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मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स पर माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी और पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के तकनीकी अनुप्रयोग

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64265
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Summary

मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएससी-सीएम) दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग और रोग मॉडलिंग के लिए एक आशाजनक इन विट्रो मॉडल के रूप में उभरे हैं। यहां, हम एचआईपीएससी-सीएम की अनुबंध और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं।

Abstract

दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी दवा एट्रिशन और बाजार से वापसी का प्रमुख कारण है। इसलिए, दवा के विकास के दौरान उचित प्रीक्लिनिकल कार्डियक सुरक्षा मूल्यांकन मॉडल का उपयोग करना एक महत्वपूर्ण कदम है। वर्तमान में, हृदय सुरक्षा मूल्यांकन अभी भी पशु अध्ययन पर अत्यधिक निर्भर है। हालांकि, पशु मॉडल प्रजातियों-विशिष्ट मतभेदों के कारण मनुष्यों के लिए खराब ट्रांसलेशनल विशिष्टता से ग्रस्त हैं, विशेष रूप से कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं के संदर्भ में। इस प्रकार, प्रीक्लिनिकल कार्डियक सुरक्षा मूल्यांकन के लिए एक विश्वसनीय, कुशल और मानव-आधारित मॉडल विकसित करने की तत्काल आवश्यकता है। मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएससी-सीएम) दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग और रोग मॉडलिंग के लिए एक अमूल्य इन विट्रो मॉडल के रूप में उभरे हैं। HIPSC-CM को विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि और विभिन्न रोगग्रस्त स्थितियों वाले व्यक्तियों से प्राप्त किया जा सकता है, जिससे उन्हें व्यक्तिगत रूप से दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी का आकलन करने के लिए एक आदर्श सरोगेट बनाया जा सकता है। इसलिए, एचआईपीएससी-सीएम की कार्यात्मक विशेषताओं की व्यापक जांच करने के लिए कार्यप्रणाली स्थापित करने की आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम विभिन्न कार्यात्मक परखों का विस्तार करते हैं जिनका मूल्यांकन एचआईपीएससी-सीएम पर किया जा सकता है, जिसमें अनुबंध, क्षेत्र क्षमता, कार्रवाई क्षमता और कैल्शियम हैंडलिंग का माप शामिल है। कुल मिलाकर, प्रीक्लिनिकल कार्डियक सुरक्षा मूल्यांकन में एचआईपीएससी-सीएम को शामिल करने से दवा के विकास में क्रांति लाने की क्षमता है।

Introduction

दवा विकास एक लंबी और महंगी प्रक्रिया है। 2009 और 2018 के बीच यूएस फूड एंड ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित नई चिकित्सीय दवाओं के एक अध्ययन ने बताया कि पूंजीकृत अनुसंधान और नैदानिक परीक्षणों की अनुमानित औसत लागत $ 985 मिलियन प्रति उत्पाद1 थी। दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटीदवा एट्रिशन और बाजार से वापसी का प्रमुख कारण है। विशेष रूप से, कार्डियोटॉक्सिसिटी चिकित्सीय दवाओंके कई वर्गों के बीच रिपोर्ट की जाती है। इसलिए, दवा विकास प्रक्रिया के दौरान हृदय सुरक्षा मूल्यांकन एक महत्वपूर्ण घटक है। हृदय सुरक्षा मूल्यांकन के लिए वर्तमान प्रतिमान अभी भी पशु मॉडल पर अत्यधिक निर्भर है। हालांकि, पशु मॉडल के उपयोग से प्रजातियों के अंतर को मानव रोगियों में दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी के लिए गलत भविष्यवाणियों के प्राथमिक कारण के रूप में तेजी से मान्यता प्राप्तहै। उदाहरण के लिए, हृदय क्रिया क्षमता की आकृति विज्ञान विभिन्न पुनर्ध्रुवीकरण धाराओंके योगदान के कारण मनुष्यों और चूहों के बीच काफी भिन्न होता है। इसके अलावा, कार्डियक मायोसिन और सर्कुलर आरएनए के अंतर आइसोफॉर्म जो कार्डियक फिजियोलॉजी को प्रभावित कर सकते हैं, प्रजातियों 6,7 के बीच अच्छी तरह से प्रलेखित किए गए हैं। इन अंतरालों को पाटने के लिए, प्रीक्लिनिकल कार्डियक सुरक्षा मूल्यांकन के लिए एक विश्वसनीय, कुशल और मानव-आधारित मॉडल स्थापित करना अनिवार्य है।

प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) तकनीक के अभूतपूर्व आविष्कार ने अभूतपूर्व दवा स्क्रीनिंग और रोग मॉडलिंग प्लेटफॉर्म उत्पन्न किए हैं। पिछले एक दशक में, मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (HIPSC-CMs) उत्पन्न करने के तरीके अच्छी तरहसे स्थापित हो गए हैं। HIPSC-CM ने रोग मॉडलिंग, दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग और सटीक चिकित्सा में अपने संभावित अनुप्रयोगों में बहुत रुचि आकर्षित की है। उदाहरण के लिए, एचआईपीएससी-सीएम का उपयोग आनुवंशिक वंशानुक्रम के कारण हृदय रोगों के पैथोलॉजिकल फेनोटाइप को मॉडल करने के लिए किया गया है, जैसे कि लंबे क्यूटी सिंड्रोम10, हाइपरट्रॉफिक कार्डियोमायोपैथी 11,12, और पतला कार्डियोमायोपैथी 13,14,15। नतीजतन, हृदय रोगों के रोगजनन में निहित प्रमुख सिग्नलिंग मार्गों की पहचान की गई है, जो प्रभावी उपचार के लिए संभावित चिकित्सीय रणनीतियों पर प्रकाश डाल सकते हैं। इसके अलावा, एचआईपीएससी-सीएम का उपयोग एंटीकैंसर एजेंटों से जुड़े दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी को स्क्रीन करने के लिए किया गया है, जिसमें डॉक्सोर्यूबिसिन, ट्रास्टुज़ुमाब और टायरोसिन किनेज इनहिबिटर 16,17,18 शामिल हैं; परिणामी कार्डियोटॉक्सिसिटी को कम करने के लिए रणनीतियों की जांच की जा रही है। अंत में, एचआईपीएससी-सीएम में रखी गई आनुवंशिक जानकारी व्यक्तिगत और जनसंख्या स्तर19,20 दोनों पर दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी की स्क्रीनिंग और भविष्यवाणी की अनुमति देती है। सामूहिक रूप से, HIPSC-CM व्यक्तिगत हृदय सुरक्षा भविष्यवाणी के लिए एक अमूल्य उपकरण साबित हुए हैं।

इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य एचआईपीएससी-सीएम की कार्यात्मक विशेषताओं की व्यापक और कुशलतापूर्वक जांच करने के लिए कार्यप्रणाली स्थापित करना है, जो रोग मॉडलिंग, दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग और सटीक चिकित्सा की ओर एचआईपीएससी-सीएम को लागू करने में बहुत महत्वपूर्ण हैं। यहां, हम HIPSC-CM के कार्यात्मक गुणों का आकलन करने के लिए कार्यात्मक परखों की एक सरणी का विस्तार करते हैं, जिसमें अनुबंध, क्षेत्र क्षमता, कार्रवाई क्षमता और कैल्शियम (Ca2+) हैंडलिंग (चित्रा 1) की माप शामिल है।

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Protocol

1. मीडिया और समाधान की तैयारी

  1. 50x B27 पूरक की 10 mL बोतल और RPMI 1640 माध्यम की 500 mL बोतल को मिलाकर HIPSC-CM रखरखाव माध्यम तैयार करें। माध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और एक महीने के भीतर इसका उपयोग करें। उपयोग से पहले मध्यम से कमरे के तापमान (आरटी) को बराबर करें।
  2. 20 एमएल सीरम प्रतिस्थापन और 180 एमएल एचआईपीएससी-सीएम रखरखाव माध्यम (10% कमजोर पड़ने, वी / वी) को मिलाकर एचआईपीएससी-सीएम सीडिंग माध्यम तैयार करें। जबकि ताजा तैयार बीजमाप को प्राथमिकता दी जाती है, इसे 2 सप्ताह से अधिक समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। उपयोग से पहले माध्यम को आरटी में बराबर करें।
  3. बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स की एक बोतल (10 एमएल) को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर पिघलाकर और बाँझ 1.5 एमएल ट्यूबों में बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के 500 μL को मिलाकर बाह्य मैट्रिक्स कोटिंग समाधान तैयार करें। आगे के उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स कोटिंग घोल बनाने के लिए बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स के 500 μL और 100 mL बर्फ-ठंडे DMEM/F12 मीडियम (1:200 कमजोर पड़ने, v/v) को मिलाएं।
  4. टायरोड के घोल का 50 एमएल तैयार करें जिसमें 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 5 mM ग्लूकोज और 10 mM HEPES शामिल हैं। पीएच को एनएओएच के साथ 7.4 में समायोजित करें। प्रयोग के दिन ताजा टायरोड का समाधान तैयार करें।
  5. 50 एमएल इंट्रासेल्युलर पिपेट समाधान तैयार करें जिसमें 120 एमएम केसीएल, 1 एमएम एमजीसीएल2, 10 एमएम ईजीटीए और 10 एमएम एचईपीईएस शामिल हैं। पीएच को KOH के साथ 7.2 में समायोजित करें। एलिकोट इंट्रासेल्युलर पिपेट समाधान को बाँझ 5 एमएल ट्यूबों में डालें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्रयोग के दिन, 3 mM की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए घोल में MgATP जोड़ें।
  6. 1 एमएल फुरा -2 एएम लोडिंग समाधान तैयार करें जिसमें 2 μM Fura-2 AM और 0.1% Pluronic F-127 हो। प्रयोग के दिन ताजा लोडिंग समाधान तैयार करें और इसे प्रकाश से बचाएं।

2. एचआईपीएससी-सीएम संकुचन गति का मापन

  1. 96-वेल प्लेटों के प्रत्येक कुएं में बाह्य मैट्रिक्स कोटिंग समाधान के 100 μL जोड़कर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटें तैयार करें। 96-वेल प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर एक ह्यूमिडिफायर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. HIPSC-CMs का एंजाइमेटिक पृथक्करण
    1. स्टैनफोर्ड कार्डियोवैस्कुलर इंस्टीट्यूट आईपीएससी बायोबैंक (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html) से उच्चपीएससी का अनुरोध करें। पिछले प्रकाशनों 8,9 के अनुसार HIPSC-CMS उत्पन्न करें। 10x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के तहत छह-अच्छी प्लेटों में संवर्धित HIPSC-CM का निरीक्षण करें।
      नोट: कोशिकाओं को अलग न करें जब वे अभी भी प्रोलिफेरेटिव हों। अन्यथा, कोशिकाएं रिप्लेटिंग के बाद कुओं पर बढ़ जाएंगी और कार्यात्मक परख के गलत परिणामों को जन्म देंगी। आमतौर पर, HIPSC-CMS 18-23 दिनों में प्रसार को रोकते हैं।
    2. सुनिश्चित करें कि HIPSC-CMS दृढ़ता से धड़क रहे हैं और 95% से अधिक शुद्धता है। कार्डियक ट्रोपोनिन टी के खिलाफ इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा शुद्धता का आकलन करें, कार्डियोमायोसाइट्स 8,9 का एक विशिष्ट मार्कर।
    3. रखरखाव माध्यम को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को 1x DPBS के साथ दो बार धोएं। छह-अच्छी प्लेटों के प्रत्येक कुएं में 1 एमएल सेल डिटेचमेंट समाधान जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: इनक्यूबेशन अवधि नियमित रूप से निगरानी की जानी चाहिए। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को अधिक न पचाएं क्योंकि यह सेल व्यवहार्यता को कम कर देगा।
    4. सिंगल-सेल सस्पेंशन उत्पन्न करने के लिए 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके धीरे-धीरे HIPSC-CM को कई बार ऊपर और नीचे करें। सेल डिटेचमेंट समाधान को बेअसर करने के लिए एचआईपीएससी-सीएम सीडिंग माध्यम की एक समान मात्रा जोड़ें।
    5. सेंट्रीफ्यूज एचआईपीएससी-सीएम 300 x g पर 3 मिनट के लिए RT. Aspirater को तैरने योग्य बनाते हैं और 1-2 mL HIPSC-CM सीडिंग माध्यम में सेल पेलेट को पुन: निलंबित करते हैं।
    6. ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण विधि का उपयोग करके सेल घनत्व और व्यवहार्यता की मात्रा निर्धारित करें। संक्षेप में, ट्राइपैन ब्लू की समान मात्रा के साथ सेल सस्पेंशन के 10 μL मिलाएं, एक सेल काउंटिंग स्लाइड में स्थानांतरित करें, और फिर सेल काउंटर का उपयोग करके गिनती करें, जैसा कि पहलेवर्णित 21 है।
  3. HIPSC-CMS को जोड़ना
    1. 96-वेल प्लेटों से बाह्य मैट्रिक्स कोटिंग समाधान को हटा दें।
    2. एचआईपीएससी-सीएम सीडिंग माध्यम के 100 μL में प्रति कुएं 50,000 कोशिकाओं को बीज दें और 96-वेल प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर एक ह्यूमिडिफायर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रात भर रखें।
    3. प्लेटिंग के 1 दिन बाद एचआईपीएससी-सीएम सीडिंग माध्यम को 100 μL HIPSC-CM रखरखाव माध्यम से बदलें। रिकॉर्डिंग तक हर 2 दिनों में HIPSC-CM रखरखाव माध्यम बदलें।
  4. डेटा अधिग्रहण
    1. कम से कम 10 दिन बाद हाइपीएससी-सीएम संकुचन गति को मापें (अनुशंसित)।
    2. तापमान नियंत्रक चालू करें और पसंदीदा तापमान के रूप में 37 डिग्री सेल्सियस सेट करें। माइक्रोस्कोप, कैमरा और सीओ2 आपूर्ति चालू करें।
    3. प्लेट धारक के पानी के जैकेट को बाँझ विआयनीकृत पानी की उचित मात्रा से भरें (चित्रा 2 ए)। प्लेट धारक पर 96-वेल प्लेट रखें और कोशिकाओं को कम से कम 5 मिनट के लिए अनुकूलित करने दें।
    4. व्यू सॉफ्टवेयर खोलें, कैमरा फ्रेम दर को 75 फ्रेम प्रति सेकंड (एफपीएस) और वीडियो / छवि रिज़ॉल्यूशन को 1024 × 1024 पिक्सेल पर सेट करें। ऑटो-फोकस और ऑटो-ब्राइटनेस फ़ंक्शन लागू करें। एचआईपीएससी-सीएम के वीडियो और छवियों को रिकॉर्ड करें।
      नोट: रिकॉर्डिंग के दौरान माइक्रोस्कोप टेबल के कंपन से बचें।
    5. स्वचालित विश्लेषण के लिए विश्लेषक सॉफ़्टवेयर खोलें।

3. एचआईपीएससी-सीएम क्षेत्र क्षमता का मापन

  1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों की तैयारी
    1. ध्यान से 48-वेल माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) प्लेटों के प्रत्येक कुएं के रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड क्षेत्र पर बाह्य मैट्रिक्स कोटिंग समाधान की 8 μL बूंद रखें। ड्रॉपलेट प्लेसमेंट के लिए उपयुक्त इलेक्ट्रोड क्षेत्र के लिए चित्रा 3 ए देखें। यह कदम इलेक्ट्रोड पर एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर को केंद्रित रखने के लिए महत्वपूर्ण है। किसी भी परिस्थिति में इलेक्ट्रोड को छूने से बचें।
    2. कोटिंग समाधान वाष्पीकरण को रोकने के लिए 48-वेल एमईए प्लेटों के कुओं (चित्रा 3 ए) के आसपास के क्षेत्र में 3 एमएल बाँझ विआयनीकृत पानी जोड़ें। 48-वेल एमईए प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 45-60 मिनट के लिए एक ह्यूमिडिफायर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
      नोट: तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को सूखने से रोकने के लिए बहुत लंबे समय तक इनक्यूबेट न करें।
  2. चरण 2.2 में वर्णित HIPSC-CM का एंजाइमेटिक पृथक्करण करें।
  3. HIPSC-CMS को जोड़ना
    1. एक ही पंक्ति या स्तंभ के भीतर 200 μL पिपेट टिप का उपयोग करके इलेक्ट्रोड को स्पर्श किए बिना कुएं की सतह से अधिकांश बाह्य मैट्रिक्स माध्यम को हटा दें।
    2. एक ही पंक्ति या स्तंभ के प्रत्येक कुएं के रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड क्षेत्र पर HIPSC-CM सीडिंग माध्यम की 8 μL बूंद में बीज 50,000 कोशिकाएं प्रति कुएं।
    3. अंतिम दो चरणों को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी कुओं को कोशिकाओं के साथ चढ़ाया न जाए। माइक्रोस्कोप के तहत जांचें कि सभी कुओं में एचआईपीएससी-सीएम निलंबन है। वांछित घनत्व के लिए, चित्रा 3 बी देखें।
      नोट: यदि तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पूरी तरह से सूख जाता है, तो एचआईपीएससी-सीएम के अनुलग्नक से समझौता किया जाएगा, जिससे सेल अटैचमेंट सबऑप्टिमल हो जाता है।
    4. 48-वेल एमईए प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 60 मिनट के लिए ह्यूमिडिफाइड सेल कल्चर इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
    5. धीरे-धीरे और धीरे-धीरे 48-वेल एमईए प्लेटों के प्रत्येक कुएं में 150 μL HIPSC-CM सीडिंग माध्यम जोड़ें। पहले से बीजित HIPSC-CM को फैलाने के बिना माध्यम जोड़ने के लिए, प्लेट को 45 ° कोण पर रखें, प्रत्येक कुएं की दीवार के खिलाफ पिपेट टिप को झुकाएं, और माध्यम को धीरे-धीरे छोड़ दें।
      नोट: बहुत जल्दी या उच्च दबाव के साथ माध्यम जोड़ने से पालन किए गए कार्डियोमायोसाइट्स को हटा दिया जाएगा। एचआईपीएससी-सीएम ड्रॉप निलंबन के साथ सीधे संपर्क से बचें।
    6. 48-वेल एमईए प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर एक ह्यूमिडिफायर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट करें।
    7. चढ़ाना के 1 दिन बाद 300 μL HIPSC-CM रखरखाव माध्यम के साथ HIPSC-CM सीडिंग माध्यम को ताज़ा करें। रिकॉर्डिंग से पहले हर 2 दिन में HIPSC-CM रखरखाव माध्यम बदलें।
  4. डेटा अधिग्रहण
    1. कम से कम 10 दिनों के बाद एमईए माप प्लेटिंग (अनुशंसित) करें। 10 वें दिन पोस्ट-प्लेटिंग पर, 10x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के तहत सहज बीटिंग HIPSC-CM मोनोलेयर के घनत्व की जांच करें, जिसे चित्र 3C में दिखाया जाना चाहिए।
    2. रिकॉर्डिंग उपकरण में 48-वेल एमईए प्लेट रखें। टच स्क्रीन तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) और सीओ2 (5%) स्थिति का निरीक्षण करने की अनुमति देता है।
    3. नेविगेटर सॉफ़्टवेयर खोलें। प्रायोगिक सेटअप विंडो में, कार्डिएक रीयल-टाइम कॉन्फ़िगरेशन और फ़ील्ड संभावित रिकॉर्डिंग का चयन करें। सहज या गति पूर्ण बीटिंग कॉन्फ़िगरेशन लागू करें।
    4. बीट डिटेक्शन पैरामीटर में, डिटेक्शन सीमा को 300 μV, न्यूनतम बीटिंग अवधि 250 ms और अधिकतम बीटिंग अवधि 5 s तक सेट करें। फ़ील्ड संभावित अवधि (एफपीडी) गणना के लिए बहुपद प्रतिगमन का चयन करें।
    5. जांचें कि बेसलाइन विद्युत गतिविधि संकेत परिपक्व और स्थिर है या नहीं।
      नोट: मल्टी-वेल एमईए प्लेट से प्रत्येक इलेक्ट्रोड द्वारा दर्ज किए गए परिपक्व तरंगों को कार्डियक डिपोलराइजेशन स्पाइक और रिपोलराइजेशन चरण के साथ आसानी से पहचाने जाने योग्य विशेषताओं के साथ कार्डियक फील्ड क्षमता को प्रतिबिंबित करना चाहिए, जैसा कि चित्रा 3 डी-एफ में दिखाया गया है।
    6. 1-3 मिनट के लिए बेसलाइन कार्डियक गतिविधियों का अधिग्रहण करें। यदि दवा उपचार की आवश्यकता है, तो बेसलाइन रिकॉर्डिंग के बाद कुओं में यौगिक जोड़ें। अगली रिकॉर्डिंग से पहले प्लेट को कम से कम 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें।

4. एचआईपीएससी-सीएम कार्रवाई क्षमता का मापन

  1. 35 मिमी व्यंजनों के ग्लास-बॉटम भाग पर 500 μL बाह्य मैट्रिक्स कोटिंग समाधान रखकर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित व्यंजन तैयार करें (चित्रा 4 ए)। 35 मिमी व्यंजनों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर एक ह्यूमिडिफाइड सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. चरण 2.2 में वर्णित HIPSC-CM का एंजाइमेटिक पृथक्करण करें।
  3. HIPSC-CMS को जोड़ना
    1. 35 मिमी व्यंजनों से बाह्य मैट्रिक्स कोटिंग समाधान को हटा दें। 35 मिमी व्यंजनों के ग्लास बॉटम भाग पर 500 μL HIPSC-CM सीडिंग माध्यम में प्रति कुएं 50,000 कोशिकाएं बीज लें।
    2. 35 मिमी व्यंजनों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर एक ह्यूमिडिफाइड सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट करें। HIPSC-CM सीडिंग माध्यम को हटा दें और 35 मिमी व्यंजनों में 2 एमएल HIPSC-CM रखरखाव माध्यम जोड़ें।
      नोट: कोशिकाओं को छूने से बचने के लिए खर्च किए गए माध्यम को हटाने के लिए 2 एमएल एस्पिरेशन पिपेट पर 200 μL गैर-फ़िल्टर्ड टिप लगाने की सिफारिश की जाती है।
    3. रिकॉर्डिंग से पहले हर 2 दिन में HIPSC-CM संस्कृति माध्यम बदलें।
  4. डेटा अधिग्रहण
    1. कम से कम 10 दिनों के बाद कार्रवाई संभावित माप-चढ़ाना (अनुशंसित) करें। चरण 1.4 में वर्णित के रूप में ताजा टायरोड का समाधान तैयार करें। इंट्रासेल्युलर पिपेट समाधान के एक एलिकोट को पिघलाएं और 3 एमएम की अंतिम एकाग्रता में एमजीएटीपी जोड़ें।
    2. माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करके बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं से माइक्रोपिपेट्स खींचें।
      नोट: माइक्रोपिपेट्स के 2-5 एम का प्रतिरोध पसंद किया जाता है।
    3. एचआईपीएससी-सीएम रखरखाव माध्यम को टायरोड के समाधान के साथ बदलें और कोशिकाओं को 15 मिनट (चित्रा 4 सी) के लिए टायरोड के समाधान के लिए अनुकूलित करने की अनुमति दें। कक्ष में तापमान सेंसर डालें, 35 मिमी डिश को कक्ष में रखें जैसा कि चित्रा 4 सी में दिखाया गया है, और तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 4 डी) में समायोजित करें।
    4. माइक्रोपिपेट्स को इंट्रासेल्युलर समाधान से भरें और उन्हें पैच-क्लैंप एम्पलीफायर हेडस्टेज (चित्रा 4 ई) से जुड़े धारक में डालें। अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें, कार्रवाई संभावित रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल लोड करें, और वोल्टेज-क्लैंप कॉन्फ़िगरेशन का चयन करें।
    5. माइक्रोपिपेट को स्नान समाधान में डालें, उपयुक्त एकल HIPSC-CMs का चयन करें, और माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके चयनित सेल के बगल में माइक्रोपिपेट की स्थिति को समायोजित और कम करें। जब पिपेट टिप को स्नान समाधान में डाला जाता है, तो पिपेट प्रतिरोध की जांच करें जिसे ऑसिलोस्कोप मॉनिटर पर देखा जा सकता है।
    6. पिपेट को सेल के करीब रखें, और बढ़ती सील प्रतिरोध को प्रतिबिंबित करने के लिए वर्तमान दालें थोड़ी कम हो जाएंगी। प्रतिरोध को बढ़ाने के लिए नकारात्मक दबाव के साथ कोमल चूषण लागू करें, जो एक गीगासियल का निर्माण करेगा। सील फ़ंक्शन लागू करें।
    7. पूरे सेल रिकॉर्डिंग कॉन्फ़िगरेशन प्राप्त करने के लिए झिल्ली को तोड़ने के लिए अतिरिक्त सक्शन लागू करें। एक बार पिपेट क्षेत्र के भीतर झिल्ली का हिस्सा सक्शन द्वारा टूट जाता है, तो आंतरिक समाधान सेल साइटोप्लाज्म के साथ संतुलन में होता है। इस बिंदु पर, एम्पलीफायर संवाद का उपयोग करके वोल्टेज-क्लैंप मोड (वी-क्लैंप) से वर्तमान-क्लैंप मोड या नो करंट इंजेक्शन (सी-क्लैंप) पर स्विच करें। कार्रवाई संभावित रिकॉर्डिंग फ़ाइलों को जनरेट करने और सहेजने के लिए रिकॉर्ड बटन दबाएँ।
      नोट: मोड परिवर्तन बिना ट्रिगर और बिना उत्तेजना रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल के माध्यम से एचआईपीएससी-सीएम की सहज कार्रवाई क्षमता की निरंतर रिकॉर्डिंग प्रदान करता है, जिसे पैच-क्लैंप एम्पलीफायर के वी-मोन आउटपुट पर निगरानी की जा सकती है।

5. HIPSC-CM Ca2+ क्षणिक का मापन

  1. सीए2 + इमेजिंग21 के लिए अनुकूलित सेल कक्ष तैयार करने के लिए पिछले प्रोटोकॉल का संदर्भ लें। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित सेल कक्ष की तैयारी के लिए, सेल कक्षों में बाह्य मैट्रिक्स कोटिंग समाधान के 200 μL रखें। सेल कक्षों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर एक ह्यूमिडिफायर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. चरण 2.2 में वर्णित HIPSC-CM का एंजाइमेटिक पृथक्करण करें।
  3. HIPSC-CMS को जोड़ना
    1. सेल कक्षों से बाह्य मैट्रिक्स कोटिंग समाधान को हटा दें। एचआईपीएससी-सीएम सीडिंग माध्यम के 200 μL में बीज 20,000 कोशिकाएं प्रति कुएं।
    2. प्लेटिंग के 1 दिन बाद एचआईपीएससी-सीएम सीडिंग माध्यम को 200 μL HIPSC-CM रखरखाव माध्यम से बदलें। रिकॉर्डिंग से पहले हर 2 दिन में HIPSC-CM रखरखाव माध्यम बदलें।
  4. डेटा अधिग्रहण
    1. कम से कम 10 दिन बाद चढ़ाना (अनुशंसित) सीए2 + क्षणिक माप करें। चरण 1.4 में वर्णित के रूप में ताजा टायरोड का समाधान तैयार करें। चरण 1.6 में वर्णित ताजा फुरा -2 एएम लोडिंग समाधान तैयार करें।
    2. हाईपीएससी-सीएम रखरखाव माध्यम को एस्पिरेट करें और टायरोड के घोल से दो बार धोएं। फुरा -2 एएम लोडिंग समाधान के 100 μL लागू करें और RT पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. फुरा -2 एएम लोडिंग समाधान को टायरोड के समाधान के साथ बदलें और फुरा -2 एएम के पूर्ण डी-एस्टरीफिकेशन के लिए कम से कम 5 मिनट की अनुमति दें।
    4. 40x तेल विसर्जन उद्देश्य (0.95 NA) से लैस एक उल्टे एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के 40x उद्देश्य पर विसर्जन तेल की एक बूंद जोड़ें। सेल कक्ष को माइक्रोस्कोप के चरण एडाप्टर में रखें (चित्रा 5 ए)।
    5. स्नान कक्ष में तापमान नियंत्रक तार स्थापित करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। विद्युत क्षेत्र उत्तेजना इलेक्ट्रोड स्थापित करें और दालों को 20 एमएस अवधि के साथ 0.5 हर्ट्ज पर सेट करें।
    6. अल्ट्रा-हाई-स्पीड तरंग दैर्ध्य-स्विचिंग प्रकाश स्रोत को चालू करें और इसे उपकरण के निर्देशों के अनुसार 340 एनएम और 380 एनएम फास्ट-स्विचिंग मोड पर सेट करें।
    7. सॉफ्टवेयर में तरंग दैर्ध्य और 20 सेकंड के रिकॉर्डिंग समय दोनों के लिए 20 एमएस का एक्सपोजर समय लागू करें। हाईपीएससी-सीएम में सीए2 + क्षणिक के वास्तविक समय के परिवर्तनों को दर्शाते हुए वीडियो रिकॉर्ड करें। डेटा को स्प्रेडशीट में निर्यात करें और पहले वर्णित डेटा का विश्लेषणकरें 23.

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल बताता है कि एचआईपीएससी-सीएम के संकुचन गति, क्षेत्र क्षमता, कार्रवाई क्षमता और सीए2 + क्षणिक को कैसे मापा जाए। एंजाइमेटिक पाचन, सेल सीडिंग, रखरखाव और कार्यात्मक परख चालन सहित एक योजनाबद्ध आरेख चित्रा 1 में दिखाया गया है। संकुचन गति माप (चित्रा 2 बी) के लिए एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर का गठन आवश्यक है। HIPSC-CM की संकुचन-विश्राम गति का एक प्रतिनिधि निशान चित्रा 2C में दिखाया गया है। विश्लेषक सॉफ्टवेयर डिफ़ॉल्ट सेटिंग (चित्रा 2 डी) का उपयोग करके संकुचन शुरू, संकुचन शिखर, संकुचन अंत, विश्राम शिखर और विश्राम अंत का पता लगाकर एक स्वचालित तरीके से संकुचन-विश्राम गति के निशान के विश्लेषण को सक्षम बनाता है। संकुचन और विश्राम चोटियों के वेग का उपयोग एचआईपीएससी-सीएम की संकुचन और विश्राम क्षमताओं का आकलन करने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, संकुचन और विश्राम विरूपण दूरी भी प्राप्त की जा सकती है।

एमईए परख कार्रवाई क्षमता की बाह्य रिकॉर्डिंग है, जिसे क्षेत्र क्षमता के रूप में जाना जाता है। क्षेत्र क्षमता के सफल माप के लिए एमईए प्लेटों के प्रत्येक कुएं के भीतर सभी इलेक्ट्रोड पर एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर के पूर्ण कवरेज की आवश्यकता होती है (चित्रा 3 सी)। प्रत्येक इलेक्ट्रोड द्वारा दर्ज परिपक्व तरंगों को आसानी से पहचाने जाने योग्य विशेषताओं के साथ कार्डियक फील्ड क्षमता को प्रतिबिंबित करना चाहिए, जैसा कि चित्रा 3 डी-एफ में दिखाया गया है। निर्दिष्ट गुणवत्ता मानक हैं 1) बेसलाइन गतिविधि को 20-90 बीट प्रति मिनट के भीतर एक सहज धड़कन दिखानी चाहिए, 2) बीटिंग दर सभी कुओं पर बेसलाइन बीटिंग दर के लिए गणना की गई 6 एसडी के भीतर होनी चाहिए, 3) बीट अवधि की भिन्नता का गुणांक 5% से कम होना चाहिए, और 4) विध्रुवण आयाम 0.3 एमवी से अधिक होना चाहिए, जैसा कि पहले22 प्रकाशित हुआ था। चित्रा 3 ई एचआईपीएससी-सीएम के प्रतिनिधि क्षेत्र संभावित निशान दिखाता है। नेविगेटर सॉफ्टवेयर बीट्स और एफपीडी का स्वचालित रूप से पता लगाता है और पहचानता है। विश्लेषण के बाद, बीट अवधि, एफपीडी और स्पाइक आयाम प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 3 एफ)। विशेष रूप से, बीट अवधि को विध्रुवण शिखर-से-शिखर अंतराल द्वारा निर्धारित किया जाता है, एफपीडी को विध्रुवण शिखर से पुनर्ध्रुवीकरण शिखर के बीच अंतराल द्वारा निर्धारित किया जाता है, और स्पाइक आयाम को विध्रुवण सकारात्मक शिखर से नकारात्मक शिखर के बीच की दूरी से मापा जाता है, जैसा कि चित्र 3 एफ में दिखाया गया है।

सिंगल-सेल पैच क्लैंप एचआईपीएससी-सीएम (चित्रा 4 बी) के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों का आकलन करने के लिए स्वर्ण मानक है। वर्तमान-क्लैंपिंग मोड में पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग एकल HIPSC-CM (चित्रा 4F) की सहज कार्रवाई क्षमता को रिकॉर्ड कर सकते हैं। विश्लेषण के बाद, आयाम, अधिकतम डायस्टोलिक क्षमता (एमडीपी), और 30%, 50% और 90% पुनर्ध्रुवण पर कार्रवाई संभावित अवधि (एपीडी) सहित कई पैरामीटर प्राप्त किए जा सकते हैं (चित्रा 4 जी)।

सीए2 + इमेजिंग के लिए, समय के साथ व्यक्तिगत एचआईपीएससी-सीएम के प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तन सॉफ्टवेयर द्वारा दर्ज किए जा सकते हैं। फुरा -2-लोडेड एचआईपीएससी-सीएम का एक प्रतिनिधि क्षेत्र चित्रा 5 बी में दिखाया गया है। अल्ट्रा-हाई-स्पीड तरंग दैर्ध्य-स्विचिंग प्रकाश स्रोत का उपयोग फ्रेम मोड स्कैनिंग के माध्यम से सैकड़ों हाईपीएससी-सीएम से सीए2 + ट्रांसिएंट्स की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। स्प्रेडशीट-आधारित प्रोग्राम23 द्वारा विश्लेषण के बाद, प्रत्येक सेल के लिए समय के साथ एफ 340 / एफ 380 अनुपात प्राप्त किया जा सकता है। फिर, उत्तेजित सीए2 + क्षणिकों के कच्चे निशान प्लॉट किए जा सकते हैं (चित्रा 5 सी)। इसके अलावा, आयाम, डायस्टोलिक सीए2 +, और सीए2 + क्षय ताऊ जैसे पैरामीटर प्राप्त किए जा सकते हैं (चित्रा 5 डी)।

Figure 1
चित्र 1. प्रोटोकॉल का समग्र योजनाबद्ध आरेख। दिन 0 पर, बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स-लेपित 96-वेल प्लेट्स/48-वेल एमईए प्लेट्स/35 मिमी व्यंजन/सेल चैंबरों पर एचआईपीएससी-सीएम को पचाएं और बीज दें। सेल मोशन इमेजिंग सिस्टम, एमईए, पैच-क्लैंप और सीए2 + इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके कार्यात्मक परख करने से पहले कम से कम 10 दिनों की वसूली अवधि की अनुमति दें। संक्षिप्तीकरण: एमईए = माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2. संकुचन गति का मापन। (ए) सेल गति इमेजिंग प्रणाली। (बी) एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर का एक प्रतिनिधि क्षेत्र। स्केल बार: 20 μm. (C) HIPSC-CM के प्रतिनिधि संकुचन-विश्राम निशान। (डी) संकुचन-विश्राम ट्रेस का योजनाबद्ध आरेख संकुचन प्रारंभ, संकुचन शिखर, संकुचन समाप्ति, विश्राम शिखर और विश्राम अंत को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3. क्षेत्र क्षमता का मापन। (ए) 48-वेल एमईए प्लेट के शीर्ष दृश्य (बाएं), (मध्य) 16 इलेक्ट्रोड के साथ एक कुआं, और (दाएं) वह क्षेत्र जिसे बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-ड्रॉपलेट को कवर करने की आवश्यकता होती है। वाष्पीकरण की भरपाई के लिए जलाशय में पर्याप्त आसुत जल जोड़ें। (बी) एचआईपीएससी-सीएम निलंबन और रिप्लेटिंग के बाद वांछित घनत्व। (सी) एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर का एक प्रतिनिधि क्षेत्र। (डी) 48-वेल एमईए प्लेट के एक कुएं में 16 इलेक्ट्रोड से निरंतर तरंग भूखंड। (ई) एचआईपीएससी-सीएम के प्रतिनिधि क्षेत्र संभावित निशान। (एफ) एक क्षेत्र संभावित ट्रेस का योजनाबद्ध आरेख दिखाता है कि मापदंडों का विश्लेषण कैसे किया गया था। संक्षिप्त नाम: एफपीडी = क्षेत्र संभावित अवधि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4. क्रिया क्षमता का मापन। (ए) बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स-कोटिंग और एचआईपीएससी-सीएम निलंबन प्लेसमेंट 35 मिमी व्यंजनों पर। (बी) एकल एचआईपीएससी-सीएम का एक प्रतिनिधि क्षेत्र। स्केल बार: 20 μm. (C-E) पैच-क्लैंप सिस्टम सेटअप. (च) एचआईपीएससी-मुख्यमंत्रियों के प्रतिनिधि कार्रवाई संभावित निशान। (जी) एक क्रिया संभावित ट्रेस का योजनाबद्ध आरेख दिखाता है कि मापदंडों का विश्लेषण कैसे किया गया था। संक्षेप: एपीडी = कार्रवाई क्षमता अवधि, एमडीपी = अधिकतम डायस्टोलिक क्षमता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5. सीए2 + क्षणिक का माप। (ए) सीए2 + इमेजिंग सिस्टम। (बी) फुरा -2-लोडेड सिंगल एचआईपीएससी-सीएम का एक प्रतिनिधि क्षेत्र। स्केल बार: 100 μm. (C) प्रतिनिधि Ca2+ HIPSC-CM के क्षणिक निशान। (डी) सीए2 + क्षणिक ट्रेस का योजनाबद्ध आरेख दिखाता है कि मापदंडों का विश्लेषण कैसे किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

मानव आईपीएससी प्रौद्योगिकी रोग मॉडलिंग और दवा स्क्रीनिंग के लिए एक शक्तिशाली मंच के रूप में उभरी है। यहां, हम HIPSC-CM अनुबंध, क्षेत्र क्षमता, कार्रवाई क्षमता और Ca2+ क्षणिक को मापने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह प्रोटोकॉल HIPSC-CM अनुबंध और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का एक व्यापक लक्षण वर्णन प्रदान करता है। इन कार्यात्मक परखों को हमारे समूह 12,13,18,24,25,26,27 के कई प्रकाशनों में लागू किया गया है।

एचआईपीएससी-सीएम का उपयोग करना आवश्यक है जो अच्छी बीटिंग स्थितियों में हैं, अन्यथा, रीडआउट का सिग्नल-टू-शोर अनुपात नाटकीय रूप से गिर जाएगा। इसके अलावा, माप से पहले एचआईपीएससी-सीएम की उच्च शुद्धता सुनिश्चित करना वांछनीय है। गैर-कार्डियोमायोसाइट्स का अस्तित्व विशेष रूप से संकुचन गति और क्षेत्र संभावित माप की डेटा सटीकता से समझौता कर सकता है, जिनमें से दोनों को एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर के गठन की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, एचआईपीएससी-सीएम की अपरिपक्वता एक प्रमुख चिंता का विषय बनी हुई है जो विभिन्न क्षेत्रों में एचआईपीएससी-सीएम के पूर्ण आवेदन में बाधाडालती है। यह ज्ञात है कि HIPSC-CMs आकृति विज्ञान, अनुबंध, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, Ca2+ हैंडलिंग और चयापचय29 सहित कई पहलुओं में कार्यात्मक रूप से अपरिपक्व हैं। इसलिए, कार्यात्मक परख करने से पहले कम से कम 30 वें दिन तक एचआईपीएससी-सीएम को संस्कृति में रखने की सिफारिश की जाती है। वैकल्पिक रूप से, एचआईपीएससी-सीएम की परिपक्वता में सुधार के लिए स्थापित की गई विभिन्न रणनीतियों को कार्यात्मक परखआयोजित करने से पहले अपनाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, मेटाबोलिक परिपक्वता मीडिया में संवर्धित एचआईपीएससी-सीएम ने सामान्य आरपीएमआई मीडिया31 में संवर्धित एचआईपीएससी-सीएम की तुलना में कार्रवाई क्षमता के अत्यधिक नकारात्मक एमडीपी और सीए2 + ट्रांसिएंट्स के काफी तेजी से क्षय का प्रदर्शन किया। अंत में, एचआईपीएससी-सीएम32 के बैच-टू-बैच भिन्नताएं हैं। इस प्रकार, एक ही आईपीएससी लाइनों के कम से कम तीन स्वतंत्र भेदभावों से उत्पन्न एचआईपीएससी-सीएम पर डेटा एकत्र किया जाना चाहिए।

सेल मोशन इमेजिंग सिस्टम एचआईपीएससी-सीएम के संकुचन और विश्राम गति को मापने के लिए एक उच्च थ्रूपुट और कुशल मंच प्रदान करता है। हालांकि, एक बड़ा नुकसान यह है कि यह प्रत्यक्ष सिकुड़ा हुआ बल नहीं मापता है, बल्कि इसके बजाय संकुचन और विश्राम वेग को मापता है। इसके अलावा, वेग तब भिन्न होते हैं जब मोनोलेयर बनाने के लिए एचआईपीएससी-सीएम की संख्या अलग होती है। इसलिए, 96-वेल प्लेटों के प्रत्येक कुएं में ठीक 50,000 कोशिकाओं को बीज देना महत्वपूर्ण है।

एमईए द्वारा मापा गया एफपीडी क्यूटी अवधि के लिए एक सरोगेट के रूप में इस्तेमाल किया गया है और इस प्रकार दवा-प्रेरित क्यूटी लंबाई का आकलन करने में व्यापक रूप से उपयोगकिया जाता है। क्यूटी अवधि के समान, एफपीडी दर निर्भर को हरा रहा है। इसलिए, एफपीडी डेटा की सटीक व्याख्या करने के लिए बीटिंग दर में सुधार आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल में, यह अनुशंसा की जाती है कि एमईए माप कम से कम 10 दिन बाद चढ़ाना किया जाता है। हालांकि, कभी-कभी यह संभव है कि क्षेत्र संभावित संकेत अभी भी 10 दिनों के बाद प्लेटिंग के बाद अस्थिर है। यदि ऐसा होता है, तो एचआईपीएससी-सीएम संस्कृति को 2-3 दिनों के लिए लंबा करें।

पैच-क्लैंप तकनीक एचआईपीएससी-सीएम के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का आकलन करने और आयन चैनलों की परख के लिए एक बहुमुखी उपकरण है। पारंपरिक पैच-क्लैंप का प्रमुख नुकसान इसकी कम थ्रूपुट संपत्ति है, जो उच्च थ्रूपुट अध्ययनों में इसके आवेदन में बाधा डालता है। इसके अलावा, इस तकनीक में अनुभवी होने से पहले इसे एक लंबे सीखने की अवस्था और व्यापक अभ्यास की आवश्यकता होती है। हालांकि, पारंपरिक पैच-क्लैंप तकनीक को अभी भी एचआईपीएससी-सीएम के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को समझने के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है। यदि उच्च थ्रूपुट तरीके से एचआईपीएससी-सीएम के एपीडी का मूल्यांकन करने की आवश्यकता है, तो एक्शन पोटेंशिअल 2 (एएसएपी 2)21 के त्वरित सेंसर का उपयोग करके एचआईपीएससी-सीएम एक्शन पोटेंशियल की ऑप्टिकल इमेजिंग से शुरू करने का भी सुझाव दिया जाता है। प्राथमिक लक्ष्य प्राप्त होने के बाद, अधिक सटीक फेनोटाइपिंग और सत्यापन के लिए आगे के अध्ययनों में एक पारंपरिक कार्रवाई क्षमता का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, स्वचालित पैच क्लैंप को विभिन्न क्षेत्रों, विशेष रूप से चैनलोपैथी में तेजी से नियोजित किया गया है। उदाहरण के लिए, एचईआरजी चैनलों और वोल्टेज-गेटेड सोडियम चैनलों के कई रूपों द्वारा किए गए आयन चैनल धाराओं को स्वचालित पैच क्लैंप 34,35,36,37 की विशेषता है। इसके अलावा, HIPSC-CM में स्वचालित पैच क्लैंप का उपयोग हाल ही में38,39 स्थापित किया गया है। स्वचालित पैच क्लैंप के निष्पादन के लिए, पाठक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल40 का उल्लेख कर सकते हैं। उच्च थ्रूपुट होने के फायदे और मशीन हैंडलिंग में सादगी के साथ, इसमें कोई संदेह नहीं है कि स्वचालित पैच क्लैंप दवा की खोज और दवा विकास में अधिक से अधिक महत्वपूर्ण भूमिका निभाएंगे।

एक अनुपातमित सीए2 + -संवेदनशील डाई, फुरा -2 का उपयोग, एचआईपीएससी-सीएम के डायस्टोलिक सीए2 + के माप को प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह कारकों जैसे डाई लोडिंग समय, असमान डाई वितरण और फोटो-ब्लीचिंग से बहुत कम प्रभावित करने की अनुमति देता है। यह विशेष हृदय रोगों के डायस्टोलिक डिसफंक्शन को पुन: उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण है। मुख्य सीमा यह है कि इसके लिए यूवी उत्तेजना प्रकाश स्रोत की आवश्यकता होती है, जो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ असंगत हो सकता है।

सारांश में, दवा के विकास के प्रीक्लिनिकल चरण में कार्डियोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन में हालिया प्रगति के बावजूद, कार्डियोटॉक्सिसिटी प्रमुख सुरक्षा चिंताओं में से एक है। मानक प्रीक्लिनिकल सुरक्षा मूल्यांकन प्रक्रिया में एचआईपीएससी-सीएम के बढ़ते समावेश में उम्मीदवार यौगिकों की विषाक्तता की भविष्यवाणी की सटीकता में सुधार करने की क्षमता है। इसके अलावा, रोगी-विशिष्ट एचआईपीएससी-सीएम व्यक्तिगत कार्डियक दवा चयन और प्रतिकूल दवा प्रतिक्रिया भविष्यवाणी को सक्षम करते हैं। यहां वर्णित विभिन्न कार्यात्मक परखों का उपयोग करने वाले प्रोटोकॉल दवा स्क्रीनिंग और रोग मॉडलिंग में एचआईपीएससी-सीएम के अनुप्रयोगों का विस्तार करने में मदद करेंगे।

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Disclosures

जेसीडब्ल्यू ग्रीनस्टोन बायोसाइंसेज के सह-संस्थापक हैं, लेकिन उनके कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं, क्योंकि यहां प्रस्तुत काम पूरी तरह से स्वतंत्र है। अन्य लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि को प्रूफरीडिंग करने के लिए ब्लेक वू को धन्यवाद देते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) आर01 एचएल113006, आर01 एचएल141371, आर01 एचएल163680, आर01 एचएल141851, यू01एफडी005978, और नासा एनएनएक्स16ए069ए (जेसीडब्ल्यू), और एएचए पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप 872244 (जीएमपी) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis D35-20-1.5-N Patch clamp
50x B27 supplements Life Technologies 17504-044 hiPSC-CM culture medium
6-well culture plate E & K Scientific EK-27160 hiPSC-CM culture
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates Corning 3603 Contraction motion measurement
Accutase Sigma-Aldrich A6964 Enzymatic dissociation
Axion's Integrated Studio (AxIS) Axion Biosystems navigator software
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus BF 100-50-10, Patch clamp
CaCl2 1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115 Tyrode’s solution
Cell counting chamber slides ThermoFisher Scientific C10228 Cell counting
CytoView 48-well MEA plates Axion Biosystems M768-tMEA-48B MEA
DMEM/F12 Gibco/Life Technologies 12634028 Extracellular matrix medium
DPBS, no calcium, no magnesium Fisher Scientific 14-190-250
EGTA Sigma-Aldrich E3889 Intracellular pipette solution
EPC 10 USB patch clamp amplifier Warner Instruments 89-5000 Patch clamp
Fura-2, AM, cell permeant ThermoFisher Scientific F1221 Ca2+ transient measurement
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Tyrode’s solution
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Tyrode’s solution
hiPSCs Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl Sigma-Aldrich 529552 Tyrode’s solution
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher Scientific 10828-028 hiPSC-CM seeding medium
KOH 8 M Sigma-Aldrich P4494 Intracellular pipette solution
Lambda DG 4 Sutter Instrument Company Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source
Luna-FL automated fluorescence cell counter WISBIOMED LB-L20001 Cell counting
Maestro Pro MEA system Axion Biosystems MEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 356231 Extracellular matrix medium
MgATP Sigma-Aldrich A9187 Intracellular pipette solution
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Tyrode’s solution
NaCl Sigma-Aldrich S9888 Tyrode’s solution
NaOH 10 M Sigma-Aldrich 72068 Tyrode’s solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) ThermoFisher Scientific P3000MP Ca2+ transient measurement
RPMI 1640 medium Life Technologies 11875-119 hiPSC-CM culture medium
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System Sony Biotechnology Contraction motion measurement
Sutter Micropipette puller Sutter Instruments P-97 Patch clamp
Trypan blue stain Life Technologies T10282 Cell counting

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References

  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
  3. Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).
  4. Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
  5. Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).
  6. Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
  7. Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
  8. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  9. Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).
  10. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  11. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  12. Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
  13. Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
  14. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  15. Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
  16. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
  17. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  18. Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
  19. Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
  20. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
  21. Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).
  22. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  23. Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
  24. Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
  25. Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
  26. Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
  27. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  28. Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
  29. Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
  30. Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117 (2014).
  31. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
  32. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  33. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
  34. Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
  35. Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
  36. Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
  37. Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  38. Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).
  39. Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).
  40. Milligan, C. J., Möller, C. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. 171-187 (2013).

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चिकित्सा अंक 186
मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स पर माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी और पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के तकनीकी अनुप्रयोग
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Zhao, S. R.,… More

Zhao, S. R., Mondéjar-Parreño, G., Li, D., Shen, M., Wu, J. C. Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (186), e64265, doi:10.3791/64265 (2022).

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