200 для быстрой экстракции гДНК; раствор B, содержащий 10 мкл буфера RPA, 0,8 мкл F-RPA-RNRf, 0,8 мкл F-RPA-RNRr и 3,9 мкл ddH2Oв каждой реакции для изотермической амплификации ДНК; раствор С, содержащий 1 мкл репортера ssDNA, 3 мкл буфера NEB 3,1, 1 мкл crRNA, нацеленной на nrdB, 4 мкл Cas12a и 11 мкл ddH2Oв каждой реакции для флуоресцентного репортерного высвобождения. Шаг 2: Пять листовых дисков, пробитых из листьев, использовали для извлечения общей ДНК цитрусовых с 200 мкл буфера A. Шаг 3: CLas-специфические нуклеиновые кислоты амплировали с использованием праймеров F-RPA-RNRf и R-RPA-RNRr, нацеленных на CLas-специфический маркер ген nrdB в растворе B с 1 мкл супернатанта со стадии 2 и 1 мкл MgOAc при 37 °C в течение 15 мин. Шаг 4: Раствор С с 10 мкл смеси со стадии 3 инкубировали при 37°С в течение 60 мин, а зеленый флуоресцентный сигнал наблюдали через портативное флуоресцентное детектирующее устройство. ssDNA-FQ был помечен 5' 6-FAM (флуоресцеин) на 5' и флуоресцентным гасящим Black Hole Quencher 1 (BHQ1) на 3'. Сокращения: F = флуоресцентный репортер; Q = флуоресцентный гаситель. (B) Зараженное HLB дерево (слева) показывает пятнистые пятнистые и желтые листья, но неинфицированное HLB дерево (справа) выглядит зеленым. (C) Наличие CLas было подтверждено с помощью праймерной пары F-RPA-RNRf и R-RPA-RNRr. (D) Образец, инфицированный HLB, демонстрирует зеленые флуоресцентные сигналы, в то время как HLB-неинфицированный иH2O не включены в анализ CLas-DETECTR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Тестирование специфики CLas-DETECTR. (A) Электрофорез агарозного геля результатов ПЦР, (B) значение Ct результатов qPCR и (C) результаты CLas-DETECTR, усиленные праймерной парой F-RPA-RNRf и R-RPA-RNRr с использованием гДНК, извлеченной из CLas-положительных листьев Ньюхолла и трех других бактерий. Опять же,H2O служил отрицательным контролем. M: лестница ДНК; гДНК экстрагирована из CLas-положительных листьев Ньюхолла (1), Agrobacterium tumefaciens GV3101 (2), Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc, 3) и штамма Burkholderia stabilis 1440, выделенных в нашей лаборатории (4). Значение Ct представляет собой среднее значение Ct трех технических повторов ± стандартной ошибке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Сравнение чувствительности CLas-DETECTR с ПЦР и qPCR. Анализ обнаружения серии специфических разведений ДНК CLas с использованием (A) ПЦР, (B) CLas-DETECTR и (C) qPCR. (A) Из 25 мкл продуктов ПЦР в гель загружали 5 мкл. (B) Снимки были сделаны с помощью камеры смартфона через защитные очки под светом, излучаемым портативным флуоресцентным детекторным устройством (длина волны возбуждения: 440 нм, длина волны излучения: 500 нм). Одни и те же грунтовки использовались во всех анализах. Очищенные продукты ПЦР длиной 1060 bp, амплифицированные с набором праймеров F-RNR и R-RNR, нацеленными на ген CLas-специфического nrdB, разбавляли с использованием H2O до концентраций 2,01 × 106 копий/мкл (1), 2,01 × 105 копий/мкл (2), 2,01 × 104 копий/мкл (3), 2,01 × 103 копий/мкл (4), 2,01 × 102 копий/мкл (5), 2,01 × 101 экз/мкл (6), 2,01 × 100 копий/мкл (7) и 2,01 × 10−1 копий/мкл (8). H2O служил отрицательным контролем. М: Лестница ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Обнаружение CA с помощью полевых образцов. CLas в 15 образцах листьев, собранных из сладких апельсиновых деревьев Ньюхолла, были протестированы с помощью анализов CLas-DETECTR и qPCR, описанных выше. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это исследование представляет собой быстрый и портативный метод обнаружения CA под названием CLas-DETECTR, который сочетает в себе системы RPA и CRISPR-Cas12a. Рабочий процесс показан на рисунке 1. CLas-DETECTR обнаруживает CA со специфичностью и чувствительностью (рисунок 2 и рисунок 3). Кроме того, используя образцы листьев Ньюхолла, CLas-DETECTR обнаруживает CLas с той же чувствительностью, что и qPCR (рисунок 4). Примечательно, что результаты обнаружения могут быть непосредственно визуализированы с помощью портативного портативного устройства, независимого от лабораторных инструментов, что имеет решающее значение для диагностики HLB в режиме реального времени.
В протоколе есть несколько важных соображений. Во-первых, в процессе отбора проб следует строго избегать перекрестного загрязнения, поскольку CLas-DETECTR так же чувствителен, как и qPCR. Реакционные реагенты не должны подвергаться воздействию интенсивного солнечного света. Все шаги должны быть точно соблюдены для достижения оптимальных результатов. Положительный контроль, плазмида, содержащая CLas-специфические фрагменты гена, должна быть включена, чтобы гарантировать, что система CLas-DETECTR правильно работает в полевых условиях. Наконец, все экспериментальные отходы, связанные с CLas, должны рассматриваться как биологическая опасность и автоклавироваться перед удалением.
Если для положительного контроля не обнаружены флуоресцентные сигналы, в реакционной смеси могут существовать ингибиторы, и реагенты необходимо заменить. В противном случае, если флуоресценция слишком слабая, чтобы ее можно было различить, время инкубации может быть продлено дольше, время инкубации может привести к ложным срабатываниям.
Существующие методы обнаружения CLas требуют дорогостоящих ПЦР-машин, стационарных операционных площадок и обученного персонала. Тем не менее, метод, представленный здесь, позволяет HLB быть точно и чувствительно диагностированным в полевых условиях широким кругом людей, включая производителей цитрусовых.
Однако CLas-DETECTR имеет некоторые ограничения. Во-первых, образцы цитрусовых не могут быть непосредственно использованы в протоколе, и цитрусовая гДНК должна быть извлечена. Во-вторых, для RPA и активации нуклеазной активности Cas12a для получения последовательных результатов требуется простой инкубатор. В-третьих, результаты должны быть визуализированы с помощью портативного флуоресцентного устройства обнаружения. Хотя боковые полосы потока могут быть использованы для непосредственного отображения результатов, это увеличится.
Образцы листьев были протестированы в этом протоколе. В будущем CLas-DETECTR может применяться для обнаружения присутствия CLas в образцах барвинков и подорожников. Кроме того, изменяя crРНК и праймеры, эта молекулярная диагностическая технология также может быть использована для других заболеваний цитрусовых, таких как цитрусовая язва, вирус распада цитрусовых и вирус фрагментации листьев цитрусовых. В то время как мы работаем над CLas-DETECTR, этот подход также использовался для параллельного обнаружения CA другими25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Эта работа была финансово поддержана Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2021YFD1400805), Программой исследований и разработок в области науки и техники провинции Цзянси (20194ABC28007), проектами Департамента образования Цзянси (GJJ201449) и Совместными инновациями современных сельскохозяйственных научных исследований в провинции Цзянси (JXXTCX2015002(3 +2)-003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China |
| Hole puncher | Deli | 114 | China |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
| NaOH | SCR | 10019718 | China |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
References
- Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Wang, N., et al. The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control. Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).
- Kim, J. S., Wang, N. Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR. BMC Research Notes. 2, 37 (2009).
- Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. Multiplex detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus" and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR. PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).
- Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China. Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).
- Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens. Scientific Reports. 6, 29272 (2016).
- Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing. The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).
- Ghosh, D. K., et al. Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus". PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).
- Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids. Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).
- Chertow, D. S. Next-generation diagnostics with CRISPR. Science. 360 (6387), 381-382 (2018).
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
- Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).
- Qian, W., et al. Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics. Virus Research. 305, 198568 (2021).
- Marques, M. C., et al. Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13. ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).
- Lu, X., et al. A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay. Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).
- Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).
- Liang, M., et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).
- Zheng, Z., et al. Unusual five copies and dual forms of nrdB in "Candidatus Liberibacter asiaticus": Biological implications and PCR detection application. Scientific Reports. 6, 39020 (2016).
- Chomczynski, P., Rymaszewski, M. Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood. BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).
- Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).
- Long, Y., et al. A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri. Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).
- Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods. Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).
