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Biology

ड्रोसोफिला माइक्रोबायोम पर लागू 96-वेल प्लेट प्रारूप में फास्ट कॉलोनी बनाने वाली इकाई गिनती

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64298
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Embryology, Carnegie Institution for Science, 2Department of Biology, Johns Hopkins University

Summary

यह विधि प्लेट कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) के लिए 96-वेल प्लेट प्रारूप का उपयोग करके माइक्रोबियल बहुतायत को निर्धारित करती है और पूरे फ्लाई होमोजेनेट नमूनों में ड्रोसोफिला माइक्रोबायोम पर लागू होती है। सीएफयू को यहां प्रदान किए गए एक स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ गिना जाता है।

Abstract

जानवरों की आंतों को कॉमेंसल रोगाणुओं द्वारा उपनिवेशित किया जाता है, जो मेजबान विकास, स्वास्थ्य और व्यवहार को प्रभावित करते हैं। माइक्रोबियल संरचना को मान्य करने और इसके प्रभावों का अध्ययन करने के लिए मेजबान और माइक्रोब दोनों के बीच जटिल बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपनिवेशीकरण का सटीक परिमाणीकरण आवश्यक है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, जिसमें कम देशी माइक्रोबियल विविधता है और परिभाषित माइक्रोबियल संरचना के साथ पालन करने के लिए किफायती है, आंत माइक्रोबायोम का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में उभरा है। एक व्यक्तिगत जीव के माइक्रोबायोम का विश्लेषण करने के लिए यह पहचानने की आवश्यकता होती है कि कौन सी माइक्रोबियल प्रजातियां मौजूद हैं और उनकी पूर्ण बहुतायत का परिमाणीकरण। यह लेख बड़ी संख्या में व्यक्तिगत फ्लाई माइक्रोबायोम के विश्लेषण के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। मक्खियों को 96-वेल प्लेटों में तैयार किया जाता है, जिससे एक बार में बड़ी संख्या में नमूने की हैंडलिंग हो सकती है। माइक्रोबियल बहुतायत को स्थानों की एक सरणी में एक ही आगर प्लेट पर 96 पूरे फ्लाई होमोजेनेट्स तक चढ़ाकर और फिर प्रत्येक स्थान में बढ़ने वाली कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की गिनती करके निर्धारित किया जाता है। इस प्लेटिंग सिस्टम को एक स्वचालित सीएफयू परिमाणीकरण मंच के साथ जोड़ा गया है, जिसमें प्लेटों की फोटोग्राफी, फ्लोरोसेंट कॉलोनियों के भेदभाव और इमेजजे प्लगइन का उपयोग करके कॉलोनियों की स्वचालित गिनती शामिल है। लाभ यह हैं कि (i) यह विधि उपचार के बीच अंतर का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील है, (ii) स्पॉट प्लेटिंग विधि पारंपरिक चढ़ाना विधियों के रूप में सटीक है, और (iii) स्वचालित गिनती प्रक्रिया मैन्युअल गिनती की तुलना में सटीक और तेज है। यहां प्रस्तुत वर्कफ़्लो बड़ी संख्या में प्रतिकृतियों में सीएफयू के उच्च-थ्रूपुट परिमाणीकरण को सक्षम बनाता है और इन विट्रो और अन्य छोटे पशु मॉडल सहित अन्य सूक्ष्म जीव विज्ञान अध्ययन प्रणालियों पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

आंतों के माइक्रोबायोटा और उनके पशु मेजबान के बीच संबंध जैविक अध्ययन1 में सबसे आगे है, जो दिखाता है कि मेजबान शरीर विज्ञान 2,3,4 के लिए माइक्रोबायोम की तनाव संरचना महत्वपूर्ण है। खोज की गति उच्च प्राकृतिक अंतर-व्यक्तिगत भिन्नता और बैक्टीरिया 5,6,7 को उपनिवेशित करने की उच्च विविधता जैसे भ्रामक कारकों से सीमित हो गई है। फ्रूट फ्लाई, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, अपने स्वाभाविक रूप से कम विविधता वाले माइक्रोबायोम, हैंडलिंग में आसानी और मजबूत मेजबान आनुवंशिकी 8,9,10,11 के कारण एक आशाजनक मॉडल के रूप में उभरा है। मक्खियों को रोगाणु मुक्त बनाया जा सकता है और परिभाषित माइक्रोबायोटा12 के साथ फिर से जोड़ा जा सकता है, और यह दिखाया गया है कि वनस्पतियां फ्लाई फिजियोलॉजिकललक्षणों को प्रभावित करती हैं 13,14। जन्मजात वनस्पतियों में बैक्टीरिया का एक सीमित सेट होता है जो सभी खेती योग्य होते हैं, और इनके करीबी रिश्तेदार स्तनधारी आंत के लिए भी अंतर्जात होते हैं, जिनमें लैक्टोबैसिली, प्रोटियोबैक्टीरिया और एंटरोकोकी15 शामिल हैं।

मेजबान लक्षणों पर माइक्रोबायोम के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए माइक्रोबायोम की मात्रा का परिमाणीकरण की आवश्यकता होती है, दोनों प्रजातियां मौजूद हैं और उनकी पूर्ण बहुतायत16। फ्लाई माइक्रोबायोम का विश्लेषण करने के प्रमुख तरीके कॉलोनी बनाने वाली इकाई (सीएफयू) गिनती17, 16 एस आरआरएनए जीन एम्प्लिकॉन अनुक्रमण9, और 16 एस आरआरएनए जीन18 के क्यूपीसीआर हैं। सीएफयू गिनती महंगे अभिकर्मकों के बिना प्राप्त की जा सकती है, और वे जीवाणु कोशिकाओं की व्यवहार्यता की पुष्टि करतेहैं। क्यूपीसीआर सहित 16 एस तकनीकों के फायदे हैं कि रोगाणुओं की वर्गीकरण पहचान को उनकी विकास आवश्यकताओं या कॉलोनी आकृति विज्ञानकी परवाह किए बिना पता लगाया जा सकता है।

उस मामले में जहां प्रयोग ज्ञात बैक्टीरिया (जीनोबायोटिक मक्खियों) के परिभाषित माइक्रोबायोम के साथ मक्खियों का उपयोग करते हैं, सीएफयू गणनामें अनुक्रमण 21 पर विशेष फायदे हैं। अनुक्रमण महंगा है, सापेक्ष बहुतायत प्राप्त करने के लिए डीएनए निष्कर्षण, पीसीआर-आधारित पुस्तकालय तैयारी और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण की आवश्यकताहोती है। उच्च लागत के कारण, उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण विधियों को आमतौर पर प्रति-नमूना मूल्य23 को कम करने के लिए थोक में प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है। पूर्ण बहुतायत प्राप्त करने के लिए क्यूपीसीआर जैसे आगे केतरीकों की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, सीएफयू गिनती तेज और सस्ती होती है और व्यवहार्य कोशिकाओं की पूर्ण संख्या देती है। ड्रोसोफिला8 और अन्य छोटे माइक्रोबायोम मॉडल24, जिनमें कीड़ा, केनोरहाब्डिस एलिगेंस25,26, और लार्वा ज़ेब्राफिश, डेनियो रेरियो,जो 27 में उगाया जाता है, में बैक्टीरिया की एक सीमित श्रृंखला होती है, जिसने विकास विशेषताओं को जानाहै। इन मामलों में, विशेष रूप से जीनोबायोटिक जानवरों के साथ, सीएफयू गिनती बहु-प्रजाति आंत समुदायों21,27,29 के भीतर बैक्टीरिया की सभी प्रजातियों को अलग कर सकती है। उच्च-थ्रूपुट सीएफयू गिनती विधियों से माइक्रोबायोम की संरचना को मापने की लागत-प्रभावशीलता और गति में और सुधार होगा और इसे कई अन्य सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगों पर लागू किया जा सकता है।

एगार-आधारित विकास मीडिया पर एक जीवाणु निलंबन के सीरियल तनुकरण चढ़ाना द्वारा सीएफयू की गिनती माइक्रोबायोलॉजी के क्षेत्र में एक मानक विधि है। प्लेटों पर उगने वाली कॉलोनियों को फिर मैन्युअल रूप से गिना जाता है। कमजोर पड़ने से शोधकर्ता को कॉलोनियों के घनत्व का चयन करने की अनुमति मिलती है जो गणना योग्य है (उदाहरण के लिए, ~ 100 सीएफयू प्रति प्लेट), जिसका अर्थ है कि उपनिवेश एक दूसरे में नहीं बढ़ रहे हैं और उचित समय में गिने जा सकते हैं। अधिकांश माइक्रोबायोलॉजिस्ट रॉबर्ट कोच की प्रयोगशाला में 140 साल पहले विकसित एक ही सीएफयू गिनती विधि का अनिवार्य रूप से उपयोग करते हैं, और कई अनुप्रयोगों के लिए, यह विधि अभी भी पर्याप्त है। हालांकि, बड़ी संख्या में नमूनों की मात्रा निर्धारित करने की मांग करते समय एक समस्या उत्पन्न होती है। एक एकल नमूने को गणना योग्य सीएफयू प्राप्त करने के लिए नमूने के 1 से 10 सीरियल कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है, इसलिए कुछ दर्जन से अधिक नमूनों से जुड़े प्रयोग कर योग्य हो जाते हैं। सीएफयू गणना की दक्षता बढ़ाने के लिए विभिन्न तरीकों का विकास किया गया है। स्वचालित सर्पिल चढ़ाना सीरियल तनुकरण30 की आवश्यकता को समाप्त करता है, जिससे सीएफयू गिनती के लिए केवल एक प्लेट आवश्यक हो जाती है लेकिन नमूने को प्लेट करने का समय बढ़ जाता है। सिंगल प्लेट-सीरियल डाइल्यूशन स्पॉटिंग (एसपी-एसडीएस) प्रति नमूना31 कम प्लेटों से सीएफयू अनुमानों की अनुमति देता है। ये विधियां पारंपरिक स्प्रेड-प्लेटिंग विधि पर एक सुधार हैं, लेकिन अभी भी बैक्टीरिया के नमूनों को अकेले संभालने और चढ़ाने की आवश्यकता होती है और इस प्रकार, उच्च थ्रूपुट के लिए आदर्श नहीं हैं। 96-वेल प्लेटों में नमूने को संभालना और आयताकार आगर प्लेटों पर उन 96 नमूनों को स्पॉट प्लेटिंग करने से नमूने19 के थ्रूपुट में काफी सुधार होता है।

माइक्रोबायोम आमतौर पर कई उपभेदों और प्रजातियों से बने होते हैं। जबकि प्रजातियों को अक्सर कॉलोनी आकृति विज्ञान या विकास मीडिया द्वारा अलग किया जा सकता है, प्रतिदीप्ति को विभिन्न प्रकार के बैक्टीरिया और उनके विकास लक्षणों को अलग करने के लिए नियोजित किया जा सकताहै। उदाहरण के लिए, एक ही प्रजाति के विभिन्न जीनोटाइप को विभिन्न आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल किया जा सकता है। प्लेट इमेजिंग विधियां जो प्रतिदीप्ति को शामिल करती हैं, शोधकर्ताओं को सीएफयू-आधारित परख32 में इन आनुवंशिक तकनीकों का लाभ उठाने की अनुमति देती हैं। उच्च-थ्रूपुट सीएफयू गिनती विधियों में प्रतिदीप्ति को शामिल करने से उनकी उपयोगिता में और वृद्धि होगी।

सीएफयू को मैन्युअल रूप से गिनना बोझिल हो जाता है जब बड़ी संख्या में नमूने होते हैं। सीएफयू की स्वचालित गिनती प्लेट की तस्वीर खींचकर और विशेष सॉफ्टवेयर33 का उपयोग करके छवि को संसाधित करके आयोजित की जा सकती है। सियूवर्ट्स एट अल ने पारंपरिक डिजिटल फोटोग्राफी और इमेजजे सॉफ्टवेयर19 का उपयोग करके स्वचालित कॉलोनी गिनती के साथ स्पॉट-प्लेटिंग की बेहतर प्लेटिंग दक्षता को जोड़ा।

विशिष्ट माइक्रोब और मेजबान संघों के फेनोटाइप को स्क्रीन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विधि माइक्रोबायोम सामुदायिक असेंबली और मेजबान स्वास्थ्य और फिटनेस पर प्रभाव के अध्ययन में सहायता करेगी। ड्रोसोफिला माइक्रोबायोम के अध्ययन के लिए, एक उच्च-थ्रूपुट माइक्रोबायोलॉजी प्लेटफॉर्म में 96-वेल प्लेट प्रारूप में फ्लाई नमूनों की हैंडलिंग, बैक्टीरियल लाइसिस के बिना फ्लाई लाइसिस, स्पॉट-प्लेटिंग की दक्षता, फ्लोरेसेंस का उपयोग करने और कई फ्लोरोफोरे को अलग करने की क्षमता, सीएफयू प्लेटों की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य इमेजिंग के लिए एक नियंत्रित प्रकाश वातावरण और एक विश्वसनीय स्वचालित कॉलोनी गिनती सॉफ्टवेयर शामिल होगा। यह लेख जीनोबायोटिक मक्खियों में सीएफयू की परख के लिए अनुकूलित एक विधि का वर्णन करता है, जो सरल, तेज और स्वचालित है। यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला में आंत माइक्रोबायोम की खोज के लिए पहले प्रकाशित तरीकों और अनुकूलित तरीकों के संयोजन वाले एक नए वर्कफ़्लो को रेखांकित करता है।

Protocol

1. मक्खी उपनिवेशीकरण

नोट: यह विधि सीएफयू के विकास चढ़ाना द्वारा एक खेती योग्य आंत माइक्रोबायोम के साथ मक्खियों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। जीनोबायोटिक मक्खियों के पालन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पहलेप्रकाशित किया गया है।

  1. एक कमेंसल बैक्टीरियल प्रजातियों द्वारा स्थिर उपनिवेश की स्थापना।
    1. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एक ताजा जीवाणु संस्कृति तैयार करें, और पीबीएस में सेल गोली को 1.0 के OD600 पर पुन: निलंबित करें। इस प्रोटोकॉल के लिए, लैक्टिप्लांटीबेसिलस प्लांटारम (जिसे पहले लैक्टोबैसिलस प्लांटरम के रूप में जाना जाता था) को रातोंरात 2.0 के ओडी 600 में उगाया गया था।
    2. एक फ्लाई शीशी में भोजन पर पिपेट 100 μL ( सामग्री की तालिका देखें)। समान रूप से फैलाएं और तरल को 15-30 मिनट के लिए अवशोषित करने दें।
    3. मानक शीशी से शीशी फ्लिपिंग तकनीक34 का उपयोग करके इस शीशी में 20 रोगाणु मुक्त मक्खियों को स्थानांतरित करें। प्रत्येक मक्खी लगभग समान मात्रा में बैक्टीरिया की खुराक35 खाएगा। वैकल्पिक रूप से, रोगाणु मुक्त अंडे जोड़े जा सकते हैं।
    4. मक्खियों को 3 दिनों के लिए रोजाना ताजा बाँझ भोजन में स्थानांतरित करें। यह सब एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में करें और बाँझ तकनीक का उपयोग करें (चित्रा 1 ए -1)।
  2. सीएफयू लोड को मापने से पहले, आंत से क्षणिक बैक्टीरिया को साफ करने के लिए मक्खियों को 4 घंटे के लिए बाँझ आगर-पानी युक्त शीशी में स्थानांतरित करें। आगर-पानी की शीशियां मक्खी के लिए नमी का स्रोत प्रदान करती हैं लेकिन सतह पर मक्खी या बैक्टीरिया के लिए कोई पोषण नहीं देती हैं। वे मानक भोजन के साथ एक ही बाँझ फ्लाई शीशियों में तैयार किए जाते हैं, लेकिन इसमें केवल विआयनीकृत पानी और 1.5% आगर होता है।

2. 96-वेल पीसीआर प्लेट में व्यक्तिगत रूप से मक्खियों को समरूप बनाना

  1. पहले से ही बीड बीटर प्लेट्स तैयार कर लें।
    1. मोती मापने वाली ट्रे पर 0.5 μm ग्लास मोती ( सामग्री की तालिका देखें) डालें ( पूरक कोडिंग फ़ाइल 1 S1-bead-measurer.stl की मदद से मुद्रित 3D)। ट्रे पर मोतियों को फैलाएं ताकि सभी कुएं भरे और समतल हों, और फिर उन्हें पुनर्प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त मोतियों को शंक्वाकार ट्यूब में ब्रश करें।
    2. मापने वाली ट्रे पर एक अर्ध-स्कर्ट वाली पीसीआर प्लेट ( सामग्री की तालिका देखें) को उल्टा रखें और इसे मापने वाली ट्रे पर इंडेंटेशन में फिट करके कुओं के साथ संरेखित करें। फिर, मोतियों को स्थानांतरित करने के लिए इसे जल्दी से पलट दें।
    3. पीसीआर प्लेट की सतह से अतिरिक्त मोतियों को हटा दें और इसे पन्नी से कवर करें। यह सुनिश्चित करने के लिए पीसीआर प्लेट का निरीक्षण करें कि सभी कुओं में मोती हैं। एक ही कुएं में मोती जोड़ने के लिए आवश्यक होने पर वजन स्कूप का उपयोग करें। यदि स्थैतिक बिजली प्लेट की सतहों पर मोतियों को चिपकाने का कारण बन रही है, तो मापने वाली ट्रे और पीसीआर प्लेट के पीछे 70% इथेनॉल के साथ पोंछें या स्प्रे करें।
    4. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें। कई प्लेटों को इस तरह से तैयार किया जा सकता है और फिर बाद में उपयोग के लिए आटोक्लेव और संग्रहीत किया जा सकता है। उपयोग के लिए तैयार होने पर, 96-चैनल पिपेटर का उपयोग करके प्रत्येक कुएं में 100 μL PBS जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. होमोजेनाइजेशन से पहले 70% इथेनॉल के साथ माइक्रोब-उपनिवेशित मक्खियों को सतह-निष्फल करें (चरण 1 देखें)।
    1. 5 सेकंड के लिए 100% सीओ2 के साथ मक्खियों को एनेस्थेटाइज करें। शीशी से एनेस्थेटाइज्ड मक्खियों को एक छोटे फ़नल का उपयोग करके 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें (चित्रा 1 ए -2)। इस अध्ययन में, 25 मक्खियों को आमतौर पर प्रति ट्यूब जोड़ा गया था।
    2. तुरंत ट्यूब में ~ 1 एमएल 70% इथेनॉल स्प्रे करें, ट्यूब को बंद करें और 10 सेकंड के लिए व्युत्क्रमण द्वारा मिलाएं। फिर, इथेनॉल को पी 1000 पिपेट के साथ एस्पिरेट करें, सावधान रहें कि किसी भी मक्खियों को न खिलाएं। इथेनॉल के साथ एक बार फिर से दोहराएं, फिर बाँझ पीबीएस के साथ दो बार (चित्रा 1 ए -3)।
  3. अंतिम पीबीएस धोने के बाद, ट्यूब को बंद करें और, कैप साइड के साथ, इसे बेंच पर कुछ बार जोर से टैप करें ताकि मक्खियां कैप में जाएं।
  4. ट्यूब खोलें और फोर्सप्स का उपयोग करके कुओं में मक्खियों को वितरित करें (चित्र 1 ए -4)। प्रत्येक कुएं में एक मक्खी रखें (चित्र 1ए-5)। मक्खियों को एनेस्थेटाइज्ड रखने के लिए लोडिंग करते समय प्लेट को बर्फ पर रखें।
  5. थर्मल बॉन्ड हीट सीलिंग पन्नी का उपयोग करके प्लेट को सील करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. सबसे पहले, कुओं के करीब किसी भी आवारा मोतियों को हटा दें क्योंकि ये पन्नी सील में रिसाव का कारण बन सकते हैं। सुनिश्चित करें कि पन्नी का सुस्त पक्ष प्लेट पर नीचे उन्मुख है और चमकदार पक्ष गर्मी सीलर की ओर है। हीट सीलर को 5 सेकंड (चित्रा 1 ए -6) के लिए मजबूती से दबाएं (सामग्री की तालिका देखें)। पन्नी को सुरक्षित करने के लिए हाथ के एप्लिकेटर (सामग्री की तालिका देखें) के साथ बर्निश।
      नोट: खराब सीलिंग नमूना हानि का एक कारण है।
  6. प्लेट शेकर में प्लेट को सुरक्षित करें। 5 मिनट के लिए समरूप करें (चित्र 1A-7)। सीलिंग पन्नी से तरल निकालने के लिए 350 x g पर मिनी-प्लेट स्पिनर (सामग्री की तालिका देखें) में 30 सेकंड के लिए मोती प्लेट को घुमाएं।
  7. प्लेट को पकड़ते समय पन्नी को हटा दें ताकि कुओं से फ्लाई होमोजेनेट की बूंदों को बाहर न निकालें।

3. फ्लाई होमोजेनेट का सीरियल कमजोर पड़ना और सीएफयू प्लेटों पर स्पॉटिंग

  1. जैव सुरक्षा कैबिनेट में चार आयताकार एमआरएस आगर विकास प्लेटें रखें ( सामग्री की तालिका देखें) और उनके ढक्कन हटा दें। इस प्रोटोकॉल में, एल प्लांटारम के विकास के लिए एमआरएस आगर का उपयोग किया गया था। इन प्लेटों को कम से कम 10 मिनट के लिए सूखने के लिए छोड़ दें (20 मिनट यदि वे ताजा डाले जाते हैं या भंडारण से ठंडे होते हैं)।
    नोट: यदि प्लेटें गीली हैं, तो 96-वेल प्लेट से बूंदें एक साथ चलेंगी और गिनती को बर्बाद कर देंगी।
  2. 96-चैनल पाइपेटर का उपयोग करके बाँझ 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 100 μL PBS जोड़कर तीन तनुकरण प्लेटें तैयार करें। 96-चैनल पाइपेटर पर पी 20 युक्तियों का एक रैक लोड करें।
  3. खंड 2 (चित्र 1ए-8) में तैयार की गई नमूना प्लेट से 11.1 μL होमोजेनेट को एस्पिरेटेड करके 1:10 तनुकरण करें। कुओं के तल के बजाय कुओं के बीच से खींचना सुनिश्चित करें क्योंकि फ्लाई होमोजेनेट और ग्लास बीड्स पिपेट को बंद कर देंगे। मोती डूब जाते हैं, और फ्लाई पार्टिकुलेट तैरते हैं, जिससे मध्य परत ज्यादातर स्पष्ट हो जाती है।
  4. 11.1 μL को पहली तनुकरण प्लेट में वितरित करें, जिसमें पहले से ही प्रति अच्छी तरह से 100 μL बाँझ PBS होता है। 600 आरपीएम पर 10 सेकंड के लिए प्लेट शेकर पर तनुकरण प्लेट रखें। पांच चक्रों के लिए ऊपर और नीचे पाइप करके फिर से मिलाएं। पहली तनुकरण प्लेट से दूसरी तनुकरण प्लेट में 11.1 μL स्थानांतरित करें, और अगले दो तनुकरण प्लेटों के लिए मिश्रण चरणों को दोहराएं।
  5. नीचे वर्णित के रूप में तनुकरण श्रृंखला चढ़ाना करें।
    1. जैव सुरक्षा कैबिनेट से विकास प्लेटों को पुनः प्राप्त करें।
    2. सबसे पतला प्लेट से शुरू करते हुए, 96-वेल पिपेटर (चित्रा 1 ए -9) का उपयोग करके एगर प्लेटों पर प्रत्येक कुएं से 2 μL स्पॉट करें।
      1. पाइपेटर के सिर को धीरे-धीरे प्लेट पर नीचे करें, इस बात का ध्यान रखें कि आगर में छुरा न मारा जाए। प्लेट की सावधानीपूर्वक जांच करें और सुनिश्चित करें कि सभी धब्बे हटा दिए गए हैं; यदि नहीं, तो मैन्युअल रूप से उपयुक्त स्थिति में 2 μL जोड़ें। जांचें कि तरल धब्बे जल्दी से आगर में भिगो ते हैं और एक साथ नहीं चलते हैं।
      2. यदि धब्बे एक साथ चलते हैं, तो ताजा एगर प्लेटों के एक नए सेट को लंबे समय तक सुखाएं और स्पॉटिंग को फिर से करें। यदि कई प्लेट प्रकार हैं (उदाहरण के लिए, विभिन्न मीडिया या एंटीबायोटिक दवाओं के साथ), तो उन्हें भी देखें। किसी भी शेष समाधान को कमजोर पड़ने की प्लेट में वापस डालें और अगली उच्च एकाग्रता पर आगे बढ़ें।
        नोट: कमजोर पड़ने का पता लगाते समय, अगले कमजोर पड़ने को पांच बार मिलाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि पिपेट युक्तियों की सामग्री पिछले कमजोर पड़ने से साफ हो गई है। कमजोर पड़ने वाली प्लेटों को कॉलोनी की गिनती35 को प्रभावित किए बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे > संग्रहीत किया जा सकता है।
  6. शेष तनुकरण प्लेटों के लिए चरण 3.5 में वर्णित प्लेटिंग प्रक्रिया को दोहराएं, मूल होमोजेनेट के साथ प्लेट तक सबसे पतला से सबसे अधिक केंद्रित तक प्रगति करें।
  7. जब सभी तरल को आगर में अवशोषित कर लिया जाता है, तो प्लेटों को उलट दें और उन्हें इनक्यूबेटर में रखें (चित्र 1 ए -10)। ड्रोसोफिला से लैक्टिप्लांटीबेसिलस और एसिटोबैक्टर के लिए, एमआरएस मीडिया पर इष्टतम तापमान 30 डिग्री सेल्सियस है। जब तक उपनिवेश इष्टतम आकार तक नहीं पहुंच जाते हैं, तब तक इनक्यूबेट करें: कॉलोनियां उन्हें स्पष्ट रूप से देखने के लिए पर्याप्त बड़ी हैं, लेकिन इतनी बड़ी नहीं हैं कि वे एक दूसरे के विकास में विलय या हस्तक्षेप करें (इष्टतम आकार के परिमाणीकरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
    नोट: इष्टतम विकास की स्थिति तनाव-निर्भर है और अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जानी चाहिए। ड्रोसोफिला से लैक्टिप्लांटीबेसिलस के लिए, इनक्यूबेशन का इष्टतम समय एमआरएस एगर पर 26 घंटे से 30 घंटे है। ड्रोसोफिला से एसिटोबैक्टर के लिए, इनक्यूबेशन का इष्टतम समय तनाव के आधार पर एमआरएस पर 30 घंटे से 48 घंटे है।
  8. इनक्यूबेशन के बाद, प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें यदि आवश्यक हो जब तक कि गिनती के लिए तैयार न हो।

4. सीएफयू का परिमाणीकरण

  1. प्लेटों की तस्वीर खींचकर सीएफयू की मात्रा निर्धारित करें और फिर स्वचालित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कॉलोनियों की गणना करें, जैसा कि नीचे बताया गया है। यदि प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था, तो पहले उन्हें कमरे के तापमान तक पहुंचने की अनुमति दें ताकि प्लेटों पर कोई संघनन न हो, जो चमक पैदा करता है।
  2. प्लेटों को एक तार्किक अनुक्रम में व्यवस्थित करें और फोटोग्राफ करते समय उन्हें उस क्रम में रखें - इससे फ़ाइलों को नाम देना आसान हो जाता है। सभी प्लेटों को उन्मुख करें ताकि ए 1 सभी प्लेटों के लिए ऊपरी बाएं कोने में हो। तस्वीरों का कोई मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए ए 1 कोने को एक अद्वितीय आईडी के साथ लेबल करने की सिफारिश की जाती है। प्रत्येक कमजोर पड़ने की श्रृंखला को क्रम में ढेर करें।
  3. प्लेट ढक्कन हटा दें और प्लेट को सही कोने में ए 1 उन्मुख के साथ मंच पर रखें। प्लेट फोटो बॉक्स (पूरक फ़ाइल 1, पूरक फ़ाइल 2) के लिए डिज़ाइन शामिल हैं, जो इन ट्रे प्लेटों की तस्वीर लेने के लिए अनुकूलित है और इसमें फ्लोरोसेंट कॉलोनियों की छवि के लिए प्रकाश और फ़िल्टर विकल्प शामिल हैं।
  4. प्लेटों को चित्रित करें। प्लेटों के बीच एक सुसंगत एक्सपोजर स्तर प्राप्त करने के लिए मैन्युअल सेटिंग्स के साथ कैमरे का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)। परिप्रेक्ष्य विकृति को कम करने के लिए एक लंबी फोकल लंबाई सेटिंग की सिफारिश की जाती है। कैमरा शेक से धुंधलापन को कम करने के लिए रिमोट शटर का उपयोग करके फोटो कैप्चर करें।
  5. छवियों को कंप्यूटर पर स्थानांतरित करें और उन्हें नाम दें, जिसमें प्रयोग का नाम, मीडिया का प्रकार, कमजोर पड़ने वाला कारक और कोई अन्य प्रासंगिक विवरण शामिल हैं। कुछ ऑपरेटिंग सिस्टम ( सामग्री की तालिका देखें) में फ़ाइलों के चयन पर राइट-क्लिक करके फाइंडर में एक उपयोगी बैच नाम बदलने की सुविधा है।

5. काउंट-ऑन-इट सूट का उपयोग करके स्वचालित कॉलोनी गिनती (पूरक फ़ाइल 3)

  1. इमेजजे के लिए प्रदान किए गए क्रॉपटेकुलर प्लगइन (पूरक कोडिंग फ़ाइल 2) का उपयोग करके छवियों को क्रॉप करें। यह प्लगइन छवि को उप-क्षेत्रों की एक व्यवस्थित सरणी में विभाजित करने में मदद करता है (उदाहरण के लिए, 96-वेल प्लेट के लिए 8 x 12)। उपक्षेत्रों को व्यक्तिगत रूप से गिना जाएगा।
    नोट: सर्कस नामक गोलाकार प्लेटों की गिनती के लिए एक अलग प्लगइन पूरक कोडिंग फ़ाइल 3 Circus_.ijm में वर्णित है।
    1. फ़ोल्डर में परिमाणीकरण के लिए संसाधित किए जाने वाले चित्रों को व्यवस्थित करें। फ़ाइल नाम चुनें जो प्लेटों को अलग करते हैं, क्योंकि ये फ़ाइल नाम गणना के प्रत्येक सेट के लिए कॉलम शीर्षक बन जाते हैं। इस फ़ोल्डर के भीतर, "क्रॉप्ड" और "रसीदें" नाम के सबफ़ोल्डर बनाएँ.
    2. क्रॉपटेकुलर लॉन्च करें, और फसल शुरू करने के लिए ठीक पर क्लिक करें।
      नोट: डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स प्रदर्शित होते हैं और आमतौर पर पर्याप्त होते हैं। छवि के रिज़ॉल्यूशन, प्रकाश व्यवस्था, स्पॉट आकार आदि के आधार पर, यह आधार मापदंडों को समायोजित करने में सहायक हो सकता है।
    3. यदि छवि पहले से ही सीधी है, तो बस स्पेस दबाएं। अन्यथा, एक किनारे के साथ एक रेखा खींचकर छवि को सीधा करें जो क्षैतिज हो जाना चाहिए। यदि छवि अभी भी सीधी दिखाई नहीं देती है तो लाइन को जितनी बार आवश्यक हो उतनी बार फिर से बनाएं।
    4. इसके बाद, उस क्षेत्र का एक बाउंड्री बॉक्स खींचें जिसके लिए गिनती की जानी है। आकार और अनुपात को समायोजित करें जब तक कि सभी धब्बे उनकी कोशिकाओं के भीतर न हों। ग्रिड को ताज़ा करने के लिए सीमा बॉक्स के बाहर कर्सर खींचें। जब ग्रिड अच्छा दिखता है, तो स्पेस दबाएं।
    5. सुनिश्चित करें कि अगली छवि स्वचालित रूप से पहले वाले के समान कोण पर घूमती है; प्लगइन मानता है कि सभी तस्वीरें समान संरेखित हैं। यदि यह सटीक है, तो जारी रखने के लिए Space दबाएँ. अन्यथा, छवि को पहले की तरह सीधा करें। ग्रिड भी पिछली छवि के समान स्थिति को याद करता है; यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें, और तब Space दबाएँ.
  2. प्रदान किए गए काउंट-ऑन-इट का उपयोग करके प्लेटों पर कॉलोनियों की गणना करें: इमेजजे के लिए ग्रिडिरोन प्लगइन (पूरक कोडिंग फ़ाइल 4)। प्लगइन स्थापित करने और उपयोग करने के लिए विस्तृत निर्देश पूरक फ़ाइल 3 में शामिल हैं।
    1. ग्रिडिरोन > काउंट-ऑन-इट लॉन्च करें। क्रॉपटेकुलर के समान ग्रिड सेटिंग्स का उपयोग करें। उपयोगकर्ता एक पूरे फ़ोल्डर को बैच कर सकते हैं, एक एकल छवि का विश्लेषण कर सकते हैं, या वर्तमान छवि से शुरू कर सकते हैं।
    2. ऊपरी और निम्न पिक्सेल तीव्रता मान के आधार पर सीमा सेट करें। सभी कॉलोनियों का चयन करते समय सीमा को यथासंभव कठोर बनाएं। आदर्श रूप से, चयनित कॉलोनियों के बीच कुछ जगह होगी, लेकिन सॉफ्टवेयर ब्लब्स को एक डिग्री तक विभाजित करने में सक्षम है। दहलीज संतोषजनक होने पर "कार्रवाई आवश्यक" संवाद बॉक्स पर ठीक क्लिक करें।
    3. परिणामों का निरीक्षण करने के लिए, ज़ूम इन करें और कॉलोनी की गिनती को अधिक बारीकी से देखें। रद्द करने पर क्लिक करने से प्लगइन निरस्त हो जाएगा. जारी रखने के लिए ठीक क्लिक करें.
    4. पहली छवि पर, सुनिश्चित करें कि सेटअप मेनू पर आगे बढ़ने या लौटने का विकल्प दिया गया है, उदाहरण के लिए, न्यूनतम कॉलोनी आकार को बदलने के लिए। बैच प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ने के लिए, ठीक क्लिक करें. फिर, रसीदों और परिणाम तालिका को रखने के लिए एक फ़ोल्डर का चयन करें। "रसीद" फ़ोल्डर का उपयोग करें या एक नया फ़ोल्डर बनाएँ।
    5. पहली छवि के बाद, अगली छवियां पिछली सेटिंग्स के समान सीमा तक डिफ़ॉल्ट होंगी। इन सेटिंग्स का उपयोग करने या सेटिंग्स समायोजित करने के लिए ठीक क्लिक करें. यदि फ़ोटो सुसंगत हैं और सेटिंग सटीक है, तो "कार्रवाई आवश्यक" संवाद बॉक्स पर ठीक क्लिक करें।
      नोट: एक बार बैच में सभी छवियां पूरी हो जाने के बाद, परिणाम तालिका रसीदों के समान फ़ोल्डर में स्वचालित रूप से सहेजती है।
    6. सॉफ़्टवेयर द्वारा उत्पादित गणना रसीदों की समीक्षा करें और मैन्युअल रूप से किसी भी गिनती त्रुटियों को ठीक करें। ImageJ प्लग-इन सांख्यिकीय रूप से सटीक है, लेकिन त्रुटियां होती हैं। आउटलायर्स की जांच करने और गलत गिनती की पहचान करने के लिए रसीदों का प्रमाण दें। सॉफ्टवेयर CFU डेटा को रसीदों के समान फ़ोल्डर में एक .csv फ़ाइल के रूप में सहेजता है।
  3. उपयोगकर्ता-पसंदीदा सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें।

Representative Results

औपनिवेशीकरण परख का उपयोग करके 96-वेल प्लेट प्रारूप में सैकड़ों अलग-अलग मक्खियों में सीएफयू की गणना
कई अलग-अलग फ्लाई माइक्रोबायोम की संरचना को समझने के लिए, सीएफयू को साथ के प्रोटोकॉल का उपयोग करके मापा गया था, जिसने मौजूद प्रजातियों की पहचान, उपनिवेशित मक्खियों के प्रतिशत और प्रत्येक मक्खी में बैक्टीरिया की पूर्ण बहुतायत को सक्षम किया। माइक्रोबायोम संरचना में बड़े पैमाने पर देखे गए व्यक्तिगत-से-व्यक्तिगत भिन्नता के कारणों को खराब तरीके से समझा जाता है, और उपनिवेशीकरण के सांख्यिकीय वितरण को निर्धारित करने से इस भिन्नता का अध्ययन करने में मदद मिल सकती है 36,37। जैविक प्रतिकृतियों की एक महत्वपूर्ण संख्या प्राप्त करने के लिए, सीएफयू गणना (चित्रा 1 ए) का उपयोग करके कई अलग-अलग मक्खियों में माइक्रोब बहुतायत की मात्रा का परिमाणीकरण करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट पाइपलाइन विकसित की गई थी।

सीएफयू की अंतिम मात्रा को इस बात से प्रभावित किया जा सकता है कि विश्लेषण से पहले मक्खियों को कैसे संभाला जाता है, उदाहरण के लिए, सतह नसबंदी, बैक्टीरिया की खपत के बाद का समय और आंत से क्षणिक बैक्टीरिया की निकासी सहित कारक। सबसे पहले, ड्रोसोफिला कॉमेंसल बैक्टीरियल प्रजातियों एल प्लांटारम (एलपी; ओबाडिया एट अल.36 में एलपी स्ट्रेन डब्ल्यूएफ देखें) पर ध्यान केंद्रित करते हुए, मक्खियों को एलपी की ~ 105 सीएफयू की खुराक खिलाई गई और प्रति शीशी 25 मक्खियों के समूहों में रखा गया। इन मक्खियों को या तो 3 दिनों के लिए एक ही शीशी में रखा गया था या दैनिक (स्थानांतरित) ताजा, बाँझ भोजन में स्थानांतरित किया गया था (चित्रा 1 बी)। तब अपरिवर्तित मक्खियों को सतह के बैक्टीरिया (धोया गया) को हटाने के लिए इथेनॉल में धोया जाता था या धोया नहीं जाता था (बिना धोया जाता था)। धोने से मापा गया कुल सीएफयू (चित्रा 1 बी) में एक गैर-महत्वपूर्ण कमी आई, यह दर्शाता है कि इन अत्यधिक नियंत्रित टीकाकरण स्थितियों के तहत, मक्खी की सतह 3 दिनों में बैक्टीरिया द्वारा महत्वपूर्ण रूप से उपनिवेशित नहीं होती है। भोजन पर विकास से बैक्टीरिया के संचय को कम करने के लिए मक्खियों के अन्य समूहों को हर दिन स्थानांतरित किया गया (स्थानांतरित); इसके अतिरिक्त, एक समूह को नमूना लेने से पहले 4 घंटे के लिए ताजा भोजन में स्थानांतरित किया गया था (पोस्ट-ट्रांसफर), या उन्हें 4 घंटे (क्लियर्ड) के लिए केवल बाँझ आगर-पानी के साथ शीशियों में रखा गया था ताकि क्षणिक रूप से निगलने वाले रोगाणुओं को आंत से साफ किया जा सके। अधिक कठोर उपनिवेशीकरण माप प्रदान करने के लिए इन चरणों में से प्रत्येक ने इथेनॉल में सतह धोने के अपवाद के साथ मक्खियों में सीएफयू की बहुतायत में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कमी का उत्पादन किया। माप से पहले 4 घंटे के लिए बाँझ भोजन (पोस्ट-ट्रांसफर) या अगर-पानी (साफ़) में स्थानांतरित करने से अप्रभेद्य प्रभाव उत्पन्न होते हैं, यह दर्शाता है कि माप से 4 घंटे पहले बाँझ स्थितियों में स्थानांतरण जीवाणु भार को कम करता है। यह परिणाम इस व्याख्या के अनुरूप है कि मक्खी आंत में कुछ आंत बैक्टीरिया क्षणिक होते हैं, जबकि अन्य अधिक स्थिर रूप से जुड़ेहोते हैं। एलपी की प्रचुरता साफ मक्खियों में 1 x 104.3 सीएफयू/फ्लाई से लेकर बिना धुली हुई मक्खियों में 1 x 104.9 सीएफयू (एन = 724 मक्खियों) तक थी।

इसके बाद, एक ही परख एसिटोबैक्टर इंडोनेसेंसिस (एआई) का उपयोग करके आयोजित की गई थी, एक ग्राम-नकारात्मक जीवाणु जो मक्खी आंत को उपनिवेशित करता है (चित्रा 1 सी; ओबाडिया एट अल .36 में तनाव एआई एसबी 003 देखें)। एलपी-उपनिवेशित मक्खियों के साथ, सतह नसबंदी ने सीएफयू में एक गैर-महत्वपूर्ण कमी का उत्पादन किया। इसी तरह, बाँझ भोजन में दैनिक स्थानांतरण ने बैक्टीरिया के भार को काफी कम कर दिया, और होमोजेनाइजेशन से पहले 4 घंटे के लिए बाँझ स्थितियों में स्थानांतरण ने बैक्टीरिया लोड में और कमी का उत्पादन किया। एआई की प्रचुरता साफ मक्खियों में 1 x 104.7 सीएफयू/फ्लाई से लेकर बिना धुली हुई मक्खियों (एन = 528 मक्खियों) में 1 x10 5.0 सीएफयू तक थी। इस प्रकार, आंत बैक्टीरिया की सटीक मात्रा हस्तांतरण की आवृत्ति पर निर्भर करती है, जिसमें स्थानांतरण का दिन भी शामिल है। इथेनॉल में धोने से बाहरी जीवाणु भार को हटाने से गैर-महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा, लेकिन बैक्टीरिया के विभिन्न उपभेदों या विभिन्न संस्कृति स्थितियों के लिए अधिक महत्वपूर्ण प्रभाव देखा जा सकता है। इन कारकों को प्रयोगात्मक रूप से नियंत्रित किया जाना चाहिए।

सीएफयू गणनाओं पर होमोजेनाइजेशन विधि के संभावित प्रभाव का भी परीक्षण किया गया था। मक्खियों को पीबीएस के 100 μL में 0.5 μm ग्लास मोतियों के साथ एक मोती बीटर का उपयोग करके समरूप किया गया था, जो जीवाणु कोशिकाओं की व्यवहार्यता को कम कर सकता था। सबसे पहले, संस्कृति से एलपी बैक्टीरिया का निलंबन पीबीएस में तैयार किया गया था और फिर सीएफयू को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में गिनने के लिए चढ़ाया गया था। उसी संस्कृति को मोती बीटर प्लेट में रखा गया था और (i) मोतियों के साथ समरूप किया गया था, (ii) मोतियों और रोगाणु मुक्त मक्खी के साथ समरूप किया गया था, या (iii) मोतियों के बिना पीबीएस में समरूप किया गया था (चित्रा 1 डी)। मक्खी के मौजूद होने पर मोतियों में होमोजेनाइजेशन ने समाधान में व्यवहार्य कोशिकाओं की बहुतायत को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं किया, जबकि मक्खी की अनुपस्थिति में बैक्टीरिया के समरूपीकरण ने बैक्टीरिया कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या को मार डाला। मोतियों के बिना पीबीएस में होमोजेनाइजेशन ने व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या को भी काफी कम कर दिया। इसी तरह, एक मक्खी की उपस्थिति में समरूप होने पर एआई व्यवहार्यता संरक्षित की गई थी, जबकि मक्खी के बिना समरूपीकरण ने समाधान में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या को कम कर दिया (चित्रा 1 ई)। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि मक्खी ऊतक बैक्टीरिया को होमोजेनाइजेशन के दौरान मोतियों द्वारा नष्ट होने से बचाता है। हालांकि, चित्रा 1 डी और चित्रा 1 ई में प्रयोगों को प्रति कुएं 10 से अधिक8 सीएफयू के साथ किया गया था। व्यवहार में, प्रति कुएं या उससे कम ~ 10 6 कोशिकाओं वालेकुओं को थोड़ा सेल हानि दिखाने के लिए पाया गया था जब मोतियों का उपयोग मक्खी के बिना किया गया था। मोती की पिटाई के माध्यम से बर्फ पर प्लेट को आधा ठंडा करने से सेल व्यवहार्यता में भी सुधार होता है। इन परिणामों का महत्व यह है कि पाठकों को इन संभावित मुद्दों के बारे में पता होना चाहिए और उनके विशिष्ट उपयोग मामले के लिए उपयुक्त नियंत्रण डिजाइन करना चाहिए।

उच्च-थ्रूपुट सीएफयू परिमाणीकरण के लिए स्पॉट प्लेटिंग 96-वेल प्लेटों की सटीकता
चूंकि लक्ष्य सैकड़ों से हजारों व्यक्तिगत मक्खियों के लिए सीएफयू बहुतायत को मापना है, पारंपरिक प्रसार चढ़ाना विधियां निषेधात्मक रूप से समय और सामग्री गहन हैं। स्पॉट प्लेटिंग सीएफयू विकास और गणना19,31 के लिए एक प्रभावी और कुशल तरीका है। स्पॉट प्लेटिंग विधि आयताकार ट्रे प्लेटों (चित्रा 2 ए) में तैयार मीडिया पर बैक्टीरिया निलंबन के 2 μL को वितरित करने के लिए 96-चैनल पाइपेटर का उपयोग करती है। प्रत्येक स्थान एक नमूने के जीवाणु भार का प्रतिनिधित्व करता है, इसलिए 96 मक्खियों का विश्लेषण एक प्लेट (चित्रा 2 बी) के साथ किया जा सकता है। स्पॉट प्लेटिंग की सटीकता की तुलना पारंपरिक प्लेटों के साथ की गई थी, जिसमें दोनों विधियों के लिए एलपी के समान 0.0001 ओडी निलंबन का उपयोग करके विकास प्लेटों को इंजेक्ट किया गया था। पीबीएस में निलंबन को दो गुना क्रमिक रूप से पांच बार पतला किया गया था। सिर-से-सिर तुलना के रूप में, इनोकुलम का 50 μL अलग-अलग गोल प्लेटों पर फैलाया गया था, या आयताकार MRS प्लेटों पर 2 μL धब्बे बनाए गए थे। प्लेटों को तब तक 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था जब तक कि कॉलोनियां गणना योग्य नहीं थीं। प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए परिणामी सीएफयू गणना का उपयोग निलंबन की मूल एकाग्रता की गणना करने और तुलना करने के लिए किया गया था (चित्रा 2 सी)। 50-500 सीएफयू वाली गोल प्लेटों को नियंत्रण के रूप में गिना गया था। उच्च-थ्रूपुट और पारंपरिक राउंड प्लेटिंग विधियों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया।

चूंकि कॉलोनियों का घनत्व उनके विकास और परिमाणीकरण को प्रभावित कर सकता है, अंतिम गणना पर सीएफयू घनत्व के प्रभाव का परीक्षण किया गया था। पारंपरिक गोल प्लेट विधि (चित्रा 2 सी) की तुलना में प्रति स्थान 2 से 25 कॉलोनियों वाले स्पॉट ने अंतिम गणना में कोई अंतर नहीं दिखाया। औसतन 35 कॉलोनियों वाले धब्बे ने ऐसे परिणाम उत्पन्न किए जो नियंत्रण प्रसार प्लेटों की तुलना में थोड़ा कम तिरछा था (चित्रा 2 सी; चित्र 2 सी) पी = 0.0017)। अलग-अलग स्थानों की तस्वीरों की बारीकी से जांच से संकेत मिलता है कि यह तिरछापन घने स्थानों में अतिव्यापी कॉलोनियों के कारण था। प्रति स्पॉट औसतन 11 कॉलोनियों वाले धब्बों के आधार पर माप के परिणामस्वरूप स्प्रेड प्लेटों के आधार पर उन लोगों के निकटतम सांद्रता हुई (चित्रा 2 सी; चित्र 2 सी) स्प्रेड प्लेट्स: माध्य = 1 x 104.4 सीएफयू; एसडी = 0.086 बनाम 11 औसत कॉलोनियों वाले धब्बे: माध्य = 1 x 104.4 सीएफयू; एसडी = 0.12, पी = 0.42, वेल्च का टी-टेस्ट)।

सफेद प्रकाश या प्रतिदीप्ति के साथ एक विशेष फोटोग्राफी मंच का उपयोग करके परिमाणीकरण के लिए उच्च गुणवत्ता वाली छवियां उत्पन्न करना
उच्च-थ्रूपुट स्पॉट-प्लेटिंग स्वाभाविक रूप से बड़ी संख्या में लक्षित क्षेत्र उत्पन्न करती है, जिन्हें सटीक रूप से गिना जाना चाहिए। डेटा को दस्तावेज करने और सीएफयू की गिनती की सुविधा के लिए गुणवत्ता वाली तस्वीरों का उपयोग किया जा सकता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सामग्री (चित्रा 3 ए) का उपयोग करके एक मजबूत और सीधा फोटोग्राफी मंच विकसित किया गया था। एक डिजिटल कैमरा एक कस्टम-निर्मित लाइट बॉक्स के शीर्ष पर एक ब्रैकेट से जुड़ा हुआ था, जिसे फ्लोरोबॉक्स कहा जाता है, और प्लेट के केंद्र के लंबवत सीधे नीचे की ओर इशारा किया गया था। एक रंगीन उत्सर्जन फ़िल्टर वैकल्पिक रूप से फ़िल्टर स्लाइडर का उपयोग करके लेंस के सामने स्थित किया गया था। एक प्रकाश ढाल ने नीचे एलईडी स्ट्रिप्स से सीधे प्रकाश को अवरुद्ध करके लेंस भड़कने से रोका। एलईडी स्ट्रिप्स ने प्लेट पर चमक को रोकने के लिए, ऊपर के बजाय किनारों से प्लेट को रोशन किया। सफेद प्रकाश के अलावा, एकल रंग के नीले और हरे एलईडी का उपयोग क्रमशः हरे और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन को उत्तेजित करने के लिए किया गया था। प्लेट को दराज पर एक प्लेट धारक द्वारा रखा गया था, और प्लेट डालने को आसान बनाने के लिए दराज को दराज स्लाइडर से लैस किया गया था। पूर्ण डिजाइन पूरक फ़ाइल 1 और पूरक फ़ाइल 2 में उपलब्ध हैं.

कॉलोनियों की गिनती और विभिन्न रंगों और आकृति विज्ञान को अलग करने में सहायता के लिए सफेद प्रकाश एलईडी और एक डिजिटल कैमरे का उपयोग करके एलपी कॉलोनियों की एक स्पॉट प्लेट की एक तस्वीर ली गई थी (चित्रा 3 बी)। यह सत्यापित करने के लिए कि प्रकाश की तीव्रता समान थी, आगर की पृष्ठभूमि तीव्रता को प्लेट फोटोग्राफ (चित्रा 3 सी) के विभिन्न क्षेत्रों में मापा गया था। यह प्रदर्शित करने के लिए कि कॉलोनियों को पृष्ठभूमि से स्पष्ट रूप से अलग किया जा सकता है, प्लेट के विभिन्न हिस्सों पर 10 अलग-अलग कॉलोनियों के व्यास में तीव्रता को मापा गया और पृष्ठभूमि की तुलना में लगभग ~ 300% अधिक पाया गया (चित्रा 3 सी)। प्लेट को एमचेरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन-व्यक्त करने वाले प्लास्मिड के साथ एलपी के साथ टीका लगाया गया था, साथ ही कुछ एलपी जिनमें प्लास्मिड नहीं था, इसलिए कॉलोनियां या तो एमचेरी-पॉजिटिव या एमचेरी-नकारात्मक थीं। इन दो प्रकार की कॉलोनियों को अलग करने के लिए, प्लेट को हरे रंग की एलईडी लाइट (515-525 एनएम) और एक लाल फिल्टर (टिफेन # 29) के साथ एक ही कैमरे का उपयोग करके फोटो खींचा गया था, जिससे एमचेरी-पॉजिटिव कॉलोनियों में फ्लोरेस (चित्रा 3 डी) हुआ। एमचेरी-पॉजिटिव और एमचेरी-नेगेटिव के बीच तीव्रता में अंतर को कॉलोनियों (एन = 10 कॉलोनियों) के नमूने में तीव्रता को मापकर निर्धारित किया गया था। एमचेरी-पॉजिटिव कॉलोनियां एमचेरी-नकारात्मक (चित्रा 3 ई) की तुलना में ~ 1,000% अधिक तीव्रता थीं। जीएफपी को व्यक्त करने वाली एआई की कॉलोनियों और बिना प्रतिदीप्ति व्यक्त करने वाली एआई की कॉलोनियों को नीली एलईडी लाइट (465-475 एनएम) और एक हरे फिल्टर (टिफेन # 58) (चित्रा 3 एफ) का उपयोग करके फोटो खींचा गया था। जीएफपी-पॉजिटिव कॉलोनियों ने जीएफपी-नकारात्मक (चित्रा 3 जी) की तुलना में 200% अधिक तीव्रता दिखाई।

कस्टम इमेजजे प्लग-इन काउंट-ऑन-इट का उपयोग करके स्पॉट प्लेटों पर सीएफयू की स्वचालित गिनती
अकेले तस्वीरें कॉलोनियों की गिनती में सहायता करती हैं (उदाहरण के लिए, डेटा संग्रहीत करके, डेटा साझा करके, ज़ूम इन करके, एक ओवरले को चिह्नित करके, रंगों को अलग करना, आदि)। हालांकि, सैकड़ों स्थानों के परिणामों को मैन्युअल रूप से गिनने और व्यवस्थित करने का कार्य थकाऊ, समय लेने वाला और अंतिम गणना में मानव-से-मानव अंतर से ग्रस्त हो सकता है। गिनती प्रक्रिया को तेज करने और गणना की प्रजनन क्षमता को मानकीकृत करने के लिए, काउंट-ऑन-इट (चित्रा 4 ए) नामक एक विशेष इमेजजे प्लग-इन विकसित किया गया था। यह प्लग-इन एगर प्लेटों पर सीएफयू की सटीक अर्ध-स्वचालित गिनती को सक्षम बनाता है। उपयोगकर्ता अतिरिक्त क्रॉपकुलर प्लग-इन का उपयोग करके पहले क्रॉप और उन्हें सीधा करके गिनती के लिए छवियों को तैयार करता है। फ़ोटो को वैकल्पिक रूप से बैच संसाधित किया जा सकता है, और सीमा को प्रत्येक प्लेट के लिए समायोजित किया जा सकता है। कई अन्य विकल्प उपयोगकर्ता को प्लेट गिनती की सटीकता बढ़ाने देते हैं, जिसमें प्रकाश तरंग दैर्ध्य (आरजीबी छवियों) को समायोजित करना, कॉलोनी आकार (पिक्सेल में) की एक श्रृंखला सेट करना, अधिकतम पहलू अनुपात बदलना और सक्रिय चयन ग्रिड के आयामों को अनुकूलित करना शामिल है। काउंट-ऑन-यह परिणामों की एक तालिका को आउटपुट करता है जिसमें प्रत्येक प्लेट को सीएफयू गिनती के कॉलम के रूप में दर्शाया जाता है। यह एक फोटो रसीद भी उत्पन्न करता है जो इसके गिनती परिणामों को नेत्रहीन रूप से दस्तावेज करने और मैन्युअल त्रुटि सुधार (चित्रा 4 बी) में सहायता करने के लिए एक ओवरले दिखाता है। जबकि त्रुटियां होती हैं, जब मैन्युअल रूप से गिनी गई कॉलोनियों की संख्या की तुलना इस प्लग-इन (चित्रा 4 सी) का उपयोग करके गिनी गई कॉलोनियों की संख्या के साथ की गई थी, तो संबंध आम तौर पर बराबर था, मैनुअल और स्वचालित गणनाओं के बीच रैखिक प्रतिगमन 90% से अधिक सटीकता (आर2 = 0.93) के साथ 0.95 की ढलान दिखाता है, हालांकि कॉलोनियों की संख्या 20 से अधिक होने पर त्रुटि बढ़ गई।

काउंट-ऑन-इसका उपयोग फ्लोरोबॉक्स की प्रतिदीप्ति सुविधा का उपयोग करके फ्लोरोसेंट कॉलोनियों को अलग से गिनने के लिए भी किया जा सकता है। सॉफ्टवेयर प्लग-इन बनाम मैनुअल द्वारा एमचेरी-पॉजिटिव कॉलोनी काउंट (चित्रा 4 डी) में 0.92 का आर 2 था (चित्रा 4 ई)। इसी तरह, सॉफ्टवेयर प्लग-इन बनाम मैनुअल के साथ गिने जाने वाले जीएफपी-पॉजिटिव कॉलोनियों (चित्रा 4 एफ) में 0.90 का आर2 था (चित्रा 4 जी)। फ्लोरोसेंट बनाम गैर-फ्लोरोसेंट कॉलोनियों को एक ही नमूने के भीतर अलग किया जा सकता है, और कॉलोनी के आकार और आकार का उपयोग अलग-अलग उप-आबादी (चित्रा 4 एच-के) को अलग करने के लिए भी किया जा सकता है। फोटो रसीदें एक रिकॉर्ड प्रदान करती हैं जो उपयोगकर्ता को गिनती की सटीकता की जल्दी से जांच करने और मैन्युअल रूप से त्रुटियों को सही करने की अनुमति देती हैं। चित्रा 4 सी, ई, जी, आई, के में, फोटो रसीदों का उपयोग गणना सटीकता में सुधार के लिए नहीं किया गया है ताकि पाठक विधि के कच्चे उत्पादन को देख सकें। चित्रा 4 जी में जैसे मामले, जहां 1 की मैन्युअल गिनती ने 21 की स्वचालित गिनती प्राप्त की, फोटो रसीदों का उपयोग करके जल्दी से पता लगाया जा सकता है। इस मामले में, प्लेट के किनारे पर चकाचौंध ने ब्लॉब्स बनाए जिन्हें कॉलोनियों के रूप में गिना जाता था। प्रत्येक उपयोग के मामले के लिए, सॉफ़्टवेयर प्लग-इन के लिए इष्टतम सेटिंग्स को उच्च थ्रूपुट गिनती से पहले निर्धारित करने की आवश्यकता होती है।

Figure 1
चित्रा 1: उपनिवेश परख 96-वेल प्लेट प्रारूप का उपयोग करके सैकड़ों व्यक्तिगत मक्खियों में सीएफयू को मापता है। (ए) प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में उपयोग किए जाने वाले उपनिवेश परख और उच्च-थ्रूपुट परिमाणीकरण विधि का सचित्र अवलोकन। (ख) औपनिवेशीकरण परख के बाद मक्खियों में लैक्टिप्लांटिबैसिलस प्लांटारम (एलपी) की प्रचुरता को उच्च-थ्रूपुट सीएफयू परिमाणीकरण विधि का उपयोग करके अलग-अलग परिस्थितियों में मापा गया था। मक्खियों को एक ही शीशी में 3 दिनों तक रखा जाता था और फिर समरूप और चढ़ाया जाता था (बिना धोया जाता था), चढ़ाना (धोया) से पहले इथेनॉल में धोया जाता था (स्थानांतरित किया जाता था), दोनों को हर दिन धोया और स्थानांतरित किया जाता था, दैनिक रूप से स्थानांतरित किया जाता था और फिर चढ़ाना (पोस्ट-ट्रांसफर) से पहले बाँझ भोजन पर रखा जाता था, या 4 घंटे (साफ़) के लिए केवल पानी के साथ शीशियों में रखा जाता था (एन = 724 मक्खियां कुल, 3 जैविक प्रतिकृतियां और ~ 72 मक्खियां प्रति उपचार)। (सी) (बी) के समान परख एसिटोबैक्टर इंडोनेसेंसिस (एआई) (एन = 528 मक्खियों) का उपयोग करके आयोजित की गई थी। (डी) एलपी बैक्टीरियल सस्पेंशन को पीबीएस में तैयार किया गया था और फिर सीएफयू की गिनती के लिए चढ़ाया गया था या पहले मोती की पिटाई द्वारा समरूप किया गया था, रोगाणु-मुक्त (जीएफ) मक्खी के साथ संयोजन में मोती-पीटा गया था, या मोती या मक्खी के बिना मोती बीटर पर हिलाया गया था (एन = 236 नमूना कुओं)। (E) समरूपता के बाद एआई व्यवहार्यता का परीक्षण उसी तरह से किया गया था जैसे (डी) (एन = 282 नमूना कुओं) में किया गया था। पैनलों (बी-ई) के लिए सांख्यिकीय महत्व की गणना क्रुस्कल-वालिस परीक्षण का उपयोग करके की गई थी, जिसके बाद बोनफेरोनी के कई तुलना सुधार के साथ जोड़ीवार विलकॉक्सन रैंक-सम परीक्षण किए गए थे। बॉक्स इंटरक्वार्टाइल रेंज देता है। रेखा माध्य को इंगित करती है। मूंछें कुल सीमा देती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: उच्च-थ्रूपुट सीएफयू परिमाणीकरण के लिए स्पॉट प्लेटिंग 96-वेल प्लेटों की सटीकता। (ए) आयताकार ट्रे प्लेटों में तैयार मीडिया पर 2 μL वितरित करने के लिए 96-चैनल पाइपेटर का उपयोग करके स्पॉट-प्लेटिंग। (बी) एलपी कॉलोनियों के 96 स्थानों के साथ एमआरएस-आगर ग्रोथ प्लेट। (ग) स्पॉट प्लेटों (एन = 680 स्पॉट) से सीएफयू गणना के आधार पर एकाग्रता की तुलना में पारंपरिक गोल प्लेटों (एन = 24 प्लेटों) से सीएफयू गणना के आधार पर एलपी निलंबन की एकाग्रता को क्रमबद्ध रूप से पतला किया जाता है और प्रति स्थान औसत कॉलोनी गणना द्वारा व्यवस्थित किया जाता है (तीन प्रतिकृति प्लेटों के लिए प्रत्येक एकल कमजोर पड़ने वाले कारक के लिए ~ 48 स्थान गिने गए थे)। प्रत्येक डेटा बिंदु प्रति स्थान सटीक कॉलोनियों का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि प्रत्येक कॉलम उस कमजोर पड़ने के लिए औसत कॉलोनियों का प्रतिनिधित्व करता है। क्षैतिज बिंदीदार रेखा उस संस्कृति की गणना सीएफयू गणना को इंगित करती है जिसे चढ़ाया गया था। हरे रंग के रेखांकित बिंदु पारंपरिक गोल प्लेट गिनती को उजागर करते हैं। लाल रंग से भरे बिंदु प्रति 2 μL स्पॉट पर 11 CFUs के इष्टतम कॉलोनी घनत्व को उजागर करते हैं। सांख्यिकीय महत्व की गणना साधारण एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके की गई थी, जिसमें बोनफेरोनी के कई तुलना सुधार के साथ स्प्रेड प्लेट नियंत्रण कॉलम के औसत के खिलाफ प्रत्येक कॉलम के औसत की तुलना की गई थी। बॉक्स इंटरक्वार्टाइल रेंज देता है। रेखा माध्य को इंगित करती है। मूंछें कुल सीमा देती हैं। ** पी < 0.01. एनएस = महत्वपूर्ण नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एक फोटोग्राफी प्लेटफॉर्म सफेद प्रकाश या प्रतिदीप्ति का उपयोग करके प्लेटों की मात्रात्मक छवियों का उत्पादन करता है। (बी) सफेद प्रकाश का उपयोग करके एलपी कॉलोनियों की एक स्पॉट प्लेट की तस्वीर। (सी) पृष्ठभूमि की तीव्रता (बीकेजी) की तीव्रता की तुलना में सफेद प्रकाश के तहत एकल कॉलोनियों की तीव्रता प्रोफाइल (एन = 10 कॉलोनियां, डैश लाइन मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती है)। (डी) एमचेरी पॉजिटिव एलपी कॉलोनियों के लिए चयन करने के लिए एकल-रंग की हरी रोशनी और लाल फिल्टर का उपयोग करके (बी) के समान स्पॉट प्लेट की फोटो। (ई) एकल कालोनियों की तीव्रता प्रोफाइल जो एमचेरी उत्सर्जन के साथ और बिना कॉलोनियों के बीच अंतर को दर्शाती है। (एफ) एआई कॉलोनियों वाले स्पॉट प्लेट की फोटो, जिनमें से कुछ में जीएफपी लेबल है। (छ) एकल कालोनियों की तीव्रता प्रोफाइल जो जीएफपी-नकारात्मक और जीएफपी-पॉजिटिव कॉलोनियों के बीच अंतर को दर्शाती है। E, F, G: n = प्रत्येक भूखंड के लिए 10 उपनिवेश। कॉलोनी व्यास लगभग 1.5 मिमी हैं। डैश्ड लाइन एसडी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: काउंट-ऑन-इट इमेजजे प्लग-इन द्वारा स्पॉट प्लेटों की सटीक गिनती। (ए) प्लग-इन सेटअप विंडो का स्क्रीनशॉट। (बी) प्लग-इन गणना दस्तावेज करने और त्रुटि सुधार में सहायता के लिए एक रसीद उत्पन्न करता है। इनसेट: प्रत्येक स्थान क्षेत्र के लिए गिनी गई कॉलोनियों की संख्या के साथ ओवरले; पीली रूपरेखा इंगित करती है कि एक एकल कॉलोनी की गणना की गई थी और लाल कि कई कॉलोनियों की गिनती की गई थी। (ग) एक सफेद प्रकाश छवि का उपयोग करते समय प्लग-इन (स्वचालित) का उपयोग करके गणना की गई कॉलोनियों की संख्या की तुलना में मैन्युअल रूप से गिने गए कॉलोनियों की संख्या को दर्शाने वाला प्लॉट, जहां ग्राफ पर प्रत्येक बिंदु मैन्युअल रूप से या स्वचालित रूप से गिने गए एकल स्थान का प्रतिनिधित्व करता है (फिट का ढलान = 0.95, सियान लाइन; 1: 1 लाइन लाल रंग की है; आर2 = 0.93, पियर्सन के सहसंबंध गुणांक, पी < 0.0001)। (डी) प्लग-इन से फोटो रसीद छवि जब फोटो बॉक्स की प्रतिदीप्ति सुविधा का उपयोग करके एमचेरी-पॉजिटिव कॉलोनियों का चयन किया गया था। (ई) लाल प्रतिदीप्ति का उपयोग करते समय स्वचालित विधि की तुलना में मैनुअल का उपयोग करके गणना की गई एमचेरी-पॉजिटिव कॉलोनियों की संख्या को दर्शाने वाला प्लॉट (फिट का ढलान = 1.1, सियान लाइन; 1: 1 लाइन लाल रंग की है; आर2 = 0.92, पियर्सन के सहसंबंध गुणांक, पी < 0.0001)। ध्यान दें कि ई, जी, आई, के के लिए विश्लेषण रसीदों का उपयोग करके आउटलायर्स और त्रुटियों को ठीक नहीं किया गया है। (एफ) प्लग-इन से फोटो रसीद छवि जब जीएफपी-पॉजिटिव कॉलोनियों को फोटो बॉक्स की हरी प्रतिदीप्ति सुविधा का उपयोग करके चुना गया था और प्लग-इन के साथ हरे चैनल का चयन किया गया था। (छ) ग्रीन फ्लोरेसेंस लाइटिंग का उपयोग करते समय स्वचालित विधि की तुलना में मैनुअल का उपयोग करके गिने गए जीएफपी-पॉजिटिव कॉलोनियों की संख्या को दर्शाने वाला प्लॉट (फिट का ढलान = 1.1, सियान लाइन; 1: 1 लाइन लाल रंग की है; आर2 = 0.90, सहसंबंध का पियरसन गुणांक, पी < 0.0001)। (एच) प्लग-इन में एक उच्च प्रतिदीप्ति सीमा का उपयोग करके मिश्रित कॉलोनी आकृति विज्ञान से चुनी गई एमचेरी-पॉजिटिव कॉलोनियां। (I) स्वचालित विधि की तुलना में मैनुअल का उपयोग करके गिने गए एमचेरी-पॉजिटिव कॉलोनियों की संख्या को दर्शाने वाला प्लॉट जब लाल प्रतिदीप्ति प्रकाश व्यवस्था का उपयोग किया गया था (फिट का ढलान = 0.99; आर2 = 0.91, पियर्सन के सहसंबंध गुणांक, पी < 0.0001)। (जे) एमचेरी-नकारात्मक कॉलोनियों को कम फ्लोरेसेंस सीमा का उपयोग करके मिश्रित कॉलोनी आकृति विज्ञान से चुना गया। (के) स्वचालित विधि की तुलना में मैनुअल का उपयोग करके गणना की गई एमचेरी-नकारात्मक कॉलोनियों की संख्या को दर्शाने वाला प्लॉट जब गैर-फ्लोरोसेंट कॉलोनियों का चयन करने के लिए तीव्रता सीमा निर्धारित की गई थी (फिट का ढलान = 1.1; आर2 = 0.85, पियर्सन के सहसंबंध गुणांक, पी < 0.0001)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: फ़्लोरोबॉक्स असेंबली निर्देश। यह फ़ाइल वीडियो में उपयोग किए गए नियंत्रित प्रकाश बॉक्स के निर्माण के माध्यम से पाठक को चरण-दर-चरण चलती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: फ्लोरोबॉक्स ऐक्रेलिक लेजर कट। यह फ़ाइल नियंत्रित प्रकाश बॉक्स के लिए ऐक्रेलिक टुकड़ों को लेजर काटने के लिए एक कट टेम्पलेट प्रदान करती है। फ़ाइल को लेजर कट ऐक्रेलिक विक्रेता को भेजा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए विक्रेता के लिए सामग्री की तालिका देखें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 3: सॉफ्टवेयर निर्देश। यह फ़ाइल इस प्रोटोकॉल के साथ प्रदान किए गए क्रॉपटेकुलर और काउंट-ऑन-इट सॉफ़्टवेयर की स्थापना और उपयोग के माध्यम से पाठक को चरण-दर-चरण चलती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: मोती मापने ट्रे के लिए 3 डी प्रिंटिंग कोड (एस 1-बीड-मेजर.एसटीएल)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 2: आयताकार प्लेट फोटो क्रॉपर इमेजजे प्लगइन (Croptacular_.ijm). कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 3: राउंड प्लेट फोटो क्रॉपर प्लगइन (Circus_.ijm). कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 4: आयताकार प्लेट 96 स्पॉट काउंटर प्लगइन (Gridiron_.ijm). कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहां प्रस्तुत विस्तृत तकनीक सीएफयू गिनती प्रयोग में मूल्यांकन किए जा सकने वाले नमूनों की संख्या में >100 गुना वृद्धि को सक्षम करती है। यह तकनीक अलग-अलग मक्खियों की परख के लिए 96-वेल प्लेट प्रारूप का उपयोग करके ड्रोसोफिला 12,35,36 में माइक्रोबायोम प्रयोगों के लिए मौजूदा तरीकों को आगे बढ़ाती है। इसके अलावा, यह एक अधिक कुशल स्पॉट प्लेटिंग विधि 19,31 और फोटोग्राफी और कॉलोनी गिनती मंच के साथ एक स्वचालित वर्कफ़्लो लागू करता है। ड्रोसोफिला के लिए इस पद्धति का महत्व 96-वेल प्लेट प्रारूप में प्रयोगों को मानकीकृत करना है, जो सीएफयू के उच्च-थ्रूपुट परिमाणीकरण को प्राप्त करने के लिए स्वचालन के साथ बड़ी संख्या में जैविक प्रतिकृतियों के एक साथ हैंडलिंग को सक्षम बनाता है।

96-वेल प्लेटफॉर्म से पता चलता है कि स्थानांतरण की बढ़ती आवृत्ति और क्षणिक बैक्टीरिया की "समाशोधन" औसत बहुतायत और नमूनों के बीच भिन्नता दोनों में महत्वपूर्ण कमी का कारण बनती है (चित्रा 1 बी, सी), इस बेहतर प्रोटोकॉल की कठोरता का प्रदर्शन करता है। सह-आवास मक्खियों की एक सीमा मक्खियों के बीच बैक्टीरिया का क्षैतिज हस्तांतरण है। एक प्रस्तावित समाधान मक्खियों को 96-वेल प्लेट प्रारूप में व्यक्तिगत रूप से रखना है, जैसे कि पूरे पशु आहार फ्लैट38।

हालांकि इथेनॉल में मक्खियों को धोए जाने पर जीवाणु भार में महत्वपूर्ण कमी नहीं देखी गई थी, इन मक्खियों को केवल 3 दिनों के लिए बाहरी बैक्टीरिया की उपस्थिति में रखा गया था। लंबे समय तक आवास एक अधिक जीवाणु भार को जमा करने की अनुमति दे सकताहै। इसलिए, इथेनॉल में धोने की अभी भी सिफारिश की जाती है।

96-वेल प्लेट में मक्खियों को स्थानांतरित करना वर्कफ़्लो (चित्रा 1 ए) स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण पहला कदम है। एक बार जब मक्खियों को धोया जाता है, तो उन्हें एक बार में कुओं में वितरित किया जाता है। इस स्तर पर एक प्लेट चार्ट यह नोट करने के लिए उपयोगी है कि प्रत्येक कुएं में कौन सी स्थितियां मौजूद हैं और "फ्लाई खो गई थी" जैसे किसी भी नोट को जोड़ें। होमोजेनाइजेशन कुछ महत्वपूर्ण चेतावनियों के साथ एक और महत्वपूर्ण कदम है। बैक्टीरिया एक मक्खी (चित्रा 1 डी, ई) की उपस्थिति में होमोजेनाइजेशन प्रक्रिया से बच जाते हैं, और संभवतः, यह सिद्धांत तब भी सच होता है जब बैक्टीरिया मक्खी की आंत के अंदर होते हैं। हालांकि, बैक्टीरिया भी मारे जाते हैं जब उन्हें अकेले बीड बीटर प्लेटों में समरूप किया जाता है, यह दर्शाता है कि होमोजेनाइजेशन कुछ परिस्थितियों में बैक्टीरिया कोशिकाओं को मार सकता है, एक सीमा जो महत्वपूर्ण हो सकती है यदि कोई विच्छेदित आंत को समरूप कर रहा है, उदाहरण के लिए। विशेष रूप से, होमोजेनाइजिंग करते समय सीएफयू का नुकसान नमूने में सीएफयू की संख्या पर निर्भर होता है, और नुकसान न्यूनतम होता है जब ~ 105 सीएफयू प्रति कुएं का उपयोग किया जाता है। सीएफयू के आगे संरक्षण को होमोजेनाइजेशन को आधे रास्ते में रोककर और बर्फ पर प्लेट को ठंडा करके प्राप्त किया जा सकता है।

नियंत्रण प्रयोगों के आधार पर इस प्रोटोकॉल में 5 मिनट के लिए होमोजेनाइजेशन किया गया था जहां सीएफयू की एक ज्ञात संख्या को रोगाणु मुक्त मक्खी के साथ मिलाया गया था, और इसने फ्लाई बैक्टीरिया के लिए अनुभवजन्य रूप से काम किया। कम धड़कन के कारण बड़े फ्लाई पार्ट्स मौजूद होते हैं, जो पिपेटिंग में हस्तक्षेप करते हैं, जबकि ~ 10 मिनट के काफी लंबे होमोजेनाइजेशन समय ने सीएफयू गिनती को अधिक परिवर्तनशील बना दिया। शंक्वाकार प्लेट कुओं की छोटी मात्रा और कोण आकार बेलनाकार 2 एमएल ट्यूबों की तुलना में मोती की धड़कन की दक्षता को कम करने के लिए देखा गया था। इस सामान्य दृष्टिकोण पर कई भिन्नताएं संभव हैं, जिनमें कौन से जीवाणु उपभेद, कौन से मोती बीटिंग कंटेनर, कौन से मोती, और कौन से फ्लाई जीनोटाइप का उपयोग किया जाता है। व्यक्तिगत उपयोगकर्ता मामलों को अपने दृष्टिकोण को स्थापित करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करने की आवश्यकता है।

स्पॉट प्लेटिंग विधि को एक विशिष्ट तरीके से नियोजित किया गया था: पीबीएस में एल प्लांटारम डब्ल्यूएफ के 1: 2 कमजोर पड़ने को एमआरएस प्लेटों पर देखा गया था और 2 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था (छोटे कॉलोनी आकार उत्पन्न करने के लिए कम इनक्यूबेशन बार लागू किया जा सकता है)। विधि को उपकरणों में कुछ अप-फ्रंट निवेश की आवश्यकता होती है, मुख्य रूप से बीड बीटर और 96-चैनल पाइपेटर (चित्रा 2 ए), जो कमजोर पड़ने की श्रृंखला और स्पॉट प्लेटिंग दोनों के लिए आवश्यक है। हालांकि, कम महंगे विकल्प उपलब्ध हैं, जिसमें स्लॉट किए गए पिन के साथ 96-वेल प्लेट रेप्लिकेटर शामिल हैं। कमजोर पड़ने की श्रृंखला एक महत्वपूर्ण कदम है जो सीएफयू गिनती परिणामों की सटीकता को प्रभावित करता है। विफलता मोड के संदर्भ में, पिपेट युक्तियों को फ्लाई पार्ट्स या ग्लास बीड्स के साथ बंद करना संभव है और पिपेट युक्तियों के लिए पिपेटर पर ठीक से सील नहीं करना या किसी अन्य कारण से विफल होना संभव है। इन सभी समस्याओं के परिणामस्वरूप प्रभावित कुओं की संख्या कम हो जाती है और इनकी निगरानी की जानी चाहिए। कमजोर पड़ने की श्रृंखला के प्रत्येक चरण में पर्याप्त मिश्रण भी महत्वपूर्ण है। प्रत्येक तनुकरण को या तो प्लेट शेकर पर प्लेट को डालकर या 15-20 बार ऊपर और नीचे करके अच्छी तरह से मिश्रित किया जाना चाहिए, जो युक्तियों को कुल्ला करने का भी कार्य करता है। सबसे पतला से कम पतला प्लेट तक स्पॉट करके, युक्तियों को पूरी कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है। 1: 2 कमजोर पड़ने के साथ, गिनती 2-25 कॉलोनियों की सीमा में सटीक होती है, जो परिमाण के क्रम में फैली होती है (चित्रा 2 सी)। इसलिए, 1:10 कमजोर पड़ने से समय और सामग्री की बचत होती है। एक अन्य चर जिसका लाभ उठाया जा सकता है वह है इनक्यूबेशन समय, जिसे छोटी कॉलोनियों का उत्पादन करने के लिए समायोजित किया जा सकता है और इस प्रकार, आसन्न कॉलोनियों के विलय को रोककर गणना योग्य स्थानों की सीमा में वृद्धि होती है।

प्लेट की एक गुणवत्ता फोटो आवश्यक है क्योंकि यह कच्चा स्रोत डेटा बन जाता है जिसमें से सीएफयू का विश्लेषण किया जाता है और अनिश्चित काल तक संग्रहीत किया जा सकता है। फ्लोरोबॉक्स को समान प्रकाश तीव्रता के साथ प्लेटों की तस्वीरें बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो आगर की सतह पर चमक को कम करता है। इसके अतिरिक्त, डिजाइन एकल-रंग एलईडी रोशनी और रंगीन फोटो फिल्टर (चित्रा 3 ए) का उपयोग करके फ्लोरोसेंट कॉलोनियों को चुनिंदा रूप से फोटोग्राफ करने में सक्षम है। नियंत्रित प्रकाश व्यवस्था और कैमरा सेटिंग्स के साथ फ्लोरोबॉक्स जैसे सेटअप का निर्माण, सीएफयू छवियों की प्रजनन क्षमता को बहुत बढ़ा सकता है, जो स्वचालित विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। कॉलोनी आकृति विज्ञान, प्रतिदीप्ति तीव्रता, और कॉलोनी के विकास पर समय या घनत्व के प्रभाव कुछ गुण हैं जिनका विश्लेषण तस्वीरों का उपयोग करके किया जा सकता है। फोटो बॉक्स का निर्माण रंग फिल्टर और एकल-रंग रोशनी के बिना किया जा सकता है यदि कोई फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया का उपयोग नहीं किया जाता है, जिससे लागत और जटिलता कम हो जाती है। यदि प्रयोगशाला द्वारा एक अलग फ्लोरोफोरे का उपयोग किया जाता है तो यहां अनुशंसित लोगों के लिए विभिन्न उत्तेजना रोशनी और उत्सर्जन फिल्टर को प्रतिस्थापित किया जा सकता है। एक कैमरा जो एक ऐप का उपयोग करके वाईफाई पर टैबलेट से जुड़ा होता है, झटकों को रोकने और डेटा ट्रांसफर में आसानी के लिए स्वचालित शटर सुविधा दोनों के लिए उपयोगी होता है। छवियों को वायरलेस फ़ाइल ट्रांसफर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके टैबलेट और फिर लैपटॉप में स्थानांतरित किया जा सकता है। इन क्षमताओं के साथ अनुशंसित कैमरों को सामग्री की तालिका में इंगित किया गया है।

काउंट-ऑन-यह इमेजजे में लिखा गया एक प्लग-इन है। स्वचालित सीएफयू गिनती सॉफ्टवेयर प्लेट छवि को एक समान 96-वेल ग्रिड में विभाजित करता है, प्रत्येक ग्रिड सेल में कॉलोनियों की गणना करता है, और परिणामों को एक साधारण स्प्रेडशीट में बैच करता है। चूंकि प्लेट पर और फोटो में स्पॉट ग्रिड की स्थिति में हमेशा भिन्नता होती है, इसलिए उपयोगकर्ता को क्रॉपटेकुलर प्लग-इन का उपयोग करके ग्रिड को मैन्युअल रूप से फोटो के अनुरूप होना चाहिए। यह प्लेट किनारे के पास के क्षेत्रों को बाहर करने में भी मदद करता है, जिनमें चमक होती है। दहलीज सेट करना छवि से सबसे सटीक सीएफयू गिनती प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। यदि सीमा बहुत अधिक निर्धारित की जाती है, तो उपनिवेश विलय हो जाएंगे; यदि सीमा बहुत कम निर्धारित की जाती है, तो कॉलोनियों को बाहर रखा जाएगा। एक बार दहलीज निर्धारित हो जाने के बाद, मैक्रो किनारों को नरम करने और उपनाम को कम करने के लिए गॉसियन ब्लर लागू करता है, वाटरशेड फिल्टर ओवरलैपिंग कॉलोनियों को विभाजित करता है, और ब्लॉब्स को विश्लेषण कणों का उपयोग करके गिना जाता है।

कभी-कभी, कॉलोनियों का घनत्व किसी विशेष स्थान पर बहुत अधिक होता है। काउंट-ऑन-यह इससे निपटने का एक तरीका प्रदान करता है। आंशिक रूप से विलय की गई कॉलोनियों वाले ग्रिड सेल में कॉलोनियों की संख्या का अनुमान लगाने के लिए, पहले पूरी प्लेट से एक गोलाकार ब्लॉब के औसत क्षेत्र को सीऔसत के रूप में लिया जाता है। फिर, ब्लॉब ए1 के क्षेत्रफल को एक गोलाकार ब्लॉब ए1/सी औसत के औसत क्षेत्रफल से विभाजित किया जाता है। यह संख्या निकटतम पूर्णांक के लिए गोल है, और यह अनुमान है कि एक ब्लॉब में कितनी कॉलोनियां हैं। यह फ़ंक्शन एक कारण है कि दहलीज गिनती परिणामों को प्रभावित कर सकती है: सापेक्ष औसत कॉलोनी क्षेत्र बनाम एक विलय ब्लॉब क्षेत्र इस बात पर निर्भर करता है कि सीमा ने विलय किए गए ब्लॉब्स को कैसे प्रभावित किया।

प्रस्तुत विधियों में कई सीमाएँ हैं। इनमें 96-वेल प्लेटों से तरल मीडिया को सटीक रूप से वितरित करने के लिए उपकरणों की आवश्यकता शामिल है। यह उपकरण, या तो एक 96-चैनल पिपेटर या एक स्लॉट डे प्रतिलिपिकार पिन उपकरण, प्राप्त करने के लिए हजारों डॉलर खर्च कर सकता है। सस्ता विकल्प मौजूद है लेकिन कम सटीक हैं। काउंट-ऑन-इट के माध्यम से स्वचालित गिनती भी कुछ सीमाएं प्रस्तुत करती है। उदाहरण के लिए, यदि मिश्रित आबादी में दो कॉलोनी प्रकारों को अकेले आकार के आधार पर सीमांकित किया गया था, तो ब्लॉब गिनती कॉलोनियों को सही प्रकार में असाइन करने में सक्षम नहीं होगी। इस मामले में, ब्लब्स वाले धब्बों को गिनती से समाप्त करने की आवश्यकता होगी। आकृति विज्ञान के आधार पर कॉलोनियों का आगे भेदभाव उस विधि का एक मूल्यवान विस्तार होगा जो वर्तमान में लागू नहीं है। तनाव-विशिष्ट पोषक तत्वों और एंटीबायोटिक दवाओं सहित चयनात्मक मीडिया का उपयोग जटिल छवि विश्लेषण की आवश्यकता को सरल बनाता है।

96-वेल प्लेटों में फ्रूट फ्लाई प्रयोगों को बनाए रखने से नमूनों और स्थितियों की संख्या कई गुना बढ़ जाती है जिन्हें एक ही प्रयोग में परीक्षण किया जा सकता है और ड्रोसोफिला-बैक्टीरिया एसोसिएशन फेनोटाइप्स में उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन की सुविधा प्रदान कर सकता है। हम कल्पना करते हैं कि जटिल मिश्रण में कई जीवाणु उपभेदों को अलग करने के लिए चयनात्मक मीडिया का उपयोग करके इस विधि को बढ़ाया जा सकता है। विधि फ्लाई माइक्रोबायोम के अध्ययन तक सीमित नहीं है। पीने के पानी में कोलीफॉर्म गिनती से लेकर रोगजनकों की पहचान तक, माइक्रोबायोलॉजी के कई अनुप्रयोगों में सीएफयू का परिमाणीकरण आम है। यहां प्रस्तुत सीएफयू प्लेटिंग सिस्टम उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन, साथ ही स्वचालित अधिग्रहण, प्रसंस्करण, भंडारण और परिणामों के वितरण को सक्षम बनाता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

केरविन केसी हुआंग, डॉ एंड्रेस अरंडा-डिआज़, टेड कूपर और लुडिंगटन प्रयोगशाला के सदस्यों ने इस प्रोटोकॉल के विकास पर मूल्यवान इनपुट दिया। एनएसएफ आईओएस अनुदान 2032985, एनआईएच अनुदान डीपी 5ओडी017851, कनाडा के कार्नेगी इंस्टीट्यूशन अनुदान और कार्नेगी इंस्टीट्यूट फॉर साइंस एंडोमेंट द्वारा वित्त पोषण प्रदान किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bead beating and spot plating
Fly vials Genesee 32-121 autoclavable
Fly vial stoppers Genesee 59-201 autoclavable
Hand Applicator 3M 3M PA1
Heat Sealer Eppendorf 5390
Mini-Beadbeater 96 BioSpec 1001
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm BioSpec  11079105
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner Labnet LI-CF-P1000
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor Mettler Toledo 30296705 Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural USA scientific 1402-9220 Must be polypropylene for heat sealer
Thermal Bond Heat Seal Foil 4titude 4ti-0591 Keep sterile
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile SPL Life Sciences 31001 For making rectangular agar plates
Photobox construction
¼”-20 X ½” Bolts (X2) Amazon ASIN: B07BP1WR3H To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works.
¼”-20 x ½” Connector Nut  Amazon UPC: 799862376780 AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important.
¼”-20 x ¾” bolts (X3) Amazon ASIN: B003QZSZY4 For the plate holder. Brand not important.
1/8” x ½” washer Amazon UPC: 611982484599 Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
18 Gauge Wire - Two Conductor Power Wire - 18 AWG Power Wire – 10ft Superbrightleds.com WP18-2
22-10 AWG Red Wire Nut - WN-R2210 – Quantity 4 Superbrightleds.com WN-R2210
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector - 22-18 AWG – Quantity 3 Superbrightleds.com SCFP-2218
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector - 8mm Single Color LED Strip Lights - Quantity 3 Superbrightleds.com SBL-MA2P-8-2
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor - 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 Superbrightleds.com SBL-MA2P-8-1 
6” drawer handle Amazon ASIN: B07Z331P99 Any drawer handle should work.
6” Drawer slides Btibpse UPC: 712243424979 Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders.
8-32 x ½” Cap Nuts (x4) Amazon ASIN: B00HYLZB98 Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) Amazon ASIN: B07KX9T7NF To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
Acrylic Glue SCIGRIP Ean: 7844908489337 SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle
Black Cable Ties - 10 Pack - 4 Inch Long  Superbrightleds.com CT-B04-10
Camera L-Bracket WLPREOE, Vikerer, Unbranded ASIN: B09X46YKQZ The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example.
Canon T series camera for tethering option OR Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. 1894C002 The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model).
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Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Natural White 4000K – 2 meters  Superbrightleds.com STN-A40K80-B6A-08C1M-24V
Drill with ¼”, 1/8” drill bits Black & Decker ‎BDCDD12PK Brand not important. 
Flat Black Spray Paint,  2X Ultra-Matte Rustoleum 331182 Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important.
Laser Cut Acrylic Walls Big Blue Saw www.bigbluesaw.com Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera 
Mean Well LED Switching Power Supply - LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply - 24V DC - 20 Watt  Superbrightleds.com LPV-20-24
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. DMC-ZS100K Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good.
Quick Release Plate Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch ASIN: B07417F21D Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example.
Rubber Bands, Assorted sizes BAZIC Products Alliance Rubber 26649 Rubber bands go on the plate holder. Brand not important.
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases - 3/4 inch base – Quantity 4 Superbrightleds.com CTMB-20
SPST Round Rocker Switch - No LED – Quantity 3 Superbrightleds.com RRS-SP
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm  Tiffen 72R29
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm Tiffen 7258
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जीव विज्ञान अंक 191
<em>ड्रोसोफिला</em> माइक्रोबायोम पर लागू 96-वेल प्लेट प्रारूप में फास्ट कॉलोनी बनाने वाली इकाई गिनती
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Dodge, R., Ludington, W. B. Fast… More

Dodge, R., Ludington, W. B. Fast Colony Forming Unit Counting in 96-Well Plate Format Applied to the Drosophila Microbiome. J. Vis. Exp. (191), e64298, doi:10.3791/64298 (2023).

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