Summary
Este artículo presenta los protocolos paso a paso para la mutagénesis CRISPR/Cas9 de la mosca oriental de la fruta Bactrocera dorsalis. Los pasos detallados proporcionados por este protocolo estandarizado servirán como una guía útil para generar moscas mutantes para estudios de genes funcionales en B. dorsalis.
Abstract
La mosca oriental de la fruta, Bactrocera dorsalis, es una especie de plaga altamente invasiva y adaptativa que causa daños a los cítricos y a más de 150 cultivos frutales en todo el mundo. Dado que las moscas adultas de la fruta tienen una gran capacidad de vuelo y las hembras ponen sus huevos debajo de las pieles de la fruta, los insecticidas que requieren contacto directo con la plaga generalmente funcionan mal en el campo. Con el desarrollo de herramientas de biología molecular y tecnología de secuenciación de alto rendimiento, muchos científicos están tratando de desarrollar estrategias de manejo de plagas respetuosas con el medio ambiente. Estos incluyen ARNi o pesticidas basados en la edición de genes que regulan a la baja o silencian los genes (objetivos moleculares), como los genes olfativos involucrados en el comportamiento de búsqueda, en varias plagas de insectos. Para adaptar estas estrategias para el control de la mosca oriental de la fruta, se necesitan métodos efectivos para la investigación genética funcional. Los genes con funciones críticas en la supervivencia y reproducción de B. dorsalis sirven como buenos objetivos moleculares para la eliminación y / o silenciamiento de genes. El sistema CRISPR/Cas9 es una técnica fiable utilizada para la edición de genes, especialmente en insectos. Este artículo presenta un método sistemático para la mutagénesis CRISPR / Cas9 de B. dorsalis, incluido el diseño y la síntesis de ARN guía, la recolección de embriones, la inyección de embriones, la cría de insectos y la detección de mutantes. Estos protocolos servirán como una guía útil para generar moscas mutantes para los investigadores interesados en estudios de genes funcionales en B. dorsalis.
Introduction
La mosca oriental de la fruta, Bactrocera dorsalis , es una especie cosmopolita de plaga de insectos que causa daños a más de 150 especies de cultivos frutales, incluyendo guayaba, mango, Eugenia spp., cereza de Surinam, cítricos, níspero y papaya1. Los daños causados solo en la provincia de Guangdong (China) se estiman en más de 200 millones de yuanes. Las hembras adultas insertan sus huevos debajo de la piel de los frutos maduros o maduros, causando caries y abscisión del fruto, lo que disminuye la calidad del fruto y el rendimiento general del cultivo2. Dado que las moscas adultas de la fruta tienen una gran capacidad de vuelo y sus larvas perforan la piel de la fruta, los insecticidas que requieren contacto directo con la plaga funcionan mal en el campo. Además, el uso extensivo de insecticidas ha aumentado la resistencia de B. dorsalis contra diversos productos químicos agrícolas, lo que dificulta aún más el control de estas plagas dañinas3. Por lo tanto, se necesita desesperadamente el desarrollo de estrategias de manejo de plagas efectivas y respetuosas con el medio ambiente.
Recientemente, con el desarrollo de herramientas biológicas moleculares y tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, los científicos están tratando de desarrollar estrategias de manejo de plagas respetuosas con el medio ambiente, como el ARNi, que se dirigen a la funcionalidad de genes importantes (objetivos moleculares) de varias plagas de insectos. Los genes que son críticos para la supervivencia y reproducción de la plaga pueden identificarse a través de estudios genéticos funcionales y además sirven como posibles objetivos moleculares para la mejora de herramientas de manejo de plagas específicamente específicas y respetuosas con el medio ambiente4. Para adaptar tales estrategias al control de la mosca oriental de la fruta, se necesitan métodos efectivos para la investigación genética funcional.
El sistema de endonucleasa CRISPR/Cas (clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) fue descubierto inicialmente en bacterias y arqueas y resultó ser un mecanismo adaptativo implicado en el reconocimiento y degradación del ADN intracelular extraño, como el introducido por bacteriófagos infectantes5. En el sistema CRISPR tipo II, la endonucleasa Cas9 es guiada por pequeños ARN asociados (crRNA y tracrRNA) para escindirel ADN 6,7,8 y se ha convertido en una de las herramientas más utilizadas para la edición de genes hasta la fecha9,10,11,12. Dado que el sistema CRISPR / Cas9 tiene varias ventajas, como la alta eficiencia del silenciamiento génico y el bajo costo, ya se ha aplicado para la edición de genes en varias especies de insectos, incluyendo Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 y Bombyx mori16. En B. dorsalis, los genes relacionados con el color del cuerpo, el dimorfismo del ala y la determinación del sexo han sido eliminados con éxito utilizando CRISPR / Cas917,18,19. Sin embargo, los procedimientos detallados para la aplicación de CRISPR/Cas9 en este insecto siguen siendo incompletos. Además, algunos pasos proporcionados por los investigadores para la edición de genes de B. dorsalis también son variados y necesitan estandarización. Por ejemplo, las formas de Cas9 fueron diferentes en las referencias publicadas17,18,19.
Este documento proporciona un método sistemático para la mutagénesis de B. dorsalis utilizando el sistema CRISPR / Cas9, incluido el diseño y la síntesis de ARN guía, la recolección de embriones, la inyección de embriones, la cría de insectos y la detección de mutantes. Este protocolo servirá como una guía útil para generar moscas mutantes para los investigadores que estén interesados en los estudios de genes funcionales en B. dorsalis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Diseño de diana y síntesis in vitro de sgRNA
- Predecir la estructura de los genes diana de interés y determinar los límites entre exones e intrones mediante el análisis bioinformático del genoma de B. dorsalis (las aplicaciones de software utilizadas aquí se enumeran en la Tabla de materiales).
NOTA: BLAT20 se utilizó para buscar posibles loci de genes en el genoma. Las lecturas de RNA-seq de alta calidad (transcriptoma) se alinearon con los loci de genes adquiridos utilizando Hisat221. Samtools22 se utilizó para generar los archivos bam ordenados. Los archivos bam ordenados se introdujeron en Stringtie223 para proporcionar las transcripciones de ensamblaje. Las transcripciones ensambladas y la información de loci de genes fueron combinadas por Transdecoder24. Los resultados adquiridos de Transdecoder fueron visualizados en las herramientas IGV25 y se pudieron determinar los límites entre exones e intrones. - Identificar las regiones diana adecuadas dentro del sitio del gen diana candidato. La longitud total debe ser inferior a 750 pb para una secuenciación más conveniente (Figura 1B). Diseñar cebadores específicos para amplificar el área diana a partir de ADN genómico de tipo salvaje mediante PCR (Figura 1B) (Primers: F-primer: AACATTGAATATCTGGAATCAGGTAAACT, R-primer: CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). Clone los productos de PCR en un vector final contundente26 y seleccione 20 colonias bacterianas individuales para su secuenciación para determinar qué tan conservada está la región objetivo en las poblaciones de insectos de laboratorio.
- Un sitio objetivo típico contiene un motivo de secuencia de tres nucleótidos (NGG o CCN) y una secuencia de 20 pb adyacente a los motivos NGG o CCN (20 pb-NGG o CCN-20 pb). Explotar los sitios objetivo candidatos contra el genoma de B. dorsalis y asegurarse de que la eficiencia prevista sea lo suficientemente alta y la tasa de desorientación sea baja; Varios programas de software de código abierto pueden predecir esto automáticamente. En este protocolo, sgRNAcas9 -AI27 se utiliza para seleccionar y evaluar los objetivos óptimos. Los detalles de uso se pueden encontrar en el manual de este software.
NOTA: Se favorecen los posibles sitios diana cerrados a la UTR 5' del gen diana y 1-2 Gs al inicio de la secuencia de 20 pb. Para lograr una gran deleción que se identificará mediante PCR seguida de electroforesis en gel de agarosa, se recomienda diseñar dos dianas28 separadas por más de 100 pb (Figura 1C). - Utilice el kit de síntesis de ARNg disponible comercialmente para generar el ARNg diseñado. Realice cada paso siguiendo la guía del usuario. Resuspender el producto de ARNg en agua libre de nucleasas, cuantificar la concentración utilizando un espectrofotómetro UV-Vis y almacenar a -80 °C antes de su uso (la concentración de ARNg único sintetizado con éxito [10 μL] con el kit utilizado aquí es de aproximadamente 4000-6000 ng / μL, o incluso más).
NOTA: Aunque la generación de las moscas mutantes es el primer paso para todos los investigadores, el control negativo apropiado para el experimento/análisis aguas abajo es crítico. Generar estos controles junto con los mutantes ahorra tiempo y esfuerzo a los investigadores. Por ejemplo, establezca sgRNA codificado como control negativo.
2. Recogida y preparación de embriones
- Coloque las pupas de B. dorsalis en jaulas de plástico. Proporcione una mezcla de azúcar y levadura (1:1) como alimento junto con una fuente de agua después de que los adultos se cierren (Figura 2A, B). Las condiciones de crianza son 55% de humedad relativa (HR), 26.5 ° C y un ciclo de 14:10 L / D (luces encendidas a las seis de la mañana, luces apagadas a las ocho de la tarde).
- La mayoría de los adultos alcanzan la madurez sexual 10 días después de la emergencia. Proporcione un ambiente adecuado para ayudar a las moscas adultas a aparearse tanto como sea posible. Lo ideal es utilizar un soporte de luz con una luz de 30-50 lux. Esto puede mejorar la fecundidad de las hembras, por lo tanto, mejorar la eficiencia de la recolección de embriones.
NOTA: Poner a los adultos (de 5 a 6 días después de la emergencia) en un ambiente poco iluminado (<100 lux) puede promover el apareamiento. Generalmente, el pico de oviposición ocurre a las 03:00 p.m. (14:10/L:D, luces encendidas a las 06:00 a.m., luces apagadas a las 08:00 p.m.); Para obtener suficientes embriones, se recomienda colocar cámaras de oviposición en las jaulas 30 min antes de las 15:00 horas. - Coloque una gasa de malla 200 en la cámara de oviposición, a 1-2 mm de distancia de la tapa de la cámara. Esto ayudará a obtener tantos embriones como sea posible.
NOTA: Evite dejar que los embriones se empapen en jugo de naranja o se froten con una gasa, ya que esto puede disminuir significativamente la tasa de supervivencia de los embriones. - Coloque una nueva cámara de oviposición en la jaula cuando la configuración de microinyección esté lista. Recoja los embriones cada 10 minutos con un cepillo fino y húmedo, luego alinearlos en una placa de inyección de fabricación propia (plexiglás con una longitud de 55 mm, un ancho de 13.75 mm y una altura de 5 mm, Se abre una ranura poco profunda de 45 mm x 5 mm x 0.3 mm en el medio para facilitar la colocación de huevos). Si los embriones tienen una presión interna alta, la desecación leve a <10% HR durante 10 minutos es opcional. Sumerja los embriones en aceite de halocarbono durante la inyección para evitar una mayor desecación (Figura 2C).
3. Microinyección del embrión
- Prepare la aguja de inyección de vidrio con un extractor de micropipetas.
NOTA: Es importante establecer los parámetros siguiendo la guía del usuario. En estos protocolos, se pueden hacer diferentes formas de aguja utilizando los parámetros sugeridos por el manual del extractor de micropipetas. El capilar de vidrio debe estar lo más limpio posible para evitar que el polvo obstruya la aguja. - Prepare la solución de trabajo. Mezclar la proteína Cas9 y el sgRNA correspondiente a las siguientes concentraciones de trabajo: sgRNA, 300 ng/μL; Proteína Cas9, 150 ng/μL. Agregue 1 μL de rojo fenol a la mezcla para que sirva como una forma conveniente de marcar los embriones inyectados. Coloque la mezcla preparada en hielo para evitar la degradación del sgRNA.
NOTA: Utilice puntas de pipeta sin nucleasa y tubos de PCR. La concentración de proteína Cas9 debe ser inferior o igual a 150 ng/μL; Las concentraciones más altas son tóxicas y disminuyen significativamente la tasa de supervivencia del embrión. Cas9 también podría administrarse en formato de ADN o ARNm para lograr una edición exitosa de genes17,19. En este protocolo, se recomienda la proteína Cas9 ya que los ARNm son susceptibles a la degradación, y la expresión de la proteína Cas9 del ADN plásmido lleva tiempo para la transcripción y traducción. - Establezca los parámetros para el inyector. El programa inicial es Pi-500 hPa, Ti-0.5 s y PC-200 hPa. Ajuste estos parámetros aún más según sea necesario durante la microinyección.
- Añadir 3 μL de la mezcla en la aguja de inyección. Evite introducir burbujas de aire que puedan obstruir la aguja. Abra la aguja con un micromolinillo.
- Conecte la aguja al micromanipulador de acuerdo con la guía del usuario (Figura 2E).
- Coloque el plato con embriones alineados en la mesa objetiva. Ajustar la posición de la micropipeta bajo un microscopio óptico fino, colocando la micropipeta y el embrión en el mismo plano. Ajuste el volumen de la gota presionando el pedal; Se recomienda 1/10 del volumen de embriones.
- Inserte la punta de la aguja en la parte posterior (polo vegetal) del embrión. Administre las mezclas en el embrión presionando el pedal del inyector. Si se agrega rojo fenol, se observa un color ligeramente rojizo al instante.
NOTA: Un pequeño volumen de reflujo citoplasmático del agujero de alfiler no disminuirá la tasa de supervivencia del embrión. La inyección de 200 embriones es suficiente para la mutagénesis exitosa de un gen. Agregar más aceite de halocarbono para sumergir los embriones puede prevenir una mayor desecación. La inyección debe realizarse antes de la formación de células polares, lo que garantiza que cada mutación pueda heredarse de manera eficiente.
4. Cría de insectos después de la inyección
- Coloque la placa de inyección con los embriones inyectados en una cámara climática artificial mantenida al 55% HR, 26.5 ° C y un ciclo de 14:10 L / D (luces encendidas a las seis de la mañana, luces apagadas a las ocho de la tarde).
- Después de la inyección, la formación del embrión suele tardar 24 h en completarse y 36 h en eclosionar. Use un cepillo de punta fina para transferir las larvas a una dieta larvaria preparada. Recoja las larvas tres o cuatro veces al día hasta que no eclosionen más. En general, las larvas tardan de 2 a 3 días en terminar de eclosionar y pupan dentro de los 7 días.
NOTA: Se utilizó una dieta a base de maíz para alimentar a las larvas. La receta contiene 150 g de harina de maíz, 150 g de plátano, 0,6 g de benzoato de sodio, 30 g de levadura, 30 g de sacarosa, 30 g de toalla de papel, 1,2 mL de ácido clorhídrico y 300 mL de agua29. Minimizar el tiempo que las larvas se dejan en aceite (<2 h). Mueva las larvas a la dieta inmediatamente después de la eclosión en la medida de lo posible. Esto puede aumentar significativamente las tasas de supervivencia y pupación. No proporcione demasiada dieta (una dieta con 2/3 de una placa de Petri de 90 mm es suficiente para 30 larvas); de lo contrario, se moverá y disminuirá la tasa de supervivencia larval. - Ponga las larvas maduras en la arena húmeda para pupar. La etapa de pupación dura unos 10 días. Mueva las pupas a jaulas de plástico antes de que comience la eclosión.
5. Cribado mutante
- Un diagrama de flujo de la criba mutante se ilustra en la Figura 3A. Cruza adultos G0 obtenidos por microinyección con adultos de tipo salvaje para obtener líneas heterocigotas. Verificar el tipo de mutaciones que porta la descendencia (G1) mediante genotipado.
- Autocruzamiento de G1 con el mismo genotipo mutante para obtener líneas homocigotas en G2. Si los genotipos de los mutantes en G1 son completamente diferentes, cruce los heterocigotos con moscas de tipo salvaje. Las líneas homocigotas se obtienen generalmente en G3. Mantener dos o tres líneas homocigotas para experimentos posteriores de fenotipado.
- Utilice el ADN genómico de un pupario fresco o de una sola pierna media de adultos individuales para realizar el genotipado. Diseñar cebadores específicos para amplificar el área objetivo; Los cebadores deben establecer al menos 50 bps aguas arriba y aguas abajo del sitio de destino. Consulte el paso 1.2 para obtener los detalles de la imprimación.
NOTA: Dado que la cantidad de ADN en un pupario es extremadamente baja, se recomiendan kits de extracción de ADN disponibles comercialmente. - Realizar PCR utilizando las siguientes condiciones de ciclo: 98 °C durante 3 min, seguido de 35 ciclos de 98 °C durante 10 s, 15 s a una temperatura de recocido apropiada para los cebadores diseñados, 72 °C durante 35 s, seguido de una extensión final de 72 °C durante 10 min.
- Secuenciar los productos de PCR purificados. Cuando se detectan múltiples picos superpuestos adyacentes al sitio de destino (Figura 3B), se ha producido una mutagénesis exitosa. Subclonar los productos de PCR purificados en un vector de extremo romo y seleccionar 10 colonias bacterianas individuales para su secuenciación para verificar el genotipo de los mutantes. Mantener las líneas con mutaciones de desplazamiento de marco y terminaciones de traslación prematuras (Figura 3C).
NOTA: No es necesario realizar la secuenciación de un solo clon para verificar el genotipo de los individuos G0. Simplemente secuencie los productos de PCR y mantenga a los individuos con múltiples picos de superposición obvios adyacentes al sitio objetivo. Después de la inyección inicial, se recomienda seleccionar 10 embriones para extraer ADN genómico y secuenciar los productos de PCR según los estándares del paso 5.3. Esto puede ayudar a predecir las tasas de mutación por adelantado. En este estudio, la secuenciación de Sanger para determinar el genotipo fue realizada por una compañía de secuenciación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este protocolo presenta pasos detallados para el desarrollo de mutantes de B. dorsalis utilizando la tecnología CRISPR / Cas9, incluidos los resultados representativos de la selección de ADNg, la recolección de embriones y microinyección, el mantenimiento de insectos y la detección de mutantes.
El ejemplo del sitio objetivo del gen seleccionado se encuentra en el tercer exón (Figura 1C). Este sitio está altamente conservado, y se detectó una sola banda por electroforesis en gel para el molde de ADN para gRNA sintético (Figura 1D) y ARNg obtenido por transcripción in vitro (Figura 1E).
La inyección en 200 huevos recién cosechados se realizó como se describe en la sección 3. Los embriones se mantuvieron siguiendo los protocolos descritos en los pasos 4.1-4.3. Según lo detectado por la secuenciación de los productos de PCR, el 80% de los individuos G0 son mutantes en mosaico (Tabla 1). Aquí, se seleccionaron mutantes con deleción de 8 pb que resultó en la terminación prematura de la traducción de aminoácidos en G1 (Figura 3C). Esto debería conducir a cambios en las funciones correspondientes de este producto génico en B. dorsalis. Los G1 seleccionados se cruzaron con heterocigotos G2 para obtener heterocigotos G2. Los heterocigotos y homocigotos G2 se recuperaron en la siguiente generación, lo que demuestra que este esquema es exitoso para el desarrollo de mutantes de B. dorsalis y podría aplicarse más ampliamente en estudios de genes funcionales en esta especie y especies estrechamente relacionadas.
Figura 1: Preparación de sgRNA. (A) Procedimientos generales para la preparación de sgRNA. (B) Área diana amplificada por PCR a partir de ADNg (100 pb). (C) Ejemplo de estructura del gen objetivo y sitio de escisión objetivo por Cas9. (D) Ensamblaje por PCR de sgRNA (~100 pb). (E) Síntesis de sgRNA por transcripción y purificación in vitro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Microinyección embrionaria . (A) El proceso y método de inyección. (B) Dispositivo de recolección de embriones, poniendo huevos en una gasa. (C) Alinee los embriones con agua y cúbralos con aceite de halocarbono. (D) Extractor de micropipetas. (E) Toda la configuración del sistema de microinyección. Microscopio (izquierda), microinyector y micromanipulador (centro) y bomba de aire automática (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cribado de mutantes . (A) Apareamiento de mutantes y adquisición de homocigotos. (B) Productos de PCR del genoma mutante que genera un conjunto distinto de picos en el objetivo. (C) Uno de los tipos de mutación y cambios de aminoácidos. Las mutaciones de deleción conducen a la terminación prematura de la traducción. Abreviaturas: HE = heterocigotos, HO = homocigotos. Control: embrión inyectado con sgRNAs revueltos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Mezcla de inyección | Embriones inyectados | Larvas eclosionadas | Pupas | Mosaico G0 | ||
| (Mosaico/Total adultos) | ||||||
| BdorOrco_gRNA1 (300 ng/μL) | 200 | 83 | 66 | 49/60 (81%) | ||
| BdorOrco_gRNA2 (300 ng/μL) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μL) | ||||||
| Rojo fenol (1 μL) | ||||||
| BdorOrco_scrambled gRNA1 (300 ng/μL) | 200 | 78 | 76 | 0/70 (0%) | ||
| BdorOrco_scrambled gRNA2 (300 ng/μL) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μL) | ||||||
| Rojo fenol (1 μL) | ||||||
Tabla 1: Supervivencia de B. dorsalis y mutagénesis después de microinyecciones.
| Problema | Causa(s) potencial(es) | Soluciones | |
| Recolección de embriones ineficiente | 1. Los adultos están en malas condiciones | 1.Asegurar la disponibilidad de alimentos y agua, especialmente el contenido de azúcar de los alimentos. | |
| 2. Apareamiento insuficiente | 2. Apareamiento por adelantado en condiciones de tenue de 30-50 lux. Es mejor seleccionar adultos apareados de 12 a 15 días de edad. | ||
| Mala incubabilidad de los huevos después de la inyección | 1. Embriones de mala calidad | 1. Escoja huevos frescos y regordetes y cepíllelos suavemente con un cepillo empapado en agua. | |
| 2. La aguja no encaja | 2. La punta de la aguja es lo más pequeña posible para minimizar el daño al óvulo durante la inyección. | ||
| 3. Cría inadecuada de huevos después de la inyección | 3. Los huevos deben mantenerse hidratados después de la inyección para evitar que la deshidratación se seque. Los huevos también se pueden transferir directamente a los alimentos después de la inyección. | ||
| Baja tasa de supervivencia larvaria | 1. La comida mohosa no es adecuada para el crecimiento de larvas | 1. Para las larvas recién eclosionadas, agregue una pequeña cantidad de alimento. Demasiada comida se moverá o secará y afectará el crecimiento de las larvas. | |
| 2. Larvas recién nacidas empapadas en aceite durante mucho tiempo | 2.Las larvas recién nacidas deben transferirse al alimento larvario a tiempo o los huevos deben recogerse directamente en el alimento después de la inyección. | ||
| La tasa de mutación en adultos es baja | 1. Baja calidad del ARNg | 1. Operación experimental rigurosa para sintetizar ARNg de alta calidad para prevenir la degradación. | |
| 2. Los objetivos ineficientes conducen a objetivos fuera de los objetivos | 2. Selección de objetivos de alta eficiencia a través de lo mencionado en nuestra discusión. | ||
Tabla 2: Posibles problemas con la construcción de mutantes, posibles causas y soluciones.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El sistema CRISPR/Cas9 es la herramienta de edición de genes más utilizada y tiene varias aplicaciones, como la trepida 30, el mejoramiento de cultivos31 y los estudios básicos de funciones genéticas32. Este sistema ya se ha aplicado para la edición de genes en varias especies de insectos y ha servido como una herramienta eficaz para el estudio de genes funcionales en plagas. Los protocolos que presentamos aquí estandarizan el procedimiento de diseño y síntesis de ARN guía, recolección de embriones, inyección de embriones, cría de insectos y cribado de mutantes. Además, se agregó una tabla de solución de problemas para resumir el problema potencial de cada paso, y se proporcionaron sus soluciones para aligerar la carga de trabajo y mejorar la eficiencia (Tabla 2). Este procedimiento proporciona una forma fiable de editar genes de interés y mejora los estudios genómicos funcionales en B. dorsalis.
En primer lugar, la selección de genes objetivo es fundamental para aumentar la eficiencia del sistema CRISPR/Cas9, y varios programas de software de código abierto como ChopChop 33,34 (http://chopchop.cbu.uib.no/), sgRNAcas9 (V3.0)35 y CRISPR optimal target finder 36 (http://targetfinder.flycrispr.neuro.brown.edu) pueden generar automáticamente objetivos y predecir posibles tasas fuera del objetivo. Dado que la alta tasa de fecundidad de B. dorsalis facilita la recolección de embriones, las tasas de mutantes se pueden predecir sacrificando una parte de los embriones para la extracción de ADN y la secuenciación de la región objetivo. Si la secuenciación no está disponible en el laboratorio, también se recomienda el uso de la endonucleasa I T7 para predecir las tasas de mutación37. Los sitios objetivo con altas tasas de deleción genómica se pueden seleccionar a través de estos tres métodos y, por lo tanto, se podría aumentar la eficiencia de la edición de genes en B. dorsalis.
La etapa de desarrollo del embrión determina si las mutaciones serán heredadas. Para obtener mutaciones heredadas, la edición de genes debe ocurrir en células germinales. En general, la mezcla de sgRNA y Cas9 no se puede administrar en las células germinales después de que se haya producido la formación de células polares. En B. dorsalis, la formación de células polares ocurrió a las 3 h después de la puesta de huevos 38, mientras que el protocolo detallado aquí para B. dorsalis toma30 minutos desde la recolección del embrión hasta el final de la microinyección. Durante la inyección, casi no se forman células polares en el extremo vegetal del embrión; por lo tanto, las mutaciones genéticas obtenidas en el G0 deben heredarse de manera eficiente. El tiempo consumido por la microinyección también es menor que el método mencionado en artículos publicados anteriormente (generalmente 1-3 h)18,19.
Es importante minimizar el daño mecánico o químico durante el proceso de recolección y manipulación de embriones. Use un cepillo fino para alinear suavemente los embriones en la placa de inyección. La posición de inyección debe reflejar el trabajo realizado previamente en Drosophila (Métodos - laboratorio de Nicolas Gompel, http://gompel.org/methods) y Ceratitis capitata39. Inyectar embriones en el polo vegetal; Nunca inserte la aguja en el poste del animal. Prepare la aguja siguiendo la guía del extractor de micropipetas; La abertura de la aguja debe ser lo más pequeña posible para evitar un reflujo citoplasmático excesivo. El método mencionado en estudios publicados en B. dorsalis generalmente decorionó los embriones con hipocorerita sódica17,18,19; Esto podría causar daño químico y disminuir las tasas de supervivencia de los embriones. En este protocolo, los embriones no son descorionados, y la inyección todavía funciona bien. El daño químico a los embriones podría ser mínimo.
La cría de insectos después de la inyección es muy importante. El protocolo de cría estandarizado proporcionado aquí puede servir como referencia para la cría de otras especies de moscas de la fruta, especialmente especies de Bactrocera . Los embriones se pueden sumergir en aceite para evitar la desecación durante la inyección utilizando nuestra placa de inyección de fabricación propia. Minimizar el tiempo que las larvas pasan en el aceite (<2 h) para lograr tasas de supervivencia en el G0 superiores al 50%.
Se recomienda un método no invasivo de extracción de ADN genómico para la detección de mutantes. Por ejemplo, algunos investigadores de lepidópteros sugieren que los exuviados de las larvas del estadio final podrían usarse para extraer ADN genómico para un genotipado adicional. Para B. dorsalis, un método no invasivo consiste en extraer ADN genómico de un pupario fresco. La inyección de múltiples sgRNAs dirigidos a un gen marcador y al gen de interés también podría mejorar la identificación de mutantes. Por ejemplo, los sgRNAs coinyectados dirigidos al color de ojos (kmo) y al receptor hormonal juvenil (Met) pueden producir el 75% de la descendencia con mutaciones dobles en mosquitos. Los mutantes met fueron examinados preliminarmente en función del color de ojos de las larvas37. Esto debería evaluarse en B. dorsalis en el futuro para mejorar aún más la eficacia de la edición de genes en esta especie de insecto mediante el uso del sistema CRISPR / Cas9.
En conclusión, el sistema CRSIPR/Cas9 es una poderosa herramienta en genómica funcional en B. dorsalis. Nuestros protocolos detallados proporcionan información útil para ayudar a los investigadores a lograr una recolección eficiente de embriones, tasas ideales de supervivencia de larvas y la eficiencia de edición deseada. Esta podría ser una forma simple y rápida de ayudar a los investigadores a obtener mutagénesis en B. dorsalis. Esta técnica no podría aplicarse en los estudios funcionales de genes letales ya que las mutaciones heredadas necesitan cruzamientos exitosos. Los estudios futuros podrían centrarse en el desarrollo de herramientas transgénicas para expresar elementos CRISPR específicos de la etapa o del tejido para superar esta limitación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (Subvención No. KQTD20180411143628272) y fondos especiales para la innovación de tecnología científica y el desarrollo industrial del Nuevo Distrito de Shenzhen Dapeng (Subvención No. PT202101-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
References
- Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
- Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
- Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , Humana Press. Totowa, NJ. 269-277 (2014).
- Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
- Zhu, G. -H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
- Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
- Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
- Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
- Kent, W. J. BLAT-the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12 (4), 656-664 (2002).
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
- Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
- TransDecoder. , Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
- Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
- Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
- El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
- Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
- Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).
