Summary
Humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade kardiomyocyter (hiPSC-CM) har framstått som en lovande in vitro-modell för läkemedelsinducerad kardiotoxicitetsscreening och sjukdomsmodellering. Här beskriver vi ett protokoll för att mäta kontraktiliteten och elektrofysiologin hos hiPSC-CM.
Abstract
Läkemedelsinducerad kardiotoxicitet är den främsta orsaken till läkemedelsförlust och tillbakadragande från marknaden. Att använda lämpliga prekliniska modeller för hjärtsäkerhetsbedömning är därför ett kritiskt steg under läkemedelsutvecklingen. För närvarande är hjärtsäkerhetsbedömningen fortfarande mycket beroende av djurstudier. Djurmodeller plågas dock av dålig translationell specificitet för människor på grund av artspecifika skillnader, särskilt när det gäller hjärtelektrofysiologiska egenskaper. Det finns därför ett akut behov av att utveckla en tillförlitlig, effektiv och människobaserad modell för preklinisk hjärtsäkerhetsbedömning. Humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade kardiomyocyter (hiPSC-CM) har framstått som en ovärderlig in vitro-modell för läkemedelsinducerad kardiotoxicitetsscreening och sjukdomsmodellering. hiPSC-CM kan erhållas från individer med olika genetisk bakgrund och olika sjuka tillstånd, vilket gör dem till ett idealiskt surrogat för att bedöma läkemedelsinducerad kardiotoxicitet individuellt. Därför måste metoder för att på ett heltäckande sätt undersöka de funktionella egenskaperna hos hiPSC-CM fastställas. I detta protokoll beskriver vi olika funktionella analyser som kan bedömas på hiPSC-CMs, inklusive mätning av kontraktilitet, fältpotential, åtgärdspotential och kalciumhantering. Sammantaget har införlivandet av hiPSC-CM i preklinisk hjärtsäkerhetsbedömning potential att revolutionera läkemedelsutvecklingen.
Introduction
Läkemedelsutveckling är en lång och dyr process. En studie av nya terapeutiska läkemedel som godkänts av US Food and Drug Administration (FDA) mellan 2009 och 2018 rapporterade att den uppskattade mediankostnaden för kapitaliserad forskning och kliniska prövningar var 985 miljoner dollar per produkt1. Läkemedelsinducerad kardiotoxicitet är den främsta orsaken till läkemedelsförlust och tillbakadragande från marknaden2. I synnerhet rapporteras kardiotoxicitet bland flera klasser av terapeutiska läkemedel3. Därför är hjärtsäkerhetsbedömning en avgörande komponent under läkemedelsutvecklingsprocessen. Det nuvarande paradigmet för hjärtsäkerhetsbedömning är fortfarande starkt beroende av djurmodeller. Artskillnader från användningen av djurmodeller erkänns dock alltmer som en primär orsak till felaktiga förutsägelser för läkemedelsinducerad kardiotoxicitet hos mänskliga patienter4. Till exempel skiljer sig morfologin för hjärtåtgärdspotential väsentligt mellan människor och möss på grund av bidragen från olika repolariserande strömmar5. Dessutom har differentiella isoformer av hjärtmyosin och cirkulära RNA som kan påverka hjärtfysiologin dokumenterats väl bland arter 6,7. För att överbrygga dessa luckor är det absolut nödvändigt att upprätta en tillförlitlig, effektiv och människobaserad modell för preklinisk hjärtsäkerhetsbedömning.
Den banbrytande uppfinningen av inducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) har genererat oöverträffade plattformar för läkemedelsscreening och sjukdomsmodellering. Under det senaste decenniet har metoder för att generera humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade kardiomyocyter (hiPSC-CM) blivit väl etablerade 8,9. hiPSC-CMs har väckt stort intresse för deras potentiella tillämpningar inom sjukdomsmodellering, läkemedelsinducerad kardiotoxicitetsscreening och precisionsmedicin. Till exempel har hiPSC-CM använts för att modellera de patologiska fenotyperna av hjärtsjukdomar orsakade av genetiskt arv, såsom långt QT-syndrom10, hypertrofisk kardiomyopati 11,12 och dilaterad kardiomyopati13,14,15. Följaktligen har viktiga signalvägar som är inblandade i patogenesen av hjärtsjukdomar identifierats, vilket kan belysa potentiella terapeutiska strategier för effektiv behandling. Dessutom har hiPSC-CM använts för att screena läkemedelsinducerad kardiotoxicitet associerad med cancermedel, inklusive doxorubicin, trastuzumab och tyrosinkinashämmare16,17,18; Strategier för att mildra den resulterande kardiotoxiciteten undersöks. Slutligen möjliggör den genetiska informationen som lagras i hiPSC-CMs screening och förutsägelse av läkemedelsinducerad kardiotoxicitet på både individ- och populationsnivå19,20. Sammantaget har hiPSC-CM visat sig vara ett ovärderligt verktyg för personlig hjärtsäkerhetsförutsägelse.
Det övergripande målet med detta protokoll är att etablera metoder för att omfattande och effektivt undersöka de funktionella egenskaperna hos hiPSC-CMs, som är av stor betydelse för att tillämpa hiPSC-CMs mot sjukdomsmodellering, läkemedelsinducerad kardiotoxicitetsscreening och precisionsmedicin. Här beskriver vi en rad funktionella analyser för att bedöma de funktionella egenskaperna hos hiPSC-CMs, inklusive mätning av kontraktilitet, fältpotential, åtgärdspotential och kalcium (Ca2+) hantering (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av media och lösningar
- Förbered hiPSC-CM underhållsmedium genom att blanda en 10 ml flaska 50x B27-tillskott och 500 ml RPMI 1640-medium. Förvara mediet vid 4 °C och använd det inom en månad. Balansera mediet till rumstemperatur (RT) före användning.
- Förbered hiPSC-CM-såddmediet genom att blanda 20 ml serumersättning och 180 ml hiPSC-CM-underhållsmedium (10% utspädning, v / v). Medan nyberedt såddmedium föredras kan det förvaras vid 4 °C i högst 2 veckor. Balansera mediet till RT före användning.
- Bered extracellulär matrisbeläggningslösning genom att tina en flaska (10 ml) källarmembranmatris vid 4 °C över natten och alikvotera 500 μl källarmembranmatris i sterila 1,5 ml rör. Förvaras vid -20 °C för vidare användning. Blanda 500 μl källarmembranmatris och 100 ml iskall DMEM/F12-medium (1:200 utspädning, v/v) för att göra lösning av källarmembranmatrisbeläggning.
- Bered 50 ml Tyrodes lösning innehållande 135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM glukos och 10 mM HEPES. Justera pH-värdet till 7,4 med NaOH. Förbered färsk Tyrodes lösning på experimentdagen.
- Bered 50 ml intracellulär pipettlösning innehållande 120 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM EGTA och 10 mM HEPES. Justera pH till 7,2 med KOH. Alikvotera den intracellulära pipettlösningen i sterila 5 ml rör och förvara den vid -20 °C. På experimentdagen tillsätter du nyligen MgATP till lösningen för att uppnå en slutlig koncentration av 3 mM.
- Förbered 1 ml Fura-2 AM-laddningslösning innehållande 2 μM Fura-2 AM och 0,1% Pluronic F-127. Förbered ny lastlösning på experimentdagen och skydda den från ljuset.
2. Mätning av hiPSC-CM sammandragningsrörelse
- Förbered källarmembranmatrisbelagda plattor genom att tillsätta 100 μL extracellulär matrisbeläggningslösning till varje brunn med 96-brunnsplattor. Inkubera 96-brunnsplattorna i en fuktad cellodlingsinkubator vid 37 °C, 5%CO2 över natten.
- Enzymatisk dissociation av hiPSC-CM
- Begär hiPSCs från Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Generera hiPSC-CM enligt tidigare publikationer 8,9. Observera hiPSC-CMs odlade i sexbrunnsplattor under ett mikroskop vid 10x förstoring.
OBS: Dissociera inte cellerna när de fortfarande är proliferativa. Annars kommer cellerna att växa över på brunnarna efter replating och leda till felaktiga resultat av de funktionella analyserna. Vanligtvis stoppar hiPSC-CMs spridning vid dagarna 18-23. - Se till att hiPSC-CMs slår starkt och har en renhet på över 95%. Bedöm renheten genom immunfärgning mot hjärttroponin T, en specifik markör för kardiomyocyter 8,9.
- Aspirera underhållsmediet och tvätta cellerna med 1x DPBS två gånger. Tillsätt 1 ml cellavskiljningslösning till varje brunn på de sex brunnsplattorna och inkubera i 10 minuter vid 37 °C.
OBS: Inkubationstiden bör övervakas regelbundet. Se till att inte översmälta cellerna eftersom det kommer att minska cellviabiliteten. - Pipettera försiktigt hiPSC-CMs upp och ner flera gånger med en 5 ml pipett för att generera en encellssuspension. Tillsätt en lika stor volym hiPSC-CMs såddmedium för att neutralisera cellavskiljningslösningen.
- Centrifugera hiPSC-CMs vid 300 x g i 3 min vid RT. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1-2 ml hiPSC-CM-såddmedium.
- Kvantifiera celldensiteten och livskraften med hjälp av en trypanblå exkluderingsmetod. Kortfattat, blanda 10 μL cellsuspension med en lika stor volym trypanblått, överför till en cellräkningsbild och räkna sedan med en cellräknare, som tidigare beskrivits21.
- Begär hiPSCs från Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Generera hiPSC-CM enligt tidigare publikationer 8,9. Observera hiPSC-CMs odlade i sexbrunnsplattor under ett mikroskop vid 10x förstoring.
- Seedning hiPSC-CMs
- Ta bort den extracellulära matrisbeläggningslösningen från 96-brunnsplattorna.
- Frö 50 000 celler per brunn i 100 μL hiPSC-CM-såddmedium och placera 96-brunnsplattorna i en fuktad cellodlingsinkubator vid 37 ° C, 5% CO2 över natten.
- Byt ut hiPSC-CM-såddmediet med 100 μL hiPSC-CM-underhållsmedium 1 dag efter plätering. Byt hiPSC-CM-underhållsmedium var 2: e dag tills inspelning.
- Insamling av uppgifter
- Mät hiPSC-CM-sammandragningsrörelsen minst 10 dagar efter plätering (rekommenderas).
- Slå på temperaturregulatorn och ställ in 37 °C som önskad temperatur. Slå på mikroskopet, kameran och CO 2-matningen.
- Fyll platthållarens vattenmantel med en lämplig mängd sterilt avjoniserat vatten (figur 2A). Placera 96-brunnsplattan på platthållaren och låt cellerna acklimatisera sig i minst 5 minuter.
- Öppna visningsprogrammet, ställ in kamerans bildhastighet till 75 bilder per sekund (fps) och video- / bildupplösningen till 1024 × 1024 pixlar. Använd funktionerna för autofokus och automatisk ljusstyrka. Spela in videor och bilder av hiPSC-CMs.
OBS: Undvik vibrationer i mikroskopbordet under inspelningen. - Öppna analysatorprogramvaran för automatisk analys.
3. Mätning av hiPSC-CM-fältpotential
- Framställning av källarmembranmatrisbelagda plattor
- Placera försiktigt en 8 μl droppe extracellulär matrisbeläggningslösning över inspelningselektrodområdet för varje brunn på 48-brunns mikroelektrodmatrisplattorna (MEA). Se figur 3A för lämpligt elektrodområde för droppplacering. Detta steg är avgörande för att hålla hiPSC-CM-monolagret koncentrerat på elektroderna. Undvik att röra elektroderna under några omständigheter.
- Tillsätt 3 ml sterilt avjoniserat vatten till området kring brunnarna (figur 3A) på MEA-plattorna med 48 brunnar för att förhindra avdunstning av beläggningslösningen. Inkubera MEA-plattor med 48 brunnar i en fuktad cellodlingsinkubator vid 37 °C, 5%CO2 i 45-60 min.
OBS: Inkubera inte för länge för att förhindra att källarmembranmatrisen torkar.
- Utför enzymatisk dissociation av hiPSC-CM enligt beskrivningen i steg 2.2.
- Seedning hiPSC-CMs
- Ta bort det mesta av det extracellulära matrismediet från brunnsytan utan att vidröra elektroderna med en 200 μL pipettspets inom samma enda rad eller kolumn.
- Frö 50 000 celler per brunn i en 8 μl droppe hiPSC-CM-såddmedium över inspelningselektrodområdet för varje brunn i samma rad eller kolonn.
- Upprepa de två sista stegen tills alla brunnar har pläterats med celler. Kontrollera under mikroskopet att alla brunnar har hiPSC-CM-upphängningen. För önskad densitet, se figur 3B.
OBS: Fastsättning av hiPSC-CMs kommer att äventyras om källarmembranmatrisen är helt uttorkad, vilket gör cellfästet suboptimalt. - Inkubera MEA-plattorna med 48 brunnar i en fuktad cellodlingsinkubator vid 37 °C, 5%CO2 i 60 minuter.
- Tillsätt långsamt och försiktigt 150 μL hiPSC-CM-såddmedium till varje brunn på MEA-plattorna med 48 brunnar. För att lägga till medium utan att sprida tidigare sådda hiPSC-CMs, håll plattan i 45 ° vinkel, luta pipettspetsen mot väggen i varje brunn och släpp mediet långsamt.
OBS: Att lägga till medium för snabbt eller med högt tryck kommer att lossna de vidhäftade kardiomyocyterna. Undvik direktkontakt med hiPSC-CM droppfjädring. - Inkubera MEA-plattorna med 48 brunnar i en fuktad cellodlingsinkubator vid 37 °C, 5 %CO2 över natten.
- Uppdatera hiPSC-CM-såddmediet med 300 μL hiPSC-CM-underhållsmedium 1 dag efter plätering. Byt hiPSC-CM-underhållsmedium var 2: e dag före inspelning.
- Insamling av uppgifter
- Utför MEA-mätning minst 10 dagar efter plätering (rekommenderas). På dag 10 efterplätering, kontrollera densiteten hos spontan slående hiPSC-CM-monolager under ett mikroskop vid 10x förstoring, vilket bör vara som visas i figur 3C.
- Placera MEA-plattan med 48 brunnar i inspelningsinstrumentet. Pekskärmen gör det möjligt att observera temperaturen (37 ° C) och CO2 (5%) status.
- Öppna navigatorprogramvaran. I det experimentella installationsfönstret väljer du Cardiac Real-time Configuration och Field Potential Recordings. Använd spontana eller tempobaserade slagkonfigurationer.
- I taktdetekteringsparametrar ställer du in detekteringströskeln till 300 μV, minsta slagperiod till 250 ms och maximal slagperiod till 5 s. Välj Polynomregression för beräkning av fältpotentialvaraktighet (FPD).
- Kontrollera om den ursprungliga elektriska aktivitetssignalen är mogen och stabil.
OBS: De mogna vågformerna som registreras av varje elektrod från MEA-plattan med flera brunnar måste återspegla hjärtfältpotentialen med lätt identifierbara egenskaper som sammanfaller med hjärtdepolariseringsspetsen och repolariseringsfasen, som visas i figur 3D-F. - Skaffa baslinjen hjärtaktiviteter i 1-3 min. Om läkemedelsbehandling behövs, tillsätt föreningar till brunnarna efter baslinjeregistrering. Placera plattan i en inkubator i minst 30 minuter före nästa inspelning.
4. Mätning av hiPSC-CM-åtgärdspotential
- Förbered källarmembranmatrisbelagda rätter genom att placera 500 μL extracellulär matrisbeläggningslösning på glasbottendelen av 35 mm skålar (figur 4A). Inkubera 35 mm-skålarna i en fuktad cellodlingsinkubator vid 37 °C, 5 %CO2 över natten.
- Utför enzymatisk dissociation av hiPSC-CM enligt beskrivningen i steg 2.2.
- Seedning hiPSC-CMs
- Ta bort den extracellulära matrisbeläggningslösningen från 35 mm-skålarna. Frö 50 000 celler per brunn i 500 μL hiPSC-CM-såddmedium på glasbottendelen av 35 mm skålar.
- Inkubera 35 mm-skålarna i en fuktad cellodlingsinkubator vid 37 °C, 5 %CO2 över natten. Ta bort hiPSC-CM-såddmediet och tillsätt 2 ml hiPSC-CM-underhållsmedium till 35 mm-skålarna.
OBS: Det rekommenderas att sätta en 200 μL icke-filtrerad spets över 2 ml aspirationspipetten för att ta bort det förbrukade mediet för att undvika att röra vid celler. - Byt hiPSC-CM-odlingsmedium var 2: e dag före inspelning.
- Insamling av uppgifter
- Utför mätning av åtgärdspotential minst 10 dagar efter plätering (rekommenderas). Bered färsk Tyrodes lösning enligt beskrivningen i steg 1.4. Tina en alikvot av intracellulär pipettlösning och tillsätt nyligen MgATP till en slutlig koncentration av 3 mM.
- Dra mikropipetterna från borosilikatglaskapillärer med en mikropipettdragare.
OBS: Ett motstånd på 2-5 MΩ hos mikropipetterna är att föredra. - Byt ut underhållsmediet hiPSC-CM mot Tyrodes lösning och låt cellerna acklimatisera sig till Tyrodes lösning i 15 minuter (figur 4C). Sätt i temperatursensorerna i kammaren, sätt 35 mm-skålen i kammaren som visas i figur 4C och justera temperaturen till 37 °C (figur 4D).
- Fyll mikropipetterna med intracellulär lösning och sätt in dem i hållaren som är ansluten till patch-clamp-förstärkarens huvudsteg (figur 4E). Öppna stimulerings- / förvärvsprogramvaran, ladda inspelningsprotokollet för åtgärdspotential och välj spänningsklämkonfigurationen.
- Sätt in mikropipetten i badlösningen, välj lämpliga enkla hiPSC-CMs och justera och sänk mikropipettens position bredvid den valda cellen med hjälp av en mikromanipulator. När pipettspetsen sätts in i badlösningen, kontrollera om pipettmotståndet kan observeras på oscilloskopmonitorn.
- Placera pipetten nära cellen, och strömpulserna minskar något för att återspegla det ökande tätningsmotståndet. Applicera försiktigt sug med undertryck för att öka motståndet, vilket kommer att bilda en gigaseal. Använd tätningsfunktionen .
- Applicera ytterligare sug för att bryta membranet för att få en helcellsinspelningskonfiguration. När membrandelen inom pipettområdet har brustit genom sugning är den inre lösningen i jämvikt med cellcytoplasman. Vid denna tidpunkt växlar du från spänningsklämläge (V-klämma) till strömklämläge eller ingen ströminjektion (C-klämma) med hjälp av förstärkardialogen. Tryck på Spela in för att generera och spara åtgärdspotentialinspelningsfilerna.
OBS: Lägesändringen ger en kontinuerlig inspelning av de spontana åtgärdspotentialerna för hiPSC-CMs via ingen utlösare och inget stimuleringsinspelningsprotokoll, som kan övervakas vid V-mon-utgången från patch-clamp-förstärkaren.
5. Mätning av hiPSC-CM Ca2+ transient
- Se föregående protokoll för beredning av anpassade cellkammare för Ca 2+ avbildning21. För beredning av källarmembranmatrisbelagd cellkammare, placera 200 μL extracellulär matrisbeläggningslösning i cellkamrarna. Inkubera cellkamrarna i en fuktad cellodlingsinkubator vid 37 °C, 5%CO2 över natten.
- Utför enzymatisk dissociation av hiPSC-CM enligt beskrivningen i steg 2.2.
- Seedning hiPSC-CMs
- Ta bort den extracellulära matrisbeläggningslösningen från cellkamrarna. Frö 20 000 celler per brunn i 200 μL hiPSC-CM såddmedium.
- Byt ut hiPSC-CM-såddmediet med 200 μL hiPSC-CM-underhållsmedium 1 dag efter plätering. Byt hiPSC-CM-underhållsmedium var 2: e dag före inspelning.
- Insamling av uppgifter
- Utför Ca2+ transient mätning minst 10 dagar efter plätering (rekommenderas). Bered färsk Tyrodes lösning enligt beskrivningen i steg 1.4. Förbered en ny Fura-2 AM-laddningslösning enligt beskrivningen i steg 1.6.
- Aspirera underhållsmediet hiPSC-CM och tvätta med Tyrodes lösning två gånger. Applicera 100 μl Fura-2 AM lastlösning och inkubera i 10 minuter vid RT.
- Byt ut Fura-2 AM-lastlösningen mot Tyrodes lösning och låt minst 5 minuter för fullständig avförestring av Fura-2 AM.
- Tillsätt en droppe nedsänkningsolja på 40x-målet för ett inverterat epifluorescensmikroskop utrustat med ett 40x oljedoppningsmål (0,95 NA). Placera cellkammaren i mikroskopets stegadapter (figur 5A).
- Montera temperaturregulatorkablarna i badkammaren och ställ in den på 37 °C. Installera de elektriska fältstimuleringselektroderna och ställ in pulserna på 0,5 Hz med en varaktighet på 20 ms.
- Slå på den ultrasnabba våglängdsbrytande ljuskällan och ställ in den på 340 nm och 380 nm snabbväxlingsläge enligt instrumentets instruktioner.
- Applicera en exponeringstid på 20 ms för båda våglängderna och en inspelningstid på 20 s i programvaran. Spela in videon som återspeglar realtidsändringar av Ca2+ transient i hiPSC-CMs. Exportera data till ett kalkylblad och analysera data enligt tidigare beskrivet23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver hur man mäter kontraktionsrörelse, fältpotential, åtgärdspotential och Ca2+ transient av hiPSC-CMs. Ett schematiskt diagram inklusive enzymatisk matsmältning, cellsådd, underhåll och funktionell analysledning visas i figur 1. Bildandet av hiPSC-CM-monoskiktet är nödvändigt för mätning av sammandragningsrörelse (figur 2B). Ett representativt spår av hiPSC-CMs kontraktionsavslappningsrörelse visas i figur 2C. Analysatorprogramvaran möjliggör analys av spår av kontraktion-avslappningsrörelse på ett automatiserat sätt genom att detektera kontraktionsstart, kontraktionstopp, kontraktionsände, avslappningstopp och avslappningsände med standardinställningen (figur 2D). Hastigheterna för sammandragning och avslappningstoppar används för att bedöma sammandragnings- och avslappningskapaciteten hos hiPSC-CMs. Dessutom kan sammandragnings- och avslappningsdeformationsavstånd också erhållas.
MEA-analys är extracellulär inspelning av åtgärdspotentialer, känd som fältpotentialer. Framgångsrik mätning av fältpotentialer kräver full täckning av hiPSC-CM-monolagret på alla elektroder i varje brunn på MEA-plattorna (figur 3C). De mogna vågformer som registreras av varje elektrod måste återspegla hjärtfältpotentialen med lätt identifierbara egenskaper, som visas i figur 3D-F. De angivna kvalitetsstandarderna är 1) baslinjeaktiviteten bör visa en spontan slagning inom 20-90 slag per min, 2) slaghastigheten bör ligga inom 6 SD beräknade för baslinjens slagfrekvens på alla brunnar, 3) variationskoefficienten för taktperioden bör vara mindre än 5% och 4) depolariseringsamplituden bör vara över 0,3 mV, som tidigare publicerats22. Figur 3E visar representativa fältpotentialspår av hiPSC-CM. Navigatorprogramvaran upptäcker och identifierar beats och FPD automatiskt. Efter analys kan taktperiod, FPD och spikamplitud erhållas (figur 3F). Specifikt bestäms taktperioden av det depolariserande topp-till-topp-intervallet, FPD bestäms av intervallet mellan depolariserande topp till repolariseringstopp, och spikamplituden mäts av avståndet mellan den depolariserande positiva toppen till den negativa toppen, som visas i figur 3F.
Encellig lappklämma är guldstandarden för att bedöma de elektrofysiologiska egenskaperna hos hiPSC-CMs (Figur 4B). Helcellspatch-kläminspelningar i strömklämningsläge kan registrera spontana åtgärdspotentialer för enstaka hiPSC-CM (figur 4F). Efter analys kan flera parametrar, inklusive amplituden, max diastolisk potential (MDP) och åtgärdspotentialvaraktighet (APD) vid 30%, 50% och 90% repolarisering erhållas (Figur 4G).
För Ca2+ avbildning kan fluorescensintensitetsförändringar av enskilda hiPSC-CM över tid registreras av programvaran. Ett representativt område av Fura-2-laddade hiPSC-CM visas i figur 5B. Användningen av en ultrahög hastighet våglängdsbrytande ljuskälla möjliggör inspelning av Ca2+ transienter från hundratals hiPSC-CM via ramlägesskanning. Efter analysen av ett kalkylbladsbaserat program23 kan F340 / F380-förhållandet över tid för varje cell erhållas. Därefter kan råa spår av stimulerade Ca2+ transienter plottas (figur 5C). Dessutom kan parametrar som amplitud, diastolisk Ca 2+ och Ca2+ sönderfall tau erhållas (figur 5D).
Figur 1. Övergripande schematiskt diagram över protokollet. På dag 0, smälta och frö hiPSC-CMs på källarmembranmatrisbelagda 96-brunnsplattor / 48-brunns MEA-plattor / 35 mm diskar / cellkammare. Tillåt en återhämtningsperiod på minst 10 dagar innan du utför de funktionella analyserna med hjälp av ett cellrörelseavbildningssystem, MEA, patch-clamp och Ca2+ bildsystem. Förkortningar: MEA = mikroelektrodmatris. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Mätning av sammandragningsrörelse. (A) Systemet för cellrörelseavbildning. B) En representativ region för monolagret hiPSC-CM. Skalstreck: 20 μm. (C) Representativa sammandragningsavslappningsspår av hiPSC-CM. (D) Schematiskt diagram över ett sammandragningsavslappningsspår som visar sammandragningsstart, kontraktionstopp, sammandragningsände, avslappningstopp och avslappningsslut. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Mätning av fältpotential. (A) Ovanifrån av (vänster) en MEA-platta med 48 brunnar, (mitten) en brunn med 16 elektroder och (höger) det område som en källarmembranmatrisdroppe behöver täcka. Tillsätt tillräckligt med destillerat vatten i vattenbehållaren för att kompensera för avdunstning. B) HiPSC-CM-suspension och önskad densitet efter replätering. C) En representativ region för monolagret hiPSC-CM. (D) Kontinuerliga vågformsdiagram från de 16 elektroderna i en brunn på MEA-plattan med 48 brunnar. E) Representativa fältpotentialspår av hiPSC-CM. (F) Schematiskt diagram över ett fältpotentialspår som visar hur parametrarna analyserades. Förkortning: FPD = fältpotentialvaraktighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Mätning av åtgärdspotential. (A) Källarmembranmatrisbeläggning och hiPSC-CMs suspensionsplacering på 35 mm diskar. B) En representativ region för enskilda hiPSC-CM. Skalstreck: 20 μm. (C-E) Patch-clamp systeminställning. (F) Grupptalan potentiella spår av hiPSC-CM. (G) Schematiskt diagram över ett åtgärdspotentialspår som visar hur parametrarna analyserades. Förkortningar: APD = åtgärdspotentialvaraktighet, MDP = maximal diastolisk potential. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Mätning av Ca2+ övergående. (A) Bildsystemet Ca2+ . B) En representativ region med Fura-2-lastade enkla hiPSC-CM. Skalstreck: 100 μm. (C) Representativa Ca2+ övergående spår av hiPSC-CM. (D) Schematiskt diagram över ett Ca2+ transient spår som visar hur parametrarna analyserades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mänsklig iPSC-teknik har vuxit fram som en kraftfull plattform för sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att mäta hiPSC-CM-kontraktilitet, fältpotential, åtgärdspotential och Ca2+ övergående. Detta protokoll ger en omfattande karakterisering av hiPSC-CM-kontraktilitet och elektrofysiologi. Dessa funktionella analyser har tillämpats i flera publikationer från vår grupp 12,13,18,24,25,26,27.
Det är viktigt att använda hiPSC-CM: erna som är i goda slagförhållanden, annars kommer signal-brusförhållandet för avläsningarna att sjunka dramatiskt. Dessutom är det önskvärt att säkerställa den höga renheten hos hiPSC-CM före mätningarna. Förekomsten av icke-kardiomyocyter kan särskilt äventyra datanoggrannheten för sammandragningsrörelse och fältpotentialmätningar, som båda kräver bildandet av hiPSC-CM-monolager. Dessutom är omogenheten hos hiPSC-CMs fortfarande ett stort problem som hindrar en fullständig tillämpning av hiPSC-CM på olika områden28. Det är känt att hiPSC-CM är funktionellt omogna i flera aspekter, inklusive morfologi, kontraktilitet, elektrofysiologi, Ca 2+ hantering och metabolism29. Därför rekommenderas att hålla hiPSC-CMs i kulturen åtminstone fram till dag 30 innan du utför funktionella analyser. Alternativt kan olika strategier som har fastställts för att förbättra mognaden hos hiPSC-CMs antas innan de funktionella analyserna30 genomförs. Till exempel uppvisade hiPSC-CMs odlade i metaboliska mognadsmedier mycket negativ MDP av åtgärdspotentialer och signifikant snabbare sönderfall av Ca2+ transienter jämfört med hiPSC-CMs odlade i normala RPMI-media31. Slutligen finns det batch-till-batch-variationer av hiPSC-CMs32. Uppgifter bör därför samlas in om hiPSC-CM som genereras från minst tre oberoende differentieringar av samma iPSC-linjer.
Cellrörelseavbildningssystemet ger en hög genomströmning och effektiv plattform för att mäta sammandragnings- och avslappningsrörelsen hos hiPSC-CMs. En stor nackdel är dock att den inte mäter den direkta kontraktila kraften utan snarare sammandragnings- och avslappningshastigheten istället. Dessutom varierar hastigheterna när antalet hiPSC-CM för att bilda ett monolager är annorlunda. Därför är det viktigt att så exakt 50 000 celler i varje brunn på de 96 brunnsplattorna.
FPD mätt med MEA har använts som surrogat under QT-varaktighet och används därför i stor utsträckning vid bedömning av läkemedelsinducerad QT-förlängning33. I likhet med QT-varaktigheten är FPD beroende på slagfrekvens. Därför är korrigeringen i slagfrekvens nödvändig för att exakt tolka FPD-data. I detta protokoll rekommenderas att MEA-mätning utförs minst 10 dagar efter plätering. Ibland är det emellertid möjligt att fältpotentialsignalen fortfarande är instabil efter 10 dagar efter plätering. Om detta händer, förläng hiPSC-CM-kulturen i ytterligare 2-3 dagar.
Patch-clamp-tekniken är ett mångsidigt verktyg för att bedöma elektrofysiologin hos hiPSC-CMs och analysjonkanaler. Den största nackdelen med den konventionella patch-klämman är dess låga genomströmningsegenskap, vilket hindrar dess tillämpning i studier med hög genomströmning. Dessutom kräver det en lång inlärningskurva och omfattande övning innan man kan bli erfaren i denna teknik. Den konventionella patch-clamp-tekniken anses dock fortfarande vara guldstandarden för att förstå elektrofysiologin hos hiPSC-CMs. Om APD för hiPSC-CMs behöver utvärderas på ett sätt med hög genomströmning, föreslås det också att man börjar med optisk avbildning av hiPSC-CM-åtgärdspotential med hjälp av den accelererade sensorn för åtgärdspotentialer 2 (ASAP2)21. Efter att primära mål har erhållits kan en konventionell åtgärdspotential användas i ytterligare studier för mer exakt fenotypning och validering. Dessutom har automatiserad patchklämma använts alltmer inom olika områden, särskilt kanalopati. Till exempel har jonkanalströmmarna som bärs av flera varianter av hERG-kanaler och spänningsstyrda natriumkanaler kännetecknats av automatiserad patchklämma34,35,36,37. Dessutom har användningen av automatiserad patchklämma i hiPSC-CMs nyligen fastställts38,39. För körning av automatiserad patchklämma kan läsare hänvisa till tidigare publicerade protokoll40. Med fördelarna med hög genomströmning och enkelheten i maskinhantering råder det ingen tvekan om att automatiserade patchklämmor kommer att spela allt viktigare roller i läkemedelsupptäckt och läkemedelsutveckling.
Användningen av ett ratiometriskt Ca 2+-känsligt färgämne, Fura-2, gör att mätningen av diastolisk Ca2+ hiPSC-CM kan påverkas mycket mindre av de experimentella biasfaktorerna såsom färgämnesladdningstid, ojämn färgfördelning och fotoblekning. Detta är viktigt för att rekapitulera den diastoliska dysfunktionen hos vissa hjärtsjukdomar. Huvudbegränsningen är att den kräver en UV-excitationsljuskälla, som kan vara oförenlig med konfokalmikroskopi.
Sammanfattningsvis, trots de senaste framstegen inom kardiotoxicitetsbedömning i den prekliniska fasen av läkemedelsutveckling, är kardiotoxicitet fortfarande ett av de ledande säkerhetsproblemen. Den växande införlivandet av hiPSC-CM i den vanliga prekliniska säkerhetsutvärderingsprocessen har potential att förbättra noggrannheten i toxicitetsförutsägelse av kandidatföreningar. Dessutom möjliggör patientspecifika hiPSC-CMs personligt val av hjärtläkemedel och förutsägelse av negativt läkemedelssvar. Protokollet med olika funktionella analyser som beskrivs här kommer att bidra till att utöka tillämpningarna av hiPSC-CM vid läkemedelsscreening och sjukdomsmodellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.C.W. är en av grundarna av Greenstone Biosciences men har inga konkurrerande intressen, eftersom arbetet som presenteras här är helt oberoende. De andra författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Blake Wu för korrekturläsningen av manuskriptet. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 och NASA NNX16A069A (JCW) och AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
| 50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
| 6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
| 96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
| Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
| CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
| CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
| DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
| EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
| Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
| hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
| KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
| Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
| Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
| Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
| NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
| NIS Elements AR | |||
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
| Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
| Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
| Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |
References
- Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).
- Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
- Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).
- Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
- Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
- Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
- Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
- Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
- Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
- Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
- Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
- Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
- Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
- Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
- Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
- Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
- Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117 (2014).
- Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
- Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
- Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
- Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
- Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
- Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
- Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).
- Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).
- Milligan, C. J., Möller, C. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. 171-187 (2013).
