Summary
本プロトコルは、等温滴定熱量測定(ITC)を使用して、DNAアプタマーとテトラサイクリンの間の結合の会合および解離速度論を分析し、サンプル調製、標準およびサンプルの実行、および結果のデータの解釈を含むことを説明しています。
Abstract
アプタマーとその標的との間の結合親和性と挙動の決定は、適用するアプタマーを選択して使用する上で最も重要なステップです。アプタマーと低分子の間には劇的な違いがあるため、科学者はそれらの結合特性の特性評価に多大な努力を払う必要があります。等温滴定熱量測定(ITC)は、この目的のための強力なアプローチです。ITCは、解離定数(Kk)の決定を超えて、溶液相における2つの分子間の相互作用のエンタルピー変化と結合化学量論を提供することができます。このアプローチは、ラベルフリー分子を使用して連続滴定を行い、各滴定によって生成される結合イベントで時間の経過とともに放出された熱を記録するため、このプロセスでは高分子とその小さなターゲット間の結合を高感度に測定できます。ここでは、小さな標的であるテトラサイクリンを用いて選択されたアプタマーのITC測定の段階的な手順を紹介します。この例は、この手法の汎用性と他のアプリケーションへの可能性を証明しています。
Introduction
アプタマーは、所望の標的1,2に対する高い結合親和性および特異性を有する進化過程を通じて選択されたssDNAまたはRNA断片であり、これは高度な認識要素または化学抗体として働き得る3,4,5。したがって、アプタマーの標的への結合親和性と特異性は、アプタマーの選択と適用において重要な役割を果たし、等温滴定熱量測定(ITC)はこれらの特性評価の目的で広く使用されています。ITC、表面プラズモン共鳴(SPR)、比色滴定、マイクロスケール熱泳動(MST)、バイオレイヤー干渉法(BLI)など、アプタマーの親和性を決定するために多くのアプローチが使用されてきました。その中で、ITCは、溶液相における2つの分子の熱力学的および速度論的会合を決定するための最新の技術の1つです。このアプローチは、ラベルフリー分子を用いて連続滴定を行い、各滴定によって生じる結合事象に対して経時的に放出された熱を記録する6,7。他の方法とは異なり、ITCは結合親和性、いくつかの結合部位、および熱力学的および速度論的会合を提供することができます(図1A)。これらの初期パラメータから、ギブズの自由エネルギー変化とエントロピー変化は、次の関係を使用して決定されます。
ΔG = ΔH-TΔS
つまり、ITCは分子間相互作用の完全な熱力学的プロファイルを提供し、結合メカニズムを解明します(図1B)。アプタマーと低分子の結合親和性の決定は、アプタマーとターゲットのサイズが大きく異なるため困難です。一方、ITCは分子を標識したり固定化したりすることなく高感度な測定が可能で、測定中にアプタマーやターゲットの自然な構造を保つことができます。上記の特性により、ITCは、アプタマーと小さなターゲットとの間の結合の特性評価のための標準的な方法として使用できます。
Guグループによる選択後、このアプタマーは、電気化学的アプタマーベースのバイオセンサー、競合する酵素結合アプタマーアッセイ、テトラサイクリン8,9,10のハイスループット検出を達成できるマイクロタイタープレートなど、さまざまなプラットフォームと統合されました。しかしながら、その結合特性は、適切なプラットフォームを選択するのに十分なほど十分に解明されていない8;ITCを用いてアプタマーのテトラサイクリンへの結合を特徴付ける価値がある。
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Protocol
注: 図2 は、DNAアプタマーとテトラサイクリンの熱力学的および速度論的会合を決定するためのITC実験の主なステップを示しています。
1. サンプルの調製
注:ITCのサンプルは、サンプルセルとシリンジからの異なるバッファーの混合による熱放出を避けるために、アプタマーとリガンドの両方で同じバッファーで調製する必要があります。これは通常、すべての材料を同じバッファーに透析することによって達成されます。バッファーは、以下のようにいくつかの変更を加えた3 kDa分子量カットオフ(MWC)濃縮器のプロトコルに適合したプロトコルを使用して交換されます。
- 以下の手順を使用して、メーカーから購入した1x PBS、pH 7.4で透析カラムのメンブレン(3 kDa MWC)を活性化します:1xバッファー(PBS)で充填し、RTで10分間平衡化し、5,000 x g で15分間遠心分離します。
- バッファーを除去し、500 μLのアプタマーサンプルをカラムにロードし、5,000 x gで遠心分離し、4回繰り返して元のバッファーを1x PBSに交換します。バッファーが膜を通過すると、質量が3 kDa未満のすべての分子が膜を通過し、アプタマーは膜の上側に残ります。
- 透析したDNAアプタマーをピペットで回収し、新しい1.5 mLチューブに移します。
- 最後のフロースルーバッファーを収集して、テトラサイクリンを溶解します。テトラサイクリン粉末は純粋で小さいので、透析は必要ありません。ただし、シリンジ内の実験用のバッファーが参照セル内のバッファーと一致することを確認するために、ターゲットのDNA用に以前に透析されたバッファーを使用してください。
- 紫外可視分光計を用いて再度アプタマー濃度を測定します。最後の交換バッファーを使用して、濃度を40 μMテトラサイクリンおよび2 μMアプタマーに調整します。
- DNAアプタマーを90°Cで10分間加熱し、4°Cで10分間冷却した後、RTに20分間戻します。
- 折り畳まれたアプタマーと透析テトラサイクリンを、脱気ステーションまたは600 mmHgに設定した真空ポンプで25°C、25分間脱気し、溶存ガスを除去します。
2.機器の洗浄とテストキットの実行
- 溶媒ポートを洗浄して、サンプルパス全体が透明であることを確認します。廃液を廃棄し、純粋なメタノール、水、バッファーをロードして洗浄します。各ポートには250mL以上が含まれており、洗浄に十分な溶液を確保します。
注意: クリーニングプロセスは、ユーザーがプログラム可能なITC制御ソフトウェアによって自動的に完了します。 - バッファを使用してITCをバッファに(つまり、1x PBSを1x PBSに)実行して、マシンの清浄度をテストします。
注:通常のノイズベースラインは、小さなバッファからバッファインジェクションピークの間に見られます。滴定シリンジとカニューレが適切に洗浄され、完全に乾燥すると、ベースラインは安定します。ベースラインの増減は、汚れた計装や装置内の気泡を反映しており、実際のサンプルを実行する前に修正する必要があります。 - EDTAとCaCl2 (図3)を含む標準キットを使用して、デフォルトのプログラムを使用し、製造元の指示に従って、機械の精度をテストします。
3.サンプルを実行して、アプタマーとテトラサイクリンの結合を決定します
- 実行パラメータを設定します:200rpmの攪拌速度、25°Cでの実行、2μMアプタマーと40μMテトラサイクリン、それぞれ2.0μLの30回の注入、180秒の遅延時間。
- 実行中のプログラム計算機を使用して、必要なボリュームを確認します。この実行パラメータを使用して、ITCシリンジ内の230 μLの40 μMテトラサイクリンとITCサンプルセル内の485 μLの2 μMアプタマーを使用してITC測定を実行します。
- 透析したテトラサイクリンシリンジプレートと折り畳まれたアプタマーを、ピペットを使用して気泡を避けてサンプルセルにロードします。
- ソフトウェアのスタートボタンをクリックして、ITC機器の実行を開始します。
注:ITC装置の実行プロセスは、リファレンスセルと滴定サンプルプレートを手動で充填した後、完全に自動化されています。
4.ソフトウェアを使用したデータ分析
- ダブルクリックしてデータ分析ソフトウェアを開き、データの分析を開始します。
- 保存した生データのパスを開いて、バインドの傾向を確認します。
- [モデリング] タブを開き、さまざまなバインド モデルを使用して、データ カーブに最適なものを見つけます。次に、ソフトウェアはITCサーモグラムと、エンタルピー(ΔH)、エントロピー(ΔS)、自由エネルギー(ΔG)、平衡結合定数(Ka)、化学量論などのさまざまな熱力学的パラメータを自動的に計算します。
- データとフィットモデル情報から決定された熱力学的パラメータを収集します。
- 図4と表1に示すように、ITCサーモグラムの写真とさまざまな熱力学的パラメータを含むレポートを作成します。
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Representative Results
ITCは、正確な解離定数(Kd)、結合化学量論、および2分子相互作用の熱力学的パラメータを提供します6。この例では、Kimら9,11によって選択されたアプタマーは、Kd 1 = 13 μM、K d 2 = 53 nMの結合親和性でテトラサイクリンに結合します。興味深いことに、この結合は平衡ろ過法および63.3nMの報告されたKdを用いて決定され、これは好ましい結合部位(部位2)と大差ない。ITCのフィッティングモデルと化学量論は、アプタマーがシーケンシャル結合モデルとの2:1の結合比でテトラサイクリンに結合することを反映しています(図4、表1)。
サイト2のITC測定によって決定された熱力学的パラメータ(ΔH = -1200 kcal/molおよび-TΔS = 99.75 kcal/mol)は、比較的有意なエントロピー損失を克服するエンタルピーが強い結合を促進することを示しました。エントロピー損失を伴うエンタルピー駆動結合は、RNAと低分子との間の結合挙動として報告されているRNA立体構造変化に関連しています。例えば、Thoaらは、RNAアプタマーとRu(bpy)3との間のそのような結合挙動(ΔH = -27 kcal/molおよび-TΔS = +17 kcal/mol)を報告した12。さらに、Horowitzらは、エントロピー駆動結合がオリゴヌクレオチドへのプロフラビンのインターカレーションに関連していることを示しました(ΔH = -2.6 kcal/molおよび-TΔS = -3.3 kcal/mol)13。これらの比較に基づいて、アプタマーはエンタルピー駆動結合時に構造挙動を切り替えることで機能し、簡単なセンサーの開発のための認識としてアプタマーを使用することができます。
図1:結合解離定数(Cd)と熱力学的プロファイル。 (A)ITCは、結合解離定数(Cd)およびエンタルピーの変化(ΔH)およびエントロピーの変化(ΔS)を含む熱力学的プロファイルを識別する。(B)熱力学的プロファイルは、相互作用の強さとメカニズムを提供します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ITC実験の主なステップ。 概略図は、DNAアプタマーとテトラサイクリンの熱力学的および速度論的会合を決定するためのITC実験の主なステップを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:EDTAとCaCl2の間のITC標準テスト。 Ca2+-EDTAキレート化は、ITCを検証するための標準反応として使用されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:DNAアプタマーとテトラサイクリンのITCサーモグラム。 熱力学的および動力学的会合のフィッティングモデルは、結合が2つの独立した結合部位を有することを反映する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| シーケンシャル 2 サイト | Kd (M) | 1.359×10-5 |
| Kd (M) | 5.378×10-8 | |
| ΔH (キロカロリー/モル) | 1223 | |
| ΔH (キロカロリー/モル) | -1200 | |
| カ (Mˉ¹) | 7.358×104 | |
| カ (Mˉ¹) | 1.859×107 | |
| ΔS (カロリー/モル K) | 4.123×103 | |
| ΔS (カロリー/モル K) | △3.992×103 |
表1:アプタマーとテトラサイクリンとの間の結合のパラメータ。 エンタルピー(ΔH)、エントロピー(ΔS)、自由エネルギー(ΔG)、平衡結合定数(Ka)、化学量論などのさまざまな熱力学的パラメータは、2つの分子の結合メカニズムによって決定できます。
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Discussion
ここで紹介する方法は、TA Instrumentsの指示に従って変更されており、当センターで選択された多くのアプタマーとターゲットの結合親和性と熱力学を決定するのに十分です。この手順の重要なステップには、リガンドに一致するターゲットを持つようにバッファーを交換すること、適切なパラメータでサンプルを実行すること、およびデータを分析するための適切な結合フィッティングモデルを見つけることが含まれます。熱放出を継続的に記録するには、バッファーの不一致、細胞とシリンジの汚れ、サンプル内の気泡など、すべてのノイズ熱を排除する必要があります。バッファー交換工程では、低分子を直接交換することは高価であるため、リガンドを溶解するために透析膜またはスピンカラムで最後の透析バッファーまたはフロースルーバッファーを使用する方が良い。
他のほとんどの結合親和性決定法は、アプタマーとリガンドの間の1:1の結合比を想定しています。しかし、結合挙動と低分子とアプタマーのサイズが大きく異なるため、1:1結合モデルは必ずしも正確ではありません14,15。この態様において、ITCは、結合部位の数を知るために結合化学量論に関するデータを提供し、結合挙動に関する情報を与えることができる7、15。この高度な機能は、ITC解析ソフトウェアの正しいバインディングモデル(1サイトまたは2サイトバインディングモデル)を使用することで提供できます。1つの飽和点は、1:1(1つの結合部位)、1:2、または0.5:1(2つの結合部位)の異なる結合比で分析できます。シーケンシャルモデルでは、明確な飽和サイトはなく、飽和サイトの総数のみがあります。サイトが同一の場合、データは順次飽和に適合します。そこでは、第1の結合部位は、部位から部位への放出熱エネルギーの減少から明らかなように、第2の部位よりも選択する同じ種類の空のコピーが多い14、15、16を有する。結合パラメータは、各結合部位の結合定数Kを決定する。この場合、2つの連続した結合部位との結合を示し、分子全体の立体構造変化を確認する。ITCは、アプタマーと低分子間の結合を特徴付けるための多くの高度な機能を提供しますが、良好な条件を持つ最適化プロセスには時間がかかります7,16,17。さらに、他の機器と比較して、ITC機器は高価であり、十分な訓練を受けた技術者による取り扱いが必要です。
ほとんどの場合、アプタマーと低分子リガンド間の結合親和性を決定することは困難です。ITCは、高精度の結合親和性と熱力学的情報を提供するため、この目的のための高度な方法と見なすことができます。この情報から、臨床使用や検出に使用するための挙動を予測することができます。例えば、2つの結合部位を有する選択されたアプタマーでは、1つの部位が結合に有利でない場合は1つの結合部位を保持するように切り捨てることができ、両方の結合部位が同じ挙動を有する場合はアプタマーを2つのアプタマーに分割することができる。また、コンフォメーション構造変化挙動により、アプタマーとクエンチングプラットフォームを組み合わせてセンサーを開発することができます。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。
Acknowledgments
この研究は、Aptagen LLCの研究開発資金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
References
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