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Applications techniques des enregistrements de microélectrodes et de patch clamp sur des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64265
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Summary

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) sont apparus comme un modèle in vitro prometteur pour le dépistage de la cardiotoxicité induite par les médicaments et la modélisation de la maladie. Ici, nous détaillons un protocole pour mesurer la contractilité et l’électrophysiologie des hiPSC-CMs.

Abstract

La cardiotoxicité induite par les médicaments est la principale cause d’attrition des médicaments et de retrait du marché. Par conséquent, l’utilisation de modèles précliniques appropriés d’évaluation de la sécurité cardiaque est une étape cruciale lors de la mise au point de médicaments. À l’heure actuelle, l’évaluation de l’innocuité cardiaque dépend encore fortement des études sur les animaux. Cependant, les modèles animaux sont en proie à une faible spécificité translationnelle pour les humains en raison de différences spécifiques à l’espèce, en particulier en termes de caractéristiques électrophysiologiques cardiaques. Il est donc urgent de développer un modèle fiable, efficace et humain pour l’évaluation préclinique de la sécurité cardiaque. Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) sont apparus comme un modèle in vitro inestimable pour le dépistage de la cardiotoxicité induite par les médicaments et la modélisation de la maladie. Les hiPSC-CM peuvent être obtenus à partir d’individus ayant divers antécédents génétiques et diverses maladies pathogènes, ce qui en fait un substitut idéal pour évaluer individuellement la cardiotoxicité induite par les médicaments. Par conséquent, il est nécessaire d’établir des méthodologies permettant d’étudier de manière exhaustive les caractéristiques fonctionnelles des CM-CSPh. Dans ce protocole, nous détaillons divers tests fonctionnels qui peuvent être évalués sur les CM-HiPSC, y compris la mesure de la contractilité, du potentiel de champ, du potentiel d’action et de la manipulation du calcium. Dans l’ensemble, l’intégration des CSPhi-CM dans l’évaluation préclinique de l’innocuité cardiaque a le potentiel de révolutionner le développement de médicaments.

Introduction

Le développement de médicaments est un processus long et coûteux. Une étude sur les nouveaux médicaments thérapeutiques approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis entre 2009 et 2018 a révélé que le coût médian estimé de la recherche et des essais cliniques capitalisés était de 985 millions de dollars par produit1. La cardiotoxicité induite par les médicaments est la principale cause d’attrition des médicaments et de retrait du marché2. Notamment, la cardiotoxicité est signalée parmi plusieurs classes de médicaments thérapeutiques3. Par conséquent, l’évaluation de la sécurité cardiaque est un élément crucial du processus de développement du médicament. Le paradigme actuel de l’évaluation de la sécurité cardiaque dépend encore fortement des modèles animaux. Cependant, les différences entre les espèces par rapport à l’utilisation de modèles animaux sont de plus en plus reconnues comme la principale cause des prédictions inexactes de la cardiotoxicité induite par les médicaments chez les patients humains4. Par exemple, la morphologie du potentiel d’action cardiaque diffère considérablement entre les humains et les souris en raison des contributions de différents courants repolarisants5. De plus, les isoformes différentielles de myosine cardiaque et d’ARN circulaires qui peuvent avoir un impact sur la physiologie cardiaque ont été bien documentées chez les espèces 6,7. Pour combler ces lacunes, il est impératif d’établir un modèle fiable, efficace et humain pour l’évaluation préclinique de la sécurité cardiaque.

L’invention révolutionnaire de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) a généré des plateformes sans précédent de dépistage de médicaments et de modélisation des maladies. Au cours de la dernière décennie, les méthodes de génération de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) sont devenues bien établies 8,9. Les hiPSC-CM ont suscité un grand intérêt pour leurs applications potentielles dans la modélisation des maladies, le dépistage de la cardiotoxicité induite par les médicaments et la médecine de précision. Par exemple, les hiPSC-CM ont été utilisés pour modéliser les phénotypes pathologiques des maladies cardiaques causées par l’hérédité génétique, telles que le syndrome du QT long10, la cardiomyopathie hypertrophique 11,12 et la cardiomyopathie dilatée13,14,15. Par conséquent, des voies de signalisation clés impliquées dans la pathogenèse des maladies cardiaques ont été identifiées, ce qui peut éclairer les stratégies thérapeutiques potentielles pour un traitement efficace. De plus, les hiPSC-CM ont été utilisés pour dépister la cardiotoxicité induite par les médicaments associée aux agents anticancéreux, y compris la doxorubicine, le trastuzumab et les inhibiteurs de la tyrosine kinase16,17,18; Des stratégies visant à atténuer la cardiotoxicité qui en résulte sont à l’étude. Enfin, l’information génétique conservée dans les CSPhi-CM permet le dépistage et la prédiction de la cardiotoxicité induite par les médicaments aux niveaux individuel et de la population19,20. Collectivement, les hiPSC-CM se sont révélés être un outil inestimable pour la prédiction personnalisée de la sécurité cardiaque.

L’objectif global de ce protocole est d’établir des méthodologies pour étudier de manière exhaustive et efficace les caractéristiques fonctionnelles des CSPh-CM, qui sont d’une grande importance dans l’application des CSPhi-CM à la modélisation de la maladie, au dépistage de la cardiotoxicité induite par les médicaments et à la médecine de précision. Ici, nous détaillons une série de tests fonctionnels pour évaluer les propriétés fonctionnelles des CM-HiPSC, y compris la mesure de la contractilité, du potentiel de champ, du potentiel d’action et de la manipulation du calcium (Ca2+) (Figure 1).

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Protocol

1. Préparation des supports et des solutions

  1. Préparer le milieu d’entretien hiPSC-CM en mélangeant un flacon de 10 ml de supplément de B27 50x et 500 ml de milieu RPMI 1640. Conservez le milieu à 4 °C et utilisez-le dans un délai d’un mois. Équilibrer la température moyenne à la température ambiante (RT) avant utilisation.
  2. Préparer le milieu d’ensemencement hiPSC-CM en mélangeant 20 mL de sérum de remplacement et 180 mL de milieu d’entretien hiPSC-CM (dilution à 10 %, v/v). Bien que le milieu de semis fraîchement préparé soit préférable, il peut être conservé à 4 °C pendant 2 semaines au maximum. Équilibrer le milieu à RT avant utilisation.
  3. Préparer la solution de revêtement de matrice extracellulaire en décongelant un flacon (10 mL) de matrice membranaire basale à 4 °C pendant une nuit et en aliquote 500 μL de matrice membranaire basale dans des tubes stériles de 1,5 mL. Conserver à -20 °C pour une utilisation ultérieure. Mélanger 500 μL de matrice membranaire basale et 100 mL de milieu DMEM/F12 glacé (dilution 1:200, v/v) pour obtenir une solution de revêtement matriciel membranaire basal.
  4. Préparer 50 mL de solution de Tyrode contenant 135 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 1 mM de MgCl 2, 1,8 mM de CaCl2, 5 mM de glucose et 10 mM HEPES. Ajustez le pH à 7,4 avec NaOH. Préparez la solution fraîche de Tyrode le jour de l’expérience.
  5. Préparer 50 mL de solution de pipette intracellulaire contenant 120 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 10 mM d’EGTA et 10 mM de HEPES. Ajustez le pH à 7,2 avec KOH. Aliquote la solution de pipette intracellulaire dans des tubes stériles de 5 mL et la conserver à -20 °C. Le jour de l’expérience, ajouter fraîchement MgATP à la solution pour obtenir une concentration finale de 3 mM.
  6. Préparer 1 mL de solution de chargement Fura-2 AM contenant 2 μM de Fura-2 AM et 0,1 % de F-127 pluronique. Préparez une solution de chargement fraîche le jour de l’expérience et protégez-la de la lumière.

2. Mesure du mouvement de contraction hiPSC-CM

  1. Préparer les plaques revêtues de matrice membranaire basale en ajoutant 100 μL de solution de revêtement à matrice extracellulaire à chaque puits de plaques de 96 puits. Incuber les plaques de 96 puits dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C, 5% de CO2 pendant la nuit.
  2. Dissociation enzymatique des CM-HIPSC
    1. Demandez des hiPSC à Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Générer des hiPSC-CM selon les publications précédentes 8,9. Observez les hiPSC-CM cultivés dans des plaques à six puits au microscope à un grossissement de 10x.
      NOTE: Ne dissociez pas les cellules lorsqu’elles sont encore prolifératives. Sinon, les cellules proliféreront sur les puits après le replacage et conduiront à des résultats inexacts des tests fonctionnels. Habituellement, les hiPSC-CM arrêtent la prolifération aux jours 18-23.
    2. Assurez-vous que les hiPSC-CM battent fort et ont une pureté de plus de 95%. Evaluer la pureté par immunomarquage contre la troponine T cardiaque, un marqueur spécifique des cardiomyocytes 8,9.
    3. Aspirez le fluide d’entretien et lavez les cellules avec 1x DPBS deux fois. Ajouter 1 mL de solution de détachement cellulaire dans chaque puits des plaques à six puits et incuber pendant 10 min à 37 °C.
      REMARQUE : La durée d’incubation doit être surveillée régulièrement. Assurez-vous de ne pas trop digérer les cellules car cela réduirait la viabilité cellulaire.
    4. Pipeter doucement les hiPSC-CM de haut en bas plusieurs fois à l’aide d’une pipette de 5 ml pour générer une suspension unicellulaire. Ajouter un volume égal de milieu d’ensemencement hiPSC-CMs pour neutraliser la solution de décollement cellulaire.
    5. Centrifuger les hiPSC-CMs à 300 x g pendant 3 min à TA. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1-2 mL de milieu d’ensemencement hiPSC-CM.
    6. Quantifier la densité cellulaire et la viabilité à l’aide d’une méthode d’exclusion du bleu trypan. En bref, mélanger 10 μL de suspension cellulaire avec un volume égal de bleu de trypan, transférer sur une lame de comptage de cellules, puis compter à l’aide d’un compteur de cellules, comme décrit précédemment21.
  3. Ensemencement des hiPSC-CM
    1. Retirez la solution de revêtement de matrice extracellulaire des plaques à 96 puits.
    2. Ensemencer 50 000 cellules par puits dans 100 μL de milieu d’ensemencement hiPSC-CM et placer les plaques de 96 puits dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C, 5% de CO2 pendant la nuit.
    3. Remplacer le milieu d’ensemencement hiPSC-CM par 100 μL de milieu d’entretien hiPSC-CM 1 jour après le placage. Changez le support de maintenance hiPSC-CM tous les 2 jours jusqu’à l’enregistrement.
  4. Acquisition de données
    1. Mesurer le mouvement de contraction hiPSC-CM au moins 10 jours après le placage (recommandé).
    2. Allumez le régulateur de température et réglez 37 °C comme température préférée. Allumez le microscope, l’appareil photo et l’alimentation en CO2 .
    3. Remplissez la chemise d’eau du porte-plaque avec une quantité appropriée d’eau désionisée stérile (figure 2A). Placez la plaque de 96 puits sur le support de plaque et laissez les cellules s’acclimater pendant au moins 5 minutes.
    4. Ouvrez le logiciel de visualisation, réglez la fréquence d’images de la caméra sur 75 images par seconde (ips) et la résolution vidéo/image sur 1024 × 1024 pixels. Appliquez les fonctions de mise au point automatique et de luminosité automatique. Enregistrez des vidéos et des images de hiPSC-CM.
      REMARQUE: Évitez les vibrations de la table de microscope pendant l’enregistrement.
    5. Ouvrez le logiciel d’analyse pour une analyse automatique.

3. Mesure du potentiel de champ hiPSC-CM

  1. Préparation de plaques revêtues de matrice à membrane basale
    1. Placez soigneusement une gouttelette de 8 μL de solution de revêtement de matrice extracellulaire sur la zone de l’électrode d’enregistrement de chaque puits des plaques MEA (Microelectrode Array) à 48 puits. Voir la figure 3A pour connaître la zone d’électrode appropriée pour le placement des gouttelettes. Cette étape est essentielle pour garder la monocouche hiPSC-CM concentrée sur les électrodes. Évitez de toucher les électrodes en aucune circonstance.
    2. Ajouter 3 mL d’eau désionisée stérile à la zone entourant les puits (figure 3A) des plaques d’AEM de 48 puits pour empêcher l’évaporation de la solution de revêtement. Incuber des plaques MEA à 48 puits dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C, 5% de CO2 pendant 45-60 min.
      REMARQUE: Ne pas incuber trop longtemps pour empêcher la matrice membranaire basale de sécher.
  2. Effectuer la dissociation enzymatique des CM-HIPSC comme décrit à l’étape 2.2.
  3. Ensemencement des hiPSC-CM
    1. Retirez la majeure partie du milieu de la matrice extracellulaire de la surface du puits sans toucher les électrodes à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL dans la même rangée ou colonne.
    2. Ensemencer 50 000 cellules par puits dans une gouttelette de 8 μL de milieu d’ensemencement hiPSC-CM sur la zone de l’électrode d’enregistrement de chaque puits de la même rangée ou colonne.
    3. Répétez les deux dernières étapes jusqu’à ce que tous les puits aient été plaqués avec des cellules. Vérifiez au microscope que tous les puits ont la suspension hiPSC-CM. Pour la densité souhaitée, voir la figure 3B.
      REMARQUE: La fixation des hiPSC-CM sera compromise si la matrice de membrane basale est complètement séchée, ce qui rend la fixation des cellules sous-optimale.
    4. Incuber les plaques MEA de 48 puits dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C, 5% de CO2 pendant 60 min.
    5. Ajouter lentement et doucement 150 μL de milieu d’ensemencement hiPSC-CM à chaque puits des plaques MEA de 48 puits. Pour ajouter du milieu sans disperser les hiPSC-CM préalablement ensemencés, tenez la plaque à un angle de 45°, appuyez l’extrémité de la pipette contre la paroi de chaque puits et relâchez lentement le milieu.
      REMARQUE: L’ajout de milieu trop rapidement ou avec une pression élevée délogera les cardiomyocytes adhérents. Évitez tout contact direct avec la suspension antichute hiPSC-CM.
    6. Incuber les plaques MEA de 48 puits dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C, 5% CO2 pendant la nuit.
    7. Rafraîchir le milieu d’ensemencement hiPSC-CM avec 300 μL de milieu d’entretien hiPSC-CM 1 jour après le placage. Changez le support de maintenance hiPSC-CM tous les 2 jours avant l’enregistrement.
  4. Acquisition de données
    1. Effectuer la mesure de l’AEM au moins 10 jours après le placage (recommandé). Au jour 10 post-placage, vérifier la densité de la monocouche hiPSC-CM battante spontanée au microscope à un grossissement de 10x, qui devrait être comme indiqué à la figure 3C.
    2. Placez la plaque MEA à 48 puits dans l’instrument d’enregistrement. L’écran tactile permet d’observer l’état de la température (37 °C) et du CO2 (5%).
    3. Ouvrez le logiciel de navigation. Dans la fenêtre de configuration expérimentale, sélectionnez Configuration cardiaque en temps réel et Enregistrements du potentiel de terrain. Appliquez des configurations de battement spontanées ou rythmées.
    4. Dans les paramètres de détection des battements, régler le seuil de détection sur 300 μV, la période de battement minimale sur 250 ms et la période de battement maximale sur 5 s. Sélectionnez Régression polynomiale pour le calcul de la durée potentielle du champ (FPD).
    5. Vérifiez si le signal d’activité électrique de base est mature et stable.
      NOTE: Les formes d’onde matures enregistrées par chaque électrode à partir de la plaque MEA multipuits doivent refléter le potentiel de champ cardiaque avec des caractéristiques facilement identifiables coïncidant avec le pic de dépolarisation cardiaque et la phase de repolarisation, comme le montre la figure 3D-F.
    6. Acquérir les activités cardiaques de base pendant 1-3 min. Si un traitement médicamenteux est nécessaire, ajouter des composés aux puits après l’enregistrement de base. Placez la plaque dans un incubateur pendant au moins 30 minutes avant le prochain enregistrement.

4. Mesure du potentiel d’action de la CSPc-CM

  1. Préparer des plats recouverts d’une matrice membranaire basale en plaçant 500 μL de solution de revêtement à matrice extracellulaire sur la partie inférieure en verre de la vaisselle de 35 mm (figure 4A). Incuber les plats de 35 mm dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C, 5% CO2 pendant la nuit.
  2. Effectuer la dissociation enzymatique des CM-HIPSC comme décrit à l’étape 2.2.
  3. Ensemencement des hiPSC-CM
    1. Retirez la solution de revêtement à matrice extracellulaire des boîtes de 35 mm. Ensemencer 50 000 cellules par puits dans 500 μL de milieu d’ensemencement hiPSC-CM sur la partie inférieure en verre de boîtes de 35 mm.
    2. Incuber les plats de 35 mm dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C, 5% CO2 pendant la nuit. Retirer le milieu d’ensemencement hiPSC-CM et ajouter 2 ml de milieu d’entretien hiPSC-CM dans les boîtes de 35 mm.
      REMARQUE : Il est recommandé de placer un embout non filtré de 200 μL sur la pipette d’aspiration de 2 mL pour retirer le milieu usé afin d’éviter de toucher les cellules.
    3. Changez le milieu de culture hiPSC-CM tous les 2 jours avant l’enregistrement.
  4. Acquisition de données
    1. Effectuer la mesure du potentiel d’action au moins 10 jours après le placage (recommandé). Préparer la solution de Tyrode fraîche comme décrit à l’étape 1.4. Décongeler une partie aliquote de la solution de pipette intracellulaire et ajouter fraîchement le MgATP à une concentration finale de 3 mM.
    2. Tirez les micropipettes des capillaires en verre borosilicaté à l’aide d’un extracteur de micropipettes.
      NOTE: Une résistance de 2-5 MΩ des micropipettes est préférée.
    3. Remplacez le milieu de maintenance hiPSC-CM par la solution de Tyrode et laissez les cellules s’acclimater à la solution de Tyrode pendant 15 min (Figure 4C). Insérez les capteurs de température dans la chambre, placez la capsule de 35 mm dans la chambre comme indiqué à la figure 4C et réglez la température à 37 °C (figure 4D).
    4. Remplissez les micropipettes avec une solution intracellulaire et insérez-les dans le support relié à la tête de l’amplificateur à pince patch-clamp (Figure 4E). Ouvrez le logiciel de stimulation/acquisition, chargez le protocole d’enregistrement du potentiel d’action et sélectionnez la configuration tension-pince.
    5. Insérez la micropipette dans la solution du bain, sélectionnez les hiPSC-CM uniques appropriés, et ajustez et abaissez la position de la micropipette à côté de la cellule sélectionnée à l’aide d’un micromanipulateur. Lorsque l’embout de la pipette est inséré dans la solution du bain, vérifiez la résistance de la pipette qui peut être observée sur le moniteur de l’oscilloscope.
    6. Placez la pipette près de la cellule, et les impulsions de courant diminueront légèrement pour refléter la résistance croissante de l’étanchéité. Appliquez une aspiration douce avec une pression négative pour augmenter la résistance, ce qui formera un gigajoint. Appliquez la fonction Sceau .
    7. Appliquez une aspiration supplémentaire pour briser la membrane afin d’obtenir une configuration d’enregistrement de cellule entière. Une fois que la partie membranaire dans la zone de la pipette est rompue par aspiration, la solution interne est en équilibre avec le cytoplasme cellulaire. À ce stade, passez du mode de pince de tension (V-clamp) au mode de pince de courant ou à l’absence d’injection de courant (C-Clamp) à l’aide de la boîte de dialogue de l’amplificateur. Appuyez sur le bouton Enregistrer pour générer et enregistrer les fichiers d’enregistrement potentiels d’action.
      REMARQUE: Le changement de mode fournit un enregistrement continu des potentiels d’action spontanée des hiPSC-CM via un protocole d’enregistrement sans déclencheur ni stimulation, qui peut être surveillé à la sortie V-mon de l’amplificateur patch-clamp.

5. Mesure du transitoire hiPSC-CM Ca2+

  1. Reportez-vous au protocole précédent pour la préparation de chambres cellulaires personnalisées pour l’imagerie Ca 2+ 21. Pour la préparation de la chambre cellulaire à matrice membranaire basale, placez 200 μL de solution de revêtement de matrice extracellulaire dans les chambres cellulaires. Incuber les chambres cellulaires dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C, 5% CO2 pendant la nuit.
  2. Effectuer la dissociation enzymatique des CM-HIPSC comme décrit à l’étape 2.2.
  3. Ensemencement des hiPSC-CM
    1. Retirez la solution de revêtement de matrice extracellulaire des chambres cellulaires. Ensemencer 20 000 cellules par puits dans 200 μL de milieu d’ensemencement hiPSC-CM.
    2. Remplacer le milieu d’ensemencement hiPSC-CM par 200 μL de milieu d’entretien hiPSC-CM 1 jour après le placage. Changez le support de maintenance hiPSC-CM tous les 2 jours avant l’enregistrement.
  4. Acquisition de données
    1. Effectuer une mesure transitoire Ca2+ au moins 10 jours après le placage (recommandé). Préparer la solution de Tyrode fraîche comme décrit à l’étape 1.4. Préparer la solution de chargement Fura-2 AM fraîche comme décrit à l’étape 1.6.
    2. Aspirez le support de maintenance hiPSC-CM et lavez deux fois avec la solution Tyrode. Appliquer 100 μL de solution de chargement Fura-2 AM et incuber pendant 10 min à TA.
    3. Remplacer la solution de chargement Fura-2 AM par la solution Tyrode et prévoir au moins 5 minutes pour une estérification complète de Fura-2 AM.
    4. Ajouter une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif 40x d’un microscope à épifluorescence inversée équipé d’un objectif d’immersion d’huile 40x (0,95 NA). Placez la chambre cellulaire dans l’adaptateur de scène du microscope (Figure 5A).
    5. Installez les fils du régulateur de température dans la chambre du bain et réglez-la à 37 °C. Installez les électrodes de stimulation de champ électrique et réglez les impulsions à 0,5 Hz avec une durée de 20 ms.
    6. Allumez la source lumineuse à commutation de longueur d’onde ultra-rapide et réglez-la sur les modes de commutation rapide 340 nm et 380 nm selon les instructions de l’instrument.
    7. Appliquez un temps d’exposition de 20 ms pour les deux longueurs d’onde et un temps d’enregistrement de 20 s dans le logiciel. Enregistrez la vidéo reflétant les changements en temps réel du transitoire Ca2+ dans les hiPSC-CM. Exportez les données vers une feuille de calcul et analysez-les comme décrit précédemment23.

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Representative Results

Ce protocole décrit comment mesurer le mouvement de contraction, le potentiel de champ, le potentiel d’action et le transitoire Ca2+ des hiPSC-CM. Un diagramme schématique comprenant la digestion enzymatique, l’ensemencement cellulaire, l’entretien et la conduction fonctionnelle du test est illustré à la figure 1. La formation de la monocouche hiPSC-CM est nécessaire pour la mesure du mouvement de contraction (Figure 2B). Une trace représentative du mouvement de contraction-relaxation des CM-HiPSC est représentée à la figure 2C. Le logiciel d’analyse permet d’analyser les traces de mouvement de contraction-relaxation de manière automatisée en détectant le début de contraction, le pic de contraction, l’extrémité de contraction, le pic de relaxation et la fin de relaxation à l’aide du paramètre par défaut (Figure 2D). Les vitesses des pics de contraction et de relaxation sont utilisées pour évaluer les capacités de contraction et de relaxation des hiPSC-CM. En outre, des distances de déformation de contraction et de relaxation peuvent également être obtenues.

Le test MEA est l’enregistrement extracellulaire des potentiels d’action, connus sous le nom de potentiels de champ. Une mesure réussie des potentiels de champ nécessite une couverture complète de la monocouche hiPSC-CM sur toutes les électrodes dans chaque puits des plaques MEA (Figure 3C). Les formes d’onde matures enregistrées par chaque électrode doivent refléter le potentiel de champ cardiaque avec des caractéristiques facilement identifiables, comme le montre la figure 3D-F. Les normes de qualité spécifiées sont les suivantes : 1) l’activité de référence doit montrer un battement spontané compris entre 20 et 90 battements par minute, 2) le taux de battement doit se situer dans les 6 écarts-types calculés pour le taux de battement de base sur tous les puits, 3) le coefficient de variation de la période de battement doit être inférieur à 5 % et 4) l’amplitude de dépolarisation doit être supérieure à 0,3 mV, tel que publié précédemment22. La figure 3E montre des traces potentielles représentatives de CM-HISP sur le terrain. Le logiciel de navigation détecte et identifie automatiquement les battements et les FPD. Après analyse, la période de battement, le FPD et l’amplitude de pointe peuvent être obtenus (Figure 3F). Plus précisément, la période de battement est déterminée par l’intervalle de crête à crête de dépolarisation, le FPD est déterminé par l’intervalle entre le pic de dépolarisation et le pic de repolarisation et l’amplitude du pic est mesurée par la distance entre le pic positif dépolarisant et le pic négatif, comme le montre la figure 3F.

La pince patch unicellulaire est l’étalon-or pour évaluer les propriétés électrophysiologiques des hiPSC-CMs (Figure 4B). Les enregistrements de patch-clamp à cellules entières en mode de serrage de courant peuvent enregistrer les potentiels d’action spontanée de CM-HiPSC uniques (Figure 4F). Après analyse, plusieurs paramètres, y compris l’amplitude, le potentiel diastolique maximal (MDP) et la durée du potentiel d’action (APD) à 30%, 50% et 90% de repolarisation peuvent être obtenus (Figure 4G).

Pour l’imagerie Ca2+, les changements d’intensité de fluorescence des CM-HiPSC individuels au fil du temps peuvent être enregistrés par le logiciel. Une zone représentative des hiPSC-CM chargés de Fura-2 est représentée à la figure 5B. L’utilisation d’une source lumineuse à commutation de longueur d’onde à ultra-haute vitesse permet l’enregistrement de transitoires Ca2+ à partir de centaines de hiPSC-CM via un balayage en mode trame. Après l’analyse par un tableur23, le rapport F340/F380 dans le temps pour chaque cellule peut être obtenu. Ensuite, des traces brutes de transitoires Ca2+ stimulés peuvent être tracées (Figure 5C). De plus, des paramètres tels que l’amplitude, le Ca 2+ diastolique et la désintégration Ca2+ tau peuvent être obtenus (Figure 5D).

Figure 1
Graphique 1. Schéma schématique global du protocole. Le jour 0, digérer et ensemencer les hiPSC-CM sur des plaques à 96 puits revêtues d’une matrice de membrane basale / plaques MEA à 48 puits/boîtes de 35 mm/chambres cellulaires. Prévoyez une période de récupération d’au moins 10 jours avant d’effectuer les tests fonctionnels à l’aide d’un système d’imagerie de mouvement cellulaire, MEA, patch-clamp et système d’imagerie Ca2+ . Abréviations : MEA = réseau de microélectrodes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Graphique 2. Mesure du mouvement de contraction. (A) Le système d’imagerie du mouvement cellulaire. (B) Une région représentative de la monocouche hiPSC-CM. Barre d’échelle: 20 μm. (C) Traces représentatives de contraction-relaxation des CM-HiPSC. (D) Diagramme schématique d’une trace de contraction-relaxation montrant le début de la contraction, le pic de contraction, la fin de la contraction, le pic de relaxation et la fin de relaxation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Graphique 3. Mesure du potentiel de champ. (A) Vue de dessus (à gauche) d’une plaque MEA de 48 puits, (au milieu) d’un puits avec 16 électrodes et (à droite) de la zone qu’une gouttelette à matrice membranaire basale doit couvrir. Ajoutez suffisamment d’eau distillée au réservoir d’eau pour compenser l’évaporation. (B) suspension hiPSC-CM et densité désirée après replacage. (C) Une région représentative de la monocouche hiPSC-CM. (D) Tracés de formes d’ondes continues à partir des 16 électrodes dans un puits de la plaque MEA à 48 puits. (E) Traces potentielles représentatives sur le terrain des CM-HIPSC. (F) Schéma de principe d’une trace de potentiel de champ montrant comment les paramètres ont été analysés. Abréviation : FPD = durée potentielle du champ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Graphique 4. Mesure du potentiel d’action. (A) Revêtement membranaire du sous-sol et mise en suspension hiPSC-CMs sur des boîtes de 35 mm. (B) Une région représentative des CM-CSPh uniques. Barre d’échelle : 20 μm. (C-E) Configuration du système de pince de patch. (F) Action représentative des traces potentielles de hiPSC-CM. (G) Schéma d’une trace de potentiel d’action montrant comment les paramètres ont été analysés. Abréviations : APD = durée du potentiel d’action, MDP = potentiel diastolique maximal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Graphique 5. Mesure du Ca2+ transitoire. (A) Le système d’imagerie Ca2+ . (B) Une région représentative des hiPSC-CM simples chargés de Fura-2. Barre d’échelle: 100 μm. (C) Traces transitoires représentatives Ca2+ de hiPSC-CM. (D) Schéma d’une trace transitoire Ca2+ montrant comment les paramètres ont été analysés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La technologie iPSC humaine est devenue une plate-forme puissante pour la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour mesurer la contractilité hiPSC-CM, le potentiel de champ, le potentiel d’action et le transitoire Ca2+. Ce protocole fournit une caractérisation complète de la contractilité et de l’électrophysiologie hiPSC-CM. Ces tests fonctionnels ont été appliqués dans plusieurs publications de notre groupe 12,13,18,24,25,26,27.

Il est essentiel d’utiliser les hiPSC-CM qui sont dans de bonnes conditions de battement, sinon le rapport signal sur bruit des lectures diminuera considérablement. En outre, il est souhaitable d’assurer la haute pureté des CM-HiPSC avant les mesures. L’existence de non-cardiomyocytes pourrait particulièrement compromettre la précision des données des mesures du mouvement de contraction et du potentiel de champ, qui nécessitent toutes deux la formation d’une monocouche hiPSC-CM. En outre, l’immaturité des CM-CSPhi reste une préoccupation majeure qui entrave la pleine application des CM-CSPhi dans divers domaines28. On sait que les hiPSC-CM sont fonctionnellement immatures dans de multiples aspects, y compris la morphologie, la contractilité, l’électrophysiologie, la manipulation du Ca 2+ et le métabolisme29. Par conséquent, il est recommandé de conserver les CM-HISP dans la culture au moins jusqu’au jour 30 avant d’effectuer des essais fonctionnels. Alternativement, diverses stratégies qui ont été établies pour améliorer la maturité des CM-HIPSC peuvent être adoptées avant de mener les tests fonctionnels30. Par exemple, les hiPSC-CM cultivés dans des milieux de maturation métabolique présentaient des MDP très négatifs de potentiels d’action et une désintégration significativement plus rapide des transitoires Ca2+ par rapport aux HIPSC-CM cultivés dans des milieux RPMInormaux 31. Enfin, il existe des variations de lot à lot des hiPSC-CM32. Ainsi, des données devraient être collectées sur les CSPh-CM générées à partir d’au moins trois différenciations indépendantes des mêmes lignées de CSPi.

Le système d’imagerie du mouvement cellulaire fournit un débit élevé et une plate-forme efficace pour mesurer le mouvement de contraction et de relaxation des CM-HiPSC. Cependant, un inconvénient majeur est qu’il ne mesure pas la force contractile directe, mais plutôt la vitesse de contraction et de relaxation. De plus, les vitesses varient lorsque le nombre de hiPSC-CM pour former une monocouche est différent. Par conséquent, il est crucial d’ensemencer précisément 50 000 cellules dans chaque puits des plaques de 96 puits.

Le FPD mesuré par MEA a été utilisé comme substitut de la durée de l’intervalle QT et est donc largement utilisé dans l’évaluation de l’allongement de l’intervalle QT induit par le médicament33. Semblable à la durée de l’intervalle QT, le FPD dépend du taux de battement. Par conséquent, la correction du taux de battement est nécessaire pour interpréter avec précision les données du FPD. Dans ce protocole, il est recommandé que la mesure de l’AEM soit effectuée au moins 10 jours après le placage. Cependant, il est parfois possible que le signal de potentiel de champ soit encore instable après 10 jours après le placage. Si cela se produit, prolongez la culture hiPSC-CM de 2 à 3 jours supplémentaires.

La technique patch-clamp est un outil polyvalent pour évaluer l’électrophysiologie des hiPSC-CM et des canaux ioniques de dosage. Le principal inconvénient de la pince patch conventionnelle est sa propriété à faible débit, ce qui entrave son application dans les études à haut débit. De plus, il faut une longue courbe d’apprentissage et une pratique approfondie avant de pouvoir acquérir de l’expérience dans cette technique. Cependant, la technique conventionnelle de patch-clamp est toujours considérée comme l’étalon-or pour comprendre l’électrophysiologie des hiPSC-CM. Si l’APD des hiPSC-CM doit être évalué de manière à haut débit, il est également suggéré de commencer par l’imagerie optique du potentiel d’action hiPSC-CM à l’aide du capteur accéléré des potentiels d’action 2 (ASAP2)21. Une fois les cibles primaires obtenues, un potentiel d’action conventionnel peut être utilisé dans d’autres études pour un phénotypage et une validation plus précis. En outre, la pince patch automatisée a été de plus en plus utilisée dans divers domaines, en particulier la canalopathie. Par exemple, les courants des canaux ioniques transportés par de multiples variantes de canaux hERG et de canaux sodium voltage-dépendants ont été caractérisés par une pince patch automatisée34,35,36,37. De plus, l’utilisation de patch clamp automatisée dans les hiPSC-CM a été établie récemment38,39. Pour l’exécution de patch clamp automatisé, les lecteurs peuvent se référer aux protocoles précédemment publiés40. Avec les avantages d’un débit élevé et la simplicité de manipulation des machines, il ne fait aucun doute que les pinces de patch automatisées joueront un rôle de plus en plus important dans la découverte et le développement de médicaments.

L’utilisation d’un colorant ratiométrique sensible au Ca 2+, Fura-2, permet de mesurer le Ca2+ diastolique des CM-HiPSC d’être beaucoup moins affectée par les facteurs de biais expérimentaux tels que le temps de chargement du colorant, la distribution inégale du colorant et le photoblanchiment. Ceci est important pour récapituler le dysfonctionnement diastolique de maladies cardiaques particulières. La principale limitation est qu’il nécessite une source de lumière d’excitation UV, ce qui peut être incompatible avec la microscopie confocale.

En résumé, malgré les progrès récents dans l’évaluation de la cardiotoxicité dans la phase préclinique du développement du médicament, la cardiotoxicité reste l’une des principales préoccupations en matière de sécurité. L’intégration croissante des CM-hiPSC dans le processus standard d’évaluation préclinique de l’innocuité a le potentiel d’améliorer la précision de la prédiction de la toxicité des composés candidats. De plus, les CM-HIPSC spécifiques au patient permettent une sélection personnalisée des médicaments cardiaques et la prédiction de la réponse indésirable aux médicaments. Le protocole utilisant divers tests fonctionnels décrits ici aidera à élargir les applications des hiPSC-CM dans le dépistage des médicaments et la modélisation des maladies.

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Disclosures

J.C.W. est co-fondateur de Greenstone Biosciences mais n’a pas d’intérêts concurrents, car le travail présenté ici est complètement indépendant. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgments

Nous remercions Blake Wu d’avoir relu le manuscrit. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978, et NASA NNX16A069A (JCW), et AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis D35-20-1.5-N Patch clamp
50x B27 supplements Life Technologies 17504-044 hiPSC-CM culture medium
6-well culture plate E & K Scientific EK-27160 hiPSC-CM culture
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates Corning 3603 Contraction motion measurement
Accutase Sigma-Aldrich A6964 Enzymatic dissociation
Axion's Integrated Studio (AxIS) Axion Biosystems navigator software
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus BF 100-50-10, Patch clamp
CaCl2 1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115 Tyrode’s solution
Cell counting chamber slides ThermoFisher Scientific C10228 Cell counting
CytoView 48-well MEA plates Axion Biosystems M768-tMEA-48B MEA
DMEM/F12 Gibco/Life Technologies 12634028 Extracellular matrix medium
DPBS, no calcium, no magnesium Fisher Scientific 14-190-250
EGTA Sigma-Aldrich E3889 Intracellular pipette solution
EPC 10 USB patch clamp amplifier Warner Instruments 89-5000 Patch clamp
Fura-2, AM, cell permeant ThermoFisher Scientific F1221 Ca2+ transient measurement
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Tyrode’s solution
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Tyrode’s solution
hiPSCs Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl Sigma-Aldrich 529552 Tyrode’s solution
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher Scientific 10828-028 hiPSC-CM seeding medium
KOH 8 M Sigma-Aldrich P4494 Intracellular pipette solution
Lambda DG 4 Sutter Instrument Company Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source
Luna-FL automated fluorescence cell counter WISBIOMED LB-L20001 Cell counting
Maestro Pro MEA system Axion Biosystems MEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 356231 Extracellular matrix medium
MgATP Sigma-Aldrich A9187 Intracellular pipette solution
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Tyrode’s solution
NaCl Sigma-Aldrich S9888 Tyrode’s solution
NaOH 10 M Sigma-Aldrich 72068 Tyrode’s solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) ThermoFisher Scientific P3000MP Ca2+ transient measurement
RPMI 1640 medium Life Technologies 11875-119 hiPSC-CM culture medium
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System Sony Biotechnology Contraction motion measurement
Sutter Micropipette puller Sutter Instruments P-97 Patch clamp
Trypan blue stain Life Technologies T10282 Cell counting

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References

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Médecine numéro 186
Applications techniques des enregistrements de microélectrodes et de patch clamp sur des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme
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