Otimização ATAC-Seq para Pesquisa em Epigenética do Câncer
Summary
ATAC-seq é um método de sequenciamento de DNA que usa a transposase mutante hiperativa, Tn5, para mapear mudanças na acessibilidade da cromatina mediadas por fatores de transcrição. O ATAC-seq permite a descoberta dos mecanismos moleculares subjacentes às alterações fenotípicas nas células cancerígenas. Este protocolo descreve procedimentos de otimização para ATAC-seq em tipos de células epiteliais, incluindo células cancerígenas.
Abstract
O ensaio para cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) sonda a acessibilidade do ácido desoxirribonucleico (DNA) usando a transposase hiperativa Tn5. Tn5 corta e ligadura adaptadores para sequenciamento de alto rendimento dentro de regiões de cromatina acessíveis. Nas células eucarióticas, o DNA genômico é embalado em cromatina, um complexo de DNA, histonas e outras proteínas, que atua como uma barreira física à maquinaria transcricional. Em resposta a sinais extrínsecos, os fatores de transcrição recrutam complexos de remodelação da cromatina para permitir o acesso à maquinaria transcricional para a ativação do gene. Portanto, a identificação de regiões abertas da cromatina é útil ao monitorar as atividades do potenciador e do promotor de genes durante eventos biológicos, como a progressão do câncer. Uma vez que este protocolo é fácil de usar e tem um baixo requisito de entrada celular, o ATAC-seq tem sido amplamente adotado para definir regiões abertas da cromatina em vários tipos de células, incluindo células cancerígenas. Para uma aquisição de dados bem-sucedida, vários parâmetros precisam ser considerados ao preparar bibliotecas ATAC-seq. Entre eles, a escolha do tampão de lise celular, a titulação da enzima Tn5 e o volume inicial de células são cruciais para a preparação da biblioteca ATAC-seq em células cancerígenas. A otimização é essencial para gerar dados de alta qualidade. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada dos métodos de otimização ATAC-seq para tipos de células epiteliais.
Introduction
A acessibilidade à cromatina é um requisito fundamental para a regulação da expressão gênica em larga escalagenômica 1. Alterações na acessibilidade à cromatina são frequentemente associadas a vários estados de doença, incluindo câncer 2,3,4. Ao longo dos anos, inúmeras técnicas foram desenvolvidas para permitir que os pesquisadores sondem a paisagem da cromatina mapeando regiões de acessibilidade à cromatina. Alguns deles incluem DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (isolamento assistido por formaldeído de elementos reguladores)6, MAPit (protocolo de acessibilidade à metiltransferase para modelos individuais)7 e o foco deste artigo, ATAC-seq (ensaio para cromatina acessível à transposase)8. O DNase-seq mapeia regiões acessíveis empregando uma característica fundamental da DNase, a saber, a digestão preferencial de DNA nu livre de histonas e outras proteínas, como fatores de transcrição5. O FAIRE-seq, semelhante ao ChIP-seq, utiliza reticulação e sonicação de formaldeído, exceto que não há imunoprecipitação envolvida, e as regiões livres de nucleossomos são isoladas por extração de fenol-clorofórmio6. O método MAPit utiliza uma metiltransferase GC para sondar a estrutura da cromatina na resolução de molécula única7. ATAC-seq baseia-se na transposase hiperativa, Tn58. A transposase Tn5 liga-se preferencialmente a regiões de cromatina abertas e insere adaptadores de sequenciamento em regiões acessíveis. O Tn5 opera através de um mecanismo de “cortar e colar” mediado por DNA, pelo qual a transposase pré-carregada com adaptadores se liga a locais de cromatina abertos, corta o DNA e liga-se aos adaptadores8. As regiões ligadas a Tn5 são recuperadas por amplificação por PCR usando primers que recozidos para esses adaptadores. FAIRE-seq e DNase-seq requerem uma grande quantidade de material de partida (~100.000 células a 225.000 células) e uma etapa de preparação de biblioteca separada antes do sequenciamento9. Por outro lado, o protocolo ATAC-seq é relativamente simples e requer um pequeno número de células (<50.000 células)10. Ao contrário das técnicas FAIRE-seq e DNase-seq, a preparação da biblioteca de sequenciamento do ATAC-seq é relativamente fácil, pois a amostra de DNA isolada já está sendo marcada com os adaptadores de sequenciamento por Tn5. Portanto, apenas a etapa de amplificação por PCR com primers apropriados é necessária para concluir a preparação da biblioteca, e as etapas de processamento prévias, como reparo final e ligadura do adaptador, não precisam ser realizadas, economizando tempo11. Em segundo lugar, o ATAC-seq evita a necessidade de conversão, clonagem e amplificação de bissulfito com primers específicos da região necessários para o MAPit7. Devido a essas vantagens, o ATAC-seq tornou-se um método extremamente popular para definir regiões abertas de cromatina. Embora o método ATAC-seq seja simples, várias etapas exigem otimização para obter dados de alta qualidade e reprodutíveis. Este manuscrito discute procedimentos de otimização para a preparação padrão da biblioteca ATAC-seq, destacando especialmente três parâmetros: (1) composição do tampão de lise, (2) concentração de transposase Tn5 e (3) número de células. Além disso, este artigo fornece dados de exemplo das condições de otimização usando células epiteliais aderentes cancerosas e não cancerosas.
Protocol
Representative Results
Discussion
ATAC-seq tem sido amplamente utilizado para mapear regiões de cromatina abertas e ativas. A progressão das células cancerígenas é frequentemente impulsionada por alterações genéticas e reprogramação epigenética, resultando em acessibilidade alterada da cromatina e expressão gênica. Um exemplo dessa reprogramação é visto durante a transição epitelial-mesenquimal (EMT) e seu processo reverso, a transição mesenquimal-epitélica (MET), que são conhecidos por serem os principais processos de reprogramaç?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos à instalação da UND Genomics Core pela excelente assistência técnica.
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde [P20GM104360 a M.T., P20 GM104360 a A.D.] e fundos iniciais fornecidos pela Escola de Medicina e Ciências da Saúde da Universidade de Dakota do Norte, Departamento de Ciências Biomédicas [a M.T.].
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific – Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum – TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP – 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | – | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
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