Humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade kardiomyocyter (hiPSC-CM) har framstått som en lovande in vitro-modell för läkemedelsinducerad kardiotoxicitetsscreening och sjukdomsmodellering. Här beskriver vi ett protokoll för att mäta kontraktiliteten och elektrofysiologin hos hiPSC-CM.
Läkemedelsinducerad kardiotoxicitet är den främsta orsaken till läkemedelsförlust och tillbakadragande från marknaden. Att använda lämpliga prekliniska modeller för hjärtsäkerhetsbedömning är därför ett kritiskt steg under läkemedelsutvecklingen. För närvarande är hjärtsäkerhetsbedömningen fortfarande mycket beroende av djurstudier. Djurmodeller plågas dock av dålig translationell specificitet för människor på grund av artspecifika skillnader, särskilt när det gäller hjärtelektrofysiologiska egenskaper. Det finns därför ett akut behov av att utveckla en tillförlitlig, effektiv och människobaserad modell för preklinisk hjärtsäkerhetsbedömning. Humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade kardiomyocyter (hiPSC-CM) har framstått som en ovärderlig in vitro-modell för läkemedelsinducerad kardiotoxicitetsscreening och sjukdomsmodellering. hiPSC-CM kan erhållas från individer med olika genetisk bakgrund och olika sjuka tillstånd, vilket gör dem till ett idealiskt surrogat för att bedöma läkemedelsinducerad kardiotoxicitet individuellt. Därför måste metoder för att på ett heltäckande sätt undersöka de funktionella egenskaperna hos hiPSC-CM fastställas. I detta protokoll beskriver vi olika funktionella analyser som kan bedömas på hiPSC-CMs, inklusive mätning av kontraktilitet, fältpotential, åtgärdspotential och kalciumhantering. Sammantaget har införlivandet av hiPSC-CM i preklinisk hjärtsäkerhetsbedömning potential att revolutionera läkemedelsutvecklingen.
Läkemedelsutveckling är en lång och dyr process. En studie av nya terapeutiska läkemedel som godkänts av US Food and Drug Administration (FDA) mellan 2009 och 2018 rapporterade att den uppskattade mediankostnaden för kapitaliserad forskning och kliniska prövningar var 985 miljoner dollar per produkt1. Läkemedelsinducerad kardiotoxicitet är den främsta orsaken till läkemedelsförlust och tillbakadragande från marknaden2. I synnerhet rapporteras kardiotoxicitet bland flera klasser av terapeutiska läkemedel3. Därför är hjärtsäkerhetsbedömning en avgörande komponent under läkemedelsutvecklingsprocessen. Det nuvarande paradigmet för hjärtsäkerhetsbedömning är fortfarande starkt beroende av djurmodeller. Artskillnader från användningen av djurmodeller erkänns dock alltmer som en primär orsak till felaktiga förutsägelser för läkemedelsinducerad kardiotoxicitet hos mänskliga patienter4. Till exempel skiljer sig morfologin för hjärtåtgärdspotential väsentligt mellan människor och möss på grund av bidragen från olika repolariserande strömmar5. Dessutom har differentiella isoformer av hjärtmyosin och cirkulära RNA som kan påverka hjärtfysiologin dokumenterats väl bland arter 6,7. För att överbrygga dessa luckor är det absolut nödvändigt att upprätta en tillförlitlig, effektiv och människobaserad modell för preklinisk hjärtsäkerhetsbedömning.
Den banbrytande uppfinningen av inducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) har genererat oöverträffade plattformar för läkemedelsscreening och sjukdomsmodellering. Under det senaste decenniet har metoder för att generera humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade kardiomyocyter (hiPSC-CM) blivit väl etablerade 8,9. hiPSC-CMs har väckt stort intresse för deras potentiella tillämpningar inom sjukdomsmodellering, läkemedelsinducerad kardiotoxicitetsscreening och precisionsmedicin. Till exempel har hiPSC-CM använts för att modellera de patologiska fenotyperna av hjärtsjukdomar orsakade av genetiskt arv, såsom långt QT-syndrom10, hypertrofisk kardiomyopati 11,12 och dilaterad kardiomyopati13,14,15. Följaktligen har viktiga signalvägar som är inblandade i patogenesen av hjärtsjukdomar identifierats, vilket kan belysa potentiella terapeutiska strategier för effektiv behandling. Dessutom har hiPSC-CM använts för att screena läkemedelsinducerad kardiotoxicitet associerad med cancermedel, inklusive doxorubicin, trastuzumab och tyrosinkinashämmare16,17,18; Strategier för att mildra den resulterande kardiotoxiciteten undersöks. Slutligen möjliggör den genetiska informationen som lagras i hiPSC-CMs screening och förutsägelse av läkemedelsinducerad kardiotoxicitet på både individ- och populationsnivå19,20. Sammantaget har hiPSC-CM visat sig vara ett ovärderligt verktyg för personlig hjärtsäkerhetsförutsägelse.
Det övergripande målet med detta protokoll är att etablera metoder för att omfattande och effektivt undersöka de funktionella egenskaperna hos hiPSC-CMs, som är av stor betydelse för att tillämpa hiPSC-CMs mot sjukdomsmodellering, läkemedelsinducerad kardiotoxicitetsscreening och precisionsmedicin. Här beskriver vi en rad funktionella analyser för att bedöma de funktionella egenskaperna hos hiPSC-CMs, inklusive mätning av kontraktilitet, fältpotential, åtgärdspotential och kalcium (Ca2+) hantering (figur 1).
Mänsklig iPSC-teknik har vuxit fram som en kraftfull plattform för sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att mäta hiPSC-CM-kontraktilitet, fältpotential, åtgärdspotential och Ca2+ övergående. Detta protokoll ger en omfattande karakterisering av hiPSC-CM-kontraktilitet och elektrofysiologi. Dessa funktionella analyser har tillämpats i flera publikationer från vår grupp 12,13,18,24,25,26,27.</s…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Blake Wu för korrekturläsningen av manuskriptet. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 och NASA NNX16A069A (JCW) och AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).
35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
NIS Elements AR | |||
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |