רגישות יתר למגע (CHS) היא מודל ניסיוני של מורין של דרמטיטיס מגע אלרגי (ACD). CHS מבוסס על רגישות עם hapten תגובתי על ידי צביעת העור המגולח של החזה והבטן, עם אתגר עור אוזן לאחר מכן עם hapten מדולל, הגורם לתגובת נפיחות כי הוא מוערך בדרכים שונות.
רגישות יתר למגע (CHS) היא מודל ניסיוני של דרמטיטיס מגע אלרגי (ACD) שניתן לחקור בעכברים. מחקר זה נועד להציג שיטת מעבדה אובייקטיבית שעשויה לסייע בחקר תגובת CHS בעכברים, אותה ניתן למדוד ולכמת על ידי בדיקות שונות. כדי לגרום ל-CHS, ביום “0”, עכברים היו רגישים לנקודה מגולחת קודם לכן על ידי צביעת עור בטן עם תערובת הפטן 2,4,6-טריניטרוכלורובנזן (TNCB) בתערובת אצטון-אתנול, בעוד שעכברי בקרה שלילית היו רגישים לתערובת אצטון-אתנול לבדה ברכב. ביום “4”, עובי האוזן הבסיסי נמדד במיקרומטר לפני ההתעוררות של CHS (אתגר) על ידי צביעת שתי האוזניים עם TNCB מדולל הן בקבוצות הבדיקה והן בקבוצות הביקורת. לאחר 24 שעות נמדדה נפיחות האוזן במיקרומטר. CHS הוא דוגמה לתגובה חיסונית בתיווך תאי T הגורמת לנפיחות ברקמה מודלקת, המגיעה לשיא של 24 שעות לאחר אתגר העור עם אותו הפטן. עלייה בצקת אוזניים מתואמת עם משקל אוזניים מוגבר, פעילות מיאלופרוקסידאז (MPO), ריכוז ציטוקינים פרו-דלקתיים בתמציות האוזניים, עיבוי מוגבר של הדרמיס האדמטי בבדיקה ההיסטולוגית וחדירות כלי הדם באוזן. כמו כן, נרשמה עלייה בריכוז נוגדני IgG1 ספציפיים ל-TNP בסרה של קבוצת הבדיקה בהשוואה לעכברי הביקורת. בנוסף, ניתן להעביר CHS בהצלחה עם תאי CHS-effector המתקבלים מתורמים שהיו רגישים בעבר ל-TNCB. התאים המשפיעים על CHS ניתנו תוך ורידי לעכברים נמענים תמימים, אשר לאחר מכן אותגרו עם אותו הפטן מדולל. נפיחות באוזן נמדדה במיקרומטר 24 שעות לאחר מכן.
דרמטיטיס במגע אלרגי (ACD) היא מחלה דלקתית נפוצה בעור במדינות מתועשות הנגרמת על ידי תגובת רגישות יתר מסוג IV הנובעת מחשיפה לכימיקלים במשקל מולקולרי נמוך הנקראים הפטנס. החומרים הגורמים לרגישות למגע בבני אדם כוללים יוני מתכות כבדות (כרום, ניקל, ברזל, קובלט), טרפנטין, חומרי ריח, צבעים וחומרים משמרים הנמצאים במוצרי קוסמטיקה (למשל, p-פנילנדיאמין), תרופות מסוימות (למשל, ניאומיצין, בנזוקאין), אנטיביוטיקה β-לקטם (כלומר, פניצילין), כימיקלים המיוצרים על ידי צמחים (pentadecacatechol, חומר הנמצא בקיסוס רעיל), כמו גם הידרוקינון המשמש בתעשיית הצילום 1,2 . חומרים אטיולוגיים ACD גבוהים מאוד מכיוון שיותר מ-100,000 כימיקלים משמשים בתעשייה בלבד, ו-2,000 כימיקלים חדשים מסונתזים מדי שנה. עד כה זוהו יותר מ-3,700 מולקולות שעשויות להיות מגע עם הפטנים/אלרגנים3. תגובת רגישות יתר למגע (CHS) היא מודל ניסיוני של ACD שניתן לחקור בעכברים, שרקנים וחולדות וניתן לגרום לה על ידי יישום עור מקומי של הפטנים כימיים תגובתיים המומסים בממסים אורגניים 4,5,6. מחקר זה נועד לתאר שיטת מעבדה אובייקטיבית שעשויה לסייע בחקר תגובת CHS בעכברים, אותה ניתן למדוד ולכמת על ידי בדיקות שונות.
ה-CHS מורכב משלבי רגישות (אינדוקציה) ואפקטור (אתגר). במודלים של בעלי חיים, הפטנים נקשרים תחילה באופן קוולנטי לחלבונים בגוף כדי ליצור ניאו-אנטיגנים. במהלך שלב הרגישות, קרטינוציטים מופעלים מקדמים את הנדידה וההבשלה של תאים דנדריטיים בעור (sDCs) על ידי ייצור ציטוקים פרו-דלקתיים-נמק סרטניים α (TNF-α) ואינטרלוקין 1β (IL-1β)7. תאי לנגרהנס אפידרמליים (LCs) מציגים אנטיגנים במהלך אינדוקציה CHS ושלבי אפקטור8. LCs שנחשפו להפטן במהלך הרגישות מקדמים את האינדוקציה של תאי הוויסות והאפקט9. עדויות הולכות וגוברות ממספר מחקרים מצביעות על כך שתגובות CHS ניתנות לתיווך על ידי תאי Th1 מוגבלים מסוג CD4+ MHC Class II, המשחררים באופן מקומי אינטרפרון-γ (IFN-γ) כדי להשתמש בהחדרה דלקתית אופיינית, לימפוציטים מוגבלים ב-Tc1 מסוג CD8+ MHC מסוג I שיכולים גם לשחרר Γ IFN אך בעיקר לתווך נזק ציטוטוקסי לקרטינוציטים, וכעת גם אינטרלוקין 17 (IL-17)-המייצרים תאי Th1710, 11.
פותחו מספר מודלים שונים של CHS המשתמשיםבמינים שונים 1 2,13,14 והפטנים (השוואה מפורטת של הפטנים, ממסים שונים וזמן היישום מסוכמת בטבלה 1). העכבר, מין מעבדה הנפוץ, מציע כמה יתרונות בחקר CHS. ישנם יותר זנים, נוקאאוטים (KO) ובעלי חיים מהונדסים בקרב עכברים בהשוואה למינים אחרים, מה שהופך אותם לחיה מושכת מאוד15. בנוסף, מודל CHS דורש בעלי חיים רבים, ועכברים הם חסכוניים יותר כאן. מודלים של בעלי חיים אינם מחקים ACD בכל ההיבטים; בפרט, הם מראים קרום ו desquamation, אשר אינו נפוץ עבור בני אדם 16,17. המאפיינים של מחלה כרונית הם מאתגרים להתרבות, בעיקר משום המודל המתואר אינו מניח את היישום של hapten במשך תקופה ארוכה של זמן. עם זאת, אושר כאן כי רבים מההיבטים המשמעותיים של ACD משוחזרים. כמו כן הוכח כי, כמו בבני אדם, תכונות אלה קשורות לתגובות אלרגיות מקומיות. הבחירה של hapten, הממס שלה, ואת היישום שלה המתואר בפרוטוקול זה הוכתבו על ידי העובדה כי התוצאות אושרו על ידי בדיקות מבחנה רבות וכי הוא נבדק ושונה במעבדה במשך שנים רבות עד הגרסה הנוכחית הוקמה. מודלים של מורין מאפשרים ניתוח של תת-קבוצות תאים או ציטוקינים המעורבים בפיתוח ACD וחיוניים להערכות פרה-קליניות של טיפולים חדשים.
CHS מושרה באמצעות haptens, אשר נקשרים לאנטיגנים של חלבון עצמי בעור, ויוצרים ניאו-אנטיגנים. CHS מתווך על ידי גיוס חוץ-וסקולרי מקומי של תאי T ספציפיים לאנטיגן, מה שגורם לנפיחות ברקמה המאותגרת, המגיעה לשיא של 24 שעות לאחר חשיפת העור המשני לאותו הפטן6. הנפיחות של הרקמה נגרמת בעיקר על י?…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי SUBZ subvention. A020.22.060 של האוניברסיטה הרפואית בוורוצלב, פולין, ועל ידי מענקים ממשרד המדע וההשכלה הגבוהה N N401 545940 לטרשת נפוצה ו- IP2012 0443 72 ל- MMS.
70% ethanol | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 65350-M | for surface disinfection |
96-well flat-bottom plates, polypropylene | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria | 655101 | for MPO and Evans blue measurement – plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind |
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 179124 | |
Aluminum foil | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z185140 | |
Analytical balance | Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany | PRACTUM224-1s, 29105177 | |
Automated tissue processor | MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India | MTP-E-212 | automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin |
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum) | Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA | BD 366882 | |
Bicinchoninic acid kit for protein determination | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | BCA1-1KT | |
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1 | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 553441 | |
BSA (bovine serum albumine) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | A9418 | protein assays & analysis, 2 mg/mL |
Cell strainer, pore size 70 μm | BIOLOGIX, China | 15-1070 | suitable for 50 mL tubes |
Coverslip | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 631-1583 | 24 mm, but it possible to use different size |
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z740301, Z740302, Z740303 | |
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14190144 | no calcium, no magnesium, mammalian cell culture |
DPX Mountant for histology | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 6522 | mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam |
Dumont 5 tweezers – straight | Animalab, Poznan, Poland | 11251-10FST | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Dumont 7 tweezers – bent | Animalab, Poznan, Poland | 11272-50FST | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Eosin Y solution, alcoholic | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HT110116 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppenforf, Germany | 3,01,20,086 | polypropylene |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL | Eppenforf, Germany | 3,01,20,094 | polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move) |
Ethanol 100% (absolute alkohol) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.07017 | |
Ethanol 96% | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.59010 | |
Evans blue | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | E2129 | |
FBS (fetal bovine serum) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A3160802 | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HT501128 | |
Formamide 99.5% (GC) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F7503 | |
Freezer -20 °C | Bosch, Germany | GSN54AW30 | |
Fridge +4 °C / freezer -20 °C | Bosch, Germany | KGV36V10 | mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL |
Glass microskope slides, SuperFrost Plus | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 | Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining. |
Graph Pad Prism | GraphPad Software Inc. | v. 9.4.0 | |
Grey soap | Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland | Bialy jelen soap bar | grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product |
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.60313 | |
Harris hematoxylin solution | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HHS16 | |
Hemocytometer | VWR, Avantor, U.S.A | 612-5719 | manual counting chamber is recommend, which is more accurate |
Hexadecyltrimethylammonium bromide | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | H5882 | |
Homogenizer | QIAGEN Hilden, Germany | Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 | homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes |
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA | SA-5004-1 | |
Hydrogen peroxide solution (H202) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | H1009 | |
Incubator Heracell 150i | Thermo Electron LED Gmbh, Germany | 41071068 | 37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology |
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection | Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland | cat.# not avaliable | |
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.05108 | |
Laboratory Centrifuge | Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany | B00013899 | speed to 300 x g, with cooling to 4 0C |
Laboratory Centrifuge | Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany | 75002425 | speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C |
Mask (FFP2) | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 111-0917 | for working with ortho-dianisine dihydrochloride |
Mice | Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland | CBA/J, C57BL/6 | |
Micrometer | Mitutoyo, Tokyo, Japan | 193-111 | digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml |
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test) | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria | 655061 | with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays |
Microscope with objectives | Leica Microsystems CMS GmbH, Germany | DM1000, 294011-082007 | histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD |
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | M6908 | |
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | S9390 | |
Olive-oil | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 75343 | pure, natural |
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 555138 | |
Ortho-dianisine dihydrochloride | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | D3252 | |
Paraffin wax | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 76242 | beads, waxy solid |
PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 20012027 | pH 7.2, mammalian cell culture |
ph meter | Elmetron, Poland | CP-401 | |
Pipettes, variable volume with tips | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | EP3123000900-1EA | 3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S. |
Razor blade | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | PERS94-0462 | scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped |
Rotary microtome | MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK | HIS-202A | |
Scissors – straight, sharp / sharp | Animalab, Poznan, Poland | 14060-10FST | Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Screw cap (open top) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 27056 | black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread |
Spectrophotometer | BioTek Instruments, U.S.A | 201446 | universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 – 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 – 4.000 Abs |
Staining dish 20 slides with rack | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | S6141 | e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle |
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm | Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA | 33-36 | |
Surgical scissors | Animalab, Poznan, Poland | 52138-46 | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Tissue processing cassettes | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z672122 | tissue processing/ embedding cassettes with lid |
TMB Substrate Reagent Set | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | |
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene) | Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan | C0307 | |
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl) | Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA | T-5050 | |
T-PER (tissue protein extration reagent) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 78510 | |
Tubes 15 mL sterile | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430055 (Corning) | polypropylene, conical bottom |
Tubes 50 mL, sterile | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430290 (Corning) | polypropylene, conical bottom |
Tween 20 | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | P1379 | |
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 27173 | for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate |
Water bath | AJL Electronic, Poland | LW102 | |
Wax (paraffin) dispenser | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 114-8737 | |
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection | Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland | cat.# not avaliable | |
Xylene (histological grade) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 534056 |