Summary
בעבודה זו פותחה שיטת זיהוי מהירה, רגישה וניידת עבור Candidatus Liberibacter asiaticus המבוססת על הגברה של רקומבינאז פולימראז בשילוב עם CRISPR-Cas12a.
Abstract
הגילוי המוקדם של קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס (CLas) על ידי מגדלי הדרים מקל על התערבות מוקדמת ומונע את התפשטות המחלה. כאן מוצגת שיטה פשוטה לאבחון מהיר ונייד של הואנגלונגבינג (HLB) המשלבת הגברה של רקומבינאז פולימראז וכתב פלואורסצנטי המנצל את פעילות הנוקלאז של מערכת החזרות הפלינדרומיות הקצרות המקובצים באופן קבוע/מערכת 12a (CRISPR-Cas12a) הקשורה לקריספר. הרגישות של טכניקה זו היא הרבה יותר גבוהה מאשר PCR. יתר על כן, שיטה זו הראתה תוצאות דומות ל- qPCR כאשר נעשה שימוש בדגימות עלים. בהשוואה לשיטות גילוי CLas קונבנציונליות, ניתן להשלים את שיטת האיתור המוצגת כאן תוך 90 דקות ועובדת במצב איזותרמי שאינו דורש שימוש במכונות PCR. בנוסף, ניתן להמחיש את התוצאות באמצעות מכשיר זיהוי פלואורסצנטי ידני בשטח.
Introduction
הואנגלונגבינג (HLB) היא אחת ממחלות ההדרים הבעייתיות ביותר בעולם1. HLB נגרם על-ידי החיידק המתיישב והמחזק של פלום קנדידטוס ליבריבקטר spp., כולל קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס (CLas), Ca. L. africanus, ו- Ca. L. americanus2. המין הנפוץ ביותר הקשור ל-HLB בסין ובארה"ב הוא CLas, המועבר על ידי פסילידים של הדרים אסייתיים (Diaphorina citri) או באמצעות השתלה3. לאחר שנדבקו ב-CLas, עצי הדר מפגינים ירידה בגדילה עד מוות2. התסמינים השכיחים של עלי הדר הנגועים ב-CLas הם כתמים עזים, איים ירוקים (נקודות ירוקות כהות עגולות קטנות), ורידים מורמים על עלים עבים ועוריים יותר, ויורה מצהיבים לא אחידים2. בנוסף, פירות נגועים CLas נראים קטנים lopsided2.
מכיוון שאף זן הדרים אינו עמיד בפני HLB ואין תרופה טיפולית ל-HLB, מניעת HLB דורשת הסגר ובידוד של עצי הדר חיוביים ל-CLas 2,3. לכן, גילוי מוקדם הוא קריטי לניטור והסגר כדי למנוע את התפשטות CLas ולמזער הפסדים כלכליים3. בנוסף, יש צורך בזיהוי CLas רגיש בשל טיטר נמוך של CLas בצמחים בשלב המוקדם של ההדבקה3. בסין, זיהוי CLas מתבצע בדרך כלל על ידי מרכזי בדיקה מוסמכים מסוימים. עם זאת, תהליך האיתור אורך בדרך כלל לפחות שבוע אחד, ודמי האיתור יקרים. לכן, כדי לסייע במעקב אחר שכיחות ה-HLB
טכנולוגיות שונות יושמו כדי לאבחן HLB 4,5,6,7,8,9. תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ו-PCR כמותי (qPCR) הם הכלים הנפוצים ביותר לזיהוי CLas בשל הרגישות והספציפיות הגבוהה שלהם 4,5. עם זאת, טכנולוגיות אלה מסתמכות במידה רבה על מכשירים יקרים וכוח אדם מיומן ביותר. בנוסף, מספר שיטות הגברה איזותרמיות, כגון הגברה איזותרמית בתיווך לולאה (LAMP), פותחו כחלופות אטרקטיביות לשיטות PCR קונבנציונליות בשל פשטותן, מהירותן ועלותן הנמוכה 8,9,10. עם זאת, מאתגר ליישם אותם כדי לזהות במדויק CLas בשל אותות ההגברה הלא ספציפיים, שעלולים לגרום לתוצאות חיוביות שגויות.
קריספר/Cas מונחה RNA (אשכולות קבועים בין פלינדרומיים קצרים חוזרים / הקשורים לקריספר) זיהוי חומצות גרעין מבוססות אנדונוקלאז פותח כטכנולוגיית אבחון מולקולרית מהדור הבא הודות לרגישות, הספציפיות והאמינות הגבוהה שלה 11,12,13,14. טכנולוגיות אבחון אלה של CRISPR/Cas מסתמכות על פעילות הנוקלאז הבטוחה של חלבוני Cas כדי לבקע דנ"א חד-גדילי (ssDNA) ששונה באמצעות כתב פלואורסצנטי ומתקן פלואורסצנטי בכל קצה של האוליגונוקלאוטידים, כמו גם מכשיר לזיהוי פלואורסצנטי כדי ללכוד את המדווח הפלואורסצנטיהמשוחרר 11,12 . פעילות הנוקלאז של מספר אפקטים של Cas המופעלים על-ידי דופלקס המטרה של CRISPR RNA (crRNA) יכולה לבקע ללא הבחנה את ה-ssDNA11 שאינו מטרה. CRISPR-Cas12a (נקרא גם Cpf 1), מערכת V-A CRISPR/CAS מסוג 2, מדגים מספר יתרונות בהשוואה ל-Cas9, כגון סובלנות נמוכה יותר לאי-התאמה וספציפיות גבוהה יותר13. מערכת Cas12a/crRNA יושמה לזיהוי רגיש וספציפי של חומצות גרעין של פתוגנים אנושיים ופיטופתוגנים 14,15,16,17,18. לכן, שימוש במערכת Cas12a/crRNA אמור לאפשר זיהוי מדויק ורגיש של חומצת הגרעין של CLas.
Cas12a לבדו אינו רגיש מספיק מבחינה תיאורטית כדי לזהות רמות נמוכות של חומצות גרעין. לכן, כדי לשפר את רגישות הגילוי שלו, זיהוי CRISPR-Cas12a משולב בדרך כלל עם שלב הגברה איזותרמי14,15. הגברת רקומבינאז פולימראז (RPA) מאפשרת הגברה של DNA איזותרמי רגיש ומהיר בטווח טמפרטורות שבין 37 °C ל-42 °C19.
פלטפורמת זיהוי בשם DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) המשלבת את פעילות ה- DNase של Cas12a עם RPA וקריאת פלואורסצנציה פותחהלאחרונה 12 והוכחה כמזהה חומצת גרעין עם רגישות גבוהה יותר20. יתר על כן, ניתן לצפות באות הפלואורסצנטי הנפלט מהדגימות החיוביות באמצעות מכשיר זיהוי פלואורסצנטי ידני בשטח.
מאחר שהגברנו את הדנ"א באמצעות RPA, תכננו crRNA המכוון לגן nrdB בעל חמישה עותקים (ריבונוקלאוטיד רדוקטאז β- תת-יחידה) הספציפי ל-CLas21, והשתמשנו בפעילות ה-DNase של חלבון Cas12a, קראנו לשיטת זיהוי CLas זו CLas-DETECTR. בהשוואה לשיטות זיהוי CLas קיימות, CLas-DETECTR הוא מהיר, מדויק, רגיש וניתן לפריסה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בניית ה-CLas-DETECTR
הערה: הבנייה של CLas-DETECTR היא תהליך בן ארבעה שלבים: הכנת תמיסה, בידוד DNA כולל של הדרים, הגברה איזותרמית של דנ"א והדמיית תוצאות. הסכימה של בדיקת CLas-DETECTR מודגמת באיור 1A.
- הכנת פתרונות
- הכן מאגר A: 20 mM NaOH ב 6% PEG 200. עבור 100 מ"ל, יש להוסיף 113 מ"ג של NaOH ו-6 גרם של PEG 200 ל-80 מ"ל של H2O בבקבוק. לדגור את הבקבוק באמבט מים ב 60 מעלות צלזיוס עד כל PEG 200 מומס. לאחר מכן, הוסף H2O לנפח של 100 מ"ל.
- הכן פתרון B: עבור כל תגובה, הוסף 10 μL של מאגר RPA, 0.8 μL של F-RPA-RNRf, 0.8 μL של R-RPA-RNRr, ו- 3.9 μL של ddH2O לנפח סופי של 15.5 μL.
הערה: F-RPA-RNRf ו-R-RPA-RNRr הם הפריימרים המשמשים בבדיקה נגד הגן NRDB . ראו טבלה 1 לרצף. - הכן פתרון C: עבור כל תגובה, הוסף 1 μL של מדווח ssDNA, 3 μL של מאגר NEB 3.1, 1 μL של crRNA, 4 μL של Cas12a, ו 11 μL של ddH2O לנפח סופי של 20 μL.
הערה: אם יש דוגמאות רבות לזיהוי, צור נפח גדול של פתרון B ופתרון C, ו- aliquot מאוחר יותר.
- בידוד דנ"א כולל בהדרים
הערה: כדי לחסוך זמן ולהפוך שיטה זו למתאימה לזיהוי CLas בשדה, הגישה המבוססת על פוליאתילן גליקול אלקליין (PEG) שימשה להשגת תמציות צמחים גולמיות להגברת DNA22,23- עלי הדר שימשו בפרוטוקול זה. ראשית, אגרוף חמישה דיסקיות עלה מתוך עלה. לאחר מכן, הכניסו את דיסקיות העלים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, והוסיפו 200 מיקרוליטר של חיץ A.
הערה: בשטח, נקו תחילה את העלים אם יש אבק המכסה אותם. ניתן לחתוך את דיסקיות העלים באמצעות המכסה של צינור 1.5 מ"ל כדי למנוע זיהום צולב. רקמות הדרים אחרות, כגון שורשים, גבעולים, פירות ופרחים, יכולות לשמש גם בפרוטוקול זה. - טוחנים את דיסקי העלים באופן ידני עד לקבלת מוט פלסטיק.
- השאירו את הצינור ללא הפרעה למשך 10 דקות. לאחר מכן, השתמש בסופרנטנט להגברת DNA.
הערה: ניתן להשהות את הבדיקה כאן, וניתן לאחסן את תמציות הצמחים הגולמיות שהופקו בשיטת אלקליין-PEG בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס למשך שנה אחת לפחות. עצי התפוז המתוק של ניוהול (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) המוצגים בסרטון גודלו בעציץ מלא בתערובת של 9/3/1 (v/v/v) אדמת כבול / ורמיקוליט / פרלייט ונשמרו בבית זכוכית הממוקם בקמפוס של אוניברסיטת Gannan Normal, ג'יאנגשי, סין. העצים הנגועים ב-HLB חוסנו על ידי השתלה עם ניצני ניוהול חיוביים ל-CLas. העצים הנגועים ב-HLB והלא נגועים ב-HLB אושרו על ידי PCR. CLas זוהה באמצעות זוג הפריימרים (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) המכוון לגן הסמן הספציפי ל-CLas nrdB. בצד השני, ניתן למצוא תסמינים אופייניים של HLB, כתמים ועלים מצהיבים על עצים חיוביים ל-CLas, אך לא על עצים שליליים ל-CLas.
- עלי הדר שימשו בפרוטוקול זה. ראשית, אגרוף חמישה דיסקיות עלה מתוך עלה. לאחר מכן, הכניסו את דיסקיות העלים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, והוסיפו 200 מיקרוליטר של חיץ A.
- הגברה איזותרמית של דנ"א
- הוסף 1 μL של סופרנטנט משלב 1.2.3 ו-1 μL של MgOAc (ריכוז סופי של 14 mM) לתמיסה B וערבב היטב.
- במעבדה, דגרו אותם באינקובטור פשוט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
הערה: בשטח, החזק את הצינורות ביד למשך 15 דקות. כמו כן, מומלץ לדגור צינורות באינקובטור פשוט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות אם התנאים מאפשרים זאת.
- תצוגה חזותית של תוצאות
- מוסיפים 10 μL מהתערובת משלב 1.3.2 לתמיסה C ומערבבים היטב.
- לדגום אותם בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
- הרכיבו משקפי מגן וצפו באות הפלואורסצנטי הירוק המשתחרר מכתב ה-ssDNA המסומן ב-5' 6-פלואורסצין ב-5' וב-quencher הפלואורסצנטי ב-3' באמצעות מכשיר לגילוי פלואורסצנטי ידני (אורך גל עירור: 440 ננומטר, אורך גל פליטה: 500 ננומטר).
הערה: אות פלואורסצנציה ירוק יכול להימשך מספר ימים, עדיף
התראה: האור הנפלט על-ידי ההתקן לזיהוי פלואורסצנציה מזיק לעיניים. הקפידו להרכיב משקפי מגן לפני שתתבוננו בתוצאות.
2. מבחן ספציפיות
הערה: כדי לבדוק את הספציפיות של CLas-DETECTR, חיידק הריזוספרה אגרובקטריום טומפצ'ינס GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc), וזן Burkholderia stabilis 1440 שבודד במעבדה24 היו נתונים לבדיקת CLas-DETECTR.
הערה: לא ניתן לתרבת קנדידטוס ליבריבקטר (CLas). ניתן להשיג דנ"א CLas רק מהפקת דנ"א גנומי מרקמות הדרים הנגועות ב-CLas. Xcc הוא הגורם הסיבתי של מחלת הדרים חשובה אחרת, קנקן הדרים. זן Burkholderia stabilis 1440 הוא חיידק אנטי-Xcc שבודד במעבדה. לכן, נעשה שימוש בזנים טהורים לכל שלושת החיידקים האלה
- חלץ את הדנ"א הגנומי החיידקי (gDNA) באמצעות ערכת מיצוי DNA גנומית חיידקית בהתאם לפרוטוקול היצרן. השתמש במים כבקרה שלילית.
- בצע PCR באמצעות רצועות צינור PCR של 0.2 מ"ל עם מכסים אופטיים בתערובת תגובה של 25 μL המכילה 1 μL של F-RPA-RNRf, 1 μL של R-RPA-RNRr, 12.5 μL של Ex Taq גרסה 2.0 בתוספת צבע, 1 μL של תבנית DNA, ו- 9.5 μL של H2O.
- השתמש בתנאי התגובה הבאים של מחזור תרמי: דקה אחת ב- 98 °C (88 °F); ואחריו 35 מחזורים של 10 שניות ב-98 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב-55 מעלות צלזיוס, 15 שניות ב-72 מעלות צלזיוס; ואז 10 דקות ב 72 מעלות צלזיוס; ולהחזיק ב 16 מעלות צלזיוס.
- הפעל את מוצרי ה- PCR על ג'ל אגרוז 1% ב- 120 V למשך 15 דקות.
- בצע qPCR בתערובת תגובה של 20 μL המכילה 0.8 μL של F-RPA-RNRf, 0.8 μL של R-RPA-RNRr, 10 μL של 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL של תבנית ה- DNA, ו- 7.4 μL של H2O.
- השתמש בתנאי התגובה הבאים של מחזור תרמי: 30 שניות ב- 95 °C; ואחריו 45 מחזורים של 5 שניות ב-95 מעלות צלזיוס ו-32 שניות ב-60 מעלות צלזיוס; ואז שלב עקומת התכה של 15 שניות ב-95 מעלות צלזיוס, דקה אחת ב-60 מעלות צלזיוס ו-15 שניות ב-95 מעלות צלזיוס.
- כלול שלוש חזרות טכניות בכל חזרה.
- בצע את פעולת השירות CLas-DETECTR בהתאם לשלבים 1.1-1.4.
3. השוואת רגישות
- כדי לבדוק את הרגישות של CLas DETECTR, זהה סדרה של דילולים של מקטעי DNA של CLas באמצעות PCR, CLas-DETECTR ו- qPCR, כמתואר לעיל.
- הגבר מקטע דנ"א באורך של 1,060 bp מ- nrdB באמצעות קבוצת הפריימרים F-RNR ו- R-RNR בתערובת תגובה של 100 μL המכילה 4 μL של F-RNR, 4 μL של R-RNR, 50 μL של PrimeSTAR Max Premix, 2 μL של תבנית DNA, ו- 40 μL של H2O, בעקבות תנאי תגובת המחזור התרמי (30 שניות ב- 98 °C; ואחריו 35 מחזורים של 10 שניות ב- 98 °C, 15 שניות ב-55 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב-72 מעלות צלזיוס; ואז 10 דקות ב 72 מעלות צלזיוס; ומחזיקים ב-16 מעלות צלזיוס).
הערה: הגן nrdB (ריבונוקלאוטיד רדוקטאז β- תת-יחידה) הוא ספציפי ל-CLas21. ניתן להשיג בקלות את האמפליקון nrdB מ-gDNA הדרים חיובי ל-CLas באמצעות ערכת הפריימרים F-RNR ו-R-RNR. קבוצת הפריימרים F-RNR ו-R-RNR מגבירה מקטע nrdB של 1,060 bp, ואילו קבוצת הפריימרים F-RPA-RNR ו-R-RPA-RNR מגבירה מקטע של 104 bp של הגן nrdB, שהוא החלק של מקטע nrdB של 1,060 bp. - טהרו את מוצרי ה-PCR עם ערכת מיצוי ג'ל DNA בהתאם למדריך היצרן.
- דלל את מוצרי ה-PCR המכילים את אמפליקונים nrdB עם ddH2O מעוקר.
- חשב את מספר ההעתקה של הגן nrdB באמצעות מספר עותק DNA מקוון זמין מסחרית ומחשבון דילול.
- הכן דילולי DNA המכילים 2.01 × 106 עותקים / μL, 2.01 × 105 עותקים / μL, 2.01 × 104 עותקים / μL, 2.01 × 103 עותקים / μL, 2.01 × 10 2 עותקים / μL, 2.01 × 10 1 עותקים/ μL, 2.01 × 10 0 עותקים / μL, ו-2.01 × 10−1 עותקים / μL של מקטע DNA CLas.
4. זיהוי מדגם
הערה: לאחר בדיקת הספציפיות והרגישות, נעשה שימוש בשיטת CLas-DETECTR כדי לזהות נוכחות של CLas בדגימות עלי השדה שנאספו מעצי תפוז מתוקים של Newhall שגדלו במשתלת משאבי הנבטים בקמפוס של אוניברסיטת Gannan Normal, ג'יאנגשי, סין. בוצע qPCR כדי לאמת את התוצאות.
- בדוק בסך הכל 15 עצים. השתמש במים כבקרה שלילית.
- בצע את השיטות CLas-DETECTR ו- qPCR כמתואר לעיל.
הערה: בשל מאפייני ההפצה הלא אחידים של CLas בהדרים, עלים המראים תסמיני HLB נאספו כעדיפות. אם עץ נראה בריא, העלים נאספו באופן אקראיCLas-DETECTR המערכת פועלת כראוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן תיארנו פלטפורמה ניידת, CLas-DETECTR, המסרקת את מערכות ה-RPA וה-CRISPR-Cas12a כדי לאבחן HLB בשטח. הסכימה של CLas-DETECTR מודגמת באיור 1A.
כאשר דגימות עלים מעצי ניוהול הנגועים ב-HLB ומעצי ניוהול שאינם נגועים ב-HLB (איור 1B), שעבורם נוכחות ה-CLas אושרה על-ידי PCR (איור 1C), היו נתונים לבדיקת CLas-DETECTR, אות פלואורסצנטי ירוק נצפה בדגימה הנגועה ב-HLB, אך לא בדגימה הלא נגועה ב-HLB ובבקרה השלילית (איור 1D).
קבענו את הספציפיות של CLas-DETECTR באמצעות חומצות גרעין המופקות מחיידקים אחרים. ערכת הפריימרים של F-RPA-RNRf ו-R-RPA-RNRr המשמשת בבדיקת CLas-DETECTR שימשה גם ב-PCR וב-qPCR. ניתן היה לראות רצועה באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז כאשר היא מוגברת באמצעות gDNA של עלי הדרים חיוביים ל-CLas, אך לא באמצעות gDNA חיידקי אחר במבחני ה-PCR (איור 2A). במבחני qPCR, ערך מחזור הסף הממוצע (Ct) של CLas היה 24 ± 0.7, בעוד שערכי ה-Ct הממוצעים של A. tumefaciens GV3101, Xcc ו-B. stabilis strain 1440 היו 38 ± 0.7, 39 ± 1.4 ו-39 ± 0.7, בהתאמה (איור 2B). בדרך כלל, התוצאה נחשבת שלילית כאשר ערך Ct גבוה מ- 38. תוצאות אלה מראות כי זוג הפריימרים F-RPA-RNRf ו-R-RPA-RNRr הם ספציפיים ל-CLas. בבדיקת CLas-DETECTR, רק CLas gDNA הדגים אותות פלואורסצנטיים ירוקים; ה-gDNA שחולץ מזן A. tumefaciens GV3101, Xcc ו-B. stabilis 1440 לא (איור 2C), מה שאומר ש-CLas-DETECTR יכול לזהות CLas באופן ספציפי.
בדקנו גם את הרגישות של CLas-DETECTR באמצעות סדרה של דילולי דנ"א של CLas. PCR יכול לזהות 2.01 × 102 עותקים/μL (איור 3A). מצד שני, CLas-DETECTR יכול לזהות 2.01 × 100 עותקים/μL, מה שמרמז על כך שזה בר קיימא כאבחון שדה רגיש (איור 3B). ה-qPCR יכול היה לזהות 2.01 × 10− 1 עותקים/μL, אך ערך ה-Ct היה גבוה מ-36 (איור 3C). לכן, CLas-DETECTR הוא שני סדרי גודל רגישים יותר מ-PCR מסורתי וסדר גודל אחד פחות רגיש מ-qPCR כאשר נעשה שימוש באמפליקונים מדוללים (איור 3).
לבסוף, בחנו את ההיתכנות של CLas-DETECTR לדגימות שדה והשווינו את הרגישות שלו ל-qPCR, גישה מבוססת ורגישה לזיהוי חומצות גרעין21. בדרך כלל, ערך Ct של זיהוי CLas על-ידי qPCR גבוה מ-36 פירושו שריכוז ה-CLas נמוך מ-2.01 ×-10− 1 עותקים/μL, שהוא ריכוז נמוך מאוד (איור 3C). מבין 15 הדגימות, ערך ה-Ct של דגימות 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 ו-14 שזוהו על-ידי qPCR היה נמוך מ-36, ונצפו אותות פלואורסצנטיים ירוקים לכאורה (איור 4). מצד שני, כאשר ערכי Ct של דגימות 6, 7, 9, 12 ו-15 שזוהו על-ידי qPCR לא נקבעו, לא נצפו אותות פלואורסצנטיים ירוקים (איור 4). יתר על כן, אותות פלואורסצנטיים ירוקים חלשים נצפו כאשר ערכי ה-Ct של מדגם 5 ומדגם 11 שזוהו על-ידי qPCR היו גבוהים מ-36 (איור 4). התוצאות מצביעות על כך שהפלטפורמה שלנו היא כלי מהיר, חזק ורגיש לאבחון HLB בתחום.
| לא | שם | רצף (5' עד 3') | ||||||||||||
| 1 | crRNA1-nrdB | rUrArArUrUrUrArGrUrArGrArUrGrUrUrArArGr | ||||||||||||
| 2 | ssDNA-FQ | FAM-TTTATTT-BHQ1 | ||||||||||||
| 3 | F-RPA-RNRf | AAAAGTCGCACCATGCTCCATGAAGCTACC | ||||||||||||
| 4 | R-RPA-RNRr | TGTTCACATGAGGGAGCATTTAACCCCACGAA | ||||||||||||
| 5 | F-RNR | ATGGCAAATAACACAGGATTAAGCCC | ||||||||||||
| 6 | R-RNR | TTAATCCCATTTCAACCCTGCTCC | ||||||||||||
טבלה 1: חומצת גרעין ששימשה במחקר זה. ה-ssDNA-FQ הוא דנ"א חד-גדילי המסומן ב-5' 6-FAM (פלואורסצין) ב-5' ו-5' החור השחור Quencher 1 (BHQ1) ב-3'. קיצורים: F = כתב פלואורסצנטי; Q = קונצ'ר פלואורסצנטי.
איור 1: תכנון ואימות של CLas-DETECTR. (A) סכמת בדיקת CLas-DETECTR. שלב 1: הכן חיץ A המכיל 20 mM NaOH ב 6% PEG 200 למיצוי gDNA מהיר; תמיסה B המכילה 10 μL של מאגר RPA, 0.8 μL של F-RPA-RNRf, 0.8 μL של F-RPA-RNRr, ו-3.9 μL של ddH2O בכל תגובה להגברת DNA איזותרמית; תמיסה C המכילה 1 μL של כתב ssDNA, 3 μL של מאגר NEB 3.1, 1 μL של crRNA המכוון ל- nrdB, 4 μL של Cas12a, ו- 11 μL של ddH2O בכל תגובה לשחרור כתב פלואורסצנטי. שלב 2: חמישה דיסקי עלים שנוקבו מעלים שימשו לחילוץ הדנ"א הכולל של ההדרים עם 200 μL של חיץ A. שלב 3: חומצות הגרעין הספציפיות ל-CLas הוגברו באמצעות הפריימרים F-RPA-RNRf ו-R-RPA-RNRr המכוונים לגן הסמן הספציפי ל-CLas nrdB בתמיסה B עם 1 μL של סופר-נטנט משלב 2 ו-1 μL של MgOAc בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. שלב 4: תמיסה C עם 10 μL של התערובת משלב 3 הודגרה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות, ואת האות הפלואורסצנטי הירוק נצפה באמצעות מכשיר גילוי פלואורסצנטי כף יד. ה-ssDNA-FQ סומן ב-5' 6-FAM (פלואורסצין) ב-5' וב-5' ב-3'. קיצורים: F = כתב פלואורסצנטי; Q = קונצ'ר פלואורסצנטי. (B) העץ הנגוע ב-HLB (משמאל) מראה כתמים ועלים צהובים, אך העץ הלא נגוע ב-HLB (מימין) נראה ירוק. (C) נוכחות CLas אושרה באמצעות זוג הפריימרים F-RPA-RNRf ו-R-RPA-RNRr. (D) הדגימה הנגועה ב-HLB מדגימה אותות פלואורסצנטיים ירוקים, בעוד שה-HLB-uninfected ו-H2O אינם מופיעים בבדיקת CLas-DETECTR. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: בדיקת הספציפיות של CLas-DETECTR. (A) אלקטרופורזה בג'ל Agarose של תוצאות ה-PCR, (B) ערך ה-Ct של תוצאות ה-qPCR, ו-(C) תוצאות ה-CLas-DETECTR מוגברות עם זוג הפריימרים של F-RPA-RNRf ו-R-RPA-RNRr באמצעות gDNA המופק מעלי ניוהול חיוביים ל-CLas ושלושה חיידקים אחרים. שוב, H2O שימש כבקרה שלילית. M: סולם DNA; gDNA המופק מעלי ניוהול חיוביים ל-CLas (1), אגרובקטריום טומפצ'ינס GV3101 (2), קסנתומונס ציטרי תת-קרקעי (Xcc, 3), וזן Burkholderia stabilis 1440 שבודד במעבדה שלנו (4). ערך Ct מייצג את ערך ה- Ct הממוצע של שלוש חזרות טכניות ± שגיאת תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: השוואת רגישות של CLas-DETECTR עם PCR ו-qPCR. ניתוח זיהוי של סדרה של דילולים ספציפיים של אמפליקון דנ"א CLas באמצעות (A) PCR, (B) CLas-DETECTR ו-(C) qPCR. (A) מתוך 25 μL של מוצרי PCR, 5 μL הועמסו לתוך הג'ל. (B) התמונות צולמו במצלמת סמארטפון באמצעות משקפי מגן מתחת לאור הנפלט על ידי מכשיר זיהוי פלואורסצנטי ידני (אורך גל עירור: 440 ננומטר, אורך גל פליטה: 500 ננומטר). אותם פריימרים שימשו בכל המבחנים. מוצרי ה-PCR המטוהרים באורך של 1,060 bp מוגברים עם ערכת הפריימר F-RNR ו-R-RNR המכוונת לגן nrdB הספציפי ל-CLas דוללו באמצעות H2O לריכוזים של 2.01 × 106 עותקים/μL (1), 2.01 × 105 עותקים/μL (2), 2.01 × 104 עותקים/μL (3), 2.01 × 103 עותקים/μL (4), 2.01 × 102 עותקים/μL (5), 2.01 × 101 עותקים/μL (6), 2.01 × 100 עותקים/μL (7), ו-2.01 × 10−1 עותקים/μL (8). H2O שימש כבקרה שלילית. M: סולם DNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: זיהוי CLas באמצעות דגימות שדה. CLas ב-15 דגימות עלים שנאספו מעצי תפוז מתוקים של ניוהול נבדקו על ידי מבחני CLas-DETECTR ו-qPCR שתוארו לעיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר זה מציג שיטה מהירה וניידת לזיהוי CLas בשם CLas-DETECTR, המשלבת את מערכות ה-RPA וה-CRISPR-Cas12a. זרימת העבודה מודגמת באיור 1. CLas-DETECTR מזהה CLas עם ספציפיות ורגישות (איור 2 ואיור 3). יתר על כן, באמצעות דגימות עלים של Newhall, CLas-DETECTR מזהה CLas באותה רגישות כמו qPCR (איור 4). יש לציין כי ניתן להמחיש את תוצאות הזיהוי ישירות באמצעות מכשיר נייד כף יד שאינו תלוי במכשירים מבוססי מעבדה, דבר קריטי לאבחון HLB בזמן אמת.
ישנם מספר שיקולים חשובים לפרוטוקול. ראשית, יש להימנע בקפדנות מזיהום צולב בתהליך הדגימה, שכן CLas-DETECTR רגיש כמו qPCR. אסור לחשוף את ריאגנטים התגובה לאור שמש עז. יש לבצע את כל השלבים בדיוק כדי להשיג תוצאות אופטימליות. יש לכלול בקרה חיובית, פלסמיד המכיל שברי גנים ספציפיים ל-CLas, כדי להבטיח שמערכת CLas-DETECTR תפעל כראוי בשטח. לבסוף, יש להתייחס לכל הפסולת הניסיונית הקשורה ל-CLas כאל ביו-האזרד ולעבור אוטוקלציה לפני ההשלכה.
אם לא מזוהים אותות פלואורסצנטיים לבקרה החיובית, מעכבים עשויים להתקיים בתערובת התגובה, ויש לשנות את הריאגנטים. אחרת, אם הפלואורסצנציה חלשה מכדי להבחין בה, ניתן להאריך את זמן הדגירה זמן הדגירה הארוך יותר עלול להוביל לתוצאות חיוביות שגויות.
שיטות הזיהוי הקיימות של CLas דורשות מכונות PCR יקרות, אתרי הפעלה קבועים וכוח אדם מיומן. עם זאת, השיטה המוצגת כאן מאפשרת לאבחן HLB באופן מדויק ורגיש בשטח על ידי מגוון רחב של אנשים, כולל מגדלי הדרים.
עם זאת, ל-CLas-DETECTR יש כמה מגבלות. ראשית, לא ניתן להשתמש ישירות בדגימות הדרים בפרוטוקול, ויש לחלץ את ה-gDNA של ההדרים. שנית, אינקובטור פשוט נדרש עבור RPA ואת ההפעלה של פעילות נוקלאז של Cas12a לקבלת תוצאות עקביות. שלישית, יש להמחיש את התוצאות באמצעות מכשיר זיהוי פלואורסצנטי ידני. למרות שניתן להשתמש ברצועות זרימה רוחביות כדי להראות את התוצאות ישירות, זה יגדל
דגימות עלים נבדקו בפרוטוקול זה. בעתיד, CLas-DETECTR יכול להיות מיושם כדי לזהות את נוכחותם של CLas בדגימות פריווינקלס ופסילידים. בנוסף, על ידי שינוי ה-crRNA והפריימרים, טכנולוגיית אבחון מולקולרית זו יכולה לשמש גם למחלות הדר אחרות, כגון קנקן הדרים, נגיף דעיכת הדרים ונגיף פיצול עלי הדר. בזמן שאנו עובדים על CLas-DETECTR, גישה זו שימשה גם לזיהוי CLas במקביל לאחרים25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה כספית על ידי תוכנית R & D המפתח הלאומית של סין (2021YFD1400805), תוכנית המדע והטכנולוגיה הגדולה R&D של מחוז ג'יאנגשי (20194ABC28007), פרויקטים של מחלקת החינוך של ג'יאנגשי (GJJ201449), והחדשנות השיתופית של המחקר המדעי החקלאי המודרני במחוז ג'יאנגשי (JXXTCX2015002(3+2)-003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China |
| Hole puncher | Deli | 114 | China |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
| NaOH | SCR | 10019718 | China |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
References
- Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Wang, N., et al. The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control. Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).
- Kim, J. S., Wang, N. Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR. BMC Research Notes. 2, 37 (2009).
- Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. Multiplex detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus" and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR. PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).
- Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China. Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).
- Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens. Scientific Reports. 6, 29272 (2016).
- Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing. The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).
- Ghosh, D. K., et al. Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus". PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).
- Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids. Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).
- Chertow, D. S. Next-generation diagnostics with CRISPR. Science. 360 (6387), 381-382 (2018).
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
- Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).
- Qian, W., et al. Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics. Virus Research. 305, 198568 (2021).
- Marques, M. C., et al. Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13. ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).
- Lu, X., et al. A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay. Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).
- Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).
- Liang, M., et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).
- Zheng, Z., et al. Unusual five copies and dual forms of nrdB in "Candidatus Liberibacter asiaticus": Biological implications and PCR detection application. Scientific Reports. 6, 39020 (2016).
- Chomczynski, P., Rymaszewski, M. Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood. BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).
- Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).
- Long, Y., et al. A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri. Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).
- Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods. Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).
