Summary
本协议描述了使用等温滴定量热法（ITC）来分析DNA适配体和四环素之间结合的关联和解离动力学，包括样品制备，运行标准品和样品，以及解释结果数据。
Abstract
确定适配体与其靶标之间的结合亲和力和行为是选择和使用适配体进行应用的最关键步骤。由于核酸适配体和小分子之间存在巨大差异，科学家们需要付出很多努力来表征它们的结合特性。等温滴定量热法（ITC）是实现此目的的有效方法。ITC不仅可以确定解离常数（Kd），还可以提供溶液相中两个分子之间相互作用的焓变化和结合化学计量。该方法使用无标记分子进行连续滴定，并在每次滴定产生的结合事件上记录随时间释放的热量，因此该过程可以灵敏地测量大分子与其小靶标之间的结合。本文介绍了使用小靶标四环素对选定的核酸适配体进行ITC测量的分步程序。这个例子证明了该技术的多功能性及其在其他应用中的潜力。
Introduction
核酸适配体是通过进化过程选择的ssDNA或RNA片段，与目标靶标1，2具有高结合亲和力和特异性，可作为高级识别元件或化学抗体3，4，5。因此，核酸适配体与其靶标的结合亲和力和特异性在适配体的选择和应用中起着至关重要的作用，等温滴定量热法（ITC）已被广泛用于这些表征目的。许多方法已被用于确定核酸适配体的亲和力，包括ITC、表面等离子体共振（SPR）、比色滴定、微量热泳（MST）和生物层干涉测量（BLI）。其中，ITC是确定两种分子在溶液相中的热力学和动力学结合的最新技术之一。该方法使用无标记分子进行连续滴定，并在每次滴定产生的结合事件6，7上记录随时间释放的热量。与其他方法不同，ITC可以提供结合亲和力，多个结合位点以及热力学和动力学结合（图1A）。根据这些初始参数，吉布斯自由能变化和熵变化使用以下关系确定：
ΔG = ΔH-TΔS
这意味着ITC提供了分子相互作用的完整热力学曲线，以阐明结合机制（图1B）。由于核酸适配体和靶标之间的尺寸大不相同，因此很难确定小分子与适配体的结合亲和力。同时，ITC可以在不标记和固定分子的情况下提供灵敏的测量，这提供了一种在测量过程中保持核酸适配体和靶标自然结构的方法。通过上述属性，ITC可用作表征适配体和小靶点之间结合的标准方法。
经过Gu组的选择，该适配体与不同的平台集成，包括基于电化学适配体的生物传感器、竞争性酶联适配体测定和微量滴定板，可实现四环素8，9，10的高通量检测。然而，其结合特性尚未得到充分阐明，无法选择合适的平台8;值得使用ITC表征适配体与四环素的结合。
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Protocol
注意： 图2 显示了ITC实验的主要步骤，用于确定DNA适配体和四环素的热力学和动力学关联。
1. 样品制备
注意：ITC样品需要在相同的缓冲液中制备适配体和配体，以避免混合样品池和注射器的不同缓冲液引起的热量释放。这通常是通过将所有材料透析到同一缓冲液中来实现的。缓冲液使用改编自3 kDa分子量截止（MWC）浓缩器方案的方案进行交换，并进行一些修改，如下所示：
- 使用从制造商处购买的1x PBS，pH 7.4激活透析柱（3 kDa MWC）的膜，使用以下步骤：填充1x缓冲液（PBS），在室温下平衡10分钟，并以5，000 x g 离心15分钟。
- 取出缓冲液并将 500 μL 适配体样品上样加载到色谱柱中，以 5，000 x g 离心，重复 4 次以将原始缓冲液换成 1x PBS。当缓冲液通过膜时，所有质量小于3kDa的分子都将通过膜，并且适配体将保留在膜的上侧。
- 使用移液管收集透析的DNA适配体并将其转移到新的1.5 mL管中。
- 收集最后的流通缓冲液以溶解四环素。四环素粉纯净小，因此不需要透析。但是，使用先前的DNA透析缓冲液作为靶标，以确保注射器中用于实验的缓冲液与参比细胞中的缓冲液相匹配。
- 使用紫外可见光谱仪再次测定适配体浓度。使用最后的交换缓冲液将浓度调节至40μM四环素和2μM适配体。
- 通过在90°C下加热10分钟，在4°C下冷却10分钟，然后返回RT20分钟来折叠DNA适配体。
- 使用脱气站或真空泵在25°C下设置为600mmHg对折叠的适配体和透析的四环素进行脱气25分钟以消除溶解气体。
2. 清洗仪器并运行检测试剂盒
- 清洁溶剂端口，确保整个样品路径畅通无阻。通过丢弃废液并用纯甲醇、水和缓冲液装载来清洁。每个端口包含超过 250 mL 的液体，以确保有足够的溶液进行清洁。
注意：清洁过程由用户可编程的ITC控制软件自动完成。 - 通过使用缓冲区将ITC运行到缓冲区中（即，将1x PBS运行到1x PBS）来测试机器的清洁度。
注意：在微小缓冲液与缓冲液注入峰之间可见正常噪声基线。当滴定注射器和插管充分清洁并完全干燥时，基线将稳定;基线的增加或减少反映了仪器内部的脏仪器或气泡，需要在运行实际样品之前进行校正。 - 使用包含 EDTA 和 CaCl2 的标准试剂盒（图 3）测试机器的准确性，使用默认程序并按照制造商的说明进行操作。
3.运行样品以确定适配体和四环素之间的结合
- 设置运行参数：搅拌速率为200rpm，在25°C下运行，2μM适配体和40μM四环素，30次进样，每次2.0μL，延迟时间为180秒。
- 使用正在运行的程序计算器检查所需的卷。使用此运行参数，使用 ITC 在 ITC 注射器中使用 230 μL 40 μM 四环素和在 ITC 样品池中使用 485 μL 2 μM 适配体进行 ITC 测量。
- 使用移液器将透析的四环素注射器板和折叠的适配体装入样品池中，避免气泡。
- 通过单击软件上的开始按钮开始运行ITC仪器。
注意：手动填充参比池和滴定剂样品板后，ITC仪器运行过程完全自动化。
4. 使用软件分析数据
- 双击打开数据分析软件，开始分析数据。
- 打开保存的原始数据的路径以了解绑定的趋势。
- 打开建模选项卡并使用不同的绑定模型来查找最适合数据曲线的模型。然后，软件自动计算ITC热图和各种热力学参数，包括焓（ΔH）、熵（ΔS）、自由能（ΔG）、平衡结合常数（Ka）和化学计量。
- 收集根据数据和拟合模型信息确定的热力学参数。
- 创建一个报告，包括ITC热图和各种热力学参数的图片，如图 4 和 表1所示。
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Representative Results
ITC提供了精确的解离常数（Kd），结合化学计量和双分子相互作用的热力学参数6。在该示例中，Kim等人选择的适配体9，11与四环素结合，结合亲和力为Kd 1 = 13 μM，Kd 2 = 53 nM。有趣的是，该结合是使用平衡过滤方法测定的，报告的Kd为63.3 nM，这与有利的结合位点（位点2）没有太大区别。ITC的拟合模型和化学计量反映了适配体通过与顺序结合模型的2：1结合比与四环素结合（图4，表1）。
通过ITC测量确定的位点2的热力学参数（ΔH = -1200 kcal/mol和-TΔS = 99.75 kcal/mol）表明，焓克服相对显着的熵损失驱动了强结合。焓驱动的与熵损失的结合与RNA构象变化有关，据报道这是RNA和小分子之间的结合行为。例如，Thoa等人报道了RNA适配体和Ru（bpy）312之间的这种结合行为（ΔH = -27 kcal/mol和-TΔS = +17 kcal/mol）。此外，Horowitz等人指出，熵驱动的结合与丙黄素与寡核苷酸的插层有关（ΔH = -2.6 kcal/mol和-TΔS = -3.3 kcal/mol）13。基于这些比较，适配体在焓驱动的结合上具有开关结构行为，允许使用适配体作为识别来开发简单的传感器。
图1：结合解离常数（Kd）和热力学曲线。 （A）ITC识别结合解离常数（Kd）和热力学曲线，包括焓的变化（ΔH）和熵的变化（ΔS）。（B）热力学剖面提供了相互作用的强度和机理。 请点击此处查看此图的大图。
图2：ITC实验的主要步骤。 示意图显示了ITC实验的主要步骤，用于确定DNA适配体和四环素的热力学和动力学结合。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：EDTA 和 CaCl2 之间的 ITC 标准测试。 Ca2+-EDTA螯合反应已被用作验证ITC的标准反应。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：DNA 适配体和四环素的 ITC 热图。 热力学和动力学缔合的拟合模型反映了结合具有两个独立的结合位点。请点击此处查看此图的大图。
| 顺序二站点 | Kd （M） | 1.359 x 10-5 |
| Kd （M） | 5.378 x 10-8 | |
| δh （千卡/摩尔） | 1223 | |
| δh （千卡/摩尔） | -1200 | |
| 卡 （Mˉ¹） | 7.358 x 104 | |
| 卡 （Mˉ¹） | 1.859 x 107 | |
| ΔS （钙/摩尔 K） | 约4.123 x 103 | |
| ΔS （钙/摩尔 K） | -3.992 x 103 |
表1：核酸适配体和四环素结合的参数。 各种热力学参数，包括焓（ΔH）、熵（ΔS）、自由能（ΔG）、平衡结合常数（Ka）和化学计量，可以通过两种分子的结合机制来确定。
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Discussion
这里介绍的方法根据TA Instruments的说明进行了修改，足以确定我们中心许多选定的核酸适配体和靶标的结合亲和力和热力学。该过程的关键步骤包括交换缓冲液以获得与配体匹配的靶标，使用适当的参数运行样品，以及找到合适的结合拟合模型来分析数据。连续记录热释放需要消除所有噪声热量，例如缓冲液不匹配、细胞和注射器脏污以及样品内部气泡。在缓冲液交换步骤中，最好使用透析膜或离心柱中的最后透析缓冲液或流通缓冲液来溶解配体，因为直接交换小分子的成本很高。
大多数其他结合亲和力测定方法假设适配体和配体之间的结合比为1：1。然而，由于结合行为以及小分子和适配体之间的巨大差异，1：1结合模型并不总是准确的14，15。在这方面，ITC可以给出结合化学计量的数据，以了解结合位点的数量，并给出有关结合行为的信息7，15。该高级功能可以通过使用ITC分析软件中的正确绑定模型（单位点或双位点绑定模型）来提供。一个饱和点可以在1：1（1个结合位点）、1：2或0.5：1（两个结合位点）的不同结合比下进行分析。对于顺序模型，没有明显的饱和位点，只有饱和位点的总数。如果站点相同，则数据符合顺序饱和度。在那里，第一个结合位点比第二个位点有更多的同类空拷贝可供选择，从位点到位点14，15，16释放的热能减少就证明了这一点。结合参数确定每个结合位点的结合常数K。在这种情况下，它显示了与两个连续结合位点的结合，确认了整个分子的构象变化。尽管ITC提供了许多高级功能来表征适配体和小分子之间的结合，但具有良好条件的优化过程需要花费时间7，16，17。此外，与其他仪器相比，ITC设备价格昂贵，需要训练有素的技术人员处理。
在大多数情况下，确定适配体和小分子配体之间的结合亲和力具有挑战性。ITC可以被认为是一种用于此目的的高级方法，因为ITC提供高度准确的结合亲和力以及热力学信息。根据这些信息，我们可以预测其行为，以将其用于临床使用或检测。例如，对于具有两个结合位点的选定适配体，如果一个位点不利于结合，我们可以截断它以保留一个结合位点，或者如果两个结合位点具有相同的行为，我们可以将核酸适配体分成两个适配体。此外，通过构象结构变化行为，我们可以将适配体与淬火平台相结合来开发传感器。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项研究得到了Aptagen LLC的研发基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
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