Summary
Door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM's) zijn naar voren gekomen als een veelbelovend in vitro model voor door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en ziektemodellering. Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de contractiliteit en elektrofysiologie van hiPSC-CM's.
Abstract
Geneesmiddel-geïnduceerde cardiotoxiciteit is de belangrijkste oorzaak van drugsverloop en terugtrekking uit de markt. Daarom is het gebruik van geschikte preklinische cardiale veiligheidsbeoordelingsmodellen een cruciale stap tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen. Momenteel is de beoordeling van de cardiale veiligheid nog steeds sterk afhankelijk van dierstudies. Diermodellen worden echter geplaagd door een slechte translationele specificiteit voor mensen als gevolg van soortspecifieke verschillen, met name in termen van cardiale elektrofysiologische kenmerken. Er is dus dringend behoefte aan de ontwikkeling van een betrouwbaar, efficiënt en op mensen gebaseerd model voor preklinische cardiale veiligheidsbeoordeling. Door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) zijn naar voren gekomen als een waardevol in vitro model voor door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en ziektemodellering. hiPSC-CMs kunnen worden verkregen van personen met verschillende genetische achtergronden en verschillende zieke aandoeningen, waardoor ze een ideaal surrogaat zijn om door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteit individueel te beoordelen. Daarom moeten methodologieën worden vastgesteld om de functionele kenmerken van hiPSC-CMs uitgebreid te onderzoeken. In dit protocol beschrijven we verschillende functionele assays die kunnen worden beoordeeld op hiPSC-CM's, waaronder de meting van contractiliteit, veldpotentiaal, actiepotentiaal en calciumbehandeling. Over het algemeen heeft de integratie van hiPSC-CM's in preklinische cardiale veiligheidsbeoordeling het potentieel om een revolutie teweeg te brengen in de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Introduction
De ontwikkeling van geneesmiddelen is een lang en duur proces. Een studie van nieuwe therapeutische geneesmiddelen goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) tussen 2009 en 2018 meldde dat de geschatte mediane kosten van gekapitaliseerd onderzoek en klinische proeven $ 985 miljoen per productbedroegen 1. Geneesmiddel-geïnduceerde cardiotoxiciteit is de belangrijkste oorzaak van drugsverloop en terugtrekking uit de markt2. Met name cardiotoxiciteit wordt gemeld onder meerdere klassen van therapeutische geneesmiddelen3. Daarom is cardiale veiligheidsbeoordeling een cruciaal onderdeel tijdens het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen. Het huidige paradigma voor cardiale veiligheidsbeoordeling is nog steeds sterk afhankelijk van diermodellen. Soortverschillen met het gebruik van diermodellen worden echter steeds meer erkend als een primaire oorzaak van onnauwkeurige voorspellingen voor door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteit bij menselijke patiënten4. De morfologie van cardiale actiepotentiaal verschilt bijvoorbeeld aanzienlijk tussen mensen en muizen vanwege de bijdragen van verschillende repolariserende stromen5. Bovendien zijn differentiële isovormen van cardiale myosine en circulaire RNA's die de hartfysiologie kunnen beïnvloeden goed gedocumenteerd bij soort 6,7. Om deze lacunes te overbruggen, is het noodzakelijk om een betrouwbaar, efficiënt en op mensen gebaseerd model op te stellen voor preklinische cardiale veiligheidsbeoordeling.
De baanbrekende uitvinding van geïnduceerde pluripotente stamceltechnologie (iPSC) heeft ongekende platforms voor geneesmiddelenscreening en ziektemodellering gegenereerd. In het afgelopen decennium zijn methoden om door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) te genereren, goed ingeburgerdgeworden 8,9. hiPSC-CMs hebben grote belangstelling getrokken voor hun potentiële toepassingen in ziektemodellering, door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en precisiegeneeskunde. HiPSC-CM's zijn bijvoorbeeld gebruikt om de pathologische fenotypen van hartaandoeningen veroorzaakt door genetische overerving te modelleren, zoals lange QT-syndroom10, hypertrofische cardiomyopathie11,12 en gedilateerde cardiomyopathie 13,14,15. Bijgevolg zijn belangrijke signaalroutes geïdentificeerd die betrokken zijn bij de pathogenese van hartaandoeningen, die licht kunnen werpen op potentiële therapeutische strategieën voor een effectieve behandeling. Bovendien zijn hiPSC-CM's gebruikt om door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteit geassocieerd met middelen tegen kanker te screenen, waaronder doxorubicine, trastuzumab en tyrosinekinaseremmers 16,17,18; strategieën om de resulterende cardiotoxiciteit te verminderen worden onderzocht. Ten slotte maakt de genetische informatie die wordt bewaard in hiPSC-CMs de screening en voorspelling van door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteit mogelijk op zowel individueel als populatieniveau19,20. Gezamenlijk hebben hiPSC-CMs bewezen een waardevol hulpmiddel te zijn voor gepersonaliseerde cardiale veiligheidsvoorspelling.
Het algemene doel van dit protocol is om methodologieën vast te stellen om de functionele kenmerken van hiPSC-CMs uitgebreid en efficiënt te onderzoeken, die van groot belang zijn bij het toepassen van hiPSC-CM's voor ziektemodellering, door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en precisiegeneeskunde. Hier beschrijven we een reeks functionele testen om de functionele eigenschappen van hiPSC-CM's te beoordelen, inclusief de meting van contractiliteit, veldpotentiaal, actiepotentiaal en calcium (Ca2 +) handling (figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van media en oplossingen
- Bereid hiPSC-CM onderhoudsmedium voor door een fles van 10 ml van 50x B27-supplement en 500 ml RPMI 1640-medium te mengen. Bewaar het medium bij 4 °C en gebruik het binnen een maand. Breng het medium voor gebruik in evenwicht tot kamertemperatuur (RT).
- Bereid hiPSC-CM zaaimedium door 20 ml serumvervanging en 180 ml hiPSC-CM onderhoudsmedium (10% verdunning, v/v) te mengen. Hoewel vers bereid zaaimedium de voorkeur heeft, kan het niet langer dan 2 weken bij 4 °C worden bewaard. Breng het medium voor gebruik in evenwicht met RT.
- Bereid extracellulaire matrixcoatingoplossing door één fles (10 ml) keldermembraanmatrix bij 4 °C 's nachts te ontdooien en 500 μL keldermembraanmatrix te aliquoteren in steriele buizen van 1,5 ml. Bewaren bij -20 °C voor verder gebruik. Meng 500 μL keldermembraanmatrix en 100 ml ijskoud DMEM/F12-medium (1:200 verdunning, v/v) om een keldermembraanmatrixcoatingoplossing te maken.
- Bereid 50 ml Tyrode's oplossing met 135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM glucose en 10 mM HEPES. Stel de pH in op 7,4 met NaOH. Bereid verse Tyrode's oplossing op de dag van het experiment.
- Bereid 50 ml intracellulaire pipetoplossing met 120 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM EGTA en 10 mM HEPES. Stel de pH in op 7,2 met KOH. Voer de intracellulaire pipetoplossing op in steriele buisjes van 5 ml en bewaar deze bij -20 °C. Voeg op de dag van het experiment mgATP toe aan de oplossing om een eindconcentratie van 3 mM te bereiken.
- Bereid 1 ml Fura-2 AM-laadoplossing met 2 μM Fura-2 AM en 0,1% Pluronic F-127. Bereid verse laadoplossing op de dag van het experiment en bescherm deze tegen het licht.
2. Meting van hiPSC-CM contractiebeweging
- Bereid keldermembraanmatrix-gecoate platen voor door 100 μL extracellulaire matrixcoatingoplossing toe te voegen aan elke put van 96-wellplaten. Incubeer de 96-well platen in een bevochtigde celkweekincubator bij 37 °C, 5% CO2 's nachts.
- Enzymatische dissociatie van hiPSC-CMs
- Vraag hiPSC's aan bij Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Genereer hiPSC-CMs volgens de vorige publicaties 8,9. Observeer de hiPSC-CM's gekweekt in zes-well platen onder een microscoop bij 10x vergroting.
OPMERKING: Dissocieer de cellen niet wanneer ze nog steeds proliferatief zijn. Anders zullen de cellen na het herverteren op de putten overgroeien en leiden tot onnauwkeurige resultaten van de functionele testen. Meestal stoppen hiPSC-CM's proliferatie op dag 18-23. - Zorg ervoor dat de hiPSC-CM's sterk kloppen en een zuiverheid van meer dan 95% hebben. Beoordeel de zuiverheid door immunostaining tegen cardiale troponine T, een specifieke marker van cardiomyocyten 8,9.
- Aspirateer het onderhoudsmedium en was de cellen twee keer met 1x DPBS. Voeg 1 ml celloslatingsoplossing toe aan elk putje van de zes putjes en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C.
OPMERKING: De incubatieduur moet regelmatig worden gecontroleerd. Zorg ervoor dat u de cellen niet te veel verteert, omdat dit de levensvatbaarheid van de cel vermindert. - Pipetteer hiPSC-CM's voorzichtig meerdere keren op en neer met behulp van een pipet van 5 ml om een eencellige suspensie te genereren. Voeg een gelijk volume hiPSC-CMs-zaaimedium toe om de celloslatingsoplossing te neutraliseren.
- Centrifugeer hiPSC-CM's bij 300 x g gedurende 3 minuten bij RT. Aspirateer het supernatant en resuspenseer de celpellet in 1-2 ml hiPSC-CM zaaimedium.
- Kwantificeer de celdichtheid en levensvatbaarheid met behulp van een trypan blue-uitsluitingsmethode. Meng in het kort 10 μL celsuspensie met een gelijk volume trypanblauw, breng over naar een celtelschuif en tel vervolgens met behulp van een celteller, zoals eerder beschreven21.
- Vraag hiPSC's aan bij Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Genereer hiPSC-CMs volgens de vorige publicaties 8,9. Observeer de hiPSC-CM's gekweekt in zes-well platen onder een microscoop bij 10x vergroting.
- Zaaien hiPSC-CMs
- Verwijder de extracellulaire matrixcoatingoplossing uit de 96-well platen.
- Zaai 50.000 cellen per put in 100 μL hiPSC-CM zaaimedium en plaats de 96-well platen in een bevochtigde celkweekincubator bij 37 °C, 5% CO2 's nachts.
- Vervang het hiPSC-CM zaaimedium door 100 μL hiPSC-CM onderhoudsmedium 1 dag na het plateren. Vervang het hiPSC-CM onderhoudsmedium om de 2 dagen tot de opname.
- Data-acquisitie
- Meet de hiPSC-CM contractiebeweging ten minste 10 dagen na het plateren (aanbevolen).
- Zet de temperatuurregelaar aan en stel 37 °C in als voorkeurstemperatuur. Schakel de microscoop, camera en CO2-voeding in.
- Vul de watermantel van de plaathouder met een geschikte hoeveelheid steriel gedeïoniseerd water (figuur 2A). Plaats de 96-well plaat op de plaathouder en laat de cellen minstens 5 minuten acclimatiseren.
- Open de weergavesoftware, stel de framesnelheid van de camera in op 75 frames per seconde (fps) en de video- / beeldresolutie op 1024 × 1024 pixels. Pas de functies autofocus en automatische helderheid toe. Neem video's en afbeeldingen op van hiPSC-CM's.
OPMERKING: Vermijd trillingen van de microscooptafel tijdens het opnemen. - Open de analyzersoftware voor automatische analyse.
3. Meting van hiPSC-CM veldpotentiaal
- Voorbereiding van keldermembraanmatrix-gecoate platen
- Plaats voorzichtig een druppel van 8 μL extracellulaire matrixcoatingoplossing over het opname-elektrodegebied van elk putje van de 48-well microelectrode array (MEA) platen. Zie figuur 3A voor het juiste elektrodegebied voor het plaatsen van druppels. Deze stap is van cruciaal belang om de hiPSC-CM monolaag geconcentreerd te houden op de elektroden. Vermijd het aanraken van de elektroden in alle omstandigheden.
- Voeg 3 ml steriel gedeïoniseerd water toe aan het gebied rond de putten (figuur 3A) van de 48-well MEA-platen om verdamping van de coatingoplossing te voorkomen. Incubeer 48-well MEA-platen in een bevochtigde celkweekincubator bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 45-60 min.
OPMERKING: Niet te lang incuberen om te voorkomen dat de keldermembraanmatrix uitdroogt.
- Voer enzymatische dissociatie van hiPSC-CMs uit zoals beschreven in stap 2.2.
- Zaaien hiPSC-CMs
- Verwijder het grootste deel van het extracellulaire matrixmedium van het putoppervlak zonder de elektroden aan te raken met behulp van een pipetpunt van 200 μL binnen dezelfde enkele rij of kolom.
- Zaai 50.000 cellen per put in een druppel van 8 μL hiPSC-CM zaaimedium over het opname-elektrodegebied van elke put van dezelfde rij of kolom.
- Herhaal de laatste twee stappen totdat alle putten zijn bekleed met cellen. Controleer onder de microscoop of alle putten de hiPSC-CM suspensie hebben. Voor de gewenste dichtheid, zie figuur 3B.
OPMERKING: De bevestiging van hiPSC-CM's komt in het gedrang als de keldermembraanmatrix volledig is uitgedroogd, waardoor de celaanhechting suboptimaal wordt. - Incubeer de 48-well MEA-platen in een bevochtigde celkweekincubator bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 60 min.
- Voeg langzaam en voorzichtig 150 μL hiPSC-CM zaaimedium toe aan elk putje van de 48-well MEA-platen. Om medium toe te voegen zonder eerder gezaaide hiPSC-CMs te verspreiden, houdt u de plaat in een hoek van 45°, leunt u de pipetpunt tegen de wand van elke put en laat u het medium langzaam los.
OPMERKING: Het te snel of met hoge druk toevoegen van medium zal de gehechte cardiomyocyten losmaken. Vermijd direct contact met de hiPSC-CM drop suspension. - Incubeer de 48-well MEA-platen in een bevochtigde celkweekincubator bij 37 °C, 5% CO2 's nachts.
- Ververs het hiPSC-CM zaaimedium met 300 μL hiPSC-CM onderhoudsmedium 1 dag na het plateren. Vervang het hiPSC-CM onderhoudsmedium elke 2 dagen voor de opname.
- Data-acquisitie
- Voer mea-metingen uit ten minste 10 dagen na het plateren (aanbevolen). Controleer op dag 10 na de beplating de dichtheid van de spontane hiPSC-CM monolaag onder een microscoop bij 10x vergroting, wat moet zijn zoals weergegeven in figuur 3C.
- Plaats de 48-well MEA-plaat in het opname-instrument. Het touchscreen maakt het mogelijk om de temperatuur (37 °C) en CO2 (5%) status te observeren.
- Open de navigatorsoftware. Selecteer in het experimentele installatievenster Cardiale real-time configuratie en veldpotentiaalopnamen. Pas spontane of tempo kloppende configuraties toe.
- Stel in beatdetectieparameters de detectiedrempel in op 300 μV, de minimale slagtijd op 250 ms en de maximale slagtijd op 5 s. Selecteer Polynomiale regressie voor FPD-berekening (Field Potential Duration).
- Controleer of het basissignaal voor elektrische activiteit volwassen en stabiel is.
OPMERKING: De volwassen golfvormen die door elke elektrode van de multi-well MEA-plaat worden geregistreerd, moeten het cardiale veldpotentiaal weerspiegelen met gemakkelijk identificeerbare kenmerken die samenvallen met de cardiale depolarisatiepiek en de repolarisatiefase, zoals weergegeven in figuur 3D-F. - Verkrijg de baseline cardiale activiteiten gedurende 1-3 min. Als medicamenteuze behandeling nodig is, voeg dan verbindingen toe aan de putten na basislijnregistratie. Plaats de plaat minstens 30 minuten in een couveuse voor de volgende opname.
4. Meting van de actiepotentiaal hiPSC-CM
- Bereid keldermembraanmatrixgecoate gerechten door 500 μL extracellulaire matrixcoatingoplossing op het glazen bodemgedeelte van 35 mm-schotels te plaatsen (figuur 4A). Incubeer de 35 mm schotels in een bevochtigde celkweekincubator bij 37 °C, 5% CO2 's nachts.
- Voer enzymatische dissociatie van hiPSC-CMs uit zoals beschreven in stap 2.2.
- Zaaien hiPSC-CMs
- Verwijder de extracellulaire matrixcoatingoplossing uit de schalen van 35 mm. Zaai 50.000 cellen per put in 500 μL hiPSC-CM zaaimedium op het glazen bodemgedeelte van 35 mm-schalen.
- Incubeer de 35 mm schotels in een bevochtigde celkweekincubator bij 37 °C, 5% CO2 's nachts. Verwijder het hiPSC-CM zaaimedium en voeg 2 ml hiPSC-CM onderhoudsmedium toe aan de schalen van 35 mm.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een niet-gefilterde punt van 200 μL over de 2 ml aspiratiepipet te plaatsen om het gebruikte medium te verwijderen om te voorkomen dat cellen worden aangeraakt. - Vervang het hiPSC-CM kweekmedium elke 2 dagen voor opname.
- Data-acquisitie
- Voer actiepotentiaalmeting uit ten minste 10 dagen na het plateren (aanbevolen). Bereid verse Tyrode-oplossing zoals beschreven in stap 1.4. Ontdooi één aliquot intracellulaire pipetoplossing en voeg MgATP vers toe tot een eindconcentratie van 3 mM.
- Trek de micropipettes uit borosilicaat glazen haarvaten met behulp van een micropipette puller.
OPMERKING: Een weerstand van 2-5 MΩ van de micropipettes heeft de voorkeur. - Vervang het hiPSC-CM onderhoudsmedium door de oplossing van Tyrode en laat de cellen gedurende 15 minuten wennen aan de oplossing van Tyrode (figuur 4C). Plaats de temperatuursensoren in de kamer, plaats de schotel van 35 mm in de kamer zoals aangegeven in figuur 4C en stel de temperatuur in op 37 °C (figuur 4D).
- Vul de micropipettes met een intracellulaire oplossing en steek ze in de houder die is aangesloten op het kopbeeld van de patchklemversterker (figuur 4E). Open de stimulatie-/acquisitiesoftware, laad het opnameprotocol voor actiepotentialen en selecteer de spanningsklemconfiguratie.
- Plaats de micropipette in de badoplossing, selecteer de juiste enkele hiPSC-CM's en pas de positie van de micropipette naast de geselecteerde cel aan en verlaag deze met behulp van een micromanipulator. Wanneer de pipetpunt in de badoplossing wordt ingebracht, controleert u op de pipetweerstand die kan worden waargenomen op de oscilloscoopmonitor.
- Plaats de pipet dicht bij de cel en de stroompulsen zullen iets afnemen om de toenemende weerstand van de afdichting weer te geven. Breng zachte zuigkracht met negatieve druk aan om de weerstand te verhogen, die een gigaseal zal vormen. Pas de sealfunctie toe .
- Pas extra zuigkracht toe om het membraan te breken om een opnameconfiguratie voor de hele cel te krijgen. Zodra het membraangedeelte in het pipetgebied door zuiging is gescheurd, is de interne oplossing in evenwicht met het celcytoplasma. Schakel op dit punt over van de spanningsklemmodus (V-klem) naar de stroomklemmodus of geen stroominjectie (C-Clamp) met behulp van het versterkerdialoogvenster. Druk op de knop Opnemen om de potentiële opnamebestanden van de actie te genereren en op te slaan.
OPMERKING: De modusverandering biedt een continue registratie van de spontane actiepotentialen van hiPSC-CM's zonder trigger en zonder stimulatie-opnameprotocol, dat kan worden bewaakt aan de V-mon-uitgang van de patchklemversterker.
5. Meting van hiPSC-CM Ca2+ transiënt
- Raadpleeg het vorige protocol voor het voorbereiden van aangepaste celkamers voor Ca2+ beeldvorming21. Voor de bereiding van de keldermembraanmatrix-gecoate celkamer, plaatst u 200 μL extracellulaire matrixcoatingoplossing in de celkamers. Incubeer de celkamers in een bevochtigde celkweekincubator bij 37 °C, 5% CO2 's nachts.
- Voer enzymatische dissociatie van hiPSC-CMs uit zoals beschreven in stap 2.2.
- Zaaien hiPSC-CMs
- Verwijder de extracellulaire matrixcoatingoplossing uit de celkamers. Zaai 20.000 cellen per put in 200 μL hiPSC-CM zaaimedium.
- Vervang het hiPSC-CM zaaimedium door 200 μL hiPSC-CM onderhoudsmedium 1 dag na het plateren. Vervang het hiPSC-CM onderhoudsmedium elke 2 dagen voor de opname.
- Data-acquisitie
- Voer Ca2+ transiënte metingen uit ten minste 10 dagen na het plateren (aanbevolen). Bereid verse Tyrode-oplossing zoals beschreven in stap 1.4. Bereid verse Fura-2 AM laadoplossing zoals beschreven in stap 1.6.
- Ontlucht het hiPSC-CM onderhoudsmedium en was tweemaal met de oplossing van Tyrode. Breng 100 μL Fura-2 AM laadoplossing aan en incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
- Vervang de Fura-2 AM laadoplossing door de oplossing van Tyrode en laat ten minste 5 minuten toe voor volledige ontestering van Fura-2 AM.
- Voeg een druppel dompelolie toe aan het 40x-objectief van een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een 40x olie-onderdompelingsobjectief (0,95 NA). Plaats de celkamer in de podiumadapter van de microscoop (figuur 5A).
- Installeer de draden van de temperatuurregelaar in de badkamer en stel deze in op 37 °C. Installeer de elektrische veldstimulatie-elektroden en stel de pulsen in op 0,5 Hz met een duur van 20 ms.
- Schakel de ultrasnelle golflengte-schakelende lichtbron in en stel deze in op 340 nm en 380 nm snelschakelmodus volgens de instructies van het instrument.
- Pas een belichtingstijd van 20 ms toe voor beide golflengten en een opnametijd van 20 s in de software. Neem de video op die real-time veranderingen van Ca2+ transiënt in hiPSC-CMs weergeeft. Exporteer de gegevens naar een spreadsheet en analyseer de gegevens zoals eerder beschreven23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol beschrijft hoe de contractiebeweging, veldpotentiaal, actiepotentiaal en Ca2+ transiënt van hiPSC-CMs kunnen worden gemeten. Een schematisch diagram met de enzymatische spijsvertering, celzaaiing, onderhoud en functionele testgeleiding is weergegeven in figuur 1. De vorming van de hiPSC-CM monolaag is noodzakelijk voor de contractiebewegingsmeting (figuur 2B). Een representatief spoor van de contractie-relaxatiebeweging van hiPSC-CMs is weergegeven in figuur 2C. De analysesoftware maakt de analyse van contractie-ontspanningsbewegingssporen op geautomatiseerde wijze mogelijk door het contractiestart, contractiepiek, contractie-einde, ontspanningspiek en ontspanningseinde te detecteren met behulp van de standaardinstelling (figuur 2D). De snelheden van contractie- en ontspanningspieken worden gebruikt om de contractie- en ontspanningscapaciteiten van hiPSC-CMs te beoordelen. Daarnaast kunnen ook contractie- en ontspanningsvervormingsafstanden worden verkregen.
MEA-assay is de extracellulaire registratie van actiepotentialen, bekend als veldpotentialen. Succesvolle meting van veldpotentialen vereist volledige dekking van de hiPSC-CM monolaag op alle elektroden in elke put van de MEA-platen (figuur 3C). De volwassen golfvormen die door elke elektrode worden geregistreerd, moeten het hartveldpotentiaal weerspiegelen met gemakkelijk identificeerbare kenmerken, zoals weergegeven in figuur 3D-F. De gespecificeerde kwaliteitsnormen zijn 1) de basisactiviteit moet een spontane slag vertonen binnen 20-90 slagen per minuut, 2) de slagsnelheid moet binnen 6 SSD's liggen, berekend voor de basisslagsnelheid op alle putten, 3) de variatiecoëfficiënt van de slagperiode moet minder dan 5% zijn en 4) de depolarisatieamplitude moet meer dan 0,3 mV zijn, zoals eerder gepubliceerd22. Figuur 3E toont representatieve veldpotentiaalsporen van hiPSC-CM's. De navigatorsoftware detecteert en identificeert beats en FPD automatisch. Na analyse kunnen beatperiode, FPD en spike-amplitude worden verkregen (figuur 3F). In het bijzonder wordt de beatperiode bepaald door het depolariserende piek-piek-piekinterval, FPD wordt bepaald door het interval tussen depolariserende piek tot de repolarisatiepiek en de spike-amplitude wordt gemeten door de afstand tussen de depolariserende positieve piek tot de negatieve piek, zoals weergegeven in figuur 3F.
Eencellige patchklem is de gouden standaard voor het beoordelen van de elektrofysiologische eigenschappen van hiPSC-CM's (figuur 4B). Whole-cell patch-clamp opnames in current-clamping mode kunnen de spontane actiepotentialen van enkele hiPSC-CMs registreren (Figuur 4F). Na analyse kunnen verschillende parameters worden verkregen, waaronder de amplitude, max diastolische potentiaal (MDP) en actiepotentiaalduur (APD) bij 30%, 50% en 90% repolarisatie (figuur 4G).
Voor Ca2+ beeldvorming kunnen fluorescentie-intensiteitsveranderingen van individuele hiPSC-CMs in de loop van de tijd door de software worden geregistreerd. Een representatief gebied van Fura-2-geladen hiPSC-CMs is weergegeven in figuur 5B. Het gebruik van een ultrasnelle golflengte-schakelende lichtbron maakt het mogelijk om Ca2+ transiënten van honderden hiPSC-CMs op te nemen via framemodus scannen. Na de analyse door een spreadsheet-gebaseerd programma23, kan de F340 / F380-verhouding in de loop van de tijd voor elke cel worden verkregen. Vervolgens kunnen ruwe sporen van gestimuleerde Ca2+ transiënten worden uitgezet (figuur 5C). Daarnaast kunnen parameters zoals amplitude, diastolische Ca2+ en Ca2+ decay tau worden verkregen (figuur 5D).
Figuur 1. Algemeen schematisch diagram van het protocol. Op dag 0, verteren en zaaien hiPSC-CMs op keldermembraan matrix-gecoate 96-well platen / 48-well MEA-platen / 35 mm schotels / celkamers. Sta een herstelperiode van ten minste 10 dagen toe voordat u de functionele testen uitvoert met behulp van een cell motion imaging-systeem, MEA, patch-clamp en Ca2+ beeldvormingssysteem. Afkortingen: MEA = microelectrode array. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Meting van de samentrekkingsbeweging. (A) Het cell motion imaging systeem. (B) Een representatief gebied van de hiPSC-CM monolaag. Schaalbalk: 20 μm. (C) Representatieve contractie-ontspanningssporen van hiPSC-CMs. (D) Schematisch diagram van een contractie-ontspanningsspoor met het begin van de contractie, de contractiepiek, het contractie-einde, de ontspanningspiek en het ontspanningseinde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Meting van veldpotentiaal. (A) Bovenaanzichten van (links) een 48-well MEA-plaat, (middelste) een put met 16 elektroden en (rechts) het gebied dat een keldermembraanmatrixdruppel moet bedekken. Voeg voldoende gedestilleerd water toe aan het waterreservoir om de verdamping te compenseren. B) hiPSC-CM suspensie en de gewenste dichtheid na herformulering. (C) Een representatief gebied van de hiPSC-CM monolaag. (D) Continue golfvormplots van de 16 elektroden in één put van de 48-well MEA-plaat. (E) Representatieve veld potentiële sporen van hiPSC-CMs. (F) Schematisch diagram van een veldpotentiaalspoor dat laat zien hoe de parameters werden geanalyseerd. Afkorting: FPD = field potential duration. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Meting van actiepotentiaal. (A) Plaatsing van de keldermembraanmatrixcoating en hiPSC-CMs-suspensie op schalen van 35 mm. (B) Een representatief gebied van enkelvoudige hiPSC-CMs. Schaalbalk: 20 μm. (C-E) Patch-clamp systeemopstelling. F) Potentiële sporen van hiPSC-CMs voor representatieve maatregelen. (G) Schematisch diagram van een actiepotentiaalspoor dat laat zien hoe de parameters werden geanalyseerd. Afkortingen: APD = actiepotentiaalduur, MDP = maximale diastolische potentiaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Meting van Ca2+ transiënt. (A) Het Ca2+ beeldvormingssysteem. (B) Een representatief gebied van Fura-2-loaded single hiPSC-CMs. Schaalbalk: 100 μm. (C) Representatieve Ca2+ voorbijgaande sporen van hiPSC-CM's. (D) Schematisch diagram van een Ca2+ transiënt spoor dat laat zien hoe de parameters werden geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Menselijke iPSC-technologie is naar voren gekomen als een krachtig platform voor ziektemodellering en medicijnscreening. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het meten van hiPSC-CM contractiliteit, veldpotentiaal, actiepotentiaal en Ca2+ transiënt. Dit protocol biedt een uitgebreide karakterisering van hiPSC-CM contractiliteit en elektrofysiologie. Deze functionele assays zijn toegepast in meerdere publicaties van onze groep 12,13,18,24,25,26,27.
Het is essentieel om de hiPSC-CM's te gebruiken die zich in goede slagomstandigheden bevinden, anders zal de signaal-ruisverhouding van de uitlezingen dramatisch dalen. Bovendien is het wenselijk om de hoge zuiverheid van hiPSC-CMs vóór de metingen te waarborgen. Het bestaan van niet-cardiomyocyten kan met name de nauwkeurigheid van de gegevens van contractiebeweging en veldpotentiaalmetingen in gevaar brengen, die beide de vorming van hiPSC-CM-monolaag vereisen. Bovendien blijft de onvolwassenheid van hiPSC-CMs een grote zorg die de volledige toepassing van hiPSC-CMs op verschillende gebieden belemmert28. Het is bekend dat hiPSC-CM's functioneel onvolwassen zijn in meerdere aspecten, waaronder morfologie, contractiliteit, elektrofysiologie, Ca2+ handling en metabolisme29. Daarom wordt aanbevolen om de hiPSC-CM's ten minste tot dag 30 in de cultuur te houden voordat functionele testen worden uitgevoerd. Als alternatief kunnen verschillende strategieën die zijn vastgesteld om de volwassenheid van hiPSC-CMs te verbeteren, worden aangenomen voordat de functionele testen worden uitgevoerd30. De hiPSC-CM's gekweekt in metabole rijpingsmedia vertoonden bijvoorbeeld een zeer negatieve MDP van actiepotentialen en significant sneller verval van Ca2+ transiënten in vergelijking met de hiPSC-CM's gekweekt in normale RPMI-media31. Ten slotte zijn er batch-to-batch variaties van hiPSC-CMs32. Er moeten dus gegevens worden verzameld over hiPSC-CMs die zijn gegenereerd uit ten minste drie onafhankelijke differentiaties van dezelfde iPSC-lijnen.
Het cell motion imaging-systeem biedt een hoge doorvoer en een efficiënt platform om de contractie- en ontspanningsbeweging van hiPSC-CM's te meten. Een groot nadeel is echter dat het niet de directe contractiele kracht meet, maar eerder de contractie- en ontspanningssnelheid. Bovendien variëren de snelheden wanneer het aantal hiPSC-CMs om een monolaag te vormen anders is. Daarom is het cruciaal om precies 50.000 cellen in elke put van de 96-well platen te zaaien.
FPD gemeten door MEA is gebruikt als surrogaat voor QT-duur en wordt dus veel gebruikt bij het beoordelen van door geneesmiddelen geïnduceerde QT-verlenging33. Net als bij QT-duur is FPD afhankelijk van de snelheid. Daarom is de correctie in slagsnelheid noodzakelijk om de FPD-gegevens nauwkeurig te interpreteren. In dit protocol wordt aanbevolen dat MEA-metingen ten minste 10 dagen na het plateren worden uitgevoerd. Soms is het echter mogelijk dat het veldpotentiaalsignaal na 10 dagen na het plateren nog steeds onstabiel is. Als dit gebeurt, verleng dan de hiPSC-CM-cultuur nog eens 2-3 dagen.
De patchklemtechniek is een veelzijdig hulpmiddel voor het beoordelen van de elektrofysiologie van hiPSC-CM's en het testen van ionkanalen. Het grote nadeel van de conventionele patchklem is de eigenschap met lage doorvoer, die de toepassing ervan in studies met hoge doorvoer belemmert. Bovendien vereist het een lange leercurve en uitgebreide oefening voordat men ervaring kan opdoen met deze techniek. De conventionele patch-clamp-techniek wordt echter nog steeds beschouwd als de gouden standaard om de elektrofysiologie van hiPSC-CM's te begrijpen. Als de APD van hiPSC-CM's op een hoge doorvoermanier moet worden geëvalueerd, wordt ook voorgesteld om te beginnen met optische beeldvorming van hiPSC-CM-actiepotentiaal met behulp van de versnelde sensor van actiepotentialen 2 (ASAP2)21. Nadat primaire doelen zijn verkregen, kan een conventioneel actiepotentiaal worden gebruikt in verdere studies voor nauwkeuriger fenotypering en validatie. Daarnaast wordt geautomatiseerde patchklem steeds vaker toegepast op verschillende gebieden, met name channelopathie. De ionenkanaalstromen die worden gedragen door meerdere varianten van hERG-kanalen en spanningsafhankelijke natriumkanalen zijn bijvoorbeeld gekenmerkt door geautomatiseerde patchklem 34,35,36,37. Bovendien is het gebruik van geautomatiseerde patchklem in hiPSC-CM's onlangsvastgesteld op 38,39. Voor de uitvoering van geautomatiseerde patchklem kunnen lezers verwijzen naar eerder gepubliceerde protocollen40. Met de voordelen van een hoge doorvoer en de eenvoud in machinebehandeling, lijdt het geen twijfel dat geautomatiseerde patchklemmen een steeds belangrijkere rol zullen spelen bij het ontdekken van geneesmiddelen en de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Het gebruik van een ratiometrische Ca2 +-gevoelige kleurstof, Fura-2, maakt het mogelijk om de meting van diastolische Ca2+ van hiPSC-CM's veel minder te beïnvloeden door de experimentele bias-factoren zoals de laadtijd van kleurstof, ongelijke kleurstofverdeling en fotobleking. Dit is belangrijk om de diastolische disfunctie van bepaalde hartaandoeningen samen te vatten. De belangrijkste beperking is dat het een UV-excitatielichtbron vereist, die mogelijk onverenigbaar is met confocale microscopie.
Kortom, ondanks de recente vooruitgang in de beoordeling van cardiotoxiciteit in de preklinische fase van de ontwikkeling van geneesmiddelen, blijft cardiotoxiciteit een van de belangrijkste veiligheidsproblemen. De groeiende integratie van hiPSC-CM's in het standaard preklinische veiligheidsevaluatieproces heeft het potentieel om de nauwkeurigheid van toxiciteitsvoorspelling van kandidaat-verbindingen te verbeteren. Bovendien maken patiëntspecifieke hiPSC-CMs gepersonaliseerde cardiale medicijnselectie en voorspelling van de respons op bijwerkingen mogelijk. Het protocol met behulp van verschillende functionele assays die hier worden beschreven, zal helpen de toepassingen van hiPSC-CMs in geneesmiddelenscreening en ziektemodellering uit te breiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.C.W. is mede-oprichter van Greenstone Biosciences, maar heeft geen concurrerende belangen, omdat het hier gepresenteerde werk volledig onafhankelijk is. De andere auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
We bedanken Blake Wu voor het proeflezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 en NASA NNX16A069A (JCW) en AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
| 50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
| 6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
| 96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
| Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
| CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
| CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
| DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
| EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
| Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
| hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
| KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
| Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
| Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
| Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
| NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
| NIS Elements AR | |||
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
| Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
| Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
| Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |
References
- Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).
- Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
- Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).
- Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
- Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
- Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
- Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
- Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
- Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
- Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
- Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
- Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
- Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
- Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
- Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
- Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
- Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117 (2014).
- Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
- Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
- Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
- Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
- Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
- Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
- Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).
- Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).
- Milligan, C. J., Möller, C. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. 171-187 (2013).
