Summary
Het huidige protocol schetst een methode die lucifergeel gebruikt in een apicale enteroïde model om de darmdoorlaatbaarheid te bepalen. Deze methode kan worden gebruikt om paracellulaire permeabiliteit te bepalen bij enteroïden die inflammatoire darmziekten modelleren, zoals necrotiserende enterocolitis.
Abstract
Enteroïden zijn een opkomend onderzoeksinstrument in de studie van inflammatoire darmziekten zoals necrotiserende enterocolitis (NEC). Ze worden traditioneel gekweekt in de basolaterale (BO) conformatie, waarbij het apicale oppervlak van de epitheelcel naar het binnenste lumen is gericht. In dit model is de toegang tot het luminale oppervlak van enteroïden voor behandeling en experimenten een uitdaging, wat het vermogen beperkt om gastheer-pathogeen interacties te bestuderen. Om dit te omzeilen, werd een neonatale apicale-out (AO) -model voor necrotiserende enterocolitis gemaakt. Aangezien veranderingen in de permeabiliteit van intestinale epitheelcellen pathognomonisch zijn voor NEC, schetst dit protocol het gebruik van lucifergeel (LY) als een marker van paracellulaire permeabiliteit. LY doorkruist de intestinale epitheliale barrière via alle drie de belangrijkste paracellulaire paden: porie, lek en onbeperkt. Het gebruik van LY in een AO-model maakt een bredere studie van de permeabiliteit in NEC mogelijk. Na IRB-goedkeuring en ouderlijke toestemming werden chirurgische monsters van darmweefsel verzameld van menselijke premature pasgeborenen. Intestinale stamcellen werden geoogst via cryptisolatie en gebruikt om enteroïden te laten groeien. Enteroïden werden tot volwassenheid gekweekt en vervolgens AO getransformeerd of achtergelaten in BO-conformatie. Deze werden niet behandeld (controle) of werden behandeld met lipopolysaccharide (LPS) en onderworpen aan hypoxische voorwaarden voor de inductie van in vitro NEC. LY werd gebruikt om te beoordelen op permeabiliteit. Immunofluorescente kleuring van het apicale eiwit zonula occludens-1 en basolateraal eiwit β-catenine bevestigde AO-conformatie. Zowel AO- als BO-enteroïden behandeld met LPS en hypoxie vertoonden een significant verhoogde paracellulaire permeabiliteit in vergelijking met controles. Zowel AO- als BO-enteroïden vertoonden een verhoogde opname van LY in het lumen van de behandelde enteroïden in vergelijking met controles. Het gebruik van LY in een AO enteroïde model maakt het mogelijk om alle drie de belangrijkste routes van paracellulaire permeabiliteit te onderzoeken. Het maakt bovendien het onderzoek mogelijk naar gastheer-pathogeen interacties en hoe dit de permeabiliteit kan beïnvloeden in vergelijking met het BO enteroïde model.
Introduction
Enteroïden zijn driedimensionale (3D) structuren die zijn afgeleid van orgaanbeperkte menselijke darmstamcellen 1,2. Ze bestaan volledig uit epitheliale afstamming en bevatten alle gedifferentieerde intestinale epitheelceltypen2. Enteroïden behouden ook cellulaire polariteit die bestaat uit een apicale luminale oppervlakte die een binnencompartiment vormt en een basolateraal oppervlak dat naar de omliggende media is gericht. Enteroïden zijn een uniek model omdat ze de kenmerken behouden van de gastheer waaruit ze zijn gegenereerd3. Enteroïden gegenereerd uit premature menselijke baby's vertegenwoordigen dus een model dat nuttig is voor het onderzoeken van ziekten die voornamelijk deze populatie treffen, zoals necrotiserende enterocolitis (NEC).
Het traditionele enteroïde model wordt gekweekt in een basolaterale (BO) conformatie, waarbij de enteroïde is ingepakt in een koepel van keldermembraanmatrix (BMM). BMM induceert de enteroïde om een 3D-structuur te behouden met het basolaterale oppervlak aan de buitenkant. BO-enteroïden zijn een geschikt model voor NEC dat de kloof overbrugt tussen tweedimensionale (2D) primaire menselijke cellijnen en in vivo diermodellen 2,4. NEC wordt geïnduceerd in enteroïden door pathogenen zoals LPS of bacteriën in de media rond de enteroïden te plaatsen, gevolgd door blootstelling aan hypoxische aandoeningen 2,3. De uitdaging met het BO enteroïde NEC-model is dat het geen effectieve studie van gastheer-pathogeeninteracties mogelijk maakt, die in vivo op het apicale oppervlak plaatsvinden. Veranderingen in de darmdoorlaatbaarheid zijn te wijten aan deze gastheer-pathogeen interacties. Om beter te begrijpen hoe permeabiliteit de pathofysiologische basis van ziekte beïnvloedt, moet een model worden gemaakt dat betrekking heeft op de behandeling van het apicale oppervlak.
Co et al. waren de eersten die aantoonden dat volwassen BO-enteroïden kunnen worden geïnduceerd om een apicale (AO) conformatie te vormen door de BMM-koepels te verwijderen en ze in media5 te resuspenderen. Dit artikel toonde aan dat AO-enteroïden de juiste epitheliale polariteit behielden, alle darmceltypen bevatten, de intestinale epitheelbarrière handhaafden en toegang gaven tot het apicale oppervlak5. Het gebruik van AO-enteroïden als NEC-model bereikt een fysiologische reproductie van het ziekteproces en studie van gastheer-pathogeeninteracties.
Een belangrijke bijdrage aan de pathofysiologie van NEC is verhoogde darmdoorlaatbaarheid6. Verschillende moleculen zijn voorgesteld als een manier om te testen op intestinale permeabiliteit in vitro7. Onder deze, lucifer geel (LY) is een hydrofiele kleurstof met excitatie en emissie pieken bij 428 nm en 540 nm, respectievelijk8. Terwijl het alle belangrijke paracellulaire routes doorkruist, is het gebruikt om paracellulaire permeabiliteit te evalueren in verschillende toepassingen, waaronder de bloed-hersenen en intestinale epitheliale barrières 8,9. De traditionele toepassing van LY maakt gebruik van cellen gekweekt in monolagen op een semi-permeabel oppervlak10. LY wordt aangebracht op het apicale oppervlak en kruist paracellulaire tight junction-eiwitten om samen te komen aan de basolaterale kant. Hogere LY-concentraties in het basolaterale compartiment wijzen op verminderde tight junction-eiwitten met daaropvolgende intestinale epitheelcelbarrièreafbraak en verhoogde permeabiliteit10. Het is ook beschreven in 3D BO enteroid modellen waar LY werd toegevoegd aan de media en individuele enteroïden werden afgebeeld voor opname van LY in het lumen11. Hoewel dit kwalitatieve analyse mogelijk maakt via de visualisatie van LY-opname, is kwantitatieve analyse beperkt. Dit protocol schetst een unieke techniek die LY gebruikt om paracellulaire permeabiliteit te beoordelen met behulp van een in vitro NEC enteroïde model in AO enteroïden met behoud van 3D-oriëntatie. Deze methode kan worden gebruikt voor zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyse van de permeabiliteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het huidige onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de goedkeuring van de Institutional Review Board (IRB, # 11610, 11611) aan de Universiteit van Oklahoma. Ouderlijke toestemming was vereist voordat menselijke chirurgische monsters werden verzameld volgens de IRB-specificaties. Na IRB-goedkeuring en ouderlijke toestemming werd menselijk dunne darmweefsel verkregen van zuigelingen (gecorrigeerde zwangerschapsduur (GA) variërend van 36-41 weken op het moment van monsterverzameling, allemaal met een voorgeschiedenis van vroeggeboorte bij een geschatte GA van 25-34 weken, 2: 1 M: F) die een operatie ondergingen voor NEC of andere intestinale resectie, zoals stoma-verwijdering of atresieherstel. Enteroïden werden gegenereerd uit weefsel verkregen uit het jejunum of ileum.
1. Van menselijke baby's afgeleide enteroïde culturen: cryptisolatie en beplating van heel weefsel
- Bereid kweekmedia voor, chelaatbuffer #1 en chelaatbuffer #2 (tabel 1) naar aanleiding van het vorige rapport4. Bewaar chelaatbuffers bij 4 °C en gebruik ze binnen 48 uur.
- Bereid menselijke minigut-media (tabel 1). Bewaar de bouillon bij −20 °C en verwarm voor gebruik in een waterbad van 37 °C.
- Bereid 50% L-WRN geconditioneerde media (CM) (tabel 1). Bewaar de bouillon bij 4 °C gedurende maximaal 1 week.
OPMERKING: 100% L-WRN-basis voor de geconditioneerde media wordt beschreven in een protocol van Miyoshi et al.12. - Genereer enteroïden uit dunne darmweefselmonsters die zijn verkregen uit chirurgische monsters na het vorige rapport4. Plaat vier putten van enteroïden in een 24-well plaat van een 0,75-2,5 g stuk darmweefsel.
OPMERKING: Enteroïden kunnen met succes worden gegenereerd uit weefsel dat is opgeslagen in 30 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium in een conische buis van 50 ml bij 4 °C gedurende maximaal 48 uur. - Plaats de 24-well plaat in een 37 °C, 5% CO2 incubator ondersteboven gedurende 15-20 minuten om de polymerisatie van BMM domes mogelijk te maken4.
- Voeg 500 μL 50% L-WRN CM (zoals beschreven in stap 1.3) met 0,5 μL Y-27632, ROCK-remmer (RI, zie Materiaaltabel) toe aan elk putje. Vervang na 2-3 dagen door 50% L-WRN CM zonder RI.
2. Generatie van AO enteroïden
- Kweek enteroïden ingebed in BMM gedurende 7-10 dagen met 50% L-WRN CM4.
- Verwijder de media en voeg 500 μL celterugwinningsoplossing (CRS, zie Materiaaltabel) toe aan één put. Schraap de koepel, pipetteer meerdere keren op en neer en voeg vervolgens de CRS/enteroïde/BMM-oplossing toe aan de volgende put.
- Schraap de koepel, pipetteer meerdere keren op en neer en plaats de oplossing in een microcentrifugebuis. Voeg 500 μL CRS toe aan het tweede putje, pipetteer op en neer en voeg het vervolgens toe aan het eerste putje. Breng deze oplossing over in dezelfde microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Herhaal stap 2.3 en voeg twee putten samen in één microcentrifugebuis totdat alle putinhoud in CRS is.
OPMERKING: Meer dan twee putten kunnen worden samengevoegd in een grotere conische buis van 15 ml als grote volumes AO-enteroïden worden gegenereerd. Het handhaven van een CRS-verhouding van 500 μL per put is belangrijk om volledige oplosbaarheid van BMM te garanderen. - Plaats de microcentrifugebuizen (stap 2.3) met een samengevoegde CRS/enteroïde/BMM-oplossing gedurende 1 uur bij 4 °C op een rotator om de BMM op te lossen.
- Centrifugeer de oplossing bij 200 x g gedurende 3 minuten bij 4°C en verwijder vervolgens het supernatant met een micropipette en laat de pellet achter.
- Resuspendeer de enteroïde pellet in 1 ml van 50% L-WRN CM (zoals bereid in stap 1.3) per microcentrifugebuis. Pipetteer voorzichtig 500 μL van de opnieuw gesuspendeerde enteroïde/media-oplossing in elk putje van de ultralage bevestigings- 24-well weefselkweekplaten (zie Materiaaltabel).
- Incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 3 dagen voorafgaand aan het experimenteren.
3. Verificatie van AO-enteroïde conformatie via immunofluorescente kleuring van de hele montering
- Na incubatie van de enteroïden in mediasuspensie gedurende 3 dagen pipetteert u de enteroïde/mediasuspensie van één put in een microcentrifugebuis.
- Centrifugeer de enteroïde/media suspensie bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant met een micropipette.
- Resuspendeer de enteroïden in 20 μL BMM. Pipetteer 10 μL enteroïde suspensie op een microscoopglaasje en verspreid deze in een dunne laag van ongeveer 1 cm bij 1 cm vierkant. Herhaal dit met de resterende 10 μL enteroïdsuspensie op een apart deel van dezelfde dia, zodat er twee uitstrijkjes van enteroïde/BMM-suspensie zijn.
- Laat de enteroïde/BMM-uitstrijkjes gedurende 15 minuten stollen bij kamertemperatuur (RT).
- Werk in de zuurkast, plaats de glijbaan in een vlekkenpot en vul met 4% paraformaldehyde totdat deze het enteroïde / BMM-uitstrijkje bedekt (~ 30 ml voor één dia als u een glazen vlekpot met 10 schuifcapaciteit gebruikt). Laat 30 minuten (bij kamertemperatuur) toe voordat de fixatie plaatsvindt.
LET OP: 4% paraformaldehyde is gevaarlijk en kan oogbeschadiging/irritatie, huidirritatie en kanker veroorzaken. Werk altijd onder een zuurkast bij gebruik. Draag beschermende handschoenen en persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren ervan. Gooi het weg in een goedgekeurde afvalcontainer. - Gooi 4% paraformaldehyde weg in een geschikte afvalcontainer. Voeg 30 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan de kleurpot of totdat PBS de enteroïde / BMM-uitstrijkjes bedekt. Laat het 3 minuten op RT zitten en gooi de PBS vervolgens weg in de paraformaldehyde-afvalfles. Herhaal deze stap nog twee keer voor een totaal van drie wasbeurten.
- Vul een nieuwe vlekkenpot met 30 ml 0,5% Triton X-100 verdund in PBS. Plaats de glijbaan met enteroïde/BMM-uitstrijkjes in de Triton-oplossing en laat deze gedurende 20 minuten doordringen op RT.
- Gooi de 0,5% Triton X-100 verdund in PBS weg. Voeg 30 ml PBS toe aan de beitspot en laat deze 3 minuten staan. Gooi de PBS weg door te decanteren.
- Veeg de glijbaan voorzichtig rond de enteroïde / BMM-uitstrijkjes en pas op dat u ze niet verstoort. Teken met behulp van een hydrofobe barrièrepen (barrière PAP-pen, zie Tabel met materialen) een cirkel rond elk van de enteroïde /BMM-uitstrijkjes. Maak een serum van 20%, specifiek voor het dier waarin het secundaire antilichaam is grootgebracht (zie materiaaltabel).
- Leg de microscoopglaasje plat op de laboratoriumbank. Blokkeer de dia gedurende 1 uur bij 4 °C door 100 μL specifiek 20% serum vanaf stap 3.9 te pipetteren op elk van de enteroïde/BMM-uitstrijkjes die door de hydrofobe barrièrepen worden geringd.
- Bereid een oplossing van 100 μL met verdunningen van respectievelijk 1:100 en 1:200 van β-catenine en ZO-1 primaire antilichamen, verdund in PBS.
OPMERKING: Elk primair antilichaam moet van een ander dier zijn om ervoor te zorgen dat ze verschillende immunofluorescente kanalen hebben wanneer ze in beeld worden gebracht. De huidige studie maakt gebruik van een muis β-catenine antilichaam en een konijn ZO-1 antilichaam (zie Tabel van Materialen). - Tik op de schuif op het aanrecht om het 20% serum te verwijderen en veeg voorzichtig droog, waarbij u moet oppassen dat u de enteroïde / BMM-uitstrijkjes niet verstoort. Pipetteer 100 μL β-catenine/ZO-1 primaire antilichaamoplossing op een van de enteroïde/BMM-uitstrijkjes. Pipetteer 100 μL PBS zonder primair antilichaam op het andere enteroïde/BMM-uitstrijkje als negatieve controle.
- Bekleed de bodem van een plastic container met een natte papieren handdoek om een bevochtigde container te maken. Plaats de glijbaan in de container en zorg ervoor dat u oplossingen die de enteroïde / BMM-uitstrijkjes bedekken, niet verstoort. Plaats het deksel op de container om af te sluiten en bewaar het plat bij 4 °C 's nachts.
OPMERKING: Laat de glijbaan niet uitdrogen. Zorg ervoor dat de container gesloten is om uitdroging te voorkomen. - Zodra u klaar bent om verder te gaan, tikt u op de schuifregelaar om primaire antilichamen en PBS uit de enteroïde / BMM-uitstrijkjes te verwijderen.
- Voer een wasstap uit door de dia in een vlekkenpot te plaatsen en te vullen met 30 ml PBS of totdat PBS de enteroïde / BMM-uitstrijkjes bedekt. Laat het 3 minuten op kamertemperatuur staan. Gooi de PBS weg en herhaal deze stap nog twee keer voor een totaal van drie wasbeurten.
- Bereid 200 μL secundaire antilichamen voor twee verschillende immunofluorescentiekanalen, waarbij elk antilichaam een verdunning van 1:1000 in PBS heeft (zie materiaaltabel). Houd de oplossing uit de buurt van licht.
- Pipetteer 100 μL secundaire antilichaamoplossing op elk van de enteroïde/BMM-uitstrijkjes. Zet het in het donker en laat het 1 uur op RT staan.
- Tik op de dia op de toonbank om secundaire antilichamen te verwijderen. Herhaal de wasstappen die in stap 3.15 zijn beschreven en zorg ervoor dat alle wasbeurten in het donker worden uitgevoerd.
- Voeg een druppel 4′,6-diamidino-2-fenylindool (Fluoroshield met DAPI, zie Materiaaltabel) montagemedium toe aan elk van de enteroïde/BMM-uitstrijkjes en breng een coverslip aan om ervoor te zorgen dat beide uitstrijkjes voldoende bedekt zijn. Voorkom dat bubbels onder de dekenslip worden opgesloten. Houd de dia in het donker totdat u klaar bent om onder de microscoop te bekijken.
OPMERKING: Onmiddellijke beeldvorming van de dia's levert de meest optimale resultaten op; dia's kunnen echter plat worden bewaard in een bevochtigde container bij 4 °C en tot 1 week na de toevoeging van DAPI in beeld worden gebracht.
4. Inductie van experimentele NEC
- Zorg ervoor dat AO-enteroïden ten minste 72 uur vóór gebruik in suspensie zijn geweest.
- Pipetteer voorzichtig alle enteroïde / media-suspensie van elke put in een microcentrifugebuis.
OPMERKING: Meerdere putten kunnen worden samengevoegd in één conische buis van 15 ml als een groot volume putten wordt behandeld. Voor dit protocol wordt minimaal drie putjes per behandelgroep aanbevolen. - Centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 minuten bij RT en verwijder het supernatant.
- Voeg 10 μL 5 mg/ml lipopolysaccharide (LPS, zie materiaaltabel) toe aan 500 μL 50% LWRN CM per putje (eindconcentratie 100 μg/ml LPS).
- Resuspend AO enteroïden aangewezen als de behandelingsgroep in 50% LWRN + LPS en aliquot 500 μL suspensie naar een 24-well ultra-low bevestigingsplaat. Resuspend AO enteroïden aangewezen als onbehandelde controles in 500 μL van 50% LWRN CM per put. Aliquot 500 μL van deze suspensie naar een aparte 24-well ultra-low bevestigingsplaat.
- Induceer hypoxie in de met LPS behandelde AO-enteroïden via een modulaire incubatorkamer (MIC) met 1% O2, 5% CO2 en 94% N2 volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel). Behandel de enteroïden met hypoxie en LPS gedurende 24 uur.
- Plaats de onbehandelde en met LPS + hypoxie behandelde culturen, nog steeds in de MIC-kamer, gedurende 24 uur in een 37 °C, 5% CO2-incubator .
5. Meting van paracellulaire permeabiliteit met behulp van LY
- Pipetteer de enteroïde/media-suspensie van elke put voorzichtig in een microcentrifugebuis. Warme DPBS en 50% LRWN CM in een waterbad van 37 °C.
- Centrifugeer de enteroïde/media suspensie bij 300 x g gedurende 3 minuten bij RT.
- Verwijder de media. Was de enteroïden met warme DPBS van 500 μL.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 min bij RT. Verwijder het supernatant met een micropipette.
- Herhaal stap 5.3-5.4 nogmaals voor een totaal van twee keer.
- Voeg na het wassen 450 μL warme 50% LWRN CM toe (zoals bereid in stap 1.3).
- Voeg 50 μL 2,5 mg/ml LY (eindconcentratie is 0,25 μg/μL, zie materiaaltabel) toe aan elk putje en draai voorzichtig om te mengen. Plaats in een 37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 2 uur.
- Pipetteer de enteroïde/media-suspensie van elke put voorzichtig in een microcentrifugebuis.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 minuten bij RT, verwijder vervolgens het supernatant en laat de enteroïde pellet achter.
- Was de enteroïden met 500 μL warme DPBS.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 minuten bij RT en verwijder vervolgens het supernatant dat de enteroïde pellet achterlaat.
- Herhaal stap 5.10-5.11 nog drie keer voor een totaal van vier wasbeurten.
- Resuspendeer elke pellet met 1.000 μL koude DPBS en pipetteer krachtig op en neer om de enteroïden te dissociëren.
- Bereid normen voor de LY-standaardcurve verdund in DPBS (100 ng/ml; 50 ng/ml; 25 ng/ml; 12,5 ng/ml; 6,25 ng/ml; 3,13 ng/ml; 1,57 ng/ml; 0 ng/ml).
- Pipetteer 150 μL van elk monster per put in drievoud op een plaat met 96 putten.
- Meet de fluorescentie bij een excitatiepiek van 428 nm en emissiepiek van 536 nm op een plaatlezer die fluorescentie kan lezen (zie Materiaaltabel). Bereken met behulp van statistische software (zie Materiaaltabel) de concentraties door de standaardcurve te interpoleren en een curve met vier parameters te gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AO-conformatie
Enteroïden die gedurende 72 uur in 50% LWRN-media zijn gesuspendeerd, gaan uit van een AO-conformatie (figuur 1). Dit werd bevestigd via immunofluorescente kleuring met behulp van enteroïde hele mounts van het apicale eiwit, zonula occludens-1 (ZO-1) en basolateraal eiwit, β-catenine (figuur 1). AO-enteroïden tonen ZO-1 (groen) op het buitenste, apicale oppervlak van de enteroïde, terwijl β-catenine (rood) zich op het binnenste, basolaterale oppervlak bevindt (figuur 1A). BO-enteroïden demonstreren de inverse met β-catenine (rood) op het buitenoppervlak en ZO-1 (groen) op het binnenste, luminale oppervlak (figuur 1B). Deze resultaten tonen de verwachte polariteitsomkering om te bevestigen dat de enteroïden AO zijn voorafgaand aan experimenten.
LY-testresultaten
Verhoogde permeabiliteit, aangetoond door de verhoogde opname van LY-kleurstof in het enteroïde lumen, wordt verwacht in NEC6. BO-enteroïden behandeld met LPS en hypoxie vertoonden een significant verhoogde permeabiliteit in vergelijking met onbehandelde controles met behulp van de in dit protocol beschreven techniek (figuur 2A, **p = 0,005). Dit komt overeen met de literatuur die een verhoogde permeabiliteit in BO enteroïde modellen van NEC 4,13 heeft beschreven. Evenzo vertoonden AO-enteroïden behandeld met LPS en hypoxie ook een significant verhoogde permeabiliteit in vergelijking met onbehandelde controles, zoals verwacht in een NEC-model (figuur 3A, * p = 0,02). Behandelde AO-enteroïden vertoonden een verhoogde opname van LY in het lumen van behandelde enteroïden (figuur 3C) in vergelijking met onbehandelde controles (figuur 3B). Dit is vergelijkbaar met wat wordt gezien bij BO-enteroïden, waarbij LY wordt gevisualiseerd in het enteroïde lumen (figuur 2B). Verhoogde opname van LY-kleurstoffen in het lumen van de enteroïde resulteert in verhoogde fluorescentie in behandelde enteroïden, waardoor kwantitatieve analyse mogelijk is via een microplaatlezer met behulp van AO-enteroïden uit verschillende putten (figuur 3A). Dit toont aan dat deze techniek, met behulp van LY, kan worden gebruikt om de permeabiliteit in 3D-enteroïden te beoordelen. Uitkomsten kunnen worden geanalyseerd met behulp van statistische software die in staat is om een standaardcurve te interpoleren om de LY-concentraties van de behandelingsgroepen te bepalen. De t-toets van een student, zoals weergegeven in figuur 2 en figuur 3, kan worden gebruikt om de significantie tussen groepen te bepalen.
Figuur 1: Verificatie van AO-conformatie. (A) Apical-out (AO) enteroïde met omgekeerde polariteit in vergelijking met (B) basolaterale out (BO) enteroïde met traditionele polariteit bij 20x vergroting, schaalbalk ingesteld op 100 μm. DAPI, blauw; beta-catenine (basolateraal eiwit), rood; zonula occludens-1 (apicale eiwit), groen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Verhoogde permeabiliteit in een BO enteroïd model na in vitro NEC inductie zoals gemeten door een LY assay. (A) LPS en met hypoxie behandelde basolaterale enteroïden hebben een significant verhoogde permeabiliteit in vergelijking met onbehandelde controles met lucifergele assay; foutbalken tonen de standaardfout van het gemiddelde; **p = 0,005. (B) Afbeelding van basolaterale enteroïden met lucifergeel gevisualiseerd in het lumen na behandeling van de media met lucifergele kleurstof bij 10x vergroting, 300 μm schaalbalk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Verhoogde permeabiliteit in een AO enteroïd model na in vitro NEC inductie zoals gemeten door een LY assay. (A) LPS en met hypoxie behandelde apicale enteroïden hebben een significant verhoogde permeabiliteit in vergelijking met onbehandelde controles met behulp van de lucifergele test; foutbalken tonen de standaardfout van het gemiddelde; *p = 0,02. (B) Een representatief beeld van onbehandelde controle apiical-out (AO) enteroïde bij 10x; de schaalbalk is ingesteld op 100 μm. (C) Een representatief beeld van een LPS- en hypoxie-behandelde AO-enteroïde met LY wordt gevisualiseerd in het lumen op 10x; de schaalbalk is ingesteld op 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Samenstelling van oplossingen, buffers en media die in deze studie worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intestinale permeabiliteit is complex en weerspiegelt de epitheliale barrièrefunctie. De darmbarrière bestaat uit een enkele laag epitheelcellen die transcellulair en paracellulair transport bemiddelt14. Paracellulaire permeabiliteit is afhankelijk van tight junction-eiwitten die de ruimte tussen epitheelcellen afdichten14. Binnen dit paracellulaire transport zijn er drie verschillende paden waarlangs moleculen elkaar kunnen kruisen: porie, lek en onbeperkt15. De porieroute zorgt voor doorlaatbaarheid voor kleine geladen ionen, terwijl de lekroute grotere, ongeladen moleculen over15 mogelijk maakt. De derde, onbeperkte route weerspiegelt permeabiliteit secundair aan epitheliale schade of overlijden16. Hoewel veel moleculen worden gebruikt om paracellulaire permeabiliteit te beoordelen, beïnvloeden het type en de grootte van het molecuul welke permeabiliteitsroute zal worden onderzocht.
Als een klein, hydrofiel molecuul kan LY alle drie de paracellulaire paden doorkruisen, waardoor het een optimaal hulpmiddel is voor het bestuderen van paracellulaire permeabiliteit. Daarentegen kan 4 kDa FITC-dextran, een suikermolecuul dat wordt gebruikt als marker van paracellulaire permeabiliteit, alleen het lek en onbeperkte paden doorkruisen. De grotere, 70 kDa FITC-dextran is beperkt tot alleen de onbeperkte route. Een andere methode om de paracellulaire permeabiliteit te bepalen is via transepitheliale weerstandsmetingen (TEER), die de elektrische weerstand tussen monolagen meten. Deze methode meet alleen de porieroute17. Zo biedt LY meer inzicht in de algehele paracellulaire permeabiliteit door zich op alle drie de paden te richten. Dit protocol speelt hierop in door LY te gebruiken om paracellulaire permeabiliteit te bestuderen.
Het enteroïde model werd in dit protocol geselecteerd omdat het in vivo omstandigheden beter nabootst door een 3D-mini-darm te maken om te bestuderen. De uitdaging met het traditionele BO-enteroïde model is echter hoe toegang te krijgen tot het apicale oppervlak om gastheer-pathogeeninteracties en de daaropvolgende permeabiliteitsveranderingen te bestuderen. Het AO enteroïde model overwint deze uitdaging door de polariteit om te keren waar het apicale oppervlak in contact staat met de omringende media. Verschillende alternatieve methoden om toegang te krijgen tot het apicale oppervlak van enteroïden zijn beschreven. Deze omvatten darmchipsystemen, micro-injectie, fragmentatie en groeiende enteroïden in monolagen18,19. Vooruitgang in darmchipsystemen heeft het mogelijk gemaakt om organoïden en endotheelcellen samen te kweken in de context van vasculariteit en peristaltiek om de darmomgeving na te bootsen18. Micro-injectie omvat de injectie in het BO enteroïde lumen via het gebruik van gespecialiseerde apparatuur zoals een micromanipulator en microinjector19. Fragmentatie maakt gebruik van de dissociatie van enteroïden in enkele cellen die vervolgens in media worden geïncubeerd met de ziekteverwekker voordat een 3D-structuur wordt hervormd19. De transformatie van enteroïden in 2D-monolagen met daaropvolgende behandeling van het apicale oppervlak is ook beschreven19. Het AO enteroïde model pakt enkele van de moeilijkheden van deze modellen aan door een eenvoudige, effectieve manier te bieden om het apicale oppervlak bloot te leggen zonder dure apparatuur nodig te hebben of de structurele integriteit van de enteroïde in gevaar te brengen.
Hoewel het gebruik van LY in een AO-model een brede studie van paracellulaire permeabiliteit mogelijk maakt die secundair is aan gastheer-pathogeeninteracties, kan dit protocol worden aangepast om te gebruiken met BO-enteroïden en FITC-dextran in plaats van LY. Twee belangrijke wijzigingen in dit protocol zijn nodig om het te wijzigen om te worden gebruikt voor BO-enteroïden. Ten eerste kunnen BO-enteroïden worden onderhouden in BMM-koepels voor alle wasstappen voor en na het toevoegen van LY. Het is belangrijk om oplossingen te gebruiken die zijn verwarmd tot 37 °C voor deze wasstappen om oplosbaarheid van de BMM-koepel te voorkomen. Ten tweede moet de BMM-koepel worden verstoord met koude DPBS en de put schrapen met een pipetpunt nadat alle wasstappen zijn voltooid om volledige resuspensie van de gedissocieerde enteroïden en LY mogelijk te maken. Als FITC-dextran wordt vervangen door LY, wordt aanbevolen om het 4 kDa-molecuul te gebruiken terwijl het twee van de drie paracellulaire paden doorkruist.
De belangrijkste stappen in dit protocol zijn onder meer zorgen voor voldoende wasbeurten om sporen van LY uit de oplossing buiten de enteroïde te verwijderen. Het is ook belangrijk om de enteroïden voorzichtig te wassen om dissociatie en mogelijke afgifte van LY uit het lumen in de omringende oplossing te voorkomen totdat ze klaar zijn om te kwantificeren met behulp van een microplaatlezer. Het gebruik van verwarmde oplossingen tijdens de wasstappen vermindert ook de stress op de enteroïden. Als koude oplossingen worden gebruikt, kunnen enteroïden apoptose ondergaan, wat leidt tot onnauwkeurige resultaten.
De beperkingen van deze methode omvatten het onvermogen om AO-enteroïden te vermeerderen en langere kweektijden vanwege de extra 72 uur die nodig is om de polariteit om te keren. Er is ook een afname van 2% -5% in het aantal behandelde AO-enteroïden in vergelijking met controles. Hoewel dit over het algemeen verwaarloosbaar is, kan het leiden tot een onderschatting van de resultaten. De beperkingen van het gebruik van LY zijn vergelijkbaar met andere permeabiliteitsmoleculen, zoals 4 kDa FITC-dextran, waarbij sporenhoeveelheden de intestinale epitheliale barrière kunnen passeren via transcytose20. Hoewel deze hoeveelheid verwaarloosbaar is, kan het de resultaten beïnvloeden. Op basis van deze bevindingen biedt het toepassen van LY op de media van AO-enteroïden een elegante en relatief eenvoudige manier om paracellulaire darmdoorlaatbaarheid kwantitatief en kwalitatief te analyseren in een 3D-model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs melden geen eigendoms- of commercieel belang in een product dat in dit artikel wordt genoemd of concept dat wordt besproken.
Acknowledgments
We willen Ashley Nelson van het University of Rochester Medical Center bedanken voor haar instrumentele hulp bij ons enteroïde model. We willen ook de afdeling Kinderchirurgie van de Universiteit van Oklahoma bedanken voor hun steun aan dit project. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health [NIH Grant R03 DK117216-01A1], het Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research en de Presbyterian Health Foundation Grant #20180587 toegekend aan de afdeling Chirurgie van het Health Sciences Center van de Universiteit van Oklahoma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
- Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186 (2021).
- Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow - A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).
- Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
- Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871 (2018).
- Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
