Bestemmelse af den termodynamiske og kinetiske forening af en DNA-aptamer og tetracyclin ved hjælp af isotermisk titreringskalorimetri
Summary
Den nuværende protokol beskriver brugen af isotermisk titreringskalorimetri (ITC) til at analysere sammenhængen og dissociationskinetikken af bindingen mellem en DNA-aptamer og tetracyclin, herunder prøveforberedelse, løbende standarder og prøver og fortolkning af de resulterende data.
Abstract
Bestemmelsen af bindende affinitet og adfærd mellem en aptamer og dens mål er det mest afgørende trin i valg og brug af en aptamer til anvendelse. På grund af de drastiske forskelle mellem aptameren og små molekyler skal forskere lægge stor vægt på at karakterisere deres bindingsegenskaber. Isotermisk titreringskalorimetri (ITC) er en kraftfuld tilgang til dette formål. ITC går ud over bestemmelse af disassociationskonstanter (Kd) og kan tilvejebringe entalpiændringer og bindende støkiometri af interaktionen mellem to molekyler i opløsningsfasen. Denne tilgang udfører kontinuerlig titrering ved hjælp af etiketfrie molekyler og registrerer frigivet varme over tid ved bindingshændelserne produceret af hver titrering, så processen følsomt kan måle bindingen mellem makromolekyler og deres små mål. Heri introducerer artiklen en trin-for-trin procedure for ITC-måling af en udvalgt aptamer med et lille mål, tetracyclin. Dette eksempel beviser teknikkens alsidighed og dens potentiale til andre applikationer.
Introduction
Aptamere er ssDNA- eller RNA-fragmenter udvalgt gennem en evolutionsproces med høj bindingsaffinitet og specificitet til de ønskede mål 1,2, som kan fungere som avancerede genkendelseselementer eller kemiske antistoffer 3,4,5. Således spiller aptamers bindingsaffinitet og specificitet til deres mål en afgørende rolle i udvælgelsen og anvendelsen af en aptamer, og isotermisk titreringskalorimetri (ITC) er blevet anvendt i vid udstrækning til disse karakteriseringsformål. Mange tilgange er blevet brugt til at bestemme affiniteten af aptamerer, herunder ITC, overfladeplasmonresonans (SPR), kolorimetrisk titrering, mikroskala termoforese (MST) og Bio-Layer Interferometri (BLI). Blandt dem er ITC en af de nyeste teknikker til bestemmelse af den termodynamiske og kinetiske forening af to molekyler i opløsningsfasen. Denne fremgangsmåde udfører kontinuerlig titrering ved hjælp af etiketfrie molekyler og registrerer frigivet varme over tid ved bindingshændelserne produceret af hver titrering 6,7. I modsætning til andre metoder kan ITC tilbyde bindingsaffinitet, flere bindingssteder og termodynamisk og kinetisk association (figur 1A). Fra disse indledende parametre bestemmes Gibbs frie energiændringer og entropiændringer ved hjælp af følgende forhold:
ΔG = ΔH-TΔS
Det betyder, at ITC tilbyder en komplet termodynamisk profil af den molekylære interaktion for at belyse bindingsmekanismerne (figur 1B). Det er vanskeligt at bestemme bindingsaffiniteten for små molekyler med en aptamer på grund af de drastisk forskellige størrelser mellem aptamer og mål. I mellemtiden kan ITC levere følsom måling uden mærkning og immobilisering af molekyler, hvilket giver et middel til at bevare den naturlige struktur af aptameren og målet under måling. Med de nævnte attributter kan ITC bruges som standardmetode til karakterisering af binding mellem en aptamer og små mål.
Efter udvælgelse af Gu-gruppen blev denne aptamer integreret med forskellige platforme, herunder elektrokemiske aptamerbaserede biosensorer, et konkurrencedygtigt enzymbundet aptamerassay og en mikrotiterplade, som kan opnå detektion af tetracyclin 8,9,10 med høj kapacitet. Dens bindende egenskaber er imidlertid ikke blevet belyst godt nok til at vælge den rigtige platform8; det er værd at karakterisere bindingen af aptameren til tetracyclin ved hjælp af ITC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden, der præsenteres her, blev ændret i henhold til instruktion fra TA Instruments og er tilstrækkelig til at bestemme bindingsaffiniteten og termodynamikken for mange udvalgte aptamerer og mål i vores center. Afgørende trin fra denne procedure inkluderer udveksling af bufferen for at have et mål, der matcher liganden, kører prøver med korrekte parametre og finder den passende bindingstilpasningsmodel til at analysere dataene. Kontinuerlig registrering af varmefrigivelse kræver, at al støjvarme elimineres, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af forsknings- og udviklingsfinansieringen fra Aptagen LLC.
Materials
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
- Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX–A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).
- Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
- Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
- Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
- Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
- Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
- Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272 (2017).
- Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2′,5′ RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
- Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
- Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
- Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
