Summary
ATAC-seq는 과민성 돌연변이 트랜스포자제 Tn5를 사용하여 전사 인자에 의해 매개되는 염색질 접근성의 변화를 매핑하는 DNA 시퀀싱 방법입니다. ATAC-seq는 암세포의 표현형 변화의 기초가되는 분자 메커니즘의 발견을 가능하게합니다. 이 프로토콜은 암세포를 포함한 상피 세포 유형에서 ATAC-seq에 대한 최적화 절차를 간략하게 설명합니다.
Abstract
고처리량 시퀀싱(ATAC-seq)을 사용한 트랜스포자제 접근 염색질에 대한 분석은 과민성 Tn5 트랜스포아제를 사용하여 디옥시리보 핵산(DNA) 접근성을 프로브합니다. Tn5는 접근 가능한 염색질 영역 내에서 고처리량 시퀀싱을 위해 어댑터를 절단하고 연결합니다. 진핵 세포에서 게놈 DNA는 DNA, 히스톤 및 기타 단백질의 복합체인 염색질로 포장되어 전사 기계에 대한 물리적 장벽 역할을 합니다. 외적 신호에 반응하여, 전사 인자는 유전자 활성화를 위한 전사 기계에 접근할 수 있도록 염색질 리모델링 복합체를 모집합니다. 따라서, 개방된 염색질 영역을 확인하는 것은 암 진행과 같은 생물학적 사건 동안 인핸서 및 유전자 프로모터 활성을 모니터링할 때 유용하다. 이 프로토콜은 사용하기 쉽고 세포 입력 요구 사항이 낮기 때문에 ATAC-seq는 암세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 열린 염색질 영역을 정의하는 데 널리 채택되었습니다. 성공적인 데이터 수집을 위해서는 ATAC-seq 라이브러리를 준비할 때 몇 가지 파라미터를 고려해야 합니다. 그 중 세포 용해 완충액의 선택, Tn5 효소의 적정 및 세포의 시작 부피는 암세포에서 ATAC-seq 라이브러리 준비에 중요합니다. 최적화는 고품질 데이터를 생성하는 데 필수적입니다. 여기에서는 상피 세포 유형에 대한 ATAC-seq 최적화 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다.
Introduction
염색질 접근성은 게놈전체 규모에서 유전자 발현을 조절하기 위한 핵심 요구 사항입니다1. 염색질 접근성의 변화는 종종 암 2,3,4를 포함한 여러 질병 상태와 관련이 있습니다. 수년에 걸쳐 연구자들이 염색질 접근성 영역을 매핑하여 염색질 환경을 조사할 수 있도록 수많은 기술이 개발되었습니다. 그 중 일부에는 DNase-seq(DNase I 과민성 부위 시퀀싱)5, FAIRE-seq(조절 요소의 포름알데히드 보조 분리)6, MAPit(개별 템플릿에 대한 메틸트랜스퍼라제 접근성 프로토콜)7 및 이 논문의 초점인 ATAC-seq(전이효소 접근 가능한 염색질에 대한 분석)8이 포함됩니다. DNase-seq는 DNase의 주요 특징, 즉 히스톤 및 전사 인자5와 같은 기타 단백질이 없는 네이키드 DNA의 우선적 소화를 사용하여 접근 가능한 영역을 매핑합니다. CHIP-seq와 유사한 FAIRE-seq는 면역 침전이 관여하지 않는 것을 제외하고는 포름 알데히드 가교 및 초음파 처리를 사용하며 뉴 클레오 솜이없는 영역은 페놀-클로로포름 추출6에 의해 분리됩니다. MAPit 방법은 GC 메틸트랜스퍼라제를 사용하여 단일 분자 분해능7에서 염색질 구조를 프로브합니다. ATAC-seq는 과민성 전이 효소 Tn58에 의존합니다. Tn5 트랜스포아제는 개방 염색질 영역에 우선적으로 결합하고 시퀀싱 어댑터를 접근 가능한 영역에 삽입합니다. Tn5는 DNA-매개 "잘라내기 및 붙여넣기" 메커니즘을 통해 작동하며, 이에 의해 어댑터가 미리 로드된 트랜스포아제는 염색질 부위를 개방하고, DNA를 절단하고, 어댑터(8)를 결찰한다. Tn5 결합 영역은 이들 어댑터에 어닐링하는 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 회수된다. FAIRE-seq 및 DNase-seq는 시퀀싱 전에 많은 양의 출발 물질(~100,000 세포 내지 225,000 세포)과 별도의 라이브러리 준비 단계를 필요로 합니다9. 반면에 ATAC-seq 프로토콜은 비교적 간단하며 적은 수의 셀(<50,000개 셀)10이 필요합니다. FAIRE-seq 및 DNase-seq 기술과 달리 ATAC-seq의 시퀀싱 라이브러리 준비는 분리된 DNA 샘플이 이미 Tn5에 의해 시퀀싱 어댑터로 태그되고 있기 때문에 비교적 쉽습니다. 따라서, 라이브러리 준비를 완료하기 위해 적절한 프라이머를 사용한 PCR 증폭 단계만이 필요하며, 최종 수리 및 어댑터 라이게이션과 같은 사전 처리 단계가 수행될 필요가 없으므로, 시간(11)을 절약할 수 있다. 둘째, ATAC-seq는 MAPit7에 필요한 영역 특이적 프라이머를 사용한 중아황산염 전환, 클로닝 및 증폭의 필요성을 방지합니다. 이러한 장점으로 인해 ATAC-seq는 개방 염색질 영역을 정의하는 데 매우 인기 있는 방법이 되었습니다. ATAC-seq 방법은 간단하지만 고품질의 재현 가능한 데이터를 얻기 위해 여러 단계를 최적화해야 합니다. 이 원고는 표준 ATAC-seq 라이브러리 준비에 대한 최적화 절차에 대해 논의하며, 특히 (1) 용해 완충액 조성, (2) Tn5 트랜스포아제 농도 및 (3) 세포 수의 세 가지 매개변수를 강조합니다. 또한, 이 논문은 암성 및 비암성 부착성 상피 세포를 모두 사용한 최적화 조건의 예제 데이터를 제공합니다.
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Protocol
1. 실험 시작 전 준비
- 용해 완충액을 준비하십시오.
참고: 최적의 핵 분리 버퍼는 각 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다. 트리판 블루 염색을 사용하여 각 세포 유형에 대해 원본 논문8에 사용된 저장성 완충액과 CSK 완충액12,13을 모두 테스트하는 것이 좋습니다.- 저장성 완충액(그린리프 완충액)을 제조하기 위해, 10 mM 트리스-HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mMMgCl2, 및 0.1% NP-40을 혼합한다.
- CSK 완충액을 제조하기 위해, 10 mM 파이프 pH 6.8, 100 mM NaCl, 300 mM 수크로스, 3 mMMgCl2, 및 0.1% 트리톤 X-100을 혼합한다.
- 세포 배양 조건이 최적인지 확인하십시오. 광학 현미경으로 세포를 검사하여 세포 사멸 수준이 높지 않은지 확인하십시오.
- 원심 분리기를 켜서 4 ° C에 도달하도록합니다.
2. 세포 수확
- <80% 컨플루언시로 세포 배양에서 배지를 흡인합니다. 세포는 일반적으로 필요한 세포 수, 처리 등에 따라 35mm 또는 60mm 접시에서 성장합니다.
- 세포를 1mL 또는 3mL의 PBS로 세척합니다.
- 0.5mL 또는 1mL의 트립신을 넣고 2-3분 동안 배양합니다(세포 유형에 따라 다름). 잘 섞기 위해 1mL 피펫을 조심스럽게 사용하십시오.
- 1mL 또는 2mL의 배지를 플레이트에 넣고 잘 섞습니다. 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 15mL 튜브에서 세포를 300 x g에서 3분 동안 원심분리합니다 .
알림: 셀 손실을 최소화하기 위해 스윙 버킷 로터를 사용하는 것이 좋습니다. - 배지를 흡인하고 1mL 또는 2mL의 배지에 세포를 재현탁합니다.
참고: 균질한 단일 셀 용액을 준비하는 것이 중요합니다. 조직의 경우 Dounce 균질화를 사용하여 조직을 균질화하고 큰 세포 덩어리 또는 응집체를 최소화할 수 있습니다. 일부 조직은 생존 가능한 세포를 분리하고 단일 세포 용액을 얻기 위해 여과 (예를 들어, 세포 스트레이너) 및/또는 FACS 세포 분류를 필요로 한다. - 셀 카운터를 사용하여 셀 수를 계산합니다.
참고: 이 연구에서는 자동 셀 카운터(재료 표)를 사용했습니다. - 실온(RT)에서 3분 동안 300 x g에서 필요한 셀 부피(예: 셀 수를 기준으로 1 x 106 셀을 포함하는 부피)를 원심분리합니다.
- 1 mL의 차가운 PBS에 1 x 106 세포를 함유하는 세포 펠릿을 재현탁시킨다.
참고: 셀 번호가 1 x 10 6 셀 미만인 경우 차가운 PBS 부피를 줄여 동일한 농도(1 x 106 cells/mL)로 셀 용액을 준비합니다.
3. 세포 용해
- 25 μL(= 2.5 x 104 개 세포)를 새 1.7mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 4°C에서 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 조심스럽게 폐기합니다.
알림: 셀 손실을 최소화하기 위해 스윙 버킷 로터를 사용하는 것이 좋습니다. 세포가 버려지지 않도록 약 3μL의 상청액을 남겨 둡니다. - 25μL의 용해 완충액을 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재현탁시킵니다. 얼음 위에서 5분간 배양
- 4°C에서 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 조심스럽게 버린다.
알림: 셀 손실을 최소화하기 위해 스윙 버킷 로터를 사용하는 것이 좋습니다. 세포가 버려지지 않도록 약 3μL의 상청액을 남겨 둡니다.
4. Tn5 태그
- 펠렛을 25 μL의 Tn5 반응 혼합물에 즉시 재현탁시킨다. Tn5 반응 혼합물은 다음과 같다: 12.5 μL의 2x 태그멘테이션 DNA 완충액 (TD 완충액), 1.25-5 μL의 Tn5 트랜스포자제, 및 11.25-7.5 μL의 뉴클레아제-비함유 물.
참고: Tn5의 표준 농도는 2.5 x 104 셀의 경우 2.5μL입니다. - 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
알림: 10분마다 용액을 혼합하십시오.
5. DNA 정제
알림: 증폭하기 전에 정제가 필요합니다. DNA 정제는 MinElute PCR 정제 키트(재료 표)를 사용하여 수행됩니다.
- 5 μL의 3 M 아세트산 나트륨 (pH 5.2)을 첨가하십시오.
- 즉시 125μL의 버퍼 PB를 추가하고 잘 혼합합니다.
- 2단계부터 PCR 정제 키트 프로토콜을 따릅니다.
- 스핀 컬럼을 2mL 수집 튜브에 넣습니다.
- 샘플을 스핀 컬럼에 적용하고 RT에서 17,900 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
- 플로우 스루를 폐기하고 스핀 컬럼을 동일한 수집 튜브에 다시 놓습니다.
- 750μL의 버퍼 PE를 스핀 컬럼에 추가하고 RT에서 17,900 x g 로 1분 동안 원심분리합니다.
- 플로우 스루를 폐기하고 스핀 컬럼을 동일한 수집 튜브에 다시 놓습니다.
- 스핀 컬럼을 5분 동안 원심분리하여 멤브레인을 완전히 건조시킵니다.
- 플로우스루를 버리고 스핀 컬럼을 새 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.
- 10 μL의 버퍼 EB로 DNA 단편을 용리합니다.
- 컬럼을 RT에서 1분 동안 그대로 두십시오.
- RT에서 17,900 x g 로 1분 동안 원심분리하여 DNA를 용리합니다.
6. PCR 증폭
참고: 전치된(태깅된) DNA의 PCR 증폭은 시퀀싱에 필요합니다. Nextera 키트 어댑터(재료 표)가 이 예에서 사용되었습니다. 본 연구에 사용된 프라이머는 표 1에 열거되어 있다.
- 200 μL PCR 튜브(각 샘플에 대해 50 μL)에서 다음 PCR 반응을 설정합니다. PCR 반응 혼합물은 다음과 같다: 용리된 DNA 10 μL (단계 5.), 25 mM 어댑터 1 2.5 μL, 25 mM 어댑터 2 2.5 μL, 2x PCR 마스터 믹스 25 μL, 및 뉴클레아제 무함유 물 10 μL
- PCR 증폭 프로그램 파트 1(표 2)을 수행한다.
알림: 초기 증폭의 경우 표준 열 순환기를 사용하는 모든 샘플에 동일한 조건이 사용됩니다. - 실시간 qPCR(샘플당 총 14.5μL)
- PCR 증폭 파트 1(단계 6.2)로부터의 생성물 5 μL를 사용하여, 이번에 SYBR 금을 포함하고 실시간 PCR 기계에서 검출하는 다음의 반응을 설정하였다.
- 5 μL의 PCR 생성물을 단계 6.2로부터의 PCR 생성물, 0.75 μL의 SYBR 금 (1000x 희석), 5 μL의 2x PCR 마스터 믹스, 및 3.75 μL의 뉴클레아제-없는 물.
참고: 각 샘플에 대해 포화에 도달하기 전에 라이브러리 증폭을 위한 정확한 주기 번호는 PCR10에서 GC 및 크기 편향을 줄이기 위해 qPCR(표 3)에 의해 결정됩니다. SYBR 골드를 뉴클레아제가 없는 물로 희석하였다. 희석된 용액을 만들기 위해, 1 μL의 SYBR Gold (스톡 농도 10,000x)를 999 μL의 뉴클레아제-없는 물에 첨가하였다. 표 3에 언급된 RT-qPCR의 실행 시간은 약 60분이다.
- 6.3단계의 실행 파라미터를 사용하여 필요한 추가 PCR 주기 수를 결정한다.
- 사이클 수 = 1/4 최대(포화) 형광 강도(일반적으로 3 또는 4 PCR 사이클)
- PCR 증폭 프로그램 파트 2 (부피 = 45 μL; 표 4): 주기 번호를 결정한 후 6.4.1단계에서 계산된 추가 주기로 PCR을 설정합니다. 예를 들어 계산된 주기 번호가 3인 경우 아래 프로그램에서 3주기를 설정합니다. 총 사이클은 8(6.2단계에서 5, 6.5단계에서 3개의 추가 사이클)입니다.
7. 구슬 정화
참고: 여기에서는 AMPure XP(재료 표) 비드가 사용되었습니다.
- 이전 단계에서 증폭된 PCR 산물에 RT에서 150μL의 비드를 추가합니다.
참고: 이 공정에는 수제 AMPure 비드14 를 사용할 수 있습니다. - RT에서 15 분 동안 배양하십시오.
- 튜브를 마그네틱 스탠드에 5분 동안 놓습니다.
- 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.
- 비드를 200μL의 80% 에탄올로 세척한다.
알림: 80 % 에탄올은 신선하게 준비해야합니다. - 7.4단계를 반복합니다.
- 에탄올을 완전히 제거하십시오.
- RT에서 10분 동안 샘플을 공기 건조합니다.
- 50 μL의 용리 완충액(10 mM Tris-HCL pH 8.0)으로 재현탁시킨다.
- 비드 정제(단계 7.1.-7.9)를 반복하여 프라이머 오염을 더욱 최소화합니다.
8. DNA 농도 및 품질 검사
- DNA 농도는 핵산 정량 키트(Table of Materials)를 이용하여 측정한다.
- SYBR Gold (0.5x TBE, 1.5 % 아가 로스 겔) 또는 자동 전기 영동 시스템 (예 : TapeStation, 바이오 분석기)을 사용하여 겔 전기 영동으로 증폭 된 DNA 단편을 확인합니다.
9. 시퀀싱
- 증폭된 DNA 샘플(12,13)을 사용하여 고처리량 시퀀싱을 수행한다.
참고: 증폭된 DNA 샘플은 고처리량 시퀀싱을 위해 준비되었습니다. 뉴 클레오솜 DNA 단편 정보를 유지하려면 단일 말단 시퀀싱보다 쌍단 시퀀싱이 권장됩니다. DNA 단편의 양쪽 끝은 트랜스포아제가 결합하는 위치를 나타냅니다. 열린 염색질 영역을 매핑하려면 일반적으로 3천만 번의 읽기/샘플로 충분합니다.
10. 데이터 분석
- 기본 통화 품질에 기반한 데이터 필터링: 최소 평균 기본 품질 점수를 20(99% 정확도)으로 설정합니다.
- 어댑터 트리밍: 적절한 도구를 사용하여 어댑터 시퀀스를 제거합니다.
참고: Trim Galore 래퍼 도구(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)를 사용하여 어댑터 시퀀스를 제거했습니다. Illumina Tn5에 의해 준비된 ATAC-seq 라이브러리의 경우, 다음 시퀀스가 어댑터 시퀀스로 사용됩니다: CTGTCTCTTATACACATCT. 어댑터 오염을 인식하는 최소 시퀀스 길이는 5로 설정됩니다. - 게놈 매핑: 다음 매개 변수 "-I 0 -X 2000 -m 1"15를 사용하여 Bowtie를 사용하여 판독값을 적절한 게놈에 매핑합니다. MDA-MB-231 기저 유방암 세포의 매핑 품질의 예는 다음과 같습니다.
하나 이상의 보고된 정렬이 있는 읽기: 52.79%
정렬에 실패한 읽기: 13.10%
-m으로 인해 정렬이 억제된 읽기: 34.11% - 중복 제거: Picard 도구로 PCR 중복 표시16.
- 데이터 시각화를 위한 게놈 커버리지 파일 생성: 중복 제거된 쌍단 읽기를 단일 끝 읽기 조각으로 변환합니다. 게놈 커버리지 트랙은 침대 도구17에서 게놈 커버리지 베드를 사용하여 얻습니다.
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Representative Results
성공적이고 고품질의 ATAC-seq 데이터를 얻으려면 실험 조건을 최적화하는 것이 중요합니다. ATAC-seq 라이브러리 준비는 세포 용해, 태그먼트(Tn5에 의한 단편화 및 어댑터 삽입), 게놈 DNA 정제, PCR 증폭 및 데이터 분석의 5가지 주요 단계(그림 1)로 분리할 수 있습니다. 초기 과정으로, 세포 용해 (핵 분리) 완충액은 먼저 각 세포 유형에 대해 최적화되어야합니다. 원래의 ATAC-seq 논문8 또는 CSK 완충액12,13에 기술된 저장성 완충액을 사용하여 유방암 세포를 용해시켰다. 트리판 블루 염색은 핵 분리18을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. MDA-MB-231, T47D, MCF7 및 A375 세포와 같은 인간 암 세포주에서 ATAC-seq 라이브러리 준비를 위해, CSK 완충액은 다수의 그룹12,13,19,20에 의해 사용되었다. CSK 완충액은 또한 배아 줄기 세포21,22 및 초파리 S2 세포 23과 같은 다른 세포 유형에서 ATAC-seq 라이브러리 준비에 사용되었습니다. 용해 완충액 최적화를 위해, 트리판 블루 염색은 세포 용해 효율을 평가하는데 유용하다. 비암성 마우스 유선 상피 세포인 NMuMG를 저장성 완충액8(단계 1 참조) 및 CSK 완충액으로 처리했을 때, CSK 처리된 세포에서 더 높은 세포 용해 효율이 관찰되었습니다(그림 2). 동결 조직의 경우 Omni-ATAC는 ATAC-seq 신호24를 개선하는 것으로 나타났습니다. Omni-ATAC에서 0.1 % NP40, 0.1 % 트윈 -20 및 0.01 % Digitonin을 포함하는 완충액이 세포 용해에 사용됩니다. Digitonin 기반 완충액이 미토콘드리아 DNA의 분율을 감소시키는 것으로 알려져 있지만, CSK 완충액을 사용한 ATAC-seq의 신호 대 잡음비 및 TSS 판독 횟수는 유방암 세포12에서 Omni-ATAC의 신호 대 잡음비 및 TSS 판독 횟수보다 우수한 것으로 나타났습니다. 따라서이 원고의 나머지 부분은 주로 CSK 버퍼가있는 ATAC-seq 데이터의 결과에 중점을 둡니다.
최상의 세포 용해 완충액(핵 분리) 조건을 결정한 후 입력 세포 수와 Tn5 트랜스포자제 농도12,25 사이의 비율을 최적화하는 것이 중요합니다. 전형적으로, Tn5 농도는 25 μL의 반응 혼합물의 총 부피에서 Tn5의 부피를 1.25 μL, 2.5 μL, 내지 5 μL로 변화시킴으로써 적정될 수 있다. 대안적으로, 입력 세포 수는 Tn5 태그먼트 반응을 최적화하기 위해 2.5μL에서 Tn5 효소를 변하지 않게 유지하면서 (예를 들어, 10,000에서 100,000으로) 변경될 수 있다. ATAC-seq 라이브러리의 품질과 Tn5 유도 염색질 분해의 효율성을 평가하기 위해 라이브러리 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 분석할 수 있습니다. 그림 3은 성공적인 ATAC-seq 라이브러리의 예를 보여줍니다. 일반적으로 8 또는 9 사이클(초기 PCR을 포함한 총 PCR 사이클)의 PCR 증폭은 3-6 ng/μL ATAC-seq 라이브러리 농도를 초래합니다. Tn5가 열린 염색질에서 뉴클레오솜이 없는 영역을 우선적으로 "공격"하므로(그림 1), 뉴클레오솜 사다리는 겔 이미지에서 분명해야 합니다(그림 3). 에티듐 브로마이드 또는 SYBR 골드는 아가로스 겔에서 증폭된 DNA를 검출하는 데 사용할 수 있습니다.
다음으로, ATAC-seq 라이브러리를 사용한 qPCR 분석을 사용하여 라이브러리의 품질과 활성 유전자의 프로모터와 같은 개방 염색질 영역에서의 단편 농축을 간략하게 확인할 수 있습니다(그림 4). 프라이머는 양성 대조군으로서 알려진 활성 유전자의 프로모터를 사용하고 음성 대조군으로서 공지된 "폐쇄된"(비활성) 염색질 영역을 사용하여 <80bp 앰플리콘을 생성하도록 설계될 수 있다(도 4A). 테스트된 조건 중에서 CSK 버퍼가 있는 T47D ATAC-seq 라이브러리에서 더 높은 농축이 관찰되었습니다(그림 4B). 예상대로, 프라이머 C를 사용한 ESR1의 상류의 폐쇄 영역에 비해 에스트로겐 수용체 알파 (ESR1) 유전자 프로모터 영역에서 프라이머 K 및 L을 사용하여 더 많은 농축을 발견했습니다 (그림 4B) 26. 그림 5는 Tn5 농도가 다른 ATAC-seq 데이터의 예를 보여줍니다 (25,000 개의 세포가 사용됨). 이 경우 가장 낮은(1.25μL의 Tn5) Tn5 조건에서 더 높은 배경 소음이 감지되었습니다(그림 5, 세로 막대). 2.5 μL 또는 5 μL의 Tn5로부터의 ATAC-seq 데이터는 배경 신호가 더 낮은 개방 염색질 영역에서 유사한 수준의 ATAC-seq 신호를 보였다. 더 높은 농도에서 Tn5에 의한 잠재적 인 과잉 소화를 고려할 때, 2.5 μL의 Tn5가이 세포 유형에 적합하다고 결론 지을 수있다.
또한 상피-중간엽 전이를 연구하는 데 자주 사용되는 NMuMG 세포에서 다른 세포 번호를 사용하여 ATAC-seq를 수행했습니다(그림 6). 시작 부피를 최적화하기 위해 4개의 다른 셀 번호(25,000, 50,000, 75,000 및 100,000)가 ATAC-seq 라이브러리 최적화에 사용되었습니다. 세포를 CSK 완충액으로 용해시키고, 핵을 25μL의 반응 혼합물 중 2.5μL의 Tn5 트랜스포아제와 함께 인큐베이션하였다. Tn5 소화 및 뉴 클레오솜 사다리의 효능을 탐구하기 위해 삽입 된 DNA의 크기 분포를 생물 정보학적으로 분석했습니다 (그림 6A). 더 낮은 세포 수가 사용되었을 때, 뉴 클레오 솜이없는 DNA 단편 (<100 bp)은 시퀀싱 데이터에서 더 풍부했다. 반면에, 모노 뉴 클레오솜 DNA 단편 (175-225 bp)의 분획은 높은 세포 투입 조건 (75,000 세포 및 100,000 세포)에 비해 낮은 세포 투입 샘플 (25,000 세포 및 50,000 세포)에서 적었다. 샘플 간에 차등 DNA 단편 패턴이 관찰되었지만, 입력 세포 수는 프로모터 및 기타 개방 염색질 영역에서 ATAC-seq 신호의 농축에 최소한의 영향을 미치는 것으로 보입니다(그림 6B). 다운스트림 분석에 대한 입력 셀 수의 영향을 추가로 조사하기 위해 ATAC-seq 피크가 정의되었습니다. ATAC-seq 피크는 다음의 파라미터를 사용하여 PeaKDEck 피크 호출 프로그램(27 )에 의해 결정되었다: -sig 0.0001 -bin 300 -back 3,000 -npBack 2,500,000. ~490만 개의 고유하게 매핑된 읽기에서 각각 25,000, 50,000, 75,000 및 100,000개의 셀 입력의 ATAC-seq 데이터에서 38,878, 43,832, 41,509 및 45,530개의 피크가 관찰되었습니다. 100,000셀 입력 조건이 가장 많은 피크 수를 보였습니다. 전사 시작 사이트(TSS) 농축 점수가 ATAC-seq 데이터의 품질을 평가하는 데 사용되었기 때문에 각 ATAC-seq 조건의 TSS 점수는 GitHub 프로그램인 Jiananlin/TSS_enrichment_score_calculation28을 사용하여 계산되었습니다. 25,000, 50,000, 75,000 및 100,000 셀 입력 조건에 대한 TSS 점수는 각각 9.03, 9,02, 8.82 및 8.28이었습니다(TSS 농축 점수는 728보다 큰 경우 이상적인 것으로 간주됨). 이는 세포 수가 증가함에 따라 TSS 농축 점수가 점진적으로 감소함을 나타냅니다. 100,000 셀 입력 조건에서 가장 큰 피크 수가 관찰되었지만 25,000 셀 입력 조건은 더 나은 TSS 점수를 제공했습니다. 호머29 에 의한 피크 주석 분석은 증가된 피크의 대부분이 프로모터 원위 피크로 분류된다는 것을 나타내었다(도 6C). 이러한 결과에 기초하여, 더 높은 셀 수 입력은 더 높은 수의 피크를 생성할 수 있고, 이 조건에서 더 낮은 셀 수 입력에 비해 비-프로모터 피크를 더 자주 검출할 수 있다고 결론지을 수 있다.
그림 1: ATAC-seq 방법의 개요. (A) ATAC-seq는 정방향 및 역방향 어댑터가 사전 로드된 과민성 Tn5 트랜스포아제를 사용하여 염색질 접근성을 측정합니다. 공정의 다양한 단계에는 (B) 세포 용해 (용해 완충액 조성의 최적화, Tn5의 적정 및 사용된 세포 수 포함); (C) 전치 (개방 / 접근 가능한 염색질에 대한 Tn5의 결합); (d) 염색질의 태깅; (E) 라이브러리의 DNA 단편 정제 및 증폭, (F) 라이브러리의 시퀀싱 및 데이터 분석. ATAC-seq 라이브러리의 단편 길이 분포 분석은 일반적으로 ~50bp(뉴클레오솜이 없는 영역) 주변의 초기 피크와 ~200bp(모노뉴클레오솜)의 또 다른 피크를 보여줍니다. 따라서 계산 또는 실험 크기 여과 없이 ATAC-seq 신호는 열린 염색질에 뉴클레오솜이 없는 영역과 뉴클레오솜 영역을 모두 포함합니다. BioRender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 트리판 블루를 사용한 세포 용해 효율 비교. (A) NMuMG 세포를 저장성 완충액8로 처리하고 트리판 블루로 염색하였다. (b) NMuMG 세포를 CSK 완충액으로 처리하고 트리판 블루로 염색하였다. 스케일 바는 50μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: ATAC-seq 라이브러리의 증폭된 DNA 단편 분석. ATAC-seq 라이브러리는 MDA-MB-231 유방암 세포로부터 제조하였다. (A) PCR 증폭 후, PCR 산물을 비드 정제 전후의 0.5x TBE, 1.5% 아가로스 겔 상에서 분석하였다. 프라이머는 대부분 초기 비드 정제에 의해 제거된다. (B) 1x TAE, 1% 아가로스 겔 전기영동 및 (C) 자동 전기영동으로부터의 DNA 밴드 패턴이 또한 지시된다. SYBR 골드는 A 및 B에 나타낸 DNA 단편을 시각화하기 위해 사용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: ATAC-seq 라이브러리의 농축 분석 . (A) ESR1 유전자좌를 보여주는 게놈 브라우저 추적. 도20 에 도시된 T47D 세포에서의 ATAC-seq 데이터의 게놈 커버리지가 도시되어 있다. 이전 간행물로부터의 프라이머는26을 사용하였고, 이들의 표적 영역은 노란색으로 강조되었다. (B) ATAC-seq 라이브러리에서 프라이머 앰플리콘 농축을 나타내는 막대 그래프. ATAC-seq 라이브러리는 저장성 완충액 또는 CSK 완충액에 의해 제조하였다. 상이한 농도의 Tn5를 또한 ATAC-seq 라이브러리를 생성하기 위해 사용하였다. 각 라이브러리의 1 ng을 qPCR을 수행하기 위해 사용하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: ATAC-seq 최적화를 위한 게놈 브라우저 시각화. 다른 양의 Tn5 트랜스포아제가 라이브러리 준비 중에 추가되었습니다. 1.25μL의 Tn5 조건은 더 높은 배경 신호(노란색으로 강조 표시됨)를 나타내는 반면 다른 두 조건은 유사하게 보입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: ATAC-seq 라이브러리의 DNA 단편 크기 분포. (A) ATAC-seq 라이브러리는 지시된 세포 번호를 사용하여 제조하였다. 25,000 세포 입력 조건의 ATAC-seq 데이터는 뉴 클레오 솜이없는 단편의 가장 높은 농축을 보여 주었고, 100,000 세포 입력 조건은 가장 높은 단일 뉴 클레오솜 DNA를 나타 냈습니다. (B) 게놈 브라우저 트랙은 다른 세포 번호의 ATAC-seq 데이터를 보여줍니다. (C) 호머 피크 주석 분석. 각각의 피크는 호머29에 의해 프로모터-근위 또는 원위 피크로서 분류되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 이름 | 순서 |
| ESR1 C 포워드 | TGGTGACTCATATTTGAACAAGCC |
| ESR1 C 역방향 | CTCCTCCGTTGAATGTGTGTCTCC |
| ESR1 K 포워드 | TGTGGCTGGCTGCGTATG |
| ESR1 K 역방향 | TGTCTCTCTCTCTGTTTGATTCCC |
| ESR1 L 포워드 | TGTGCCTGGAGTGATGTTTAAG |
| ESR1 L 역방향 | 캇타카아아그트그트가갓 |
표 1: 본 연구에 사용된 프라이머 목록.
| 단계 | 온도 | 시간 | 주기 |
| 갭 메우기 | 72 °C | 5 분 | 1 |
| 초기 변성 | 98 °C | 30초 | 1 |
| 변성 | 98 °C | 10초 | 5 |
| 어 닐 링 | 63 °C | 30초 | |
| 확장 | 72 °C | 1 분 | |
| 들다 | 4 °C | 영원히 |
표 2: PCR 증폭 프로그램 파트 1.
| 단계 | 온도 | 주기 |
| 초기 변성 | 98 °C 30 초 | 1 |
| 변성 | 98 °C 10 초 | 20 |
| 어 닐 링 | 63 °C 30 초 | |
| 확장 | 72 °C 1 분 | |
| 플레이트 읽기 |
표 3: qPCR 설정.
| 단계 | 온도 | 시간 | 주기 |
| 초기 변성 | 98 °C | 30초 | 1 |
| 변성 | 98 °C | 10초 | 6.4단계에서 계산된 총 사이클 |
| 어 닐 링 | 63 °C | 30초 | |
| 확장 | 72 °C | 1 분 | |
| 들다 | 4 °C | 영원히 |
표 4: PCR 증폭 프로그램 파트 2.
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Discussion
ATAC-seq는 개방 및 활성 염색질 영역을 매핑하는 데 널리 사용되었습니다. 암세포 진행은 종종 유전적 변형과 후성유전학적 재프로그래밍에 의해 주도되어 염색질 접근성과 유전자 발현이 변경됩니다. 이러한 재프로그래밍의 예는 상피-중간엽 전이(EMT) 및 이의 역과정인 중간엽-상피로의 전이(MET) 동안 볼 수 있으며, 이는 종양 전이 동안 주요 세포 재프로그래밍 과정으로 알려져 있다(30). 또 다른 예는 호르몬 요법에 대한 약물 내성의 획득이 종종 내강 유방 종양에서 관찰된다는 것이다31. ATAC-seq는 염색질 수준에서 이러한 세포 표현형 변화를 모니터링하는 데 유용하며 기원 세포 및 암 아형을 예측하는 데 사용할 수 있습니다4.
ATAC-seq에 의한 염색질 리모델링을 정확하게 측정하려면 재현 가능하고 일관된 프로토콜을 수립해야 합니다. 이 원고에서는 ATAC-seq 라이브러리 최적화를 위한 표준 전략에 대해 설명합니다. MDA-MB-231 및 NMuMG 세포주의 ATAC-seq 데이터는 최적화 프로세스의 예로 사용됩니다. NMuMG 세포는 EMT를 연구하는 데 사용되었으며 MDA-MB-231 세포는 역 과정인 MET를 연구하는 데 사용되었습니다. 이러한 세포 모델은 이전에 EMT 및 MET13,32 동안 후성 유전 적 변화를 연구하는 데 사용되었습니다. 세포 용해 및 Tn5 농도에 적합한 완충액을 사용하는 것은 성공적인 ATAC-seq 라이브러리 준비의 핵심 구성 요소입니다. 이러한 구성 요소 외에도 높은 비율(>90%)의 세포 생존율, 용해 완충액 중 적절한 농도의 세제 및 단일 세포 현탁액의 제조도 매우 중요합니다. Tn5 분해 효율이 샘플마다 크게 다르면 데이터 변동을 수정하기가 어렵습니다. 이는 소화 효율을 정량적으로 평가하기위한 내부 및 외부 제어가 부족하기 때문입니다. 세포 특성 또는 특성은 또한 대조군의 세포와 시험군의 세포 간에 다를 수 있다. 따라서 두 실험 그룹 모두에서 고품질 ATAC-seq 데이터를 얻으려면 용해 완충액 선택을 포함한 실험 조건을 신중하게 고려해야 합니다(그림 5 및 그림 6).
개방형 염색질 프로파일링 외에도 ATAC-seq는 전사 인자 발자국과 뉴클레오솜 위치 8,33을 식별하는 데 사용되었습니다. 이러한 정보는 대부분 열린 염색질 영역에서 파생된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다 (그림 1F). 따라서 결과는 열린 염색질 영역으로 편향됩니다. 그럼에도 불구하고 ATAC-seq는 염색질 구조를 연구하기 위한 강력한 도구입니다. 이 혁신적인 도구는 최근 단일 세포 유전체학에 채택되었으며 유전자 조절 및 염색질 생물학에 대한 이해를 향상시키는 데 지속적으로 기여하고 있습니다.
데이터 가용성:
이 프로토콜에 제시된 데이터는 유전자 발현 옴니버스에서 수탁 번호 GSE202791로 입수할 수 있다. GSE72141 및 GSE99479의 ATAC-seq 데이터도 분석에 사용되었습니다.
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Disclosures
저자는이 논문에 설명 된 연구와 관련된 관련 또는 물질적 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
UND 유전체학 핵심 시설에 탁월한 기술 지원에 감사드립니다.
이 연구는 국립 보건원 [P20GM104360에서 M.T., P20 GM104360에서 A.D.]과 노스 다코타 대학교 의과 대학 및 건강 과학 대학 생물 의학과에서 제공 한 창업 기금에서 자금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum - TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP - 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | - | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
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