Summary
Il presente protocollo descrive l'uso della calorimetria isotermica di titolazione (ITC) per analizzare l'associazione e la cinetica di dissociazione del legame tra un aptamero del DNA e una tetraciclina, compresa la preparazione del campione, gli standard di esecuzione e i campioni e l'interpretazione dei dati risultanti.
Abstract
La determinazione dell'affinità e del comportamento di legame tra un aptamero e il suo bersaglio è il passo più cruciale nella selezione e nell'utilizzo di un aptamero per l'applicazione. A causa delle drastiche differenze tra l'aptamero e le piccole molecole, gli scienziati devono impegnarsi molto per caratterizzare le loro proprietà leganti. La calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è un approccio potente per questo scopo. L'ITC va oltre la determinazione delle costanti di dissociazione (Kd) e può fornire le variazioni di entalpia e la stechiometria di legame dell'interazione tra due molecole nella fase di soluzione. Questo approccio conduce la titolazione continua utilizzando molecole label-free e registra il calore rilasciato nel tempo sugli eventi di legame prodotti da ciascuna titolazione, in modo che il processo possa misurare sensibilmente il legame tra le macromolecole e i loro piccoli bersagli. Qui, l'articolo introduce una procedura passo-passo della misurazione ITC di un aptamero selezionato con un piccolo bersaglio, la tetraciclina. Questo esempio dimostra la versatilità della tecnica e il suo potenziale per altre applicazioni.
Introduction
Gli aptameri sono frammenti di ssDNA o RNA selezionati attraverso un processo evolutivo con elevata affinità di legame e specificità ai bersagli desiderati 1,2, che possono funzionare come elementi di riconoscimento avanzato o anticorpi chimici 3,4,5. Pertanto, l'affinità di legame e la specificità degli aptameri ai loro bersagli svolgono un ruolo cruciale nella selezione e nell'applicazione di un aptamero e la calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è stata ampiamente utilizzata per questi scopi di caratterizzazione. Molti approcci sono stati utilizzati per determinare l'affinità degli aptameri, tra cui ITC, risonanza plasmonica di superficie (SPR), titolazione colorimetrica, termoforesi su microscala (MST) e interferometria a biostrati (BLI). Tra questi, ITC è una delle ultime tecniche per determinare l'associazione termodinamica e cinetica di due molecole nella fase di soluzione. Questo approccio conduce la titolazione continua utilizzando molecole label-free e registra il calore rilasciato nel tempo sugli eventi di legame prodotti da ciascuna titolazione 6,7. A differenza di altri metodi, ITC può offrire affinità di legame, diversi siti di legame e associazione termodinamica e cinetica (Figura 1A). Da questi parametri iniziali, le variazioni di energia libera di Gibbs e le variazioni di entropia sono determinate usando la seguente relazione:
ΔG = ΔH-TΔS
Ciò significa che ITC offre un profilo termodinamico completo dell'interazione molecolare per chiarire i meccanismi di legame (Figura 1B). Determinare l'affinità di legame per piccole molecole con un aptamero è difficile a causa delle dimensioni drasticamente diverse tra aptamero e bersaglio. Nel frattempo, ITC può fornire misurazioni sensibili senza etichettare e immobilizzare le molecole, il che fornisce un mezzo per mantenere la struttura naturale dell'aptamero e del bersaglio durante la misurazione. Con gli attributi menzionati, ITC può essere utilizzato come metodo standard per la caratterizzazione del legame tra un aptamero e piccoli bersagli.
Dopo la selezione da parte del gruppo Gu, questo aptamero è stato integrato con diverse piattaforme, tra cui biosensori elettrochimici basati su aptamero, un test aptamero enzimatico competitivo e una piastra di microtitolazione, che può ottenere un rilevamento ad alta produttività della tetraciclina 8,9,10. Tuttavia, le sue caratteristiche di legame non sono state chiarite abbastanza bene da sceglierela piattaforma 8 corretta; vale la pena caratterizzare il legame dell'aptamero alla tetraciclina usando ITC.
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Protocol
NOTA: La Figura 2 mostra le fasi principali dell'esperimento ITC per determinare l'associazione termodinamica e cinetica di un aptamero del DNA e della tetraciclina.
1. Preparazione dei campioni
NOTA: I campioni per ITC devono essere preparati nello stesso tampone sia per l'aptamero che per il ligando per evitare il rilascio di calore causato dalla miscelazione di tamponi diversi dalla cella del campione e dalla siringa. Ciò si ottiene in genere attraverso la dialisi di tutti i materiali nello stesso tampone. Il buffer viene scambiato utilizzando un protocollo adattato dal protocollo di un concentratore di taglio del peso molecolare (MWC) da 3 kDa con alcune modifiche, come di seguito:
- Attivare la membrana della colonna di dialisi (3 kDa MWC) con 1x PBS, pH 7,4, acquistata dal produttore, utilizzando i seguenti passaggi: riempire con 1x tampone (PBS), equilibrare per 10 minuti a RT e centrifugare a 5.000 x g per 15 minuti.
- Rimuovere il tampone e caricare 500 μL di campioni di aptamero nella colonna, centrifugare a 5.000 x g e ripeterlo 4 volte per sostituire il tampone originale con 1x PBS. Quando il tampone passa attraverso la membrana, tutte le molecole con una massa inferiore a 3 kDa passeranno attraverso la membrana e l'aptamero rimarrà sul lato superiore della membrana.
- Raccogliere l'aptamero del DNA dializzato usando un pipet e trasferirlo nei nuovi tubi da 1,5 ml.
- Raccogliere l'ultimo buffer di flusso per sciogliere la tetraciclina. La polvere di tetraciclina è pura e piccola, quindi la dialisi non è necessaria. Tuttavia, utilizzare il tampone dializzato precedente per il DNA per il bersaglio per assicurarsi che il tampone per l'esperimento nella siringa corrisponda al tampone nella cella di riferimento.
- Determinare nuovamente la concentrazione dell'aptamero utilizzando uno spettrometro UV-visibile. Utilizzare l'ultimo tampone di scambio per regolare la concentrazione a 40 μM di tetraciclina e 2 μM di aptamero.
- Ripiegare l'aptamero del DNA riscaldando a 90 °C per 10 minuti, raffreddando a 4 °C per 10 minuti e quindi tornando a RT per 20 minuti.
- Degasare l'aptamero piegato e la tetraciclina dializzata utilizzando una stazione di degasaggio o una pompa per vuoto impostata a 600 mmHg a 25 °C per 25 minuti per eliminare i gas disciolti.
2. Lavare lo strumento e far funzionare il kit di prova
- Pulire le porte del solvente per assicurarsi che l'intero percorso del campione sia chiaro. Pulire scartando la soluzione di scarto e caricandoli con metanolo puro, acqua e tampone. Ogni porta contiene più di 250 ml per garantire una soluzione sufficiente per la pulizia.
NOTA: Il processo di pulizia viene completato automaticamente dal software di controllo ITC programmabile dall'utente. - Testare la pulizia della macchina eseguendo ITC utilizzando il buffer in un buffer (ad esempio, 1x PBS in 1x PBS).
NOTA: una normale linea di base del rumore è visibile tra il piccolo buffer nei picchi di iniezione del buffer. Quando la siringa di titolazione e le cannule sono adeguatamente pulite e completamente asciutte, la linea di base sarà stabile; Un aumento o una diminuzione della linea di base riflette la strumentazione sporca o le bolle all'interno dello strumento, che devono essere corrette prima di eseguire campioni effettivi. - Testare l'accuratezza della macchina con un kit standard che include EDTA e CaCl2 (Figura 3), utilizzando il programma predefinito e seguendo le istruzioni del produttore.
3. Esecuzione del campione per determinare il legame tra aptamero e tetraciclina
- Impostare i parametri di funzionamento: una velocità di agitazione di 200 giri / min, funzionante a 25 °C, 2 μM aptamero e 40 μM tetraciclina, 30 iniezioni con 2,0 μL ciascuna, un tempo di ritardo di 180 s.
- Controllare i volumi richiesti utilizzando un calcolatore di programmi in esecuzione. Con questo parametro corrente, eseguire la misurazione ITC con 230 μL di tetraciclina da 40 μM nella siringa ITC e 485 μL di aptamero da 2 μM nella cella campione ITC utilizzando ITC.
- Caricare le piastre della siringa tetraciclina dializzate e l'aptamero piegato nella cella del campione, evitando bolle, usando una pipetta.
- Avviare l'esecuzione dello strumento ITC facendo clic sul pulsante Start sul software.
NOTA: Il processo di funzionamento dello strumento ITC è completamente automatizzato dopo aver riempito manualmente la cella di riferimento e le piastre campione titolanti.
4. Analisi dei dati tramite software
- Aprire il software di analisi dei dati facendo doppio clic per avviare l'analisi dei dati.
- Aprire il percorso dei dati grezzi salvati per conoscere la tendenza all'associazione.
- Aprire la scheda Modellazione e utilizzare diversi modelli di associazione per trovare la soluzione migliore per la curva di dati. Quindi, il software calcola automaticamente il termogramma ITC e vari parametri termodinamici, tra cui entalpia (ΔH), entropia (ΔS), energia libera (ΔG), costante di legame all'equilibrio (Ka) e stechiometria.
- Raccogliere i parametri termodinamici determinati dai dati e dalle informazioni del modello di adattamento.
- Creare un report, includendo immagini del termogramma ITC e vari parametri termodinamici, come mostrato nella Figura 4 e nella Tabella 1.
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Representative Results
ITC fornisce un'accurata costante di dissociazione (Kd), la stechiometria di legame e i parametri termodinamici delle interazioni a due molecole6. In questo esempio, l'aptamero selezionato da Kim et al.9,11 si lega alla tetraciclina con affinità di legame di K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. È interessante notare che questo legame è stato determinato utilizzando il metodo di filtrazione all'equilibrio e un Kd riportato di 63,3 nM, che non è molto diverso dal sito di legame favorevole (sito 2). Il modello di adattamento e la stechiometria di ITC riflettono che l'aptamero si lega alla tetraciclina attraverso un rapporto di legame 2:1 con il modello di legame sequenziale (Figura 4, Tabella 1).
I parametri termodinamici determinati dalla misurazione ITC per il sito 2 (ΔH = -1200 kcal/mol e -TΔS = 99,75 kcal/mol) hanno indicato che il superamento di una perdita entropica relativamente significativa guida il forte legame. Il legame guidato dall'entalpia con perdita di entropia si riferisce ai cambiamenti conformazionali dell'RNA, che sono stati riportati come comportamenti di legame tra RNA e una piccola molecola. Ad esempio, Thoa et al. hanno riportato tale comportamento di legame (ΔH = -27 kcal / mol e -TΔS = +17 kcal / mol) tra un aptamero RNA e Ru (bpy) 312. Inoltre, Horowitz et al. hanno indicato che il legame guidato dall'entropia è associato all'intercalazione della proflavina in un oligonucleotide (ΔH = -2,6 kcal / mol e -TΔS = -3,3 kcal / mol)13. Sulla base di questi confronti, l'aptamero funziona con un comportamento strutturale di commutazione su legame guidato dall'entalpia, consentendo di utilizzare l'aptamero come riconoscimento per lo sviluppo di un sensore semplice.
Figura 1: Costante di dissociazione di legame (Kd) e profilo termodinamico. (A) ITC identifica la costante di dissociazione di legame (Kd) e il profilo termodinamico, compresa la variazione dell'entalpia (ΔH) e la variazione dell'entropia (ΔS). (B) Il profilo termodinamico fornisce la forza e il meccanismo di interazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Fasi principali dell'esperimento ITC. Lo schema mostra le fasi principali dell'esperimento ITC per determinare l'associazione termodinamica e cinetica di un aptamero del DNA e della tetraciclina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Test standard ITC tra EDTA e CaCl2. La chelazione Ca2+-EDTA è stata utilizzata come reazione standard per convalidare ITC. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Termogramma ITC di un aptamero del DNA e della tetraciclina. Il modello di adattamento dell'associazione termodinamica e cinetica riflette che il legame ha due siti di legame indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Due siti sequenziali | Kd (M) | 1.359 x 10-5 |
| Kd (M) | 5.378 x 10-8 | |
| ΔH (kcal/mol) | 1223 | |
| ΔH (kcal/mol) | -1200 | |
| Ka (mˉ¹) | 7.358 x 104 | |
| Ka (mˉ¹) | 1,859 x 107 | |
| ΔS (cal/mol K) | 4.123 x 103 | |
| ΔS (cal/mol K) | -3,992 x 103 |
Tabella 1: Parametri del legame tra aptamero e tetraciclina. Vari parametri termodinamici, tra cui entalpia (ΔH), entropia (ΔS), energia libera (ΔG), costante di legame all'equilibrio (Ka) e stechiometria, possono essere determinati dal meccanismo di legame di due molecole.
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Discussion
Il metodo qui presentato è stato modificato secondo le istruzioni di TA Instruments ed è sufficiente per determinare l'affinità di legame e la termodinamica di molti aptameri e bersagli selezionati presso il nostro centro. I passaggi cruciali di questa procedura includono lo scambio del buffer per avere un target corrispondente al ligando, l'esecuzione di campioni con parametri appropriati e la ricerca del modello di adattamento di binding appropriato per analizzare i dati. La registrazione continua del rilascio di calore richiede l'eliminazione di tutto il calore del rumore, ad esempio dalla mancata corrispondenza del buffer, dalla sporcizia della cella e della siringa e dalle bolle all'interno dei campioni. Nella fase di scambio del tampone, è meglio utilizzare l'ultimo tampone di dialisi o tampone di flusso nella membrana di dialisi o nella colonna di spin per dissolvere il ligando perché è costoso scambiare direttamente piccole molecole.
La maggior parte degli altri metodi di determinazione dell'affinità di legame presuppone un rapporto di legame 1:1 tra aptamero e ligando. Tuttavia, a causa del comportamento di legame e delle dimensioni drasticamente diverse tra piccole molecole e aptameri, il modello di legame 1:1 non è sempre accurato14,15. In questo aspetto, l'ITC può fornire dati sulla stechiometria di legame per conoscere il numero di siti di legame e fornire informazioni sul comportamento di legame 7,15. Questa funzione avanzata può essere fornita utilizzando il modello di associazione corretto dal software di analisi ITC, il modello di associazione a uno o due siti. Un punto saturo può essere analizzato con un diverso rapporto di legame di 1:1 (1 sito di legame), 1:2 o 0,5:1 (due siti di legame). Per il modello sequenziale, non esiste un sito saturo distinto, ma solo un numero totale di siti saturi. Se i siti sono identici, i dati si adattano alla saturazione sequenziale. Lì, il primo sito di rilegatura ha più copie vuote dello stesso tipo tra cui scegliere rispetto al secondo sito, come evidente dalla diminuzione dell'energia termica rilasciata da sito a sito14,15,16. I parametri di associazione determinano la costante di associazione K per ciascun sito di associazione. In questo caso, mostra il legame con due siti di legame sequenziali, confermando il cambiamento conformazionale nella molecola complessiva. Sebbene ITC offra molte funzioni avanzate per caratterizzare il legame tra l'aptamero e le piccole molecole, il processo di ottimizzazione che ha buone condizioni costa tempo 7,16,17. Inoltre, rispetto ad altri strumenti, le apparecchiature ITC sono costose e richiedono la gestione da parte di un tecnico ben addestrato.
Nella maggior parte dei casi, determinare l'affinità di legame tra un aptamero e un ligando a piccola molecola è difficile. L'ITC può essere considerato un metodo avanzato per questo scopo perché l'ITC fornisce affinità di legame altamente accurate, nonché informazioni termodinamiche. Da queste informazioni, possiamo prevedere il suo comportamento per usarlo per uso clinico o rilevamento. Ad esempio, con l'aptamero selezionato con due siti di associazione, possiamo troncarlo per mantenere un sito di associazione se un sito non è favorevole per l'associazione, oppure possiamo dividere l'aptamero in due aptameri se entrambi i siti di associazione hanno lo stesso comportamento. Inoltre, con il comportamento di modifica della struttura di conformazione, possiamo combinare l'aptamero con una piattaforma di tempra per sviluppare un sensore.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata supportata dal finanziamento per la ricerca e lo sviluppo di Aptagen LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
- Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).
- Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
- Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
- Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
- Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
- Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
- Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272 (2017).
- Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
- Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
- Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
- Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
