Summary
O presente protocolo descreve o uso da Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) para analisar a cinética de associação e dissociação da ligação entre um aptâmero de DNA e tetraciclina, incluindo a preparação de amostras, padrões de corrida e amostras, e a interpretação dos dados resultantes.
Abstract
A determinação da afinidade de ligação e do comportamento entre um aptâmero e seu alvo é o passo mais crucial na seleção e uso de um aptâmero para aplicação. Devido às diferenças drásticas entre o aptâmero e as pequenas moléculas, os cientistas precisam se esforçar muito para caracterizar suas propriedades de ligação. A Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) é uma abordagem poderosa para esse fim. O ITC vai além da determinação de constantes de dissociação (Kd) e pode fornecer as alterações de entalpia e estequiometria de ligação da interação entre duas moléculas na fase de solução. Essa abordagem conduz a titulação contínua usando moléculas livres de rótulo e registra o calor liberado ao longo do tempo sobre os eventos de ligação produzidos por cada titulação, de modo que o processo possa medir sensivelmente a ligação entre as macromoléculas e seus pequenos alvos. Aqui, o artigo introduz um procedimento passo-a-passo da medição ITC de um aptâmero selecionado com um pequeno alvo, a tetraciclina. Este exemplo comprova a versatilidade da técnica e seu potencial para outras aplicações.
Introduction
Aptamers são fragmentos de ssDNA ou RNA selecionados através de um processo evolutivo com alta afinidade de ligação e especificidade aos alvos desejados1,2, que podem funcionar como elementos avançados de reconhecimento ou anticorpos químicos 3,4,5. Assim, a afinidade de ligação e especificidade dos aptâmeros aos seus alvos desempenham um papel crucial na seleção e aplicação de um aptâmero, e a Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) tem sido amplamente utilizada para esses fins de caracterização. Muitas abordagens têm sido usadas para determinar a afinidade dos aptâmeros, incluindo ITC, ressonância plasmônica de superfície (SPR), titulação colorimétrica, termoforese em microescala (MST) e interferometria de biocamada (BLI). Entre elas, a TIC é uma das mais recentes técnicas para determinar a associação termodinâmica e cinética de duas moléculas na fase de solução. Essa abordagem realiza titulação contínua utilizando moléculas livres de rótulo e registra calor liberado ao longo do tempo sobre os eventos de ligação produzidos por cada titulação 6,7. Ao contrário de outros métodos, o ITC pode oferecer afinidade de ligação, vários sítios de ligação e associação termodinâmica e cinética (Figura 1A). A partir desses parâmetros iniciais, as mudanças de energia livre de Gibbs e as mudanças de entropia são determinadas usando a seguinte relação:
ΔG = ΔH-TΔS
Isso significa que o ITC oferece um perfil termodinâmico completo da interação molecular para elucidar os mecanismos de ligação (Figura 1B). Determinar a afinidade de ligação para pequenas moléculas com um aptâmero é difícil devido aos tamanhos drasticamente diferentes entre o aptâmero e o alvo. Enquanto isso, o ITC pode fornecer medição sensível sem rotular e imobilizar moléculas, o que fornece um meio de manter a estrutura natural do aptâmero e do alvo durante a medição. Com os atributos mencionados, o ITC pode ser usado como o método padrão para a caracterização da ligação entre um aptâmero e pequenos alvos.
Após a seleção pelo grupo Gu, este aptâmero foi integrado com diferentes plataformas, incluindo biossensores eletroquímicos à base de aptâmeros, um ensaio de aptâmero ligado a enzimas competitivas e uma placa de microtitulação, que pode alcançar a detecção de alto rendimento de tetraciclina 8,9,10. No entanto, suas características vinculantes não foram elucidadas o suficiente para escolher a plataforma adequada8; vale a pena caracterizar a ligação do aptâmero à tetraciclina usando ITC.
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Protocol
NOTA: A Figura 2 mostra as principais etapas do experimento ITC para determinar a associação termodinâmica e cinética de um aptâmero de DNA e tetraciclina.
1. Preparação das amostras
NOTA: As amostras para ITC têm de ser preparadas no mesmo tampão para o aptâmero e o ligante, a fim de evitar a libertação de calor causada pela mistura de diferentes tampões da célula e da seringa da amostra. Isto é tipicamente conseguido através da diálise de todos os materiais no mesmo tampão. O tampão é trocado usando um protocolo adaptado do protocolo de um concentrador de corte de peso molecular (MWC) de 3 kDa com algumas modificações, como abaixo:
- Ativar a membrana da coluna de diálise (3 kDa MWC) com 1x PBS, pH 7,4, adquirida do fabricante, utilizando as seguintes etapas: preencher com tampão 1x (PBS), equilibrar por 10 min no RT e centrifugar a 5.000 x g por 15 min.
- Remova o buffer e carregue 500 μL de amostras de aptâmero na coluna, centrifugar a 5.000 x g e repeti-lo 4x para trocar o buffer original por 1x PBS. Quando o tampão passa pela membrana, todas as moléculas com uma massa inferior a 3 kDa passarão pela membrana, e o aptâmero permanecerá no lado superior da membrana.
- Recolha o aptâmero de ADN dialisado utilizando uma pipeta e transfira-o para o(s) novo(s) tubo(s) de 1,5 ml.
- Recolher o último tampão de fluxo para dissolver a tetraciclina. O pó de tetraciclina é puro e pequeno, por isso a diálise não é necessária. No entanto, utilize o tampão dialisado anterior para o ADN para o alvo para garantir que o tampão para a experiência na seringa corresponde ao tampão na célula de referência.
- Determine a concentração de aptâmero novamente usando um espectrômetro UV-visível. Use o último tampão de troca para ajustar a concentração para tetraciclina de 40 μM e aptâmero de 2 μM.
- Dobrar o aptâmero de ADN aquecendo a 90 °C durante 10 min, arrefecendo a 4 °C durante 10 min e, em seguida, regressando ao RT durante 20 min.
- Desgaseifique o aptâmero dobrado e a tetraciclina dialisada utilizando uma estação de desgaseificação ou uma bomba de vácuo regulada para 600 mmHg a 25 °C durante 25 minutos para eliminar os gases dissolvidos.
2. Lavar o instrumento e executar o kit de teste
- Limpe as portas do solvente para garantir que todo o caminho da amostra esteja limpo. Limpe descartando a solução residual e carregando-os com metanol puro, água e tampão. Cada porta contém mais de 250 mL para garantir solução suficiente para a limpeza.
NOTA: O processo de limpeza é concluído automaticamente pelo software de controle ITC programável pelo usuário. - Teste a limpeza da máquina executando o ITC usando buffer em um buffer (ou seja, 1x PBS em 1x PBS).
NOTA: Uma linha de base de ruído normal é visível entre o pequeno buffer em picos de injeção de buffer. Quando a seringa de titulação e as cânulas estiverem adequadamente limpas e completamente secas, a linha de base será estável; um aumento ou diminuição na linha de base reflete instrumentação suja ou bolhas dentro do instrumento, que precisam ser corrigidas antes de executar amostras reais. - Teste a precisão da máquina com um kit padrão que inclui EDTA e CaCl2 (Figura 3), usando o programa padrão e seguindo as instruções do fabricante.
3. Funcionamento da amostra para determinar a ligação entre o aptâmero e a tetraciclina
- Configure os parâmetros de funcionamento: uma taxa de agitação de 200 rpm, funcionando a 25 °C, 2 μM de aptâmero e 40 μM de tetraciclina, 30 injeções com 2,0 μL cada, um tempo de atraso de 180 s.
- Verifique os volumes necessários usando uma calculadora de programa em execução. Com este parâmetro de execução, execute a medição de ITC com 230 μL de tetraciclina de 40 μM na seringa ITC e 485 μL de aptâmero de 2 μM na célula de amostra ITC usando o ITC.
- Carregue as placas de seringa de tetraciclina dialisada e o aptâmero dobrado na célula da amostra, evitando bolhas, utilizando uma pipeta.
- Comece a executar o instrumento ITC clicando no botão Iniciar no software.
NOTA: O processo de execução do instrumento ITC é totalmente automatizado após o enchimento manual da célula de referência e das placas de amostra de titulante.
4. Analisando dados usando software
- Abra o software de análise de dados clicando duas vezes para começar a analisar os dados.
- Abra o caminho dos dados brutos salvos para saber a tendência de vinculação.
- Abra a guia modelagem e use diferentes modelos de vinculação para encontrar o melhor ajuste para a curva de dados. Em seguida, o software calcula automaticamente o termograma ITC e vários parâmetros termodinâmicos, incluindo entalpia (ΔH), entropia (ΔS), energia livre (ΔG), constante de ligação de equilíbrio (Ka) e estequiometria.
- Colete os parâmetros termodinâmicos determinados a partir dos dados e informações do modelo de ajuste.
- Crie um relatório, incluindo imagens do termograma ITC e vários parâmetros termodinâmicos, como mostra a Figura 4 e a Tabela 1.
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Representative Results
A ITC fornece uma constante de dissociação precisa (Kd), a estequiometria de ligação e os parâmetros termodinâmicos das interações de duas moléculas6. Neste exemplo, o aptâmero selecionado por Kim et al.9,11 liga-se à tetraciclina com afinidades de ligação de K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. Curiosamente, essa ligação foi determinada usando o método de filtração de equilíbrio e um Kd relatado de 63,3 nM, o que não é muito diferente do local de ligação favorável (sítio 2). O modelo de adaptação e a estequiometria do ITC refletem que o aptâmero se liga à tetraciclina através de uma relação de ligação de 2:1 com o modelo de ligação sequencial (Figura 4, Tabela 1).
Os parâmetros termodinâmicos determinados pela medição do ITC para o sítio 2 (ΔH = -1200 kcal/mol e -TΔS = 99,75 kcal/mol) indicaram que a superação da entalpia relativamente significativa impulsiona a forte ligação. A ligação impulsionada pela entalpia com perda de entropia refere-se às alterações conformacionais de RNA, que foram relatadas como comportamentos de ligação entre o RNA e uma pequena molécula. Por exemplo, Thoa et al. relataram tal comportamento de ligação (ΔH = -27 kcal/mol e -TΔS = +17 kcal/mol) entre um aptâmero de RNA e Ru(bpy)312. Além disso, Horowitz et al. indicaram que a ligação impulsionada por entropia está associada à intercalação da proflavina a um oligonucleotídeo (ΔH = -2,6 kcal/mol e -TΔS = -3,3 kcal/mol)13. Com base nessas comparações, o aptâmero funciona com comportamento estrutural de comutação na ligação acionada por entalpia, permitindo o uso do aptâmero como reconhecimento para o desenvolvimento de um sensor direto.
Figura 1: Constante de dissociação de ligação (Kd) e perfil termodinâmico. (A) O TIC identifica a constante de dissociação de ligação (Kd) e o perfil termodinâmico, incluindo a alteração da entalpia (ΔH) e a alteração da entropia (ΔS). (B) O perfil termodinâmico fornece a força e o mecanismo de interação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Principais etapas do experimento ITC. O esquema mostra as principais etapas do experimento ITC para determinar a associação termodinâmica e cinética de um aptâmero de DNA e tetraciclina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Teste padrão ITC entre EDTA e CaCl2. A quelação Ca2+-EDTA tem sido usada como uma reação padrão para validar a ITC. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Termograma ITC de um aptâmero de DNA e tetraciclina. O modelo de ajuste de associação termodinâmica e cinética reflete que a ligação tem dois sítios de ligação independentes. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Dois Sites Sequenciais | Kd (M) | 1,359 x 10-5 |
| Kd (M) | 5,378 x 10-8 | |
| ΔH (kcal/mol) | 1223 | |
| ΔH (kcal/mol) | -1200 | |
| Ka (Mˉ¹) | 7,358 x 104 | |
| Ka (Mˉ¹) | 1,859 x 107 | |
| ΔS (cal/mol K) | 4,123 x 103 | |
| ΔS (cal/mol K) | -3,992 x 103 |
Tabela 1: Parâmetros da ligação entre o aptâmero e a tetraciclina. Vários parâmetros termodinâmicos, incluindo entalpia (ΔH), entropia (ΔS), energia livre (ΔG), constante de ligação de equilíbrio (Ka) e estequiometria, podem ser determinados pelo mecanismo de ligação de duas moléculas.
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Discussion
O método aqui apresentado foi modificado de acordo com as instruções da TA Instruments e é suficiente para determinar a afinidade de ligação e termodinâmica de muitos aptâmeros e alvos selecionados em nosso centro. As etapas cruciais desse procedimento incluem a troca do buffer para ter um alvo correspondente ao ligante, a execução de amostras com parâmetros adequados e a localização do modelo de ajuste de ligação apropriado para analisar os dados. O registro contínuo da liberação de calor requer a eliminação de todo o calor do ruído, como a incompatibilidade do buffer, a sujeira da célula e da seringa e as bolhas dentro das amostras. Na etapa de troca de tampão, é melhor usar o último tampão de diálise ou tampão de fluxo na membrana de diálise ou coluna de spin para dissolver o ligante, porque é caro trocar pequenas moléculas diretamente.
A maioria dos outros métodos de determinação de afinidade de ligação assume uma razão de ligação de 1:1 entre o aptâmero e o ligante. No entanto, devido ao comportamento de ligação e ao tamanho drasticamente diferente entre pequenas moléculas e aptâmeros, o modelo de ligação 1:1 nem sempre é preciso14,15. Nesse aspecto, o ITC pode fornecer dados sobre a estequiometria de ligação para conhecer o número de sítios de ligação e fornecer informações sobre o comportamento de ligação 7,15. Essa função avançada pode ser fornecida usando o modelo de vinculação correto do software de análise ITC, seja o modelo de vinculação de um ou dois locais. Um ponto saturado pode ser analisado em uma proporção de ligação diferente de 1:1 (1 local de ligação), 1:2 ou 0,5:1 (dois locais de ligação). Para o modelo sequencial, não há um local saturado distinto, mas apenas um número total de locais saturados. Se os sites forem idênticos, os dados se ajustarão à saturação sequencial. Lá, o primeiro local de encadernação tem mais cópias vazias do mesmo tipo para escolher do que o segundo local, como evidenciado pela diminuição da energia térmica liberada de um local para outro14,15,16. Os parâmetros de ligação determinam a constante de ligação K para cada local de ligação. Neste caso, mostra a ligação com dois sítios de ligação sequenciais, confirmando a alteração conformacional na molécula global. Embora a TIC ofereça muitas funções avançadas para caracterizar a ligação entre o aptâmero e as moléculas pequenas, o processo de otimização com boas condições custa tempo 7,16,17. Além disso, em comparação com outros instrumentos, o equipamento ITC é caro e requer manuseio por um técnico bem treinado.
Na maioria dos casos, determinar a afinidade de ligação entre um aptâmero e um ligante de molécula pequena é um desafio. O ITC pode ser considerado um método avançado para esse fim porque o ITC fornece afinidades de ligação altamente precisas, bem como informações termodinâmicas. A partir dessas informações, podemos prever seu comportamento para usá-lo para uso clínico ou detecção. Por exemplo, com o aptâmero selecionado com dois sites de ligação, podemos truncá-lo para manter um site de ligação se um site não for favorável para ligação, ou podemos dividir o aptâmero em dois aptâmeros se ambos os sites de ligação tiverem o mesmo comportamento. Além disso, com o comportamento de mudança da estrutura de conformação, podemos combinar o aptâmero com uma plataforma de têmpera para desenvolver um sensor.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo Financiamento de Pesquisa e Desenvolvimento da Aptagen LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
References
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