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Technische Anwendungen von Mikroelektrodenarray- und Patch-Clamp-Aufnahmen an humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64265
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Summary

Human-induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) haben sich als vielversprechendes In-vitro-Modell für das medikamenteninduzierte Kardiotoxizitätsscreening und die Krankheitsmodellierung herausgestellt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der Kontraktilität und Elektrophysiologie von hiPSC-CMs.

Abstract

Arzneimittelinduzierte Kardiotoxizität ist die Hauptursache für Arzneimittelabnutzung und Rückzug vom Markt. Daher ist die Verwendung geeigneter präklinischer kardialer Sicherheitsbewertungsmodelle ein kritischer Schritt bei der Arzneimittelentwicklung. Derzeit hängt die kardiale Sicherheitsbewertung noch stark von Tierversuchen ab. Tiermodelle sind jedoch aufgrund artspezifischer Unterschiede, insbesondere in Bezug auf kardiale elektrophysiologische Eigenschaften, von einer schlechten translationalen Spezifität für den Menschen geplagt. Daher besteht ein dringender Bedarf, ein zuverlässiges, effizientes und humanbasiertes Modell für die präklinische kardiale Sicherheitsbewertung zu entwickeln. Human-induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) haben sich als unschätzbares In-vitro-Modell für das medikamenteninduzierte Kardiotoxizitätsscreening und die Krankheitsmodellierung herausgestellt. hiPSC-CMs können von Personen mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen und verschiedenen Krankheitszuständen erhalten werden, was sie zu einem idealen Surrogat macht, um die medikamenteninduzierte Kardiotoxizität individuell zu beurteilen. Daher müssen Methoden zur umfassenden Untersuchung der funktionellen Merkmale von hiPSC-CMs festgelegt werden. In diesem Protokoll beschreiben wir verschiedene funktionelle Assays, die an hiPSC-CMs bewertet werden können, einschließlich der Messung der Kontraktilität, des Feldpotentials, des Aktionspotentials und der Kalziumhandhabung. Insgesamt hat die Einbeziehung von hiPSC-CMs in die präklinische kardiale Sicherheitsbewertung das Potenzial, die Arzneimittelentwicklung zu revolutionieren.

Introduction

Die Entwicklung von Medikamenten ist ein langer und teurer Prozess. Eine Studie über neue therapeutische Medikamente, die zwischen 2009 und 2018 von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) zugelassen wurden, berichtete, dass die geschätzten Mediankosten für aktivierte Forschung und klinische Studien 985 Millionen US-Dollar pro Produktbetrugen 1. Arzneimittelinduzierte Kardiotoxizität ist die Hauptursache für Arzneimittelabnutzung und Rückzug vom Markt2. Insbesondere wird Kardiotoxizität unter mehreren Klassen von Therapeutika berichtet3. Daher ist die kardiale Sicherheitsbewertung eine entscheidende Komponente während des Arzneimittelentwicklungsprozesses. Das derzeitige Paradigma für die kardiale Sicherheitsbewertung ist immer noch stark von Tiermodellen abhängig. Speziesunterschiede von der Verwendung von Tiermodellen werden jedoch zunehmend als Hauptursache für ungenaue Vorhersagen für medikamenteninduzierte Kardiotoxizität bei menschlichen Patienten erkannt4. Zum Beispiel unterscheidet sich die Morphologie des kardialen Aktionspotentials zwischen Mensch und Maus aufgrund der Beiträge verschiedener repolarisierender Ströme erheblich5. Darüber hinaus wurden differentielle Isoformen von kardialem Myosin und zirkulären RNAs, die die Herzphysiologie beeinflussen können, bei Spezies 6,7 gut dokumentiert. Um diese Lücken zu schließen, ist es unerlässlich, ein zuverlässiges, effizientes und humanbasiertes Modell für die präklinische kardiale Sicherheitsbewertung zu etablieren.

Die bahnbrechende Erfindung der Technologie für induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) hat beispiellose Plattformen für das Arzneimittelscreening und die Krankheitsmodellierung geschaffen. In den letzten zehn Jahren haben sich Methoden zur Erzeugung humaninduzierter pluripotenter Stammzell-abgeleiteter Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) gut etabliert 8,9. hiPSC-CMs haben großes Interesse an ihren potenziellen Anwendungen in der Krankheitsmodellierung, im medikamenteninduzierten Kardiotoxizitätsscreening und in der Präzisionsmedizin geweckt. Zum Beispiel wurden hiPSC-CMs verwendet, um die pathologischen Phänotypen von Herzerkrankungen zu modellieren, die durch genetische Vererbung verursacht werden, wie das Long-QT-Syndrom10, die hypertrophe Kardiomyopathie 11,12 und die dilatative Kardiomyopathie13,14,15. Folglich wurden wichtige Signalwege identifiziert, die an der Pathogenese von Herzerkrankungen beteiligt sind und Aufschluss über mögliche therapeutische Strategien für eine wirksame Behandlung geben können. Darüber hinaus wurden hiPSC-CMs verwendet, um medikamenteninduzierte Kardiotoxizität im Zusammenhang mit Antikrebsmitteln, einschließlich Doxorubicin, Trastuzumab und Tyrosinkinase-Inhibitoren, zu screenen16,17,18; Strategien zur Milderung der daraus resultierenden Kardiotoxizität werden derzeit untersucht. Schließlich ermöglicht die in hiPSC-CMs zurückgehaltene genetische Information das Screening und die Vorhersage der medikamenteninduzierten Kardiotoxizität sowohl auf individueller als auch auf Bevölkerungsebene19,20. Insgesamt haben sich hiPSC-CMs als unschätzbares Werkzeug für die personalisierte Vorhersage der kardialen Sicherheit erwiesen.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Methoden zur umfassenden und effizienten Untersuchung der funktionellen Eigenschaften von hiPSC-CMs zu etablieren, die für die Anwendung von hiPSC-CMs für die Krankheitsmodellierung, das medikamenteninduzierte Kardiotoxizitätsscreening und die Präzisionsmedizin von großer Bedeutung sind. Hier beschreiben wir eine Reihe von funktionellen Assays zur Beurteilung der funktionellen Eigenschaften von hiPSC-CMs, einschließlich der Messung der Kontraktilität, des Feldpotentials, des Aktionspotentials und der Handhabung von Kalzium (Ca2+) (Abbildung 1).

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Protocol

1. Vorbereitung von Medien und Lösungen

  1. Bereiten Sie das hiPSC-CM-Wartungsmedium vor, indem Sie eine 10-ml-Flasche 50x B27-Ergänzung und 500 ml RPMI 1640-Medium mischen. Lagern Sie das Medium bei 4 °C und verbrauchen Sie es innerhalb eines Monats. Gleichen Sie das Medium vor Gebrauch auf Raumtemperatur (RT) aus.
  2. Das hiPSC-CM-Seeding-Medium wird durch Mischen von 20 ml Serumersatz und 180 ml hiPSC-CM-Erhaltungsmedium (10% Verdünnung, v/v) hergestellt. Während frisch zubereitetes Saatmedium bevorzugt wird, kann es nicht länger als 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden. Gleichen Sie das Medium vor Gebrauch auf RT aus.
  3. Bereiten Sie eine extrazelluläre Matrixbeschichtungslösung vor, indem Sie eine Flasche (10 ml) Basalmembranmatrix bei 4 °C über Nacht auftauen und 500 μL Basalmembranmatrix in sterilen 1,5-ml-Röhrchen aliquotieren. Zur weiteren Verwendung bei -20 °C lagern. Mischen Sie 500 μL Basalmembranmatrix und 100 ml eiskaltes DMEM/F12-Medium (1:200 Verdünnung, v/v), um eine Basalmembranmatrix-Beschichtungslösung herzustellen.
  4. Bereiten Sie 50 ml Tyrode-Lösung vor, die 135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM Glucose und 10 mM HEPES enthält. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4 ein. Bereiten Sie am Tag des Experiments frische Tyrode-Lösung vor.
  5. Bereiten Sie 50 ml intrazelluläre Pipettenlösung vor, die 120 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM EGTA und 10 mM HEPES enthält. Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 7,2 ein. Aliquot die intrazelluläre Pipettenlösung in sterilen 5 ml Röhrchen und lagern Sie sie bei -20 °C. Am Tag des Experiments wird der Lösung frisch MgATP hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 3 mM zu erreichen.
  6. Bereiten Sie 1 ml Fura-2 AM Ladelösung vor, die 2 μM Fura-2 AM und 0,1% Pluronic F-127 enthält. Bereiten Sie am Tag des Experiments eine frische Ladelösung vor und schützen Sie sie vor dem Licht.

2. Messung der hiPSC-CM-Kontraktionsbewegung

  1. Bereiten Sie mit Basalmembranen beschichtete Platten vor, indem Sie 100 μL extrazelluläre Matrixbeschichtungslösung zu jeder Vertiefung von 96-Well-Platten hinzufügen. Inkubieren Sie die 96-Well-Platten in einem befeuchteten Zellkulturinkubator bei 37 °C, 5% CO2 über Nacht.
  2. Enzymatische Dissoziation von hiPSC-CMs
    1. Fordern Sie hiPSCs bei der iPSC Biobank des Stanford Cardiovascular Institute an (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Generierung von hiPSC-CMs gemäß den vorherigen Veröffentlichungen 8,9. Beobachten Sie die hiPSC-CMs, die in Sechs-Well-Platten kultiviert wurden, unter einem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung.
      HINWEIS: Dissoziieren Sie die Zellen nicht, wenn sie noch proliferativ sind. Andernfalls wachsen die Zellen nach dem Replattieren an den Vertiefungen über und führen zu ungenauen Ergebnissen der funktionellen Assays. Normalerweise stoppen hiPSC-CMs die Proliferation an den Tagen 18-23.
    2. Stellen Sie sicher, dass die hiPSC-CMs stark schlagen und eine Reinheit von über 95% aufweisen. Beurteilung der Reinheit durch Immunfärbung gegen kardiales Troponin T, einen spezifischen Marker für Kardiomyozyten 8,9.
    3. Das Pflegemedium absaugen und die Zellen zweimal mit 1x DPBS waschen. 1 ml Zellablösungslösung in jede Vertiefung der sechs Vertiefungsplatten geben und 10 min bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Die Inkubationsdauer sollte regelmäßig überwacht werden. Achten Sie darauf, die Zellen nicht zu überverdauen, da dies die Lebensfähigkeit der Zellen verringert.
    4. Pipettieren Sie hiPSC-CMs vorsichtig mehrmals mit einer 5-ml-Pipette auf und ab, um eine einzellige Suspension zu erzeugen. Fügen Sie ein gleiches Volumen des hiPSC-CMs-Seeding-Mediums hinzu, um die Zellablösungslösung zu neutralisieren.
    5. Zentrifugieren Sie hiPSC-CMs bei 300 x g für 3 min bei RT. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1-2 ml hiPSC-CM-Seedingmedium.
    6. Quantifizieren Sie die Zelldichte und Lebensfähigkeit mit einer Trypanblau-Ausschlussmethode. Kurz gesagt, mischen Sie 10 μL Zellsuspension mit einem gleichen Volumen Trypanblau, übertragen Sie es in einen Zellzählobjektträger und zählen Sie dann mit einem Zellzähler, wie zuvor beschrieben21.
  3. Aussaat von hiPSC-CMs
    1. Entfernen Sie die extrazelluläre Matrixbeschichtungslösung von den 96-Well-Platten.
    2. Aussaat von 50.000 Zellen pro Vertiefung in 100 μL hiPSC-CM-Seeding-Medium und Platzieren der 96-Well-Platten in einem befeuchteten Zellkulturinkubator bei 37 °C, 5% CO2 über Nacht.
    3. Ersetzen Sie das hiPSC-CM-Sämedium 1 Tag nach der Beschichtung durch 100 μL hiPSC-CM-Wartungsmedium. Wechseln Sie das hiPSC-CM Wartungsmedium alle 2 Tage bis zur Aufnahme.
  4. Datenerfassung
    1. Messen Sie die hiPSC-CM-Kontraktionsbewegung mindestens 10 Tage nach der Beschichtung (empfohlen).
    2. Schalten Sie den Temperaturregler ein und stellen Sie 37 °C als bevorzugte Temperatur ein. Schalten Sie das Mikroskop, die Kamera und die CO2-Versorgung ein.
    3. Füllen Sie den Wassermantel des Plattenhalters mit einer angemessenen Menge sterilen entionisierten Wassers (Abbildung 2A). Legen Sie die 96-Well-Platte auf den Plattenhalter und lassen Sie die Zellen mindestens 5 Minuten akklimatisieren.
    4. Öffnen Sie die Ansichtssoftware, stellen Sie die Kamerabildrate auf 75 Bilder pro Sekunde (fps) und die Video-/Bildauflösung auf 1024 × 1024 Pixel ein. Wenden Sie die Autofokus- und Autohelligkeitsfunktionen an. Nehmen Sie Videos und Bilder von hiPSC-CMs auf.
      HINWEIS: Vermeiden Sie Vibrationen des Mikroskoptisches während der Aufnahme.
    5. Öffnen Sie die Analysesoftware für die automatische Analyse.

3. Messung des hiPSC-CM-Feldpotentials

  1. Herstellung von Basalmembranmatrix-beschichteten Platten
    1. Platzieren Sie vorsichtig einen 8-μL-Tröpfchen extrazellulärer Matrixbeschichtungslösung über die Aufnahmeelektrodenfläche jeder Vertiefung der 48-Well-Mikroelektrodenarray-Platten (MEA). Siehe Abbildung 3A für den geeigneten Elektrodenbereich für die Tröpfchenplatzierung. Dieser Schritt ist entscheidend, um die hiPSC-CM-Monoschicht auf die Elektroden konzentriert zu halten. Vermeiden Sie es, die Elektroden unter keinen Umständen zu berühren.
    2. Fügen Sie 3 ml steriles entionisiertes Wasser in den Bereich um die Vertiefungen (Abbildung 3A) der 48-Well-MEA-Platten hinzu, um die Verdunstung der Beschichtungslösung zu verhindern. Inkubieren Sie 48-Well-MEA-Platten in einem befeuchteten Zellkulturinkubator bei 37 °C, 5%CO2 für 45-60 min.
      HINWEIS: Inkubieren Sie nicht zu lange, um ein Austrocknen der Basalmembranmatrix zu verhindern.
  2. Führen Sie eine enzymatische Dissoziation von hiPSC-CMs durch, wie in Schritt 2.2 beschrieben.
  3. Aussaat von hiPSC-CMs
    1. Entfernen Sie den größten Teil des extrazellulären Matrixmediums von der Vertiefungsoberfläche, ohne die Elektroden zu berühren, indem Sie eine 200-μL-Pipettenspitze innerhalb derselben einzelnen Reihe oder Säule verwenden.
    2. Aussaat von 50.000 Zellen pro Vertiefung in einem 8 μL Tröpfchen hiPSC-CM-Seeding-Medium über die Aufzeichnungselektrodenfläche jeder Vertiefung derselben Reihe oder Säule.
    3. Wiederholen Sie die letzten beiden Schritte, bis alle Vertiefungen mit Zellen plattiert sind. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob alle Vertiefungen die hiPSC-CM-Suspension haben. Die gewünschte Dichte finden Sie in Abbildung 3B.
      HINWEIS: Die Anheftung von hiPSC-CMs wird beeinträchtigt, wenn die Basalmembranmatrix vollständig ausgetrocknet ist, was die Zellanheftung suboptimal macht.
    4. Inkubieren Sie die 48-Well-MEA-Platten in einem befeuchteten Zellkulturinkubator bei 37 °C, 5%CO2 für 60 min.
    5. Geben Sie langsam und vorsichtig 150 μL hiPSC-CM-Seeding Medium in jede Vertiefung der 48-Well-MEA-Platten. Um Medium hinzuzufügen, ohne zuvor ausgesäte hiPSC-CMs zu dispergieren, halten Sie die Platte in einem Winkel von 45°, lehnen Sie die Pipettenspitze an die Wand jeder Vertiefung und lassen Sie das Medium langsam los.
      HINWEIS: Wenn Sie zu schnell oder mit hohem Druck Medium hinzufügen, werden die anhaftenden Kardiomyozyten entfernt. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit der hiPSC-CM Fallaufhängung.
    6. Inkubieren Sie die 48-Well-MEA-Platten in einem befeuchteten Zellkulturinkubator bei 37 °C, 5% CO2 über Nacht.
    7. Erfrischen Sie das hiPSC-CM-Saatmedium 1 Tag nach der Beschichtung mit 300 μL hiPSC-CM-Wartungsmedium. Wechseln Sie das hiPSC-CM Wartungsmedium alle 2 Tage vor der Aufnahme.
  4. Datenerfassung
    1. Führen Sie die MEA-Messung mindestens 10 Tage nach der Beschichtung durch (empfohlen). Überprüfen Sie am Tag 10 nach der Beschichtung die Dichte der spontan schlagenden hiPSC-CM-Monoschicht unter einem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung, die wie in Abbildung 3C gezeigt sein sollte.
    2. Setzen Sie die 48-Well-MEA-Platte in das Aufnahmegerät ein. Der Touchscreen ermöglicht die Beobachtung des Temperatur- (37 °C) und CO2 (5%) Status.
    3. Öffnen Sie die Navigator-Software. Wählen Sie im Fenster Versuchsaufbau die Optionen Kardiale Echtzeitkonfiguration und Feldpotentialaufzeichnungen aus. Wenden Sie spontane oder temporeiche Schlagkonfigurationen an.
    4. Stellen Sie bei den Beat-Erkennungsparametern die Erkennungsschwelle auf 300 μV, die minimale Schlagdauer auf 250 ms und die maximale Schlagdauer auf 5 s ein. Wählen Sie Polynomregression für die Berechnung der Feldpotentialdauer (FPD) aus.
    5. Überprüfen Sie, ob das Ausgangssignal der elektrischen Aktivität ausgereift und stabil ist.
      HINWEIS: Die reifen Wellenformen, die von jeder Elektrode von der Multi-Well-MEA-Platte aufgezeichnet werden, müssen das Herzfeldpotential mit leicht identifizierbaren Eigenschaften widerspiegeln, die mit der kardialen Depolarisationsspitze und der Repolarisationsphase übereinstimmen, wie in Abbildung 3D-F gezeigt.
    6. Erfassen Sie die grundlegenden kardialen Aktivitäten für 1-3 min. Wenn eine medikamentöse Behandlung erforderlich ist, fügen Sie den Vertiefungen nach der Baseline-Aufzeichnung Verbindungen hinzu. Legen Sie die Platte für mindestens 30 Minuten vor der nächsten Aufnahme in einen Inkubator.

4. Messung des hiPSC-CM-Aktionspotentials

  1. Bereiten Sie mit Basalmembranmatrix beschichtete Schalen vor, indem Sie 500 μl extrazelluläre Matrixbeschichtungslösung auf den Glasboden von 35 mm Schalen geben (Abbildung 4A). Die 35 mm großen Schalen in einem befeuchteten Zellkulturinkubator bei 37 °C, 5% CO2 über Nacht inkubieren.
  2. Führen Sie eine enzymatische Dissoziation von hiPSC-CMs durch, wie in Schritt 2.2 beschrieben.
  3. Aussaat von hiPSC-CMs
    1. Entfernen Sie die extrazelluläre Matrixbeschichtungslösung aus den 35 mm großen Schalen. 50.000 Zellen pro Vertiefung in 500 μL hiPSC-CM-Seeding-Medium auf den Glasboden von 35 mm Schalen.
    2. Die 35 mm großen Schalen in einem befeuchteten Zellkulturinkubator bei 37 °C, 5% CO2 über Nacht inkubieren. Entfernen Sie das hiPSC-CM-Saatmedium und geben Sie 2 ml hiPSC-CM-Wartungsmedium in die 35-mm-Schalen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, eine 200 μL ungefilterte Spitze über die 2 ml Aspirationspipette zu legen, um das verbrauchte Medium zu entfernen und zu vermeiden, dass Zellen berührt werden.
    3. Wechseln Sie das hiPSC-CM-Kulturmedium alle 2 Tage vor der Aufnahme.
  4. Datenerfassung
    1. Führen Sie die Messung des Aktionspotentials mindestens 10 Tage nach der Beschichtung durch (empfohlen). Bereiten Sie die frische Tyrode-Lösung wie in Schritt 1.4 beschrieben vor. Eine aliquote intrazelluläre Pipettenlösung auftauen und MgATP frisch zu einer Endkonzentration von 3 mM hinzufügen.
    2. Ziehen Sie die Mikropipetten mit einem Mikropipettenzieher aus Borosilikatglaskapillaren.
      HINWEIS: Ein Widerstand von 2-5 MΩ der Mikropipetten ist bevorzugt.
    3. Ersetzen Sie das hiPSC-CM-Erhaltungsmedium durch Tyrode-Lösung, und lassen Sie die Zellen 15 Minuten lang an die Tyrode-Lösung gewöhnen (Abbildung 4C). Setzen Sie die Temperatursensoren in die Kammer ein, stellen Sie die 35-mm-Schüssel in die Kammer (siehe Abbildung 4C), und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein (Abbildung 4D).
    4. Füllen Sie die Mikropipetten mit intrazellulärer Lösung, und führen Sie sie in den Halter ein, der mit der Kopfstufe des Patchklemmverstärkers verbunden ist (Abbildung 4E). Öffnen Sie die Stimulations-/Erfassungssoftware, laden Sie das Aktionspotentialaufzeichnungsprotokoll und wählen Sie die Spannungsklemmenkonfiguration aus.
    5. Führen Sie die Mikropipette in die Badlösung ein, wählen Sie geeignete einzelne hiPSC-CMs aus und passen Sie die Position der Mikropipette neben der ausgewählten Zelle mit einem Mikromanipulator an und senken Sie sie. Wenn die Pipettenspitze in die Badlösung eingeführt wird, überprüfen Sie den Pipettenwiderstand, der auf dem Oszilloskopmonitor beobachtet werden kann.
    6. Positionieren Sie die Pipette in der Nähe der Zelle, und die Stromimpulse nehmen leicht ab, um den zunehmenden Dichtungswiderstand widerzuspiegeln. Wenden Sie eine sanfte Absaugung mit Unterdruck an, um den Widerstand zu erhöhen, wodurch ein Gigaseal gebildet wird. Wenden Sie die Funktion Versiegeln an.
    7. Wenden Sie zusätzliche Absaugung an, um die Membran zu brechen, um eine Aufzeichnungskonfiguration für die gesamte Zelle zu erhalten. Sobald der Membranabschnitt innerhalb des Pipettenbereichs durch Absaugen gerissen ist, befindet sich die interne Lösung im Gleichgewicht mit dem Zellzytoplasma. Wechseln Sie an dieser Stelle über den Verstärkerdialog vom Spannungszangenmodus (V-Klemme) in den Stromzangenmodus oder keine Stromeinspeisung (C-Klemme). Klicken Sie auf die Aufnahmetaste , um die Aktionspotential-Aufzeichnungsdateien zu generieren und zu speichern.
      HINWEIS: Der Modenwechsel ermöglicht eine kontinuierliche Aufzeichnung der spontanen Aktionspotentiale von hiPSC-CMs über kein Trigger- und kein Stimulationsaufzeichnungsprotokoll, das am V-mon-Ausgang des Patch-Clamp-Verstärkers überwacht werden kann.

5. Messung von hiPSC-CM Ca2+ transient

  1. Siehe das vorherige Protokoll zur Vorbereitung kundenspezifischer Zellkammern für die Ca 2+ -Bildgebung21. Zur Herstellung der mit Basalmembranmatrix beschichteten Zellkammer werden 200 μL extrazelluläre Matrixbeschichtungslösung in die Zellkammern gegeben. Die Zellkammern in einem befeuchteten Zellkulturinkubator bei 37 °C, 5%CO2 über Nacht inkubieren.
  2. Führen Sie eine enzymatische Dissoziation von hiPSC-CMs durch, wie in Schritt 2.2 beschrieben.
  3. Aussaat von hiPSC-CMs
    1. Entfernen Sie die extrazelluläre Matrixbeschichtungslösung aus den Zellkammern. Aussaat von 20.000 Zellen pro Vertiefung in 200 μL hiPSC-CM-Seeding-Medium.
    2. Ersetzen Sie das hiPSC-CM-Saatmedium 1 Tag nach der Beschichtung durch 200 μL hiPSC-CM-Wartungsmedium. Wechseln Sie das hiPSC-CM Wartungsmedium alle 2 Tage vor der Aufnahme.
  4. Datenerfassung
    1. Führen Sie die transiente Ca2+ -Messung mindestens 10 Tage nach der Beschichtung durch (empfohlen). Bereiten Sie die frische Tyrode-Lösung wie in Schritt 1.4 beschrieben vor. Bereiten Sie die frische Fura-2 AM-Ladelösung wie in Schritt 1.6 beschrieben vor.
    2. Das hiPSC-CM-Wartungsmedium absaugen und zweimal mit der Lösung von Tyrode waschen. 100 μL Fura-2 AM Ladelösung auftragen und 10 min bei RT inkubieren.
    3. Ersetzen Sie die Fura-2 AM-Ladelösung durch die Lösung von Tyrode und lassen Sie mindestens 5 Minuten für die vollständige Entesterung von Fura-2 AM einplanen.
    4. Fügen Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das 40x-Objektiv eines inversen Epifluoreszenzmikroskops hinzu, das mit einem 40-fachen Ölimmersionsobjektiv (0,95 NA) ausgestattet ist. Setzen Sie die Zellkammer in den Tischadapter des Mikroskops ein (Abbildung 5A).
    5. Installieren Sie die Kabel des Temperaturreglers an der Badkammer und stellen Sie sie auf 37 °C ein. Installieren Sie die elektrischen Feldstimulationselektroden und stellen Sie die Impulse auf 0,5 Hz mit einer Dauer von 20 ms ein.
    6. Schalten Sie die ultraschnelle wellenlängenumschaltende Lichtquelle ein und stellen Sie sie gemäß den Anweisungen des Instruments auf 340 nm und 380 nm Schnellschaltmodus ein.
    7. Wenden Sie eine Belichtungszeit von 20 ms für beide Wellenlängen und eine Aufnahmezeit von 20 s in der Software an. Nehmen Sie das Video auf, das Echtzeitänderungen von Ca2+ Transienten in hiPSC-CMs widerspiegelt. Exportieren Sie die Daten in eine Tabelle und analysieren Sie die Daten wie zuvor beschrieben23.

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Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Kontraktionsbewegung, das Feldpotential, das Aktionspotential und der Ca2+ -Transient von hiPSC-CMs gemessen werden. Ein schematisches Diagramm einschließlich der enzymatischen Verdauung, Zellaussaat, Aufrechterhaltung und funktionellen Assay-Leitung ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Bildung der hiPSC-CM-Monoschicht ist für die Messung der Kontraktionsbewegung notwendig (Abbildung 2B). Eine repräsentative Spur der Kontraktions-Relaxationsbewegung von hiPSC-CMs ist in Abbildung 2C dargestellt. Die Analysesoftware ermöglicht die automatisierte Analyse von Kontraktions-Relaxations-Bewegungsspuren, indem Kontraktionsbeginn, Kontraktionsspitze, Kontraktionsende, Relaxationsspitze und Relaxationsende mit der Standardeinstellung erkannt werden (Abbildung 2D). Die Geschwindigkeiten von Kontraktions- und Relaxationspeaks werden verwendet, um die Kontraktions- und Relaxationskapazitäten von hiPSC-CMs zu bewerten. Darüber hinaus können auch Kontraktions- und Relaxationsverformungsabstände erhalten werden.

MEA-Assay ist die extrazelluläre Aufzeichnung von Aktionspotentialen, bekannt als Feldpotentiale. Die erfolgreiche Messung von Feldpotentialen erfordert eine vollständige Abdeckung der hiPSC-CM-Monoschicht auf allen Elektroden in jeder Vertiefung der MEA-Platten (Abbildung 3C). Die von jeder Elektrode aufgezeichneten reifen Wellenformen müssen das Herzfeldpotential mit leicht identifizierbaren Eigenschaften widerspiegeln, wie in Abbildung 3D-F dargestellt. Die angegebenen Qualitätsstandards sind 1) die Baseline-Aktivität sollte ein spontanes Schlagen innerhalb von 20-90 Schlägen pro Minute zeigen, 2) die Schlagrate sollte innerhalb von 6 SDs liegen, die für die Baseline-Schlagrate auf allen Bohrlöchern berechnet wurden, 3) der Variationskoeffizient der Schlagperiode sollte weniger als 5% betragen und 4) die Depolarisationsamplitude sollte über 0,3 mV liegen, Wie bereits veröffentlicht22. Abbildung 3E zeigt repräsentative Feldpotentialspuren von hiPSC-CMs. Die Navigator-Software erkennt und identifiziert Beats und FPD automatisch. Nach der Analyse können Schlagperiode, FPD und Spikeamplitude erhalten werden (Abbildung 3F). Insbesondere wird die Schlagperiode durch das depolarisierende Spitze-zu-Spitze-Intervall bestimmt, FPD wird durch das Intervall zwischen depolarisierendem Peak und Repolarisationspeak bestimmt und die Spike-Amplitude wird durch den Abstand zwischen dem depolarisierenden positiven Peak und dem negativen Peak gemessen, wie in Abbildung 3F gezeigt.

Einzelzell-Patchklemmen sind der Goldstandard für die Beurteilung der elektrophysiologischen Eigenschaften von hiPSC-CMs (Abbildung 4B). Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen im Stromklemmmodus können die spontanen Aktionspotentiale einzelner hiPSC-CMs erfassen (Abbildung 4F). Nach der Analyse können mehrere Parameter, einschließlich Amplitude, maximales diastolisches Potential (MDP) und Aktionspotentialdauer (APD) bei 30%, 50% und 90% Repolarisation erhalten werden (Abbildung 4G).

Für die Ca2+ Bildgebung können Fluoreszenzintensitätsänderungen einzelner hiPSC-CMs über die Zeit von der Software aufgezeichnet werden. Ein repräsentativer Bereich der Fura-2-geladenen hiPSC-CMs ist in Abbildung 5B dargestellt. Die Verwendung einer ultraschnellen wellenlängenumschaltenden Lichtquelle ermöglicht die Aufnahme von Ca2+ Transienten von Hunderten von hiPSC-CMs mittels Frame-Mode-Scanning. Nach der Analyse durch ein tabellenbasiertes Programm23 kann das F340/F380-Verhältnis über die Zeit für jede Zelle erhalten werden. Dann können rohe Spuren stimulierter Ca2+ Transienten aufgetragen werden (Abbildung 5C). Zusätzlich können Parameter wie Amplitude, diastolisches Ca 2+ und Ca2+ Zerfallstau erhalten werden (Abbildung 5D).

Figure 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung des Protokolls. An Tag 0 werden die hiPSC-CMs auf mit Basalmembranmatrix beschichteten 96-Well-Platten/48-Well-MEA-Platten/35-mm-Schalen/Zellkammern aufgeschlossen und ausgesät. Warten Sie eine Erholungsphase von mindestens 10 Tagen, bevor Sie die funktionellen Assays mit einem Cell Motion Imaging-System, MEA, Patch-Clamp und Ca2+ Bildgebungssystem durchführen. Abkürzungen: MEA = microelectrode array. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2. Messung der Kontraktionsbewegung. (A) Das Cell Motion Imaging System. (B) Eine repräsentative Region der hiPSC-CM-Monoschicht. Maßstabsbalken: 20 μm. (C) Repräsentative Kontraktionsrelaxationsspuren von hiPSC-CMs. (D) Schematische Darstellung einer Kontraktions-Relax-Spur, die den Kontraktionsbeginn, die Kontraktionsspitze, das Kontraktionsende, die Relaxationsspitze und das Relaxationsende zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3. Messung des Feldpotentials. (A) Draufsicht (links) einer 48-Well-MEA-Platte, (mittlerer) Vertiefung mit 16 Elektroden und (rechts) des Bereichs, den ein Basalmembran-Matrix-Tröpfchen abdecken muss. Fügen Sie ausreichend destilliertes Wasser in das Wasserreservoir hinzu, um die Verdunstung auszugleichen. (B) hiPSC-CM-Suspension und die gewünschte Dichte nach dem Umplattieren. (C) Eine repräsentative Region der hiPSC-CM-Monoschicht. (D) Kontinuierliche Wellenformdiagramme der 16 Elektroden in einer Vertiefung der 48-Well-MEA-Platte. (E) Repräsentative Feldspuren von hiPSC-CM. (F) Schematische Darstellung einer Feldpotentialspur, die zeigt, wie die Parameter analysiert wurden. Abkürzung: FPD = Feldpotentialdauer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4. Messung des Aktionspotentials. (A) Matrixbeschichtung der Basalmembran und Platzierung der HiPSC-CM-Aufhängung auf 35-mm-Schalen. (B) Eine repräsentative Region einzelner hiPSC-CM. Maßstabsleiste: 20 μm. (C-E) Patch-Clamp-System-Setup. (F) Repräsentative Aktion Potenzielle Spuren von hiPSC-CM. (G) Schematische Darstellung einer Aktionspotentialspur, die zeigt, wie die Parameter analysiert wurden. Abkürzungen: APD = Aktionspotentialdauer, MDP = maximales diastolisches Potential. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5. Messung von Ca2+ transient. (A) Das Bildgebungssystem Ca2+ . (B) Eine repräsentative Region von Fura-2-geladenen einzelnen hiPSC-CMs. Maßstabsbalken: 100 μm. (C) Repräsentative Ca2+ transiente Spuren von hiPSC-CMs. (D) Schematische Darstellung einer transienten Ca2+ -Spur, die zeigt, wie die Parameter analysiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Die humane iPSC-Technologie hat sich zu einer leistungsstarken Plattform für die Krankheitsmodellierung und das Arzneimittelscreening entwickelt. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der hiPSC-CM-Kontraktilität, des Feldpotentials, des Aktionspotentials und des Ca2+-Transienten. Dieses Protokoll bietet eine umfassende Charakterisierung der hiPSC-CM-Kontraktilität und Elektrophysiologie. Diese funktionellen Assays wurden in mehreren Publikationen unserer Gruppe 12,13,18,24,25,26,27 angewendet.

Es ist wichtig, die hiPSC-CMs zu verwenden, die sich in guten Schlagbedingungen befinden, da sonst das Signal-Rausch-Verhältnis der Anzeigen dramatisch sinkt. Darüber hinaus ist es wünschenswert, die hohe Reinheit der hiPSC-CMs vor den Messungen sicherzustellen. Die Existenz von Nicht-Kardiomyozyten könnte insbesondere die Datengenauigkeit von Kontraktionsbewegungs- und Feldpotentialmessungen beeinträchtigen, die beide die Bildung einer hiPSC-CM-Monoschicht erfordern. Darüber hinaus ist die Unausgereiftheit der hiPSC-CM nach wie vor ein großes Problem, das die vollständige Anwendung von hiPSC-CM in verschiedenen Bereichen behindert28. Es ist bekannt, dass hiPSC-CMs in vielerlei Hinsicht funktionell unreif sind, einschließlich Morphologie, Kontraktilität, Elektrophysiologie, Ca 2+ Handhabung und Metabolismus29. Daher wird empfohlen, die hiPSC-CMs mindestens bis zum 30. Tag in der Kultur zu halten, bevor funktionelle Assays durchgeführt werden. Alternativ können verschiedene Strategien, die zur Verbesserung der Reife von hiPSC-CMs etabliert wurden, vor der Durchführung der funktionellen Assays30 angewendet werden. Zum Beispiel zeigten die in metabolischen Reifungsmedien kultivierten hiPSC-CMs im Vergleich zu den in normalen RPMI-Medien kultivierten hiPSC-CMs ein stark negatives MDP der Aktionspotentiale und einen signifikant schnelleren Zerfall von Ca2+ -Transienten31. Schließlich gibt es Chargenvariationen von hiPSC-CMs32 von Charge zu Charge. Daher sollten Daten über hiPSC-CMs erhoben werden, die aus mindestens drei unabhängigen Differenzierungen derselben iPSC-Linien generiert wurden.

Das Cell Motion Imaging-System bietet einen hohen Durchsatz und eine effiziente Plattform zur Messung der Kontraktions- und Relaxationsbewegung von hiPSC-CMs. Ein großer Nachteil ist jedoch, dass es nicht die direkte Kontraktionskraft misst, sondern die Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeit. Darüber hinaus variieren die Geschwindigkeiten, wenn die Anzahl der hiPSC-CMs zur Bildung einer Monoschicht unterschiedlich ist. Daher ist es entscheidend, genau 50.000 Zellen in jeder Vertiefung der 96-Well-Platten zu säen.

FPD, gemessen durch MEA, wurde als Surrogat für die QT-Dauer verwendet und wird daher häufig bei der Beurteilung der medikamenteninduzierten QT-Verlängerung verwendet33. Ähnlich wie bei der QT-Dauer ist FPD von der Geschwindigkeit abhängig. Daher ist die Korrektur der Schlagrate notwendig, um die FPD-Daten genau zu interpretieren. In diesem Protokoll wird empfohlen, dass die MEA-Messung mindestens 10 Tage nach der Beschichtung durchgeführt wird. Manchmal ist es jedoch möglich, dass das Feldpotentialsignal nach 10 Tagen nach der Beschichtung immer noch instabil ist. Wenn dies geschieht, verlängern Sie die hiPSC-CM-Kultur um weitere 2-3 Tage.

Die Patch-Clamp-Technik ist ein vielseitiges Werkzeug zur Beurteilung der Elektrophysiologie von hiPSC-CMs und zur Bestimmung von Ionenkanälen. Der Hauptnachteil der herkömmlichen Patchklemme ist ihre geringe Durchsatzeigenschaft, die ihre Anwendung in Hochdurchsatzstudien behindert. Darüber hinaus erfordert es eine lange Lernkurve und umfangreiche Übung, bevor man Erfahrung in dieser Technik sammeln kann. Die konventionelle Patch-Clamp-Technik gilt jedoch immer noch als Goldstandard, um die Elektrophysiologie von hiPSC-CMs zu verstehen. Wenn der APD von hiPSC-CMs mit hohem Durchsatz bewertet werden soll, wird auch empfohlen, mit der optischen Abbildung des hiPSC-CM-Aktionspotentials unter Verwendung des beschleunigten Sensors der Aktionspotentiale 2 (ASAP2)21 zu beginnen. Nachdem primäre Ziele erreicht wurden, kann ein konventionelles Aktionspotential in weiteren Studien für eine genauere Phänotypisierung und Validierung verwendet werden. Darüber hinaus wird die automatisierte Patchklemme zunehmend in verschiedenen Bereichen, insbesondere in der Kanalopathie, eingesetzt. Zum Beispiel wurden die Ionenkanalströme, die von mehreren Varianten von hERG-Kanälen und spannungsgesteuerten Natriumkanälen getragen werden, durch die automatisierte Patchklemme34,35,36,37 charakterisiert. Darüber hinaus wurde kürzlich die Verwendung von automatisierten Patchklemmen in hiPSC-CMs etabliert38,39. Für die Ausführung automatisierter Patchklemmen können Lesegeräte auf zuvor veröffentlichte Protokolle40 zurückgreifen. Mit den Vorteilen des hohen Durchsatzes und der Einfachheit in der Maschinenhandhabung besteht kein Zweifel, dass automatisierte Patchklemmen eine immer wichtigere Rolle in der Wirkstoffforschung und -entwicklung spielen werden.

Die Verwendung eines ratiometrischen Ca 2+-sensitiven Farbstoffs, Fura-2, ermöglicht es, dass die Messung von diastolischem Ca2+ von hiPSC-CMs viel weniger von den experimentellen Bias-Faktoren wie Farbstoffladezeit, ungleichmäßiger Farbstoffverteilung und Photobleiche beeinflusst wird. Dies ist wichtig, um die diastolische Dysfunktion bestimmter Herzerkrankungen zu rekapitulieren. Die Haupteinschränkung besteht darin, dass eine UV-Anregungslichtquelle erforderlich ist, die möglicherweise nicht mit der konfokalen Mikroskopie kompatibel ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kardiotoxizität trotz der jüngsten Fortschritte bei der Bewertung der Kardiotoxizität in der präklinischen Phase der Arzneimittelentwicklung nach wie vor eines der größten Sicherheitsbedenken darstellt. Die zunehmende Einbeziehung von hiPSC-CMs in den standardmäßigen präklinischen Sicherheitsbewertungsprozess hat das Potenzial, die Genauigkeit der Toxizitätsvorhersage von Kandidatenverbindungen zu verbessern. Darüber hinaus ermöglichen patientenspezifische hiPSC-CMs eine personalisierte kardiale Arzneimittelauswahl und die Vorhersage unerwünschter Arzneimittelreaktionen. Das hier beschriebene Protokoll mit verschiedenen funktionellen Assays wird dazu beitragen, die Anwendungen von hiPSC-CMs im Arzneimittelscreening und in der Krankheitsmodellierung zu erweitern.

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Disclosures

J.C.W. ist Mitbegründer von Greenstone Biosciences, hat aber keine Interessenkonflikte, da die hier vorgestellte Arbeit völlig unabhängig ist. Die anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Wir danken Blake Wu für das Korrekturlesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 und NASA NNX16A069A (JCW) und AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis D35-20-1.5-N Patch clamp
50x B27 supplements Life Technologies 17504-044 hiPSC-CM culture medium
6-well culture plate E & K Scientific EK-27160 hiPSC-CM culture
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates Corning 3603 Contraction motion measurement
Accutase Sigma-Aldrich A6964 Enzymatic dissociation
Axion's Integrated Studio (AxIS) Axion Biosystems navigator software
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus BF 100-50-10, Patch clamp
CaCl2 1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115 Tyrode’s solution
Cell counting chamber slides ThermoFisher Scientific C10228 Cell counting
CytoView 48-well MEA plates Axion Biosystems M768-tMEA-48B MEA
DMEM/F12 Gibco/Life Technologies 12634028 Extracellular matrix medium
DPBS, no calcium, no magnesium Fisher Scientific 14-190-250
EGTA Sigma-Aldrich E3889 Intracellular pipette solution
EPC 10 USB patch clamp amplifier Warner Instruments 89-5000 Patch clamp
Fura-2, AM, cell permeant ThermoFisher Scientific F1221 Ca2+ transient measurement
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Tyrode’s solution
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Tyrode’s solution
hiPSCs Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl Sigma-Aldrich 529552 Tyrode’s solution
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher Scientific 10828-028 hiPSC-CM seeding medium
KOH 8 M Sigma-Aldrich P4494 Intracellular pipette solution
Lambda DG 4 Sutter Instrument Company Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source
Luna-FL automated fluorescence cell counter WISBIOMED LB-L20001 Cell counting
Maestro Pro MEA system Axion Biosystems MEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 356231 Extracellular matrix medium
MgATP Sigma-Aldrich A9187 Intracellular pipette solution
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Tyrode’s solution
NaCl Sigma-Aldrich S9888 Tyrode’s solution
NaOH 10 M Sigma-Aldrich 72068 Tyrode’s solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) ThermoFisher Scientific P3000MP Ca2+ transient measurement
RPMI 1640 medium Life Technologies 11875-119 hiPSC-CM culture medium
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System Sony Biotechnology Contraction motion measurement
Sutter Micropipette puller Sutter Instruments P-97 Patch clamp
Trypan blue stain Life Technologies T10282 Cell counting

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References

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Medizin Ausgabe 186
Technische Anwendungen von Mikroelektrodenarray- und Patch-Clamp-Aufnahmen an humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten
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