Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CMs), стали многообещающей моделью in vitro для скрининга кардиотоксичности, вызванной лекарственными препаратами, и моделирования заболеваний. Здесь мы подробно описываем протокол измерения сократимости и электрофизиологии hiPSC-CM.
Медикаментозная кардиотоксичность является основной причиной истощения и вывода лекарств с рынка. Поэтому использование соответствующих доклинических моделей оценки сердечной безопасности является критическим шагом при разработке лекарств. В настоящее время оценка сердечной безопасности по-прежнему сильно зависит от исследований на животных. Тем не менее, животные модели страдают от плохой трансляционной специфичности для людей из-за видовых различий, особенно с точки зрения электрофизиологических характеристик сердца. Таким образом, существует острая необходимость в разработке надежной, эффективной и основанной на человеке модели доклинической оценки сердечной безопасности. Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CMs), стали бесценной моделью in vitro для скрининга кардиотоксичности, вызванной лекарственными средствами, и моделирования заболеваний. hiPSC-CMs могут быть получены от людей с различным генетическим фоном и различными заболеваниями, что делает их идеальным суррогатом для оценки лекарственно-индуцированной кардиотоксичности индивидуально. Поэтому необходимо разработать методологии всестороннего изучения функциональных характеристик hiPSC-CM. В этом протоколе мы подробно описываем различные функциональные анализы, которые могут быть оценены на hiPSC-CM, включая измерение сократимости, потенциала поля, потенциала действия и обработки кальция. В целом, включение hiPSC-CM в доклиническую оценку сердечной безопасности может революционизировать разработку лекарств.
Разработка лекарств является длительным и дорогостоящим процессом. Исследование новых терапевтических препаратов, одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) в период с 2009 по 2018 год, показало, что средняя стоимость капитализированных исследований и клинических испытаний составила 985 миллионов долларов США за продукт1. Медикаментозная кардиотоксичность является основной причиной истощения и изъятия лекарств с рынка2. Примечательно, что кардиотоксичность сообщается среди нескольких классов терапевтических препаратов3. Поэтому оценка сердечной безопасности является важным компонентом в процессе разработки препарата. Нынешняя парадигма оценки сердечной безопасности по-прежнему сильно зависит от животных моделей. Тем не менее, видовые различия от использования животных моделей все чаще признаются в качестве основной причины неточных прогнозов лекарственно-индуцированной кардиотоксичности у пациентов с человеческими заболеваниями4. Например, морфология потенциала сердечного действия существенно различается между людьми и мышами из-за вклада различных реполяризующих токов5. Кроме того, дифференциальные изоформы сердечного миозина и круговых РНК, которые могут влиять на физиологию сердца, были хорошо задокументированы среди видов 6,7. Чтобы восполнить эти пробелы, необходимо создать надежную, эффективную и основанную на человеке модель доклинической оценки сердечной безопасности.
Новаторское изобретение технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) создало беспрецедентные платформы для скрининга лекарств и моделирования заболеваний. За последнее десятилетие методы получения индуцированных человеком плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток (hiPSC-CMs), стали хорошо известными 8,9. hiPSC-CMs привлекли большой интерес к их потенциальному применению в моделировании заболеваний, скрининге кардиотоксичности, вызванном лекарственными средствами, и прецизионной медицине. Например, hiPSC-CM были использованы для моделирования патологических фенотипов сердечных заболеваний, вызванных генетическим наследованием, таких как синдром удлиненного интервала QT10, гипертрофическая кардиомиопатия 11,12 и дилатационная кардиомиопатия 13,14,15. Следовательно, были выявлены ключевые сигнальные пути, участвующие в патогенезе сердечных заболеваний, которые могут пролить свет на потенциальные терапевтические стратегии эффективного лечения. Кроме того, hiPSC-CMs использовались для скрининга лекарственно-индуцированной кардиотоксичности, связанной с противоопухолевыми агентами, включая доксорубицин, трастузумаб и ингибиторы тирозинкиназы 16,17,18; изучаются стратегии смягчения результирующей кардиотоксичности. Наконец, генетическая информация, хранящаяся в hiPSC-CM, позволяет проводить скрининг и прогнозировать медикаментозную кардиотоксичность как на индивидуальном, так и на популяционном уровнях19,20. В совокупности hiPSC-CM оказались бесценным инструментом для персонализированного прогнозирования сердечной безопасности.
Общей целью этого протокола является разработка методологий для всестороннего и эффективного исследования функциональных характеристик hiPSC-CMs, которые имеют большое значение для применения hiPSC-CM для моделирования заболеваний, скрининга кардиотоксичности, вызванного лекарственными средствами, и прецизионной медицины. Здесь мы подробно описываем массив функциональных анализов для оценки функциональных свойств hiPSC-CM, включая измерение сократимости, потенциала поля, потенциала действия и обработки кальция (Ca2+) (рисунок 1).
Технология iPSC человека стала мощной платформой для моделирования заболеваний и скрининга лекарств. Здесь мы описываем подробный протокол для измерения сократимости hiPSC-CM, потенциала поля, потенциала действия и переходного периода Ca2+. Этот протокол обеспечивает комплексную хара…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Блейка Ву за корректуру рукописи. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 и NASA NNX16A069A (JCW), а также AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).
35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
NIS Elements AR | |||
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |