암 후성유전학 연구를 위한 ATAC-Seq 최적화
Summary
ATAC-seq는 과민성 돌연변이 트랜스포자제 Tn5를 사용하여 전사 인자에 의해 매개되는 염색질 접근성의 변화를 매핑하는 DNA 시퀀싱 방법입니다. ATAC-seq는 암세포의 표현형 변화의 기초가되는 분자 메커니즘의 발견을 가능하게합니다. 이 프로토콜은 암세포를 포함한 상피 세포 유형에서 ATAC-seq에 대한 최적화 절차를 간략하게 설명합니다.
Abstract
고처리량 시퀀싱(ATAC-seq)을 사용한 트랜스포자제 접근 염색질에 대한 분석은 과민성 Tn5 트랜스포아제를 사용하여 디옥시리보 핵산(DNA) 접근성을 프로브합니다. Tn5는 접근 가능한 염색질 영역 내에서 고처리량 시퀀싱을 위해 어댑터를 절단하고 연결합니다. 진핵 세포에서 게놈 DNA는 DNA, 히스톤 및 기타 단백질의 복합체인 염색질로 포장되어 전사 기계에 대한 물리적 장벽 역할을 합니다. 외적 신호에 반응하여, 전사 인자는 유전자 활성화를 위한 전사 기계에 접근할 수 있도록 염색질 리모델링 복합체를 모집합니다. 따라서, 개방된 염색질 영역을 확인하는 것은 암 진행과 같은 생물학적 사건 동안 인핸서 및 유전자 프로모터 활성을 모니터링할 때 유용하다. 이 프로토콜은 사용하기 쉽고 세포 입력 요구 사항이 낮기 때문에 ATAC-seq는 암세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 열린 염색질 영역을 정의하는 데 널리 채택되었습니다. 성공적인 데이터 수집을 위해서는 ATAC-seq 라이브러리를 준비할 때 몇 가지 파라미터를 고려해야 합니다. 그 중 세포 용해 완충액의 선택, Tn5 효소의 적정 및 세포의 시작 부피는 암세포에서 ATAC-seq 라이브러리 준비에 중요합니다. 최적화는 고품질 데이터를 생성하는 데 필수적입니다. 여기에서는 상피 세포 유형에 대한 ATAC-seq 최적화 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다.
Introduction
염색질 접근성은 게놈전체 규모에서 유전자 발현을 조절하기 위한 핵심 요구 사항입니다1. 염색질 접근성의 변화는 종종 암 2,3,4를 포함한 여러 질병 상태와 관련이 있습니다. 수년에 걸쳐 연구자들이 염색질 접근성 영역을 매핑하여 염색질 환경을 조사할 수 있도록 수많은 기술이 개발되었습니다. 그 중 일부에는 DNase-seq(DNase I 과민성 부위 시퀀싱)5, FAIRE-seq(조절 요소의 포름알데히드 보조 분리)6, MAPit(개별 템플릿에 대한 메틸트랜스퍼라제 접근성 프로토콜)7 및 이 논문의 초점인 ATAC-seq(전이효소 접근 가능한 염색질에 대한 분석)8이 포함됩니다. DNase-seq는 DNase의 주요 특징, 즉 히스톤 및 전사 인자5와 같은 기타 단백질이 없는 네이키드 DNA의 우선적 소화를 사용하여 접근 가능한 영역을 매핑합니다. CHIP-seq와 유사한 FAIRE-seq는 면역 침전이 관여하지 않는 것을 제외하고는 포름 알데히드 가교 및 초음파 처리를 사용하며 뉴 클레오 솜이없는 영역은 페놀-클로로포름 추출6에 의해 분리됩니다. MAPit 방법은 GC 메틸트랜스퍼라제를 사용하여 단일 분자 분해능7에서 염색질 구조를 프로브합니다. ATAC-seq는 과민성 전이 효소 Tn58에 의존합니다. Tn5 트랜스포아제는 개방 염색질 영역에 우선적으로 결합하고 시퀀싱 어댑터를 접근 가능한 영역에 삽입합니다. Tn5는 DNA-매개 “잘라내기 및 붙여넣기” 메커니즘을 통해 작동하며, 이에 의해 어댑터가 미리 로드된 트랜스포아제는 염색질 부위를 개방하고, DNA를 절단하고, 어댑터(8)를 결찰한다. Tn5 결합 영역은 이들 어댑터에 어닐링하는 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 회수된다. FAIRE-seq 및 DNase-seq는 시퀀싱 전에 많은 양의 출발 물질(~100,000 세포 내지 225,000 세포)과 별도의 라이브러리 준비 단계를 필요로 합니다9. 반면에 ATAC-seq 프로토콜은 비교적 간단하며 적은 수의 셀(<50,000개 셀)10이 필요합니다. FAIRE-seq 및 DNase-seq 기술과 달리 ATAC-seq의 시퀀싱 라이브러리 준비는 분리된 DNA 샘플이 이미 Tn5에 의해 시퀀싱 어댑터로 태그되고 있기 때문에 비교적 쉽습니다. 따라서, 라이브러리 준비를 완료하기 위해 적절한 프라이머를 사용한 PCR 증폭 단계만이 필요하며, 최종 수리 및 어댑터 라이게이션과 같은 사전 처리 단계가 수행될 필요가 없으므로, 시간(11)을 절약할 수 있다. 둘째, ATAC-seq는 MAPit7에 필요한 영역 특이적 프라이머를 사용한 중아황산염 전환, 클로닝 및 증폭의 필요성을 방지합니다. 이러한 장점으로 인해 ATAC-seq는 개방 염색질 영역을 정의하는 데 매우 인기 있는 방법이 되었습니다. ATAC-seq 방법은 간단하지만 고품질의 재현 가능한 데이터를 얻기 위해 여러 단계를 최적화해야 합니다. 이 원고는 표준 ATAC-seq 라이브러리 준비에 대한 최적화 절차에 대해 논의하며, 특히 (1) 용해 완충액 조성, (2) Tn5 트랜스포아제 농도 및 (3) 세포 수의 세 가지 매개변수를 강조합니다. 또한, 이 논문은 암성 및 비암성 부착성 상피 세포를 모두 사용한 최적화 조건의 예제 데이터를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
ATAC-seq는 개방 및 활성 염색질 영역을 매핑하는 데 널리 사용되었습니다. 암세포 진행은 종종 유전적 변형과 후성유전학적 재프로그래밍에 의해 주도되어 염색질 접근성과 유전자 발현이 변경됩니다. 이러한 재프로그래밍의 예는 상피-중간엽 전이(EMT) 및 이의 역과정인 중간엽-상피로의 전이(MET) 동안 볼 수 있으며, 이는 종양 전이 동안 주요 세포 재프로그래밍 과정으로 알려져 있다(<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
UND 유전체학 핵심 시설에 탁월한 기술 지원에 감사드립니다.
이 연구는 국립 보건원 [P20GM104360에서 M.T., P20 GM104360에서 A.D.]과 노스 다코타 대학교 의과 대학 및 건강 과학 대학 생물 의학과에서 제공 한 창업 기금에서 자금을 지원했습니다.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific – Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum – TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP – 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | – | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
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