Summary
In dieser Arbeit wurde eine schnelle, empfindliche und tragbare Nachweismethode für Candidatus Liberibacter asiaticus entwickelt, die auf Rekombinase-Polymerase-Amplifikation in Kombination mit CRISPR-Cas12a basiert.
Abstract
Die Früherkennung von Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) durch Zitrusbauern erleichtert ein frühzeitiges Eingreifen und verhindert die Ausbreitung von Krankheiten. Eine einfache Methode zur schnellen und tragbaren Huanglongbing (HLB) -Diagnose wird hier vorgestellt, die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation und einen Fluoreszenzreporter kombiniert, der die Nukleaseaktivität des Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats / CRISPR-associated 12a (CRISPR-Cas12a) -Systems nutzt. Die Sensitivität dieser Technik ist viel höher als die PCR. Darüber hinaus zeigte diese Methode ähnliche Ergebnisse wie qPCR, wenn Blattproben verwendet wurden. Im Vergleich zu herkömmlichen CLas-Nachweismethoden kann das hier vorgestellte Nachweisverfahren in 90 min abgeschlossen werden und arbeitet in einem isothermen Zustand, der den Einsatz von PCR-Geräten nicht erfordert. Darüber hinaus können die Ergebnisse durch ein tragbares Fluoreszenzdetektionsgerät im Feld visualisiert werden.
Introduction
Huanglongbing (HLB) ist eine der problematischsten Zitruskrankheiten weltweit1. HLB wird durch die phloemkolonisierenden und anspruchsvollen Bakterien Candidatus Liberibacter spp. verursacht, einschließlich Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus und Ca. L. americanus 2. Die häufigste HLB-assoziierte Art in China und den USA ist CLas, die durch asiatische Zitruspsylliden (Diaphorina citri) oder durch Pfropfen übertragenwird 3. Nach der Infektion mit CLas zeigen Zitrusbäume einen Wachstumsrückgang bis zum Tod2. Die häufigsten Symptome von Zitrusblättern, die mit CLas infiziert sind, sind fleckige Flecken, grüne Inseln (kleine kreisförmige dunkelgrüne Punkte), erhöhte korkige Adern auf dickeren und ledrigen Blättern und ungleichmäßige vergilbte Triebe2. Darüber hinaus erscheinen mit CLas infizierte Früchte klein und schief2.
Da keine Zitrussorte gegen HLB resistent ist und es keine therapeutische Heilung für HLB gibt, erfordert die Prävention von HLB die Quarantäne und Isolierung von CLas-positiven Zitrusbäumen 2,3. Daher ist die Früherkennung entscheidend für die Überwachung und Quarantäne, um die Ausbreitung von CLas zu verhindern und wirtschaftliche Verluste zu minimieren3. Darüber hinaus ist ein empfindlicher CLas-Nachweis aufgrund des niedrigen Titers von CLas in Pflanzen im frühen Stadium der Infektion erforderlich3. In China wird die CLas-Erkennung in der Regel von bestimmten zertifizierten Testzentren durchgeführt. Der Erkennungsprozess dauert jedoch in der Regel mindestens 1 Woche und die Erkennungsgebühr ist teuer. Um die HLB-Inzidenz zu überwachen,
Verschiedene Technologien wurden angewendet, um HLB 4,5,6,7,8,9 zu diagnostizieren. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und quantitative PCR (qPCR) sind aufgrund ihrer hohen Sensitivität und Spezifität die am häufigsten verwendeten Werkzeuge für den CLas-Nachweis 4,5. Diese Technologien hängen jedoch stark von teuren Instrumenten und hochqualifiziertem Personal ab. Darüber hinaus wurden mehrere isotherme Amplifikationsmethoden, wie die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP), aufgrund ihrer Einfachheit, Schnelligkeit und niedrigen Kosten als attraktive Alternativen zu herkömmlichen PCR-Methoden entwickelt 8,9,10. Es ist jedoch schwierig, sie anzuwenden, um CLas aufgrund der unspezifischen Verstärkungssignale genau zu erkennen, was zu falsch-positiven Ergebnissen führen kann.
RNA-gesteuerter CRISPR/Cas (Clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-assoziierter) Endonuklease-basierter Nukleinsäurenachweis wurde aufgrund seiner hohen Sensitivität, Spezifität und Zuverlässigkeit als molekulardiagnostische Technologie der nächsten Generation entwickelt11,12,13,14. Diese CRISPR/Cas-Diagnostiktechnologien beruhen auf der kollateralen Nukleaseaktivität von Cas-Proteinen, um einzelsträngige DNA (ssDNA) zu spalten, die mit einem fluoreszierenden Reporter und einem Fluoreszenzlöscher an jedem Ende der Oligonukleotide modifiziert wurde, sowie einer Fluoreszenzdetektionsvorrichtung zur Erfassung des freigesetzten Fluoreszenzreporters11,12 . Die Nukleaseaktivität mehrerer Cas-Effektoren, die durch den CRISPR-RNA (crRNA)-Zielduplex aktiviert werden, kann die umgebende Nicht-Ziel-ssDNA11 wahllos spalten. CRISPR-Cas12a (auch Cpf 1 genannt), ein CRISPR/Cas-System der Klasse 2 Typ V-A, weist im Vergleich zu Cas9 mehrere Vorteile auf, wie z. B. eine geringere Fehlanpassungstoleranz und eine größere Spezifität13. Das Cas12a/crRNA-System wurde für den sensitiven und spezifischen Nachweis der Nukleinsäuren humanpathogener und phytopathogener 14,15,16,17,18 eingesetzt. Daher sollte die Verwendung des Cas12a/crRNA-Systems den genauen und empfindlichen Nachweis der Nukleinsäure von CLas ermöglichen.
Cas12a allein ist theoretisch nicht empfindlich genug, um niedrige Konzentrationen von Nukleinsäuren nachzuweisen. Um seine Detektionsempfindlichkeit zu verbessern, wird der CRISPR-Cas12a-Nachweis daher typischerweise mit einem isothermen Amplifikationsschritt14,15 kombiniert. Die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) ermöglicht eine empfindliche und schnelle isotherme DNA-Amplifikation in einem Temperaturbereich von 37 °C bis 42 °C19.
Eine Detektionsplattform namens DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter), die die DNase-Aktivität von Cas12a mit RPA und einer Fluoreszenzanzeige kombiniert, wurde kürzlich entwickelt12 und es wurde gezeigt, dass sie Nukleinsäure mit höherer Empfindlichkeit detektiert20. Darüber hinaus kann das von den positiven Proben emittierte Fluoreszenzsignal durch ein tragbares Fluoreszenzdetektionsgerät im Feld beobachtet werden.
Da wir DNA mit RPA amplifizierten, crRNA entwickelten, die auf das CLas-21-spezifische Gen nrdB (Ribonukleotidreduktase β-Untereinheit) abzielt, und die DNase-Aktivität des Cas12a-Proteins verwendeten, nannten wir diese CLas-Nachweismethode CLas-DETECTR. Im Vergleich zu bestehenden CLas-Erkennungsmethoden ist CLas-DETECTR schnell, genau, empfindlich und einsetzbar.
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Protocol
1. Aufbau des CLas-DETECTR
HINWEIS: Die Konstruktion von CLas-DETECTR ist ein vierstufiger Prozess: Lösungsvorbereitung, Gesamt-DNA-Isolierung von Zitrusfrüchten, isotherme DNA-Amplifikation und Ergebnisvisualisierung. Das Schema des CLas-DETECTR-Assays ist in Abbildung 1A dargestellt.
- Lösungsvorbereitung
- Puffer A: 20 mM NaOH in 6% PEG 200 vorbereiten. Für 100 ml 113 mg NaOH und 6 g PEG 200 in 80 mlH2Oin einer Flasche geben. Die Flasche in einem Wasserbad bei 60 °C inkubieren, bis sich das gesamte PEG 200 aufgelöst hat. Dann fügen Sie H2O zu einem Volumen von 100 ml hinzu.
- Lösung B vorbereiten: Für jede Reaktion werden 10 μL RPA-Puffer, 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL R-RPA-RNRr und 3,9 μLddH2Ozu einem Endvolumen von 15,5 μL hinzugefügt.
HINWEIS: F-RPA-RNRf und R-RPA-RNRr sind die Primer, die im Assay gegen das nrdB-Gen verwendet werden. Siehe Tabelle 1 für die Reihenfolge. - Lösung C vorbereiten: Für jede Reaktion werden 1 μL ssDNA-Reporter, 3 μL NEB-Puffer 3.1, 1 μL crRNA, 4 μL Cas12a und 11 μLddH2Ozu einem Endvolumen von 20 μL hinzugefügt.
HINWEIS: Wenn viele Proben zu erkennen sind, stellen Sie eine große Menge Lösung B und Lösung C her und aliquoten Sie später.
- Totale DNA-Isolierung von Zitrusfrüchten
HINWEIS: Um Zeit zu sparen und diese Methode für den CLas-Nachweis im Feld geeignet zu machen, wurde der auf alkalischem Polyethylenglykol (PEG) basierende Ansatz verwendet, um rohe Pflanzenextrakte für die DNA-Amplifikation zu erhalten22,23- In diesem Protokoll wurden Zitrusblätter verwendet. Stanzen Sie zuerst fünf Blattscheiben von einem Blatt. Als nächstes legen Sie die Blattscheiben in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 200 μL Puffer A hinzu.
HINWEIS: Reinigen Sie die Blätter auf dem Feld zuerst, wenn Staub sie bedeckt. Die Blattscheiben können mit dem Deckel des 1,5-ml-Röhrchens abgeschnitten werden, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Andere Zitrusgewebe wie Wurzeln, Stängel, Früchte und Blumen können ebenfalls in diesem Protokoll verwendet werden. - Schleifen Sie die Blattscheiben manuell mit einem Kunststoffstab, bis sie glatt sind.
- Lassen Sie die Röhre 10 min ungestört. Verwenden Sie dann den Überstand für die DNA-Amplifikation.
HINWEIS: Der Assay kann hier pausiert werden, und die rohen Pflanzenextrakte, die mit der alkalischen PEG-Methode extrahiert wurden, können bei −20 °C für mindestens 1 Jahr gelagert werden. Die im Video gezeigten Newhall-Süßorangenbäume (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) wurden in einem Topf angebaut, der mit einer Mischung aus 9/3/1 (v / v / v) Torferde / Vermiculit / Perlit gefüllt war, und in einem Gewächshaus auf dem Campus der Gannan Normal University, Jiangxi, China, gepflegt. Die HLB-infizierten Bäume wurden durch Pfropfen mit CLas-positiven Newhall-Knospen geimpft. Die HLB-infizierten und HLB-nicht infizierten Bäume wurden mittels PCR bestätigt. CLas wurde unter Verwendung des Primerpaares (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) nachgewiesen, das auf das CLas-spezifische Markergen nrdB abzielt. Auf der anderen Seite können charakteristische HLB-Symptome, fleckige Flecken und gelbliche Blätter auf CLas-positiven, aber nicht auf CLas-negativen Bäumen gefunden werden.
- In diesem Protokoll wurden Zitrusblätter verwendet. Stanzen Sie zuerst fünf Blattscheiben von einem Blatt. Als nächstes legen Sie die Blattscheiben in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 200 μL Puffer A hinzu.
- Isotherme DNA-Amplifikation
- 1 μL des Überstands aus Schritt 1.2.3 und 1 μL MgOAc (14 mM Endkonzentration) in Lösung B geben und gut mischen.
- Im Labor inkubieren Sie sie in einem einfachen Inkubator bei 37 °C für 15 min.
HINWEIS: Halten Sie die Röhrchen im Feld 15 Minuten lang in der Hand. Es wird auch empfohlen, Röhrchen in einem einfachen Inkubator bei 37 °C für 15 min zu inkubieren, wenn die Bedingungen dies zulassen.
- Visualisierung der Ergebnisse
- 10 μl der Mischung aus Schritt 1.3.2 in Lösung C geben und gut mischen.
- Inkubieren Sie sie in einem 37 °C Inkubator für 60 min.
- Tragen Sie eine Schutzbrille und beobachten Sie das grüne Fluoreszenzsignal, das vom mit 5' 6-Fluorescein markierten ssDNA-Reporter bei 5' und dem Fluoreszenzlöscher bei 3' durch ein tragbares Fluoreszenzdetektionsgerät (Anregungswellenlänge: 440 nm, Emissionswellenlänge: 500 nm) freigesetzt wird.
HINWEIS: grünes Fluoreszenzsignal kann mehrere Tage dauern, es ist besser,
ACHTUNG: Das vom Fluoreszenzdetektionsgerät emittierte Licht ist schädlich für die Augen. Stellen Sie sicher, dass Sie eine Schutzbrille tragen, bevor Sie die Ergebnisse beobachten.
2. Spezifitätstest
HINWEIS: Um die Spezifität von CLas-DETECTR zu testen, wurden das Rhizosphärenbakterium Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) und Burkholderia stabilis Stamm 1440, die im Labor24 isoliert wurden, dem CLas-DETECTR-Test unterzogen.
HINWEIS: Candidatus Liberibacter (CLas) kann nicht kultiviert werden. CLas-DNA kann man nur aus der Extraktion genomischer DNA aus mit CLas infiziertem Zitrusgewebe gewinnen. Xcc ist der Erreger einer anderen wichtigen Zitruskrankheit, Zitruskrebs. Burkholderia stabilis Stamm 1440 ist ein Anti-Xcc-Bakterium , das im Labor isoliert wurde. Daher wurden für alle diese drei Bakterien reine Stämme verwendet.
- Extrahieren Sie die bakterielle genomische DNA (gDNA) mit einem bakteriellen genomischen DNA-Extraktionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Verwenden Sie Wasser als Negativkontrolle.
- Die PCR wird unter Verwendung von 0,2-ml-PCR-Röhrchenstreifen mit optischen Kappen in einem 25-μL-Reaktionsgemisch durchgeführt, das 1 μL F-RPA-RNRf, 1 μL R-RPA-RNRr, 12,5 μL Ex Taq Version 2.0 plus Farbstoff, 1 μL DNA-Vorlage und 9,5 μLH2Oenthält.
- Verwenden Sie die folgenden thermischen Reaktionsbedingungen: 1 min bei 98 °C; gefolgt von 35 Zyklen von 10 s bei 98 °C, 30 s bei 55 °C, 15 s bei 72 °C; dann 10 min bei 72 °C; und bei 16 °C halten.
- Lassen Sie die PCR-Produkte 15 Minuten lang auf 1% Agarosegel bei 120 V laufen.
- Die qPCR wird in einem 20-μL-Reaktionsgemisch durchgeführt, das 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL R-RPA-RNRr, 10 μL 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL der DNA-Vorlage und 7,4 μLH2Oenthält.
- Verwenden Sie die folgenden thermischen Reaktionsbedingungen: 30 s bei 95 °C; gefolgt von 45 Zyklen von 5 s bei 95 °C und 32 s bei 60 °C; und dann eine Schmelzkurvenstufe von 15 s bei 95 °C, 1 min bei 60 °C und 15 s bei 95 °C.
- Fügen Sie jeder Wiederholung drei technische Wiederholungen hinzu.
- Führen Sie die CLas-DETECTR-Methode gemäß den Schritten 1.1 bis 1.4 aus.
3. Sensitivitätsvergleich
- Um die Empfindlichkeit von CLas DETECTR zu testen, detektieren Sie eine Reihe von CLas-DNA-Fragmentverdünnungen mittels PCR, CLas-DETECTR und qPCR, wie oben beschrieben.
- Amplifizieren Sie ein DNA-Segment mit einer Länge von 1.060 bp aus nrdB unter Verwendung des Primersets F-RNR und R-RNR in einem 100 μL Reaktionsgemisch, das 4 μL F-RNR, 4 μL R-RNR, 50 μL PrimeSTAR Max Premix, 2 μL DNA-Vorlage und 40 μLH2O enthält, nach den thermischen Reaktionsbedingungen (30 s bei 98 °C; gefolgt von 35 Zyklen von 10 s bei 98 °C, 15 s bei 55 °C, 30 s bei 72 °C; dann 10 min bei 72 °C; und bei 16 °C halten).
HINWEIS: Das nrdB (Ribonukleotidreduktase β- Untereinheit) Gen ist spezifisch fürCLas 21. Man kann das nrdB-Amplikon leicht aus CLas-positiver Citrus-gDNA mit dem Primer-Set F-RNR und R-RNR erhalten. Das Primer-Set F-RNR und R-RNR amplifiziert ein 1.060 bp nrdB-Fragment, während das Primer-Set F-RPA-RNR und R-RPA-RNR ein 104 bp Fragment des nrdB-Gens amplifiziert, das der Teil des 1.060 bp nrdB-Fragments ist. - Reinigen Sie die PCR-Produkte mit einem DNA-Gel-Extraktionskit gemäß dem Handbuch des Herstellers.
- Die PCR-Produkte, die die nrdB-Amplicons enthalten, werden mit sterilisiertemddH2Overdünnt.
- Berechnen Sie die Kopienzahl des nrdB-Gens unter Verwendung der handelsüblichen Online-DNA-Kopiennummer und des Verdünnungsrechners.
- DNA-Verdünnungen mit 2,01 × 106 Kopien/μL, 2,01 × 105 Kopien/μL, 2,01 × 104 Kopien/μL, 2,01 × 103 Kopien/μL, 2,01 × 10 2 Kopien/μL, 2,01 × 101 Kopien/μL, 2,01 × 100 Kopien/μL und2,01 × 10−1 Kopien/μL CLas-DNA-Fragment enthalten.
4. Probenerkennung
HINWEIS: Nach dem Spezifitäts- und Sensitivitätstest wurde die CLas-DETECTR-Methode verwendet, um das Vorhandensein von CLas in den Feldblattproben nachzuweisen, die von Newhall-Süßorangenbäumen gesammelt wurden, die in der Keimplasma-Ressourcengärtnerei auf dem Campus der Gannan Normal University, Jiangxi, China, angebaut wurden. Eine qPCR wurde durchgeführt, um die Ergebnisse zu verifizieren.
- Testen Sie insgesamt 15 Bäume. Verwenden Sie Wasser als Negativkontrolle.
- Führen Sie die Methoden CLas-DETECTR und qPCR wie oben beschrieben aus.
HINWEIS: Aufgrund der ungleichmäßigen Verteilungsmerkmale von CLas in Zitrusfrüchten wurden Blätter mit HLB-Symptomen vorrangig gesammelt. Wenn ein Baum gesund aussah, wurden die Blätter zufällig gesammeltCLas-DETECTR-System funktioniert korrekt.
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Representative Results
Hier haben wir eine tragbare Plattform, CLas-DETECTR, beschrieben, die die RPA- und CRISPR-Cas12a-Systeme kombiniert, um HLB im Feld zu diagnostizieren. Das Schema von CLas-DETECTR ist in Abbildung 1A dargestellt.
Wenn Blattproben von HLB-infizierten und HLB-nicht infizierten Newhall-Bäumen (Abbildung 1B), für die das Vorhandensein von CLas durch PCR bestätigt wurde (Abbildung 1C), dem CLas-DETECTR-Test unterzogen wurden, wurde ein grünes Fluoreszenzsignal in der HLB-infizierten Probe beobachtet, nicht jedoch in der HLB-nicht infizierten Probe und Negativkontrolle (Abbildung 1D).
Wir bestimmten die Spezifität von CLas-DETECTR mit Nukleinsäuren, die aus anderen Bakterien extrahiert wurden. Der Primersatz aus F-RPA-RNRf und R-RPA-RNRr, der im CLas-DETECTR-Assay verwendet wurde, wurde auch in PCR und qPCR verwendet. Eine Bande konnte in der Agarosegelelektrophorese gesehen werden, wenn sie mit CLas-positiver Zitrusblatt-gDNA amplifiziert wurde, aber nicht mit anderer bakterieller gDNA in den PCR-Assays (Abbildung 2A). In den qPCR-Assays betrug der durchschnittliche Schwellenwert (Ct) von CLas 24 ± 0,7, während die durchschnittlichen Ct-Werte von A. tumefaciens GV3101, Xcc und B. stabilis Stamm 1440 38 ± 0,7, 39 ± 1,4 bzw. 39 ± 0,7 betrugen (Abbildung 2B). Normalerweise wird das Ergebnis als negativ angesehen, wenn der Ct-Wert höher als 38 ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Primerpaar F-RPA-RNRf und R-RPA-RNRr spezifisch für CLas ist. Im CLas-DETECTR-Assay zeigte nur CLas gDNA grüne Fluoreszenzsignale; Die aus A. tumefaciens GV3101, Xcc und B. stabilis Stamm 1440 extrahierte gDNA tat dies nicht (Abbildung 2C), was bedeutet, dass CLas-DETECTR CLas spezifisch nachweisen kann.
Wir testeten auch die Empfindlichkeit von CLas-DETECTR mit einer Reihe von CLas-DNA-Verdünnungen. PCR konnte 2,01 × 102 Kopien/μL nachweisen (Abbildung 3A). Auf der anderen Seite konnte CLas-DETECTR 2,01 × 100 Kopien/μL detektieren, was darauf hindeutet, dass dies als empfindliche Felddiagnostik möglich ist (Abbildung 3B). Die qPCR konnte 2,01 × 10−1 Kopien/μL nachweisen, aber der Ct-Wert war höher als 36 (Abbildung 3C). Daher ist CLas-DETECTR zwei Größenordnungen empfindlicher als herkömmliche PCR und eine Größenordnung weniger empfindlich als qPCR, wenn verdünnte Amplicons verwendet werden (Abbildung 3).
Schließlich untersuchten wir die Machbarkeit von CLas-DETECTR für Feldproben und verglichen seine Sensitivität mit qPCR, einem etablierten, sensitiven Nukleinsäure-Detektionsansatz21. Normalerweise bedeutet ein Ct-Wert des CLas-Nachweises durch qPCR über 36, dass die CLas-Konzentration weniger als 2,01 × 10−1 Kopien/μL beträgt, was eine sehr niedrige Konzentration ist (Abbildung 3C). Unter den 15 Proben betrug der Ct-Wert der mittels qPCR detektierten Proben 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 und 14 weniger als 36, und es wurden scheinbare grüne Fluoreszenzsignale beobachtet (Abbildung 4). Wenn andererseits die Ct-Werte der mittels qPCR detektierten Ct-Werte der Proben 6, 7, 9, 12 und 15 unbestimmt waren, wurden keine grünen Fluoreszenzsignale beobachtet (Abbildung 4). Darüber hinaus wurden schwache grüne Fluoreszenzsignale beobachtet, wenn die mittels qPCR detektierten Ct-Werte von Probe 5 und Probe 11 höher als 36 waren (Abbildung 4). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass unsere Plattform ein schnelles, robustes und empfindliches Werkzeug für die HLB-Diagnose im Feld ist.
| Nein | Name | Sequenz (5' bis 3') | ||||||||||||
| 1 | crRNA1-nrdB | rUrArArUrUrUrCrUrArGrUrArUrUrGrArGrArUrUrUrCrGrArUrUrUrGrArGrArG | ||||||||||||
| 2 | ssDNA-FQ | FAM-TTTATTT-BHQ1 | ||||||||||||
| 3 | F-RPA-RNRf | AAAAGTCGCACCATGCTCCATGAAGCTACC | ||||||||||||
| 4 | R-RPA-RNRr | TGTTCACATGAGGGAGCATTTAACCCCACGAA | ||||||||||||
| 5 | F-RNR | ATGGCAAATAACACAGGATTAAGCCC | ||||||||||||
| 6 | R-RNR | TTAATCCCATTTCAACCCTGCTCC | ||||||||||||
Tabelle 1: In dieser Studie verwendete Nukleinsäure. Die ssDNA-FQ ist einzelsträngige DNA, die mit 5' 6-FAM (Fluorescein) bei 5' und dem Fluoreszenzlöscher Black Hole Quencher 1 (BHQ1) bei 3' markiert ist. Abkürzungen: F = fluoreszierender Reporter; Q = Fluoreszenzlöscher.
Abbildung 1: Design und Validierung des CLas-DETECTR. (A) Schematische Darstellung des CLas-DETECTR-Assays. Schritt 1: Puffer A mit 20 mM NaOH in 6% PEG 200 für eine schnelle gDNA-Extraktion vorbereiten; Lösung B enthält 10 μL RPA-Puffer, 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL F-RPA-RNRr und 3,9 μLddH2Oin jeder Reaktion zur isothermen DNA-Amplifikation; Lösung C enthält 1 μL ssDNA-Reporter, 3 μL NEB-Puffer 3.1, 1 μL crRNA, die auf nrdB abzielt, 4 μL Cas12a und 11 μLddH2Oin jeder Reaktion zur Freisetzung von fluoreszierenden Reportern. Schritt 2: Fünf aus Blättern gestanzte Blattscheiben wurden verwendet, um die Gesamt-DNA der Zitrusfrüchte mit 200 μL Puffer A zu extrahieren. Schritt 3: Die CLas-spezifischen Nukleinsäuren wurden unter Verwendung der Primer F-RPA-RNRf und R-RPA-RNRr amplifiziert, die auf das CLas-spezifische Markergen nrdB in Lösung B mit 1 μL Überstand aus Schritt 2 und 1 μL MgOAc bei 37 °C für 15 min abzielen. Schritt 4: Lösung C mit 10 μL der Mischung aus Schritt 3 wurde bei 37 °C für 60 min inkubiert, und das grüne Fluoreszenzsignal wurde durch eine tragbare Fluoreszenzdetektionsvorrichtung beobachtet. Die ssDNA-FQ wurde mit 5' 6-FAM (Fluorescein) bei 5' und einem Fluoreszenzlöscher Black Hole Quencher 1 (BHQ1) bei 3' markiert. Abkürzungen: F = fluoreszierender Reporter; Q = Fluoreszenzlöscher. (B) Der HLB-infizierte Baum (links) zeigt fleckige Flecken und gelbe Blätter, aber der HLB-nicht infizierte Baum (rechts) sieht grün aus. (C) Das Vorhandensein von CLas wurde anhand des Primerpaares F-RPA-RNRf und R-RPA-RNRr bestätigt. (D) Die HLB-infizierte Probe zeigt grüne Fluoreszenzsignale, während HLB-nicht infiziert undH2Oim CLas-DETECTR-Assay nicht vorhanden sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Testen der Spezifität des CLas-DETECTR. (A) Agarose-Gelelektrophorese der PCR-Ergebnisse, (B) der Ct-Wert der qPCR-Ergebnisse und (C) die CLas-DETECTR-Ergebnisse, amplifiziert mit dem Primer-Paar von F-RPA-RNRf und R-RPA-RNRr unter Verwendung von gDNA, die aus CLas-positiven Newhall-Blättern und drei anderen Bakterien extrahiert wurde. Auch hier dienteH2Oals Negativkontrolle. M: DNA-Leiter; gDNA extrahiert aus CLas-positiven Newhall-Blättern (1), Agrobacterium tumefaciens GV3101 (2), Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc, 3) und Burkholderia stabilis Stamm 1440, isoliert in unserem Labor (4). Der Ct-Wert stellt den durchschnittlichen Ct-Wert von drei technischen Wiederholungen ± Standardfehlers dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Sensitivitätsvergleich von CLas-DETECTR mit PCR und qPCR. Detektionsanalyse einer Reihe spezifischer CLas-DNA-Amplikonverdünnungen mittels (A) PCR, (B) CLas-DETECTR und (C) qPCR. (A) Von 25 μL der PCR-Produkte wurden 5 μL in das Gel geladen. (B) Die Bilder wurden mit einer Smartphone-Kamera durch eine Schutzbrille unter dem Licht eines tragbaren Fluoreszenzdetektionsgeräts aufgenommen (Anregungswellenlänge: 440 nm, Emissionswellenlänge: 500 nm). In allen Assays wurden die gleichen Primer verwendet. Die gereinigten PCR-Produkte mit einer Länge von 1.060 bp, amplifiziert mit dem Primerset F-RNR und R-RNR, das auf das CLas-spezifische nrdB-Gen abzielt, wurden mittels H2O in Konzentrationen von 2,01 × 106 Kopien/μL (1), 2,01 × 105 Kopien/μL (2), 2,01 × 104 Kopien/μL (3), 2,01 × 103 Kopien/μL (4), 2,01 × 102 Kopien/μL (5), 2,01 × 101 Kopien/μL (6), verdünnt. 2,01 × 100 Kopien/μL (7) und 2,01 × 10−1 Kopien/μL (8). H2O diente als Negativkontrolle. M: DNA-Leiter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: CLas-Detektion anhand von Feldproben. CLas in 15 Blattproben, die von Newhall-Süßorangenbäumen entnommen wurden, wurden mit CLas-DETECTR und qPCR-Assays getestet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Diese Studie stellt eine schnelle und tragbare Methode zum Nachweis von CLas namens CLas-DETECTR vor, die die Systeme RPA und CRISPR-Cas12a kombiniert. Der Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. CLas-DETECTR erkennt CLas mit Spezifität und Sensitivität (Abbildung 2 und Abbildung 3). Darüber hinaus detektiert CLas-DETECTR mithilfe von Newhall-Blattproben CLas mit der gleichen Empfindlichkeit wie qPCR (Abbildung 4). Insbesondere können die Detektionsergebnisse direkt über ein tragbares Handgerät unabhängig von laborbasierten Instrumenten visualisiert werden, was für die HLB-Diagnose in Echtzeit entscheidend ist.
Es gibt mehrere wichtige Überlegungen zum Protokoll. Erstens sollte Kreuzkontamination im Probenahmeprozess strikt vermieden werden, da CLas-DETECTR genauso empfindlich ist wie qPCR. Die Reaktionsreagenzien dürfen keiner intensiven Sonneneinstrahlung ausgesetzt werden. Alle Schritte müssen genau befolgt werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Eine Positivkontrolle, ein Plasmid, das CLas-spezifische Genfragmente enthält, sollte enthalten sein, um sicherzustellen, dass das CLas-DETECTR-System im Feld korrekt funktioniert. Schließlich sollten alle CLas-bezogenen Versuchsabfälle als Biogefährdung behandelt und vor der Entsorgung autoklaviert werden.
Wenn keine Fluoreszenzsignale für die Positivkontrolle detektiert werden, können Inhibitoren im Reaktionsgemisch vorhanden sein, und die Reagenzien müssen gewechselt werden. Andernfalls, wenn die Fluoreszenz zu schwach ist, um zu unterscheiden, kann die Inkubationszeit verlängert werden Längere Inkubationszeit kann zu falsch positiven Ergebnissen führen.
Die bestehenden CLas-Nachweismethoden erfordern teure PCR-Maschinen, feste Einsatzorte und geschultes Personal. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht es jedoch, HLB auf dem Feld von einer Vielzahl von Menschen, einschließlich Zitrusbauern, genau und empfindlich zu diagnostizieren.
CLas-DETECTR hat jedoch einige Einschränkungen. Erstens können Zitrusproben nicht direkt im Protokoll verwendet werden, und die Zitrus-gDNA muss extrahiert werden. Zweitens ist ein einfacher Inkubator für die RPA und die Aktivierung der Nukleaseaktivität von Cas12a erforderlich, um konsistente Ergebnisse zu erzielen. Drittens müssen die Ergebnisse durch ein tragbares Fluoreszenzdetektionsgerät visualisiert werden. Obwohl laterale Strömungsstreifen verwendet werden könnten, um die Ergebnisse direkt zu zeigen, würde dies die
In diesem Protokoll wurden Blattproben getestet. In Zukunft könnte CLas-DETECTR eingesetzt werden, um das Vorhandensein von CLas in Periwinkles und Psyllidenproben nachzuweisen. Darüber hinaus könnte diese molekulardiagnostische Technologie durch Veränderung der crRNA und der Primer auch für andere Zitruskrankheiten wie Zitruskrebs, Zitruszerfallsvirus und Zitrusblattfragmentierungsvirus verwendet werden. Während wir an CLas-DETECTR arbeiten, wurde dieser Ansatz auch verwendet, um CLas parallel von anderenzu erkennen 25.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Artikel haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt durch das National Key R & D Program of China (2021YFD1400805), das Major Science and Technology R & D Program der Provinz Jiangxi (20194ABC28007), Projects of Jiangxi Education Department (GJJ201449) und die Collaborative Innovation of Modern Agricultural Scientific Research in Jiangxi Province (JXXTCX2015002(3+2)-003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China |
| Hole puncher | Deli | 114 | China |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
| NaOH | SCR | 10019718 | China |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
References
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