Summary
인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CM)는 약물 유도 심장 독성 스크리닝 및 질병 모델링을위한 유망한 시험관 내 모델로 부상했습니다. 여기에서는 hiPSC-CM의 수축성과 전기 생리학을 측정하기위한 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.
Abstract
약물 유발 심장 독성은 약물 소모 및 시장 철수의 주요 원인입니다. 따라서 적절한 전임상 심장 안전성 평가 모델을 사용하는 것은 약물 개발 과정에서 중요한 단계입니다. 현재 심장 안전성 평가는 여전히 동물 연구에 크게 의존하고 있습니다. 그러나 동물 모델은 종 특이적 차이, 특히 심장 전기생리학적 특성 측면에서 인간에 대한 열악한 번역 특이성에 시달리고 있습니다. 따라서, 전임상 심장 안전성 평가를 위한 신뢰할 수 있고, 효율적이며, 인간 기반 모델을 개발하는 것이 시급하다. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CM)는 약물 유도 심장 독성 스크리닝 및 질병 모델링을위한 귀중한 시험 관 내 모델로 부상했습니다. hiPSC-CM은 다양한 유전적 배경과 다양한 질병 상태를 가진 개인으로부터 얻을 수 있으므로 약물 유발 심장 독성을 개별적으로 평가하는 데 이상적인 대용물입니다. 따라서 hiPSC-CM의 기능적 특성을 종합적으로 조사할 수 있는 방법론을 수립할 필요가 있다. 이 프로토콜에서는 수축성, 전계 전위, 활동 전위 및 칼슘 처리 측정을 포함하여 hiPSC-CM에서 평가할 수 있는 다양한 기능 분석에 대해 자세히 설명합니다. 전반적으로 hiPSC-CM을 전임상 심장 안전성 평가에 통합하면 약물 개발에 혁명을 일으킬 잠재력이 있습니다.
Introduction
약물 개발은 길고 비용이 많이 드는 과정입니다. 2009년과 2018년 사이에 미국 식품의약국(FDA)에서 승인한 신약 치료에 대한 연구에 따르면 자본화된 연구 및 임상 시험의 예상 중간비용은 제품당 9억 8,500만 달러였습니다1. 약물 유발 심장 독성은 약물 소모 및 시장 철수의 주요 원인입니다2. 특히, 심장 독성은 여러 종류의 치료 약물3에서 보고됩니다. 따라서 심장 안전성 평가는 약물 개발 과정에서 중요한 구성 요소입니다. 심장 안전성 평가를위한 현재의 패러다임은 여전히 동물 모델에 크게 의존합니다. 그러나, 동물 모델의 사용으로부터의 종 차이는 인간 환자에서 약물 유도 심장 독성에 대한 부정확 한 예측의 주요 원인으로 점점 더 인식되고있다4. 예를 들어, 심장 활동 전위의 형태는 상이한 재분극 전류5로부터의 기여로 인해 인간과 마우스 사이에 실질적으로 다르다. 또한, 심장 생리학에 영향을 줄 수있는 심장 미오신 및 원형 RNA의 차등 이소 형은 종 6,7에서 잘 문서화되었습니다. 이러한 격차를 해소하려면 전임상 심장 안전성 평가를 위한 신뢰할 수 있고 효율적이며 인간 기반 모델을 구축하는 것이 필수적입니다.
유도만능줄기세포(iPSC) 기술의 획기적인 발명은 전례 없는 약물 스크리닝 및 질병 모델링 플랫폼을 생성했습니다. 지난 10 년 동안 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CM)를 생성하는 방법은 잘 확립되었습니다 8,9. hiPSC-CM은 질병 모델링, 약물 유발 심장 독성 스크리닝 및 정밀 의학에서의 잠재적 응용 분야에 큰 관심을 끌었습니다. 예를 들어, hiPSC-CM은 긴 QT 증후군 10, 비대성 심근 병증11,12 및 확장 성 심근 병증13,14,15와 같은 유전 적 유전에 의해 유발되는 심장 질환의 병리학 적 표현형을 모델링하는 데 활용되었습니다. 결과적으로 심장 질환의 발병 기전과 관련된 주요 신호 전달 경로가 확인되어 효과적인 치료를위한 잠재적 인 치료 전략을 밝힐 수 있습니다. 또한, hiPSC-CM은 독소루비신, 트라스투주맙 및 티로신 키나제 억제제16,17,18을 포함한 항암제와 관련된 약물 유도 심장 독성을 스크리닝하는 데 사용되었습니다. 결과적인 심장 독성을 완화하기위한 전략이 조사 중입니다. 마지막으로, hiPSC-CM에 보유 된 유전 정보는 개인 및 인구 수준19,20 모두에서 약물 유발 심장 독성의 스크리닝 및 예측을 가능하게합니다. 종합적으로 hiPSC-CM은 개인화된 심장 안전 예측을 위한 귀중한 도구임이 입증되었습니다.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 hiPSC-CM을 질병 모델링, 약물 유발 심장 독성 스크리닝 및 정밀 의학에 적용하는 데 매우 중요한 hiPSC-CM의 기능적 특성을 포괄적이고 효율적으로 조사하는 방법론을 수립하는 것입니다. 여기에서는 수축성, 전계 전위, 활동 전위 및 칼슘(Ca 2+) 처리 측정을 포함하여 hiPSC-CM의 기능적 특성을 평가하기 위한 일련의 기능 분석에 대해 자세히 설명합니다(그림 1).
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Protocol
1. 매체 및 용액 준비
- 50x B27 보충제 10mL 병과 RPMI 1640 배지 500mL를 혼합하여 hiPSC-CM 유지 배지를 준비합니다. 배지를 4 ° C에 보관하고 한 달 이내에 사용하십시오. 사용하기 전에 매체를 실온(RT)으로 평형화하십시오.
- 혈청 대체 배지 20mL와 hiPSC-CM 유지 배지 180mL(10% 희석, v/v)를 혼합하여 hiPSC-CM 파종 배지를 준비합니다. 신선하게 준비된 파종 배지가 선호되지만 4 ° C에서 2 주 이상 보관할 수 없습니다. 사용하기 전에 매체를 RT와 평형화하십시오.
- 4°C에서 하룻밤 동안 기저막 매트릭스 1병(10mL)을 해동하고 멸균된 1.5mL 튜브에서 기저막 매트릭스 500μL를 분취하여 세포외 매트릭스 코팅 용액을 준비합니다. 추가 사용을 위해 -20 °C에서 보관하십시오. 500μL의 기저막 매트릭스와 100mL의 얼음처럼 차가운 DMEM/F12 배지(1:200 희석, v/v)를 혼합하여 기저막 매트릭스 코팅 용액을 만듭니다.
- 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mMCaCl2, 5 mM 포도당 및 10 mM 헤페스를 포함하는 50 mL의 티로드 용액을 준비합니다. NaOH로 pH를 7.4로 조정하십시오. 실험 당일 신선한 Tyrode의 솔루션을 준비하십시오.
- 120 mM KCl, 1 mMMgCl2, 10 mM EGTA 및 10 mM hepes를 포함하는 50 mL의 세포내 피펫 용액을 준비합니다. KOH로 pH를 7.2로 조정합니다. 세포 내 피펫 용액을 멸균 5mL 튜브에 분취하여 -20°C에서 보관합니다. 실험 당일, 용액에 MgATP를 신선하게 첨가하여 3mM의 최종 농도를 달성한다.
- 2 μM Fura-2 AM 및 0.1% 플루로닉 F-127을 포함하는 Fura-2 AM 로딩 용액 1 mL를 준비합니다. 실험 당일에 신선한 로딩 용액을 준비하고 빛으로부터 보호하십시오.
2. hiPSC-CM 수축 운동 측정
- 96웰 플레이트의 각 웰에 100μL의 세포외 매트릭스 코팅 용액을 추가하여 기저막 매트릭스 코팅 플레이트를 준비합니다. 96-웰 플레이트를 37°C, 5%CO2 의 가습 세포 배양 인큐베이터에서 밤새 배양한다.
- hiPSC-CM의 효소 해리
- Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html)에 hiPSC를 요청하십시오. 이전 간행물 8,9에 따라 hiPSC-CM을 생성합니다. 6웰 플레이트에서 배양된 hiPSC-CM을 10배 배율로 현미경으로 관찰합니다.
알림: 세포가 여전히 증식 중일 때 세포를 분리하지 마십시오. 그렇지 않으면, 세포는 재 도금 후 웰에서 과도하게 자라서 기능 분석의 부정확 한 결과를 초래합니다. 일반적으로 hiPSC-CM은 18-23 일에 증식을 멈 춥니 다. - hiPSC-CM이 강하게 뛰고 순도가 95% 이상인지 확인하십시오. 심근 세포의 특정 마커인 심장 트로포 닌 T에 대한 면역 염색으로 순도를 평가하십시오 8,9.
- 유지 배지를 흡인하고 1x DPBS로 세포를 두 번 세척합니다. 6웰 플레이트의 각 웰에 세포 분리 용액 1mL를 추가하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
알림: 잠복기는 정기적으로 모니터링해야합니다. 세포를 과도하게 소화하면 세포 생존력이 감소하므로 절대 소화하지 마십시오. - 5mL 피펫을 사용하여 hiPSC-CM을 위아래로 여러 번 부드럽게 피펫팅하여 단일 셀 현탁액을 생성합니다. 동일한 부피의 hiPSC-CMs 파종 배지를 추가하여 세포 분리 용액을 중화합니다.
- RT에서 3분 동안 hiPSC-CM을 300 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 세포 펠릿을 1-2mL의 hiPSC-CM 파종 배지에 재현탁합니다.
- 트리판 블루 배제 방법을 사용하여 세포 밀도와 생존율을 정량화합니다. 간략하게, 10 μL의 세포 현탁액을 동일한 부피의 트리판 블루와 혼합하고, 세포 계수 슬라이드로 옮긴 다음, 앞서 기술된 바와 같이 세포 계수기를 사용하여 계수한다21.
- Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html)에 hiPSC를 요청하십시오. 이전 간행물 8,9에 따라 hiPSC-CM을 생성합니다. 6웰 플레이트에서 배양된 hiPSC-CM을 10배 배율로 현미경으로 관찰합니다.
- hiPSC-CM 시드
- 세포외 매트릭스 코팅 용액을 96-웰 플레이트로부터 제거한다.
- 100 μL의 hiPSC-CM 시딩 배지에 웰당 50,000개의 세포를 시드하고, 96-웰 플레이트를 37°C, 5%CO2 의 가습 세포 배양 인큐베이터에 밤새 넣었다.
- 도말 1일 후 hiPSC-CM 파종 배지를 hiPSC-CM 유지 배지 100μL로 교체합니다. 녹화할 때까지 2일마다 hiPSC-CM 유지 관리 매체를 교체하십시오.
- 데이터 수집
- 도금 후 최소 10일 후에 hiPSC-CM 수축 동작을 측정합니다(권장).
- 온도 컨트롤러를 켜고 37 ° C를 기본 온도로 설정하십시오. 현미경, 카메라 및 CO2 공급 장치를 켭니다.
- 플레이트 홀더의 워터 재킷을 적절한 양의 멸균 탈이온수로 채웁니다(그림 2A). 96웰 플레이트를 플레이트 홀더에 놓고 세포가 최소 5분 동안 적응하도록 합니다.
- 보기 소프트웨어를 열고 카메라 프레임 속도를 75fps(초당 프레임)로 설정하고 비디오/이미지 해상도를 1024 × 1024픽셀로 설정합니다. 자동 초점 및 자동 밝기 기능을 적용합니다. hiPSC-CM의 비디오 및 이미지를 녹화합니다.
알림: 기록 중 현미경 테이블의 진동을 피하십시오. - 자동 분석을 위해 분석기 소프트웨어를 엽니다.
3. hiPSC-CM 전위 측정
- 기저막 매트릭스 코팅판의 제조
- 8μL 방울의 세포외 매트릭스 코팅 용액을 48웰 미세 전극 어레이(MEA) 플레이트의 각 웰의 기록 전극 영역에 조심스럽게 놓습니다. 액적 배치를 위한 적절한 전극 영역에 대해서는 그림 3A 를 참조하십시오. 이 단계는 hiPSC-CM 단층을 전극에 집중시키는 데 중요합니다. 어떤 상황에서도 전극을 만지지 마십시오.
- 코팅 용액 증발을 방지하기 위해 3-well MEA 플레이트의 웰 주변 영역(그림 48A)에 멸균 탈이온수 3mL를 추가합니다. 48-웰 MEA 플레이트를 37°C, 5%CO2 의 가습 세포 배양 인큐베이터에서 45-60분 동안 배양합니다.
알림: 기저막 매트릭스가 마르지 않도록 너무 오래 배양하지 마십시오.
- 단계 2.2에 설명된 대로 hiPSC-CM의 효소적 해리를 수행합니다.
- hiPSC-CM 시드
- 동일한 단일 행 또는 컬럼 내에서 200 μL 피펫 팁을 사용하여 전극을 건드리지 않고 웰 표면으로부터 대부분의 세포외 매트릭스 배지를 제거한다.
- 동일한 행 또는 컬럼의 각 웰의 기록 전극 면적에 걸쳐 8μL hiPSC-CM 시딩 배지 액적에 웰당 50,000개의 세포를 시드합니다.
- 모든 웰이 셀로 도금 될 때까지 마지막 두 단계를 반복합니다. 현미경으로 모든 웰에 hiPSC-CM 현탁액이 있는지 확인하십시오. 원하는 밀도는 그림 3B를 참조하십시오.
참고: 기저막 매트릭스가 완전히 건조되면 hiPSC-CM의 부착이 손상되어 세포 부착이 최적이 아닙니다. - 48-웰 MEA 플레이트를 37°C, 5%CO2 의 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 60분 동안 인큐베이션한다.
- 150-웰 MEA 플레이트의 각 웰에 48μL의 hiPSC-CM 파종 배지를 천천히 부드럽게 추가합니다. 이전에 시드된 hiPSC-CM을 분산시키지 않고 배지를 추가하려면 플레이트를 45° 각도로 잡고 피펫 팁을 각 웰의 벽에 기대고 배지를 천천히 놓습니다.
알림: 배지를 너무 빨리 또는 고압으로 추가하면 부착된 심근 세포가 제거됩니다. hiPSC-CM 드롭 서스펜션과의 직접적인 접촉을 피하십시오. - 48-웰 MEA 플레이트를 37°C, 5%CO2 의 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션한다.
- 도말 1일 후 hiPSC-CM 유지 배지 300μL로 hiPSC-CM 파종 배지를 새로 고칩니다. 녹화하기 전에 2일마다 hiPSC-CM 유지 관리 매체를 교체하십시오.
- 데이터 수집
- 도금 후 최소 10일 후에 MEA 측정을 수행하십시오(권장). 도금 후 10일째에 10배 배율로 현미경으로 자발적 박동 hiPSC-CM 단층의 밀도를 확인하며, 이는 그림 3C와 같아야 합니다.
- 48웰 MEA 플레이트를 녹음기에 놓습니다. 터치 스크린은 온도 (37 °C) 및CO2 (5 %) 상태를 관찰 할 수있게합니다.
- 네비게이터 소프트웨어를 엽니다. 실험 설정 창에서 심장 실시간 구성 및 현장 전위 기록을 선택합니다. 자발적 또는 속도별 박동 구성을 적용합니다.
- 비트 감지 파라미터에서 감지 임계값을 300μV로, 최소 박동 기간을 250ms로, 최대 박동 기간을 5초로 설정합니다. FPD(필드 전위 기간) 계산을 위해 다항식 회귀를 선택합니다.
- 기준 전기 활동 신호가 성숙하고 안정적인지 확인하십시오.
알림: 멀티 웰 MEA 플레이트의 각 전극에 의해 기록 된 성숙한 파형은 그림 3D-F와 같이 심장 탈분극 스파이크 및 재분극 단계와 일치하는 쉽게 식별 할 수있는 특성을 가진 심장 전위를 반영해야합니다. - 1-3 분 동안 기준선 심장 활동을 획득하십시오. 약물 치료가 필요한 경우 기준선 기록 후 웰에 화합물을 추가하십시오. 다음 녹음 전에 플레이트를 인큐베이터에 최소 30분 동안 두십시오.
4. hiPSC-CM 활동 전위 측정
- 35mm 접시의 유리 바닥 부분에 500μL의 세포외 매트릭스 코팅 용액을 놓아 기저막 매트릭스 코팅 접시를 준비합니다(그림 4A). 35 mm 디쉬를 37°C, 5%CO2 의 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션한다.
- 단계 2.2에 설명된 대로 hiPSC-CM의 효소적 해리를 수행합니다.
- hiPSC-CM 시드
- 35mm 접시에서 세포외 매트릭스 코팅 용액을 제거합니다. 35mm 접시의 유리 바닥 부분에 500μL의 hiPSC-CM 파종 배지에 웰당 50,000개의 세포를 시드합니다.
- 35 mm 디쉬를 37°C, 5%CO2 의 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션한다. hiPSC-CM 시드 배지를 제거하고 2mL의 hiPSC-CM 유지 배지를 35mm 접시에 추가합니다.
알림: 세포가 닿지 않도록 사용한 배지를 제거하기 위해 2mL 흡인 피펫 위에 200μL의 여과되지 않은 팁을 두는 것이 좋습니다. - 기록 전에 2일마다 hiPSC-CM 배양 배지를 교체하십시오.
- 데이터 수집
- 도금 후 최소 10일 후에 활동 전위 측정을 수행하십시오(권장). 1.4 단계에서 설명한대로 신선한 Tyrode의 솔루션을 준비하십시오. 세포 내 피펫 용액의 1 분취량을 해동하고 MgATP를 최종 농도 3mM로 신선하게 첨가한다.
- 마이크로피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관에서 마이크로피펫을 당깁니다.
참고: 마이크로피펫의 2-5MΩ의 저항이 선호됩니다. - hiPSC-CM 유지 배지를 Tyrode의 용액으로 교체하고 세포가 Tyrode의 용액에 15분 동안 적응하도록 합니다(그림 4C). 온도 센서를 챔버에 삽입하고 그림 4C와 같이 35mm 접시를 챔버에 넣고 온도를 37° C로 조정합니다(그림 4D).
- 마이크로피펫에 세포 내 용액을 채우고 패치 클램프 증폭기 헤드스테이지에 연결된 홀더에 삽입합니다(그림 4E). 자극/획득 소프트웨어를 열고 활동 전위 기록 프로토콜을 로드한 다음 전압 클램프 구성을 선택합니다.
- 마이크로피펫을 수조 용액에 삽입하고 적절한 단일 hiPSC-CM을 선택한 다음 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 선택한 셀 옆의 마이크로피펫 위치를 조정하고 내립니다. 피펫 팁을 수조 용액에 삽입할 때 오실로스코프 모니터에서 관찰할 수 있는 피펫 저항을 확인하십시오.
- 피펫을 셀 가까이에 놓으면 전류 펄스가 약간 감소하여 증가하는 밀봉 저항을 반영합니다. 저항을 높이기 위해 음압으로 부드럽게 흡입하면 기가 씰이 형성됩니다. 씰 기능을 적용합니다.
- 추가 흡입을 적용하여 멤브레인을 깨뜨려 전체 셀 기록 구성을 얻습니다. 피펫 영역 내의 막 부분이 흡입에 의해 파열되면 내부 용액은 세포질과 평형을 이룹니다. 이 시점에서 전압 클램프 모드(V-클램프)에서 전류 클램프 모드 또는 전류 주입 없음(C-클램프)으로 전환합니다.amp 대화 상자. 기록 버튼을 눌러 작업 전위 기록 파일을 생성하고 저장합니다.
알림: 모드 변경은 트리거 및 자극 기록 프로토콜을 통해 hiPSC-CM의 자발적 활동 전위를 지속적으로 기록하며, 이는 패치 클램프 증폭기의 V-mon 출력에서 모니터링할 수 있습니다.
5. hiPSC-CMCa2+ 과도 측정
- Ca 2+ 이미징 21을 위한 맞춤형 세포 챔버를 준비하기 위한 이전 프로토콜을 참조하십시오. 기저막 매트릭스 코팅 세포 챔버의 제조를 위해, 200 μL의 세포외 매트릭스 코팅 용액을 세포 챔버에 넣는다. 세포를 37°C, 5%CO2의 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 밤새 배양한다.
- 단계 2.2에 설명된 대로 hiPSC-CM의 효소적 해리를 수행합니다.
- hiPSC-CM 시드
- 세포외 매트릭스 코팅 용액을 세포 챔버로부터 제거한다. 200μL의 hiPSC-CM 파종 배지에 웰당 20,000개의 세포를 시드합니다.
- 도말 1일 후 hiPSC-CM 시딩 배지를 200μL의 hiPSC-CM 유지 배지로 교체합니다. 녹화하기 전에 2일마다 hiPSC-CM 유지 관리 매체를 교체하십시오.
- 데이터 수집
- 도금 후 최소 10일 후에 Ca2+ 과도 측정을 수행합니다(권장). 1.4 단계에서 설명한대로 신선한 Tyrode의 솔루션을 준비하십시오. 2단계에 설명된 대로 신선한 Fura-1.6AM 로딩 용액을 준비합니다.
- hiPSC-CM 유지 매체를 흡인하고 Tyrode의 용액으로 두 번 세척하십시오. 100μL의 Fura-2AM 로딩 용액을 적용하고 RT에서 10분 동안 배양합니다.
- Fura-2 AM 로딩 용액을 Tyrode의 용액으로 교체하고 Fura-2 AM의 완전한 탈에스테르화를 위해 최소 5분 동안 기다립니다.
- 40x 오일 이멀젼 대물렌즈(0.95 NA)가 장착된 도립 에피형광 현미경의 40x 대물렌즈에 액침 오일 한 방울을 추가합니다. 세포 챔버를 현미경의 스테이지 어댑터에 놓습니다(그림 5A).
- 온도 컨트롤러 와이어를 욕조 챔버에 설치하고 37 ° C로 설정하십시오. 전기장 자극 전극을 설치하고 펄스를 0.5ms의 지속 시간으로 20Hz로 설정합니다.
- 초고속 파장 전환 광원을 켜고 기기의 지침에 따라 340nm 및 380nm 고속 전환 모드로 설정하십시오.
- 두 파장에 대해 20ms의 노출 시간과 소프트웨어에서 20초의 기록 시간을 적용합니다. hiPSC-CM에서 과도 상태의 Ca2+ 실시간 변화를 반영하는 비디오를 녹화합니다. 데이터를 스프레드시트로 내보내고 앞서 설명한 대로 데이터를 분석합니다23.
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Representative Results
이 프로토콜은 hiPSC-CM의 수축 운동, 전계자전위, 활동전위 및Ca 2+ 과도 상태를 측정하는 방법을 설명합니다. 효소 소화, 세포 파종, 유지 및 기능 분석 전도를 포함하는 개략도가 그림 1에 나와 있습니다. hiPSC-CM 단층의 형성은 수축 운동 측정에 필요합니다(그림 2B). hiPSC-CM의 수축-이완 운동의 대표적인 흔적이 그림 2C에 나와 있습니다. 분석기 소프트웨어를 사용하면 기본 설정을 사용하여 수축 시작, 수축 피크, 수축 종료, 이완 피크 및 이완 종료를 감지하여 자동화된 방식으로 수축-완화 동작 추적을 분석할 수 있습니다(그림 2D). 수축 및 이완 피크의 속도는 hiPSC-CM의 수축 및 이완 능력을 평가하는 데 사용됩니다. 또한, 수축 및 이완 변형 거리도 얻을 수있다.
MEA 분석은 전위로 알려진 활동 전위의 세포 외 기록입니다. 전위를 성공적으로 측정하려면 MEA 플레이트의 각 웰 내에 있는 모든 전극에서 hiPSC-CM 단층을 완전히 커버해야 합니다(그림 3C). 각 전극에 의해 기록 된 성숙 파형은 그림 3D-F와 같이 쉽게 식별 할 수있는 특성을 가진 심장 전위를 반영해야합니다. 지정된 품질 표준은 1) 기준선 활동이 분당 20-90 비트 내에서 자발적인 박동을 나타내야 하고, 2) 박동 속도는 모든 웰에서 기준 박동 속도에 대해 계산된 6 SD 이내여야 하고, 3) 박동 기간의 변동 계수는 5% 미만이어야 하고, 4) 탈분극 진폭은 0.3mV 이상이어야 하며, 이전에 게시 된 바와 같이22. 그림 3E는 hiPSC-CM의 대표적인 전위 트레이스를 보여줍니다. 네비게이터 소프트웨어는 비트와 FPD를 자동으로 감지하고 식별합니다. 분석 후 비트 주기, FPD 및 스파이크 진폭을 얻을 수 있습니다(그림 3F). 구체적으로, 비트 주기는 탈분극 피크 대 피크 간격에 의해 결정되고, FPD는 탈분극 피크와 재분극 피크 사이의 간격에 의해 결정되며, 스파이크 진폭은 도 3F에 도시된 바와 같이 탈분극 포지티브 피크와 네거티브 피크 사이의 거리에 의해 측정된다.
단일 셀 패치 클램프는 hiPSC-CM의 전기생리학적 특성을 평가하기 위한 황금 표준입니다(그림 4B). 전류 클램핑 모드의 전체 셀 패치 클램프 기록은 단일 hiPSC-CM의 자발적 활동 전위를 기록할 수 있습니다(그림 4F). 분석 후 30%, 50% 및 90% 재분극에서 진폭, 최대 이완기 전위(MDP) 및 활동 전위 지속 시간(APD)을 포함한 여러 매개변수를 얻을 수 있습니다(그림 4G).
Ca2+ 이미징의 경우 시간 경과에 따른 개별 hiPSC-CM의 형광 강도 변화를 소프트웨어로 기록할 수 있습니다. Fura-2 로딩 hiPSC-CM의 대표적인 영역이 그림 5B에 나와 있습니다. 초고속 파장 전환 광원을 사용하면 프레임 모드 스캐닝을 통해 수백 개의 hiPSC-CM에서 Ca2+ 과도 상태를 기록할 수 있습니다. 스프레드시트 기반 프로그램(23)에 의한 분석 후에, 각 셀에 대한 시간에 따른 F340/F380 비율이 얻어질 수 있다. 그런 다음 자극 된Ca 2+ 과도 현상의 원시 흔적을 플롯 할 수 있습니다 (그림 5C). 또한 진폭, 이완기 Ca2+ 및Ca2+ 붕괴 타우와 같은 파라미터를 얻을 수 있습니다(그림 5D).
그림 1. 프로토콜의 전체 회로도. 0일째에 hiPSC-CM을 기저막 매트릭스 코팅된 96웰 플레이트/48웰 MEA 플레이트/35mm 접시/셀 챔버에서 분해하고 시드합니다. 세포 운동 이미징 시스템, MEA, 패치 클램프 및Ca2+ 이미징 시스템을 사용하여 기능 분석을 수행하기 전에 최소 10일의 회복 기간을 허용한다. 약어 : MEA = 미세 전극 어레이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 수축 운동 측정. (a) 세포 운동 이미징 시스템. (b) hiPSC-CM 단분자층의 대표적인 영역. 스케일 바 : 20 μm. (C) hiPSC-CM의 대표적인 수축-이완 흔적. (d) 수축 개시, 수축 피크, 수축 종료, 이완 피크 및 이완 종료를 나타내는 수축-이완 트레이스의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 전계 전위 측정. (A) 48웰 MEA 플레이트(왼쪽), 16개의 전극이 있는 웰 1개, (오른쪽) 기저막 매트릭스 액적이 덮어야 하는 영역의 평면도. 증발을 보충하기 위해 물통에 충분한 증류수를 추가하십시오. (b) hiPSC-CM 현탁액 및 재도금 후 원하는 밀도. (c) hiPSC-CM 단층의 대표적인 영역. (D) 48웰 MEA 플레이트의 한 웰에 있는 16개의 전극에서 나오는 연속 파형 플롯. (E) hiPSC-CM의 대표적인 필드 전위 트레이스. (F) 파라미터가 어떻게 분석되었는지 보여주는 필드 전위 추적의 개략도. 약어: FPD = 필드 전위 기간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 활동 전위 측정. (A) 35mm 접시에 기저막 매트릭스 코팅 및 hiPSC-CMs 서스펜션 배치. (B) 단일 hiPSC-CM의 대표적인 영역. 스케일 바: 20 μm. (C-E) 패치 클램프 시스템 설정. (F) hiPSC-CM의 대표적인 작용 전위 흔적. (G) 매개 변수가 어떻게 분석되었는지 보여주는 활동 전위 추적의 개략도. 약어 : APD = 활동 전위 기간, MDP = 최대 이완기 전위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. Ca2+ 과도 측정. (A) Ca2+ 이미징 시스템. (B) Fura-2 로딩 단일 hiPSC-CM의 대표적인 영역. 스케일 바: 100 μm. (C) hiPSC-CM의 대표적인Ca 2+ 과도 트레이스. (D) 파라미터가 어떻게 분석되었는지 보여주는Ca 2+ 과도 트레이스의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인간 iPSC 기술은 질병 모델링 및 약물 스크리닝을 위한 강력한 플랫폼으로 부상했습니다. 여기에서는 hiPSC-CM 수축성, 전계자전위, 활동전위 및Ca2+ 과도 상태를 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 hiPSC-CM 수축성 및 전기 생리학의 포괄적인 특성화를 제공합니다. 이러한 기능적 분석은 우리 그룹 12,13,18,24,25,26,27의 여러 간행물에 적용되었습니다.
양호한 박동 조건에 있는 hiPSC-CM을 사용하는 것이 필수적이며, 그렇지 않으면 판독값의 신호 대 잡음비가 크게 떨어집니다. 또한, 측정 전에 hiPSC-CMs의 고순도를 확보하는 것이 바람직하다. 비 심근 세포의 존재는 특히 수축 운동 및 전계 전위 측정의 데이터 정확도를 손상시킬 수 있으며, 둘 다 hiPSC-CM 단층의 형성을 필요로합니다. 또한, hiPSC-CM의 미성숙은 다양한 분야에서 hiPSC-CM의 완전한 적용을 방해하는 주요 관심사로 남아 있습니다28. hiPSC-CM은 형태학, 수축성, 전기생리학,Ca2+ 취급, 및 대사29를 포함하는 다수의 측면에서 기능적으로 미성숙인 것으로 알려져 있다. 따라서 기능 분석을 수행하기 전에 적어도 30일까지 hiPSC-CM을 배양 중에 보관하는 것이 좋습니다. 대안적으로, hiPSC-CM의 성숙도를 향상시키기 위해 확립된 다양한 전략이 기능 분석(30)을 수행하기 전에 채택될 수 있다. 예를 들어, 대사 성숙 배지에서 배양된 hiPSC-CM은 정상 RPMI 배지31에서 배양된 hiPSC-CM과 비교할 때 활동 전위의 매우 부정적인 MDP 및Ca2+ 과도 현상의 상당히 빠른 붕괴를 나타냈다. 마지막으로, hiPSC-CM들(32)의 배치-투-배치 변형이 있다. 따라서 동일한 iPSC 라인의 최소 3개의 독립적인 차별화에서 생성된 hiPSC-CM에서 데이터를 수집해야 합니다.
세포 동작 이미징 시스템은 hiPSC-CM의 수축 및 이완 운동을 측정할 수 있는 높은 처리량과 효율적인 플랫폼을 제공합니다. 그러나 가장 큰 단점은 직접적인 수축력이 아니라 수축 및 이완 속도를 측정한다는 것입니다. 또한, 단층을 형성하는 hiPSC-CM의 수가 다를 때 속도가 달라집니다. 따라서 96웰 플레이트의 각 웰에 정확히 50,000개의 세포를 파종하는 것이 중요합니다.
MEA에 의해 측정된 FPD는 QT 지속 기간의 대용물로 사용되어 왔으며, 따라서 약물-유도된 QT 연장을 평가하는 데 널리 사용된다33. QT 기간과 마찬가지로 FPD는 속도에 따라 다릅니다. 따라서 FPD 데이터를 정확하게 해석하기 위해서는 박동률의 보정이 필요합니다. 이 프로토콜에서는 도금 후 최소 10일 후에 MEA 측정을 수행하는 것이 좋습니다. 그러나 때로는 도금 후 10 일 후에도 전계 전위 신호가 여전히 불안정 할 수 있습니다. 이런 일이 발생하면 hiPSC-CM 배양 물을 2-3 일 더 연장하십시오.
패치 클램프 기술은 hiPSC-CM의 전기 생리학을 평가하고 이온 채널을 분석하기 위한 다목적 도구입니다. 기존 패치 클램프의 주요 단점은 낮은 처리량 특성으로 높은 처리량 연구에서 적용하는 데 방해가 된다는 것입니다. 또한 이 기술을 경험하기 전에 긴 학습 곡선과 광범위한 연습이 필요합니다. 그러나 기존의 패치 클램프 기술은 여전히 hiPSC-CM의 전기 생리학을 이해하기 위한 황금 표준으로 간주됩니다. hiPSC-CM의 APD를 높은 처리량 방식으로 평가해야 하는 경우 가속 활동 전위 센서 2(ASAP2)21을 사용하여 hiPSC-CM 활동 전위의 광학 이미징으로 시작하는 것이 좋습니다. 1차 표적을 얻은 후, 보다 정확한 표현형 및 검증을 위해 기존의 활동 전위를 추가 연구에 사용할 수 있습니다. 또한, 자동화된 패치 클램프는 다양한 분야, 특히 채널병증에서 점점 더 많이 사용되고 있다. 예를 들어, hERG 채널 및 전압 게이트 나트륨 채널의 다중 변형에 의해 전달되는 이온 채널 전류는 자동화된 패치 클램프(34,35,36,37)에 의해 특성화되었다. 또한, hiPSC-CM에서 자동 패치 클램프의 사용은 최근38,39로 확립되었다. 자동화된 패치 클램프의 실행을 위해, 독자는 이전에 공개된 프로토콜(40)을 참조할 수 있다. 높은 처리량과 기계 취급의 단순성이라는 장점으로 인해 자동화된 패치 클램프가 약물 발견 및 약물 개발에서 점점 더 중요한 역할을 할 것이라는 데는 의심의 여지가 없습니다.
비율계량Ca 2+ 감응 염료인 Fura-2를 사용하면 hiPSC-CM의 이완기Ca2+ 를 측정할 때 염료 로딩 시간, 고르지 않은 염료 분포 및 광표백과 같은 실험적 편향 요인의 영향을 훨씬 덜 받을 수 있습니다. 이것은 특정 심장 질환의 이완기 기능 장애를 요약하는 데 중요합니다. 주요 제한 사항은 공초점 현미경과 호환되지 않을 수 있는 UV 여기 광원이 필요하다는 것입니다.
요약하면, 약물 개발의 전임상 단계에서 최근 심장 독성 평가의 진전에도 불구하고 심장 독성은 여전히 주요 안전 문제 중 하나입니다. 표준 전임상 안전성 평가 프로세스에 hiPSC-CM의 통합이 증가함에 따라 후보 화합물의 독성 예측 정확도가 향상될 가능성이 있습니다. 또한 환자 맞춤형 hiPSC-CM은 개인화된 심장 약물 선택 및 약물 이상 반응 예측을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 다양한 기능 분석을 사용하는 프로토콜은 약물 스크리닝 및 질병 모델링에서 hiPSC-CM의 적용을 확장하는 데 도움이 될 것입니다.
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Disclosures
J.C.W.는 Greenstone Biosciences의 공동 설립자이지만 여기에 제시된 작업이 완전히 독립적이기 때문에 경쟁 이익이 없습니다. 다른 저자들은 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
원고를 교정해 주신 Blake Wu에게 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 및 NASA NNX16A069A (JCW) 및 AHA 박사후 연구원 872244 (GMP)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
| 50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
| 6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
| 96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
| Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
| CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
| CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
| DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
| EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
| Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
| hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
| KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
| Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
| Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
| Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
| NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
| NIS Elements AR | |||
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
| Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
| Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
| Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |
References
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