Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Идентификация каспаз и их мотивов, которые расщепляют белки во время вирусной инфекции гриппа А

Published: July 21, 2022 doi: 10.3791/64189
Automatic Translation
1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Otago

Summary

Инфекция вируса гриппа А (IAV) активирует каспазы, расщепляющие хозяина, и вирусные белки, которые, в свою очередь, обладают про- и противовирусными функциями. Используя ингибиторы, интерференцию РНК, сайт-направленный мутагенез и методы западного блоттинга и RT-qPCR, были идентифицированы каспазы в инфицированных клетках млекопитающих, которые расщепляют кортактин хозяина и гистоновые деацетилазы.

Abstract

Caspases, семейство цистеиновых протеаз, организует запрограммированную гибель клеток в ответ на различные раздражители, включая микробные инфекции. Первоначально описанная как происходящая апоптозом, запрограммированная гибель клеток в настоящее время, как известно, охватывает три взаимосвязанных пути: пироптоз, апоптоз и некроптоз, вместе придуманные как один процесс, PANoptosis. Вирусная инфекция (IAV) вызывает PANoptosis в клетках млекопитающих, индуцируя активацию различных каспаз, которые, в свою очередь, расщепляют различные белки-хозяева, а также вирусные белки, что приводит к таким процессам, как активация врожденного противовирусного ответа хозяина или деградация антагонистических белков-хозяев. В связи с этим каспаза 3-опосредованное расщепление кортактина хозяина, гистондеацетилазы 4 (HDAC4) и гистондеацетилазы 6 (HDAC6) было обнаружено как в эпителиальных клетках животных, так и в эпителиальных клетках человека в ответ на инфекцию IAV. Чтобы продемонстрировать это, были использованы ингибиторы, интерференция РНК и сайт-направленный мутагенез, и, впоследствии, расщепление или устойчивость к расщеплению и восстановление кортактина, HDAC4 и HDAC6 полипептидов были измерены с помощью западного блоттинга. Эти методы в сочетании с RT-qPCR образуют простую, но эффективную стратегию идентификации хозяина, а также вирусных белков, подвергающихся опосредованному каспазой расщеплению во время заражения IAV или другими вирусами человека и животных. В настоящем протоколе излагаются репрезентативные результаты этой стратегии, а также обсуждаются пути повышения ее эффективности.

Introduction

Вирус гриппа А (IAV) является прототипным членом семейства Orthomyxoviridae и, как известно, вызывает глобальные эпидемии и непредсказуемые пандемии. IAV вызывает респираторные заболевания человека, грипп, широко известный как «грипп». Грипп является острым заболеванием, которое приводит к индукции про- и противовоспалительных врожденных иммунных реакций хозяина и гибели эпителиальных клеток в дыхательных путях человека. Оба процесса управляются явлением, называемым запрограммированной гибелью клеток1. Передача сигналов о запрограммированной гибели клеток индуцируется, как только различные рецепторы распознавания патогенов воспринимают входящие вирусные частицы в клетках-хозяевах. Это приводит к программированию смерти инфицированных клеток и передаче сигналов соседним здоровым клеткам тремя взаимосвязанными путями, называемыми пироптозом, апоптозом и некроптозом, недавно придуманным как один процесс, PANoptosis1.

PANoptosis включает в себя протеолитическую обработку многих белков-хозяев и вирусных белков от индукции до исполнения. Такая обработка белков в первую очередь возглавляется семейством цистеиновых протеаз, называемых каспазами 1,2. Известно до 18 каспаз (от каспазы 1 до каспазы 18). Большинство каспаз экспрессируются как прокаспазы и активируются путем прохождения собственной протеолитической обработки либо автокатализом, либо другими каспазами4 в ответ на стимул, такой как вирусная инфекция. PANoptosis IAV-инфицированных клеток считался защитным механизмом хозяина, но IAV разработал способы уклонения и использования его для облегчения его репликации 1,2,5,6. Одним из них является антагонизм факторов хозяина посредством опосредованного каспазой расщепления или деградации, которые либо по своей сути являются противовирусными, либо мешают одной из стадий жизненного цикла IAV. С этой целью было обнаружено, что факторы хозяина, кортактин, HDAC4 и HDAC6 подвергаются опосредованному каспазой расщеплению или деградации в инфицированных IAV эпителиальных клетках 7,8,9. HDAC4 и HDAC6 являются анти-IAV факторами 8,10, а кортактин препятствует репликации IAV на более поздней стадии инфекции, потенциально во время вирусной сборки и почкования11.

Кроме того, также активируются различные каспазы, которые, в свою очередь, расщепляют несколько белков, чтобы активировать воспалительную реакцию хозяина во время инфекции IAV 1,2. Кроме того, нуклеопротеин (NP), белок М2 ионного канала IAV 12,13,14 и различные белки других вирусов 3,15,16 также подвергаются каспазно-опосредованному расщеплению во время инфекции, что влияет на вирусный патогенез. Поэтому существует постоянная потребность в изучении опосредованного каспазой расщепления или деградации белков-хозяев и вирусных белков во время IAV и других вирусных инфекций, чтобы понять молекулярную основу вирусного патогенеза. В настоящем описании представлены способы (1) оценки расщепления или деградации таких белков каспазами, (2) идентификации этих каспаз и (3) локализации участков расщепления.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Регулирующие разрешения были получены от Институционального комитета по биологической безопасности Университета Отаго для работы с IAV и клетками млекопитающих. Для настоящего исследования использовались клетки собачьей почки Мадина-Дарби (MDCK) или альвеолярные эпителиальные клетки A549 легких человека и подтипы IAV H1N1. IAV был выращен в куриных яйцах, как описано в другом месте17. Стерильные и асептические условия использовались для работы с клетками млекопитающих, а для работы с подтипами IAV использовались установка уровня биобезопасности 2 (или физическая изоляция 2) и шкаф биобезопасности класса II.

1. Оценка расщепления или деградации белков в IAV-инфицированных клетках каспазами

  1. Семена 3 x 105 клеток MDCK или A549 на лунку в 12-луночной клеточной культуральной пластине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании клеток MDCK убедитесь, что антитело против интересующего белка распознает свои собачьи виды.
  2. Засейте скважины парами, т.е. контрольной парой - одна скважина для неинфицированного пробного образца и одна для зараженного пробного образца - и тестовая пара - одна скважина для образца неинфицированного ингибитора А и одна для образца инфицированного ингибитора А. Увеличьте количество пар с каждым дополнительным ингибитором (см. ссылки 7,8).
  3. Инкубируйте клетки при 37 °C при 5% атмосфере CO2 в течение ночи.
  4. На следующий день заражайте клетки IAV (подтип H1N1 или другой подтип).
    1. Для этого готовят вирусный инокулят путем разведения запаса вируса в 400 мкл бессывороточной минимально необходимой среды (MEM) (см. Таблицу материалов) при кратности заражения (MOI) 0,5-3,0 бляшекообразующих единиц (pfu)/клетка 7,11 (коэффициент удвоения числа клеток при расчете MOI).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для заражения клеток MDCK дополните инокулятор вируса тозилфенилаланилхлорметилкетоном (TPCK)-трипсином в конечной концентрации 1 мкг/мл.
  5. Удалите старую культуральную среду из клеток (этап 1.3) и промыть клетки 1 мл/лунку безсыворочного MEM 2x.
  6. Добавьте к клеткам 400 мкл инокулята вируса (стадия 1.4.1) и инкубируйте их в течение 1 ч при 35 °C при 5% атмосфере CO2 .
  7. Тем временем разбавляют ингибитор каспазы (например, Z-DEVD-FMK), ингибитор лизосомы (например, NH4Cl) или ингибитор протеасомы (например, MG132) (см. Таблицу материалов) при конечной концентрации 40 мкМ, 20 мМ или 10 мкМ, соответственно, в mem7 без сыворотки (см. Таблицу материалов). Последние два ингибитора служат в качестве контроля. Разбавить равный объем растворителя (если он не является водой), используемый для восстановления одного из ингибиторов в среде, свободной от сыворотки, в качестве макета.
  8. Удалите вирусный инокулятор и промыть клетки, как на шаге 1.5 (1x).
  9. Добавьте бессывороточный MEM, 1 мл/лунку, макет или дополненный ингибитором, к клеткам и инкубируйте клетки, как на этапе 1.6. Этот момент времени считается 0-часовой инфекцией.
  10. Через 24 ч соберите клетки, соскоблив их плунжером шприца 1 мл (резиновая сторона) и переложите их в полипропиленовую трубку объемом 1,5 мл.
  11. Центрифугируйте трубку при 12 000 х г в течение 1-2 мин при комнатной температуре. Соберите супернатант с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот супернатант может быть выброшен или использован для анализа бляшек8 для измерения титра высвобождаемого потомства вируса.
  12. Промыть ячейку гранулы 250 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) путем повторного центрифугирования, как на этапе 1.11.
  13. Удаляют супернатант и лизируют клетки, добавляя 80-100 мкл буфера лизиса клеток (50 мМ Tris-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,5% додецилсульфата натрия (SDS), 0,5% дезоксихолата натрия, 1% тритона X-100 и коктейль ингибитора протеазы 1x, см. Таблицу материалов) и вихревое.
  14. Нагревайте трубку при 98 °C в течение 10 мин, чтобы полностью лизировать и приготовить общий клеточный лизат. Храните лизаты при 4 °C для выполнения шагов 1,15-1,17 на следующий день, но для достижения наилучших результатов завершите эти шаги в тот же день.
  15. Оцените количество белка в каждом образце с помощью набора для анализа BCA (см. Таблицу материалов).
  16. Разрешать равные количества белка из неинфицированных и инфицированных образцов с помощью стандартного электрофореза SDS-полиакриламидного геля (SDS-PAGE)11 вместе с маркерами молекулярной массы11.
  17. Перенос белка на мембрану из нитроцеллюлозы или поливинилидендифторида (PVDF) (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: PVDF мембрана может давать высокий фон в некоторых западных блот-тепловизорах; проверьте совместимость.
  18. Выполняют вестерн-блоттинг для обнаружения интересующего белка с помощью способа, описанного в другом месте11.
  19. Сравните уровни белка в полосах инфицированных образцов, обработанных имитацией и ингибиторами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если уровень белка восстановился в инфицированной полосе образца, обработанной ингибитором каспазы, то белок расщепляется или разлагается каспазами. В противном случае он деградирует либо лизосомой, либо протеасомой.
  20. Количественно оценить восстановление белка, измерив его интенсивность полосы в каждой полосе по меньшей мере от трех реплик одного и того же эксперимента и нормализовав его с соответствующей полосой управления нагрузкой.
  21. Используйте любой современный тепловизор и связанное с ним программное обеспечение (см. Таблицу материалов) для изображения западных пятен и количественной оценки восстановления белка.

2. Подтверждение опосредованного каспазой расщепления или деградации белков в IAV-инфицированных клетках РНК-интерференцией

  1. Спроектировать или получить предварительно разработанную малоинтерферирующую РНК (siRNA), нацеленную либо на собачью, либо на человеческую каспазу 3, каспазу 6 и каспазу 7 (каспазы палача1), и нецелевую контрольную siRNA (см. Таблицу материалов).
  2. Доставляют каждую siRNA в клетки MDCK или A549 путем обратной трансфекции 8,11.
  3. Для этого разводят в отдельных пробирках 100 нМ контрольной siRNA или каспазы siRNA или рекомендуемого объема трансфекционного реагента (см. Таблицу материалов) в 100 мкл соответствующей среды (например, OptiMEM, см. Таблица материалов) и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре.
  4. Подготовьте каждое разведение в двух экземплярах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот дубликат включает в себя одну реплику для анализа нокдауна экспрессии каспазы с помощью RT-qPCR или западного блоттинга (если доступны антитела к каспазам) и другую для оценки восстановления интересующего белка путем вестерн-блоттинга.
  5. Смешайте 100 мкл каждого раствора siRNA со 100 мкл раствора трансфекционного реагента (стадия 2.3) и инкубируйте в течение 20-45 мин при комнатной температуре с образованием комплекса реагентов siRNA-трансфекции.
  6. Тем временем разделите и добавьте 1 х 105 клеток MDCK или A549 в 800 мкл полной питательной среды, смешайте с 200 мкл комплекса реагентов siRNA-трансфекции (стадия 2,5) и добавьте 1 мл суспензии в лунку 12-луночной культуральной пластины. Это разведение доводит конечную концентрацию контрольной siRNA или каспазы siRNA до 10 нМ.
  7. Инкубируют клетки при 37 °C при 5% CO2 атмосфере в течение 72 ч.
  8. Соберите клетки из одной реплики, как на этапе 1.10, и обработайте их для проверки или подтверждения нокдауна экспрессии каспазы 3, каспазы 6 и каспазы 7 либо с помощью RT-qPCR, либо западного блоттинга, соответственно, используя стандартные методы и протоколы 8,11.
  9. Инфицировать клетки в другой реплицируемой С помощью IAV, как описано в шагах 1.4-1.9 (без ингибиторов).
  10. Через 24 ч собирают, обрабатывают и анализируют клетки с помощью вестерн-блоттинга, а также измеряют и количественно оценивают восстановление белка, как описано в шагах 1.10-1.20.

3. Сайт-направленный мутагенез для определения местоположения места (участков) расщепления каспазы в полипептиде

  1. Клонировать ген-кодирующий белок, представляющий интерес в плазмидеэкспрессии 11 млекопитающих, или получить его из исследовательской лаборатории или коммерческого источника (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно, если ген клонируется с эпитопной меткой или в виде слияния GFP, чтобы отличить эктопически экспрессированный полипептид от эндогенно экспрессированного во время вестерн-блоттинга.
  2. Используя базы данных субстрата каспазы4 или инструменты выравнивания белка, найдите консенсусные мотивы расщепления каспазы, XXXD и DXXD, на полипептиде. Почти все мотивы расщепления каспазы обладают аспарагиновой кислотой в месте расщепления (P1)3,4.
  3. Мутировать предполагаемую аспарагиновую кислоту P1 в глутаминовую кислоту или неполярную аминокислоту (аланин, валин) путем сайт-направленного мутагенеза с последующим секвенированием ДНК11 с использованием стандартных методов и протоколов.
  4. Доставляют ДНК диких (WT) и мутантных плазмид в клетки MDCK или A549 путем обратной трансфекции11.
    1. Для этого разводят 2 мкг плазмидной ДНК или рекомендуемый объем трансфекционного реагента в 100 мкл соответствующей среды (см. стадию 2.3 и Таблицу материалов) в отдельных пробирках и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Смешайте 100 мкл каждого раствора плазмидной ДНК со 100 мкл раствора трансфекционного реагента и инкубируйте в течение 20-45 мин при комнатной температуре с образованием днк-трансфекционного реагентного комплекса.
  5. Тем временем разделите и добавьте 3 х 105 клеток MDCK или A549 к 800 мкл полной питательной среды, смешайте с 200 мкл комплекса реагентов ДНК-трансфекции и добавьте суспензию 1 мл в лунку 12-луночной культуральной пластины.
  6. Инкубируйте клетки при 37 °C в атмосфере 5% CO2 .
  7. Через 48 ч инфицируют клетки IAV, как описано на этапах 1.4-1.9 (без добавления ингибиторов).
  8. Через 24 ч собирают, обрабатывают и анализируют клетки путем вестерн-блоттинга (если применимо, с использованием антитела к эпитопной метке или GFP). Затем измерьте и количественно оцените восстановление белка, как описано в шагах 1.10-1.20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Лечение ингибитором каспазы 3
Было обнаружено, что полипептиды кортактина хозяина, HDAC4 и HDAC6 подвергаются деградации в ответ на инфекцию IAV как в собачьих (MDCK), так и в человеческих (A549, NHBE) клетках 7,8,9. Используя вышеуказанные подходы, было обнаружено, что IAV-индуцированные хост-каспазы, в частности каспаза 3, вызывают их деградацию 7,8,9. Кортактин разлагался в зависимости от дозы и времени инфекции и независимым от штамма клетки-хозяина и IAV способом7. Аналогичные результаты были получены для HDAC48 и HDAC69. Интересно, что деградация всех трех белков-хозяев совпала с расщеплением вирусного NP 7,8,9, который, как известно, подвергается опосредованному каспазой расщеплению14. Таким образом, была выдвинута гипотеза, что кортактин, HDAC4 и HDAC6 также подвергаются опосредованному каспазой расщеплению и последующей деградации. Чтобы проверить это, сначала IAV-инфицированные клетки обрабатывали ингибитором каспазы 3, а спасение полипептидов кортактина, HDAC4 и HDAC6 было проанализировано с помощью западного блоттинга. Все три полипептида (а также вирусный NP) восстановились после деградации, вызванной инфекцией IAV, после лечения ингибитором каспазы 3 7,8,9. Репрезентативные данные7 для кортактина показаны на фиг.1А. Это восстановление было количественно определено путем измерения интенсивности белковых полос и нормализации значения кортактинового диапазона по значению соответствующей полосы актина (контроль нагрузки). Впоследствии нормализованное значение кортактина в соответствующих неинфицированных образцах считалось 100% для определения его значения в зараженных образцах. Этот метод количественного определения учитывал восстановление полипептида кортактина в инфицированных клетках, обработанных ингибитором каспазы 3, как 78,8% с 20,7% в необработанных инфицированных клетках7 (рисунок 1B).

РНК-интерференционный нокдаун экспрессии каспазы 3
Затем был использован генетический инструмент, РНК-интерференция (RNAi), за которым последовало западное блоттинг для подтверждения роли каспаз в деградации кортактина11 и HDAC48, вызванной инфекцией IAV. В клетках, обедненных каспазой 3 (рисунок 2C)11, полипептиды кортактина (рисунок 2A)11 и HDAC48 были восстановлены в результате деградации, вызванной инфекцией IAV. Однако в клетках, обедненных каспазой 6- или каспазой 7 (рисунок 2C)11, не наблюдалось значительного восстановления уровней полипептида кортактина (рисунок 2A)11. В частности, при количественной оценке и сравнении с их уровнями в соответствующих неинфицированных клетках, как упоминалось выше, уровень полипептида кортактина в инфицированных клетках с истощенной экспрессией каспазы 3 восстановился до 83% с 28,6% в инфицированных клетках с нормальной экспрессией каспазы 3 (Рисунок 2B)11.

Мотивы расщепления каспазы в кортактине и полипептидах HDAC6
Наконец, аминокислотная последовательность в полипептидах кортактина и HDAC6 была просеяна, и, в предполагаемых мотивах расщепления каспазы, аспарагиновая кислота в положении P1 была мутирована до глутаминовой кислоты 9,11. Этот подход идентифицировал аспарагиновую кислоту 116 в полипептиде кортактина11 и аспарагиновую кислоту 1088 в полипептиде HDAC69 как участок расщепления каспазы. Мутация остатков аспарагиновой кислоты в глутаминовую кислоту сделала полипептиды кортактина (рисунок 3A)11 и HDAC69 устойчивыми к деградации, вызванной инфекцией IAV. В частности, при количественной оценке и сравнении с их уровнями в соответствующих неинфицированных клетках, как упоминалось выше, уровень плазмид-экспрессированного мутантного полипептида кортактина в инфицированных клетках составлял 77,9%, тогда как уровень плазмидного экспрессированного полипептида кортактина дикого типа в инфицированных клетках составлял 23,6% (Рисунок 3B)11.

Figure 1
Рисунок 1: Полипептид кортактина подвергается каскадной 3-опосредованной деградации в IAV-инфицированных клетках. (A) Клетки MDCK были инфицированы штаммом вируса гриппа A/New Caledonia/20/1999/H1N1 при MOI 0,5 и впоследствии обработаны как макет или ингибитором каспазы 3 (Cas3-I, 40 мкМ). Через 24 ч кортактин, вирусный NP и полипептиды актина были обнаружены в общих клеточных лизатах путем вестерн-блоттинга. УНИ, неинфицированный; ИНФ, инфицированный. Стрелки указывают на полноразмерный и расщепленный NP. (B) Интенсивность полос кортактина и актина была количественно определена. Затем значение кортактина нормализовали со значением актина. Нормализованное количество кортактина в образцах UNI считалось 100% для определения его количества в соответствующих образцах INF. Представленные данные являются средствами ± SE трех биологических реплик. P = 0,0006, рассчитано с использованием двусторонней ANOVA. ns, не значительный. Эта цифра была изменена по сравнению с Chen et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Нокдаун экспрессии каспазы 3 спас деградацию полипептида кортактина в IAV-инфицированных клетках. (A) Клетки A549 трансфектировались в дубликатах с 10 нМ контрольной (Ctrl), каспазой 3 (Cas3), каспазой 6 (Cas6) или каспазой 7 (Cas7) siRNA. Через 72 ч клетки в одной реплике собирали и обрабатывали для извлечения общей РНК. Клетки в другой репликации были инфицированы подтипом вируса гриппа A/WSN/1933/H1N1 при MOI 3,0. Через 24 ч кортактин, вирусный NP и актин полипептиды были обнаружены методом вестерн-блоттинга. УНИ, неинфицированный; ИНФ, инфицированный. (B) Интенсивность полос кортактина и актина была количественно определена, и значение кортактина было нормализовано со значением актина. Затем нормализованное количество кортактина в образцах UNI считалось 100% для определения его количества в соответствующих образцах INF. Представленные данные являются средствами ± SE трех биологических реплик. P < 0,0001, ***P = 0,0007, ***P = 0,0002, рассчитано с использованием двусторонней ANOVA. ns, не значительный. (C) Общая РНК, извлеченная выше, была преобразована в кДНК, которая затем использовалась в качестве шаблона для обнаружения уровней каспазы 3, каспазы 6, каспазы 7 и актин-мРНК с помощью RT-qPCR. В качестве эталона использовался уровень актиновой мРНК, а уровень мРНК каждой каспазы в контрольных клетках siRNA (Ctrl) и соответствующих трансфектированных клеток caspase siRNA (Cas) рассчитывали с использованием стандартного метода 2−ΔΔCT . P < 0,0001, рассчитанный с использованием двусторонней ANOVA. Эта цифра была изменена по сравнению с Chen et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Мутация аспарагиновой кислоты 116 в глутаминовую кислоту сделала полипептид кортактина устойчивым к деградации, вызванной инфекцией IAV. (A) Клетки MDCK были трансфектированы плазмидой, экспрессирующей слияние дикого типа (WT) или мутировавшего (D116E) GFP-кортактина. Через 48 ч клетки были инфицированы подтипом вируса гриппа A/WSN/1933/H1N1 при MOI 3,0. Через 24 ч ГФП-кортактин, вирусный NP и актин полипептиды были обнаружены методом западного блоттинга. УНИ, неинфицированный; ИНФ, инфицированный. (B) Интенсивность полос кортактина и актина была количественно определена, и значение кортактина было нормализовано со значением актина. Затем нормализованное количество кортактина в образцах UNI считалось 100% для определения его количества в соответствующих образцах INF. Представленные данные являются средствами ± SE трех биологических реплик. **P = 0,001, рассчитано с использованием двусторонней ANOVA. ns, не значительный. Эта цифра была изменена по сравнению с Chen et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Установлено, что вирусы адаптируют факторы и пути хозяина к своей выгоде. В свою очередь, клетки-хозяева сопротивляются этому, используя различные стратегии. Одной из таких стратегий является PANoptosis, который клетки-хозяева используют в качестве противовирусной стратегии против вирусных инфекций. Тем не менее, вирусы, такие как IAV, разработали свои собственные стратегии противодействия PANoptosis и используют его в своих интересах 1,3,6. Это взаимодействие включает в себя расщепление различных белков-хозяев и вирусных белков каспазами. Идентификация этих каспаз и их участков расщепления в субстратных белках важна для выяснения механизмов и значения такого взаимодействия.

С этой целью были использованы стандартные биохимические и молекулярные методы для идентификации каспаз и участков их расщепления в кортактине хозяина, HDAC4 и HDAC6 7,8,9,11. Протоколы, описанные выше, могут быть использованы для таких исследований с участием вирусов гриппа, других вирусов млекопитающих, других микробов и внешних раздражителей, таких как токсины и химические вещества. Кроме того, эти методы могут быть воспроизведены в стандартной лаборатории молекулярной биологии с соответствующими навыками и не требуют специализированного оборудования и обучения программному обеспечению. Формат пластины для 12-луночной клеточной культуры был успешно адаптирован для этих и аналогичных исследований для получения достаточного количества образцов для последующего анализа с помощью западного блоттинга и RT-qPCR. Тем не менее, по мере необходимости, этот формат может быть уменьшен или увеличен соответствующим образом. При проведении эксперимента с участием ингибитора каспазы в первый раз предлагается оценить, подвергается ли интересующий белок деградации, опосредованной каспазой (Z-VAD-FMK) наряду с ингибитором лизосомы и протеасомы. Кроме того, в дополнение к NH4Cl и MG132 могут использоваться другие ингибиторы лизосом и протеасом, такие как бафиломицин А и эпоксомицин, соответственно. После положительных результатов с ингибитором панкаспазы могут быть использованы либо специфические ингибиторы отдельных каспаз, либо могут быть использованы РНК-интерференции. Для первых важно оптимизировать эффективные ингибирующие концентрации, чтобы избежать токсичности для типа клеток-мишеней и неспецифических результатов.

Генетический инструмент, такой как РНК-интерференция или CRISPR, должен быть использован рядом, чтобы подтвердить участие каспаз, потому что ингибиторы перекрестно реагируют. Альтернативно, может быть проведена РНК-интерференция или экран CRISPR, индивидуально нацеленный на все известные каспазы. Пары праймеров siRNA, gRNA и RT-qPCR ко всем известным каспазам могут быть приобретены как предварительно разработанные или разработанные с использованием онлайн-инструментов. Кроме того, две или более каспазы могут быть истощены одновременно для оценки последовательного или кооперативного расщепления полипептидов (эта стратегия недавно была использована в еще не опубликованном исследовании). Считается, что РНК-интерференция является идеальным инструментом для исследования взаимодействия клеток вируса и хозяина. Последнее требует контролируемого манипулирования экспрессией генов хозяина, чтобы клетки-хозяева оставались относительно жизнеспособными для вирусной инфекции и завершения жизненного цикла для отображения фенотипа этой манипуляции. Однако оптимизация эффективной концентрации siRNA и комбинации реагентов siRNA-трансфекции необходима для каждого типа клеток для оптимального соотношения нокдауна и жизнеспособности для последующей инфекции.

Чтобы найти предполагаемые мотивы расщепления каспазы, были разработаны многие базы данных, такие как CASBAH18, CaspDB19, CutDB20, DegraBase21, MEROPS22 и TopFIND 23,24. Был проведен визуальный скрининг, чтобы найти эти мотивы на полипетиде HDAC69, но для кортактина11 был использован CaspDB (хотя веб-сайт CaspDB был недоступен в последнее время). Эти мотивы были успешно подтверждены как места расщепления каспазы путем мутации аспарагиновой кислоты P1 в глутаминовую кислоту. Однако сначала предлагается мутация аспарагиновой кислоты в неполярный аминокислотоподобный аланин или валин, потому что некоторые каспазы могут расщепляться после глутаминовой кислоты P14. Это упражнение может быстро привести к идентификации места (мест) расщепления каспазы, но может потребовать генерации десятков мутантов, если целевой полипептид богат аспарагиновыми кислотами, а предполагаемые целевые мотивы неканонические. Для доставки плазмид (и siRNA) в клетки может быть проведена прямая, а не обратная, трансфекция. Кроме того, дозу инфекции и кинетику времени следует выполнять с использованием 4%-20% градиента SDS-PAGE для вестерн-блоттинга для оценки кинетики деградации полипептидов и идентификации любых продуктов расщепления меньшего размера. Наконец, чтобы подтвердить интересующий белок в качестве прямого субстрата каспазы, могут быть разработаны биохимические анализы in vitro, содержащие очищенные каспазы и целевые белки (WT или мутантные) и любые кофакторы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У автора нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Автор признает Дженнифер Типпер, Билана Ли, Джесси ванВестринена, Кевина Харрода, Да-Юань Чена, Фарджану Ахмед, Соню Мрос, Кеннета Ямаду, Ричарда Уэбби, BEI Resources (NIAID), Совет по исследованиям в области здравоохранения Новой Зеландии, Фонд Мориса и Филлис Пайкель (Новая Зеландия), Фонд H.S. и J.C. Anderson Trust (Данидин), а также Департамент микробиологии и иммунологии и Школу биомедицинских наук (Университет Отаго).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A549 cells ATCC CRM-CCL-185 Human, epithelial, lung
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434
Caspase 3 Inhibitor Sigma-Aldrich 264156-M Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
Goat anti-NP antibody Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 13778150
MDCK cells ATCC CCL-34 Dog, epithelial, kidney
MG132 Sigma-Aldrich M7449
Minimum Essential Medium (MEM) ThermoFisher Scientific 11095080 Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1 Sigma-Aldrich SIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2  LI-COR Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion  Addgene 50728 Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 Sigma-Aldrich NM_004346 siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 Sigma-Aldrich NM_001226 siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 Sigma-Aldrich NM_001227 siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs Sigma-Aldrich KSPQ12012 Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membrane Cytiva (Fomerly GE Healthcare) 10600003
Rabbit anti-actin antibody Abcam ab8227
Rabbit anti-cortactin antibody Cell Signaling 3502
Rabbit anti-GFP antibody Takara 632592
SeeBlue Pre-stained Protein Standard ThermoFisher Scientific LC5625
Transfection medium, Opti-MEM ThermoFisher Scientific 11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 Merck
Trypsin, TPCK-Treated Sigma-Aldrich 4370285

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -D. PANoptosis in microbial infection. Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).
  2. Zheng, M., Kanneganti, T. -D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).
  3. Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).
  4. Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).
  5. Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection. Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).
  6. Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation. Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).
  7. Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells. Virology. 497, 146-156 (2016).
  8. Galvin, H. D., Husain, M. Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4. Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).
  9. Husain, M., Harrod, K. S. Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells. FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).
  10. Husain, M., Cheung, C. Y. Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules. Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).
  11. Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres. Viruses. 12 (1), 87 (2020).
  12. Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).
  13. Zhirnov, O. P., Klenk, H. -D. Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus. Virology. 394 (1), 57-63 (2009).
  14. Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells. Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).
  15. Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells. PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940 (2019).
  16. Richard, A., Tulasne, D. Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis. Cell Death & Disease. 3 (3), 277 (2012).
  17. Brauer, R., Chen, P. Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e52421 (2015).
  18. Lüthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: A searchable database of caspase substrates. Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
  19. Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates. PLoS One. 9 (10), 110539 (2014).
  20. Igarashi, Y., et al. CutDB: A proteolytic event database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).
  21. Crawford, E. D., et al. The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).
  22. Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. MEROPS: The peptidase database. Nucleic Acids Research. 32, Database issue 160-164 (2004).
  23. Lange, P. F., Overall, C. M. TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function. Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).
  24. Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 290-297 (2015).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 185
Идентификация каспаз и их мотивов, которые расщепляют белки во время вирусной инфекции гриппа А
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Husain, M. Identifying Caspases and… More

Husain, M. Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection. J. Vis. Exp. (185), e64189, doi:10.3791/64189 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter