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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

アレルギー性接触皮膚炎のマウスモデルとしての接触過敏症

Published: September 26, 2022 doi: 10.3791/64329
Automatic Translation
1, 2, 1, 3
1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

ERRATUM NOTICE

Summary

接触過敏症(CHS)は、アレルギー性接触皮膚炎(ACD)のマウス実験モデルである。CHSは、胸部および腹部の剃毛された皮膚を塗ることによって反応性ハプテンによる感作に基づいており、その後の耳の皮膚の課題を希釈ハプテンで、様々な方法で評価される腫脹反応を引き起こす。

Abstract

接触過敏症(CHS)は、マウスで研究することができるアレルギー性接触皮膚炎(ACD)の実験モデルである。この研究は、様々な試験によって測定および定量化することができるマウスにおけるCHS反応を研究するのに役立つかもしれない客観的な実験室法を提示することを目的としている。CHSを誘導するために、「0」日目に、マウスをアセトン - エタノール混合物中のハプテン2,4,6−トリニトロクロロベンゼン(TNCB)による腹部皮膚塗装によって予め剃毛したスポット上で感作し、一方、陰性対照マウスは、ビヒクル単独 - アセトン - エタノール混合物で偽感作した。「4」日目に、試験群および対照群の両方で希釈TNCBで両耳を塗ることによってCHSの惹起(チャレンジ)の前にベースライン耳厚をマイクロメーターで測定した。24時間後、耳の腫れをマイクロメーターで測定した。CHSは、炎症を起こした組織に腫脹を引き起こすT細胞媒介性免疫応答の一例であり、同じハプテンによる皮膚チャレンジの24時間後にピークに達する。耳水腫の増加は、耳の体重の増加、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性、耳抽出物中の前炎症性サイトカイン濃度、組織学的検査における浮腫性真皮の肥厚の増加、および耳の血管透過性と相関した。対照マウスと比較した場合、試験群の血清中のTNP特異的IgG1抗体の濃度も増加した。さらに、CHSは、以前にTNCBで感作されたドナーから得られたCHSエフェクター細胞を用いて首尾よく転写することができる。CHSエフェクター細胞をナイーブレシピエントマウスに静脈内投与し、その後、同じ希釈ハプテンでチャレンジした。耳の腫れは、24時間後にマイクロメーターで測定した。

Introduction

アレルギー性接触皮膚炎(ACD)は、ハプテンと呼ばれる低分子量化学物質への曝露に起因するIV型過敏反応によって引き起こされる先進国における一般的な皮膚炎症性疾患である。ヒトにおける接触感作を引き起こす物質には、重金属イオン(クロム、ニッケル、鉄、コバルト)、テルペンチン、化粧品中に存在する香料、染料、および防腐剤(例えば、パラフェニレンジアミン)、いくつかの薬物(例えば、ネオマイシン、ベンゾカイン)、βラクタム系抗生物質(すなわち、ペニシリン)、植物によって産生される化学物質(ペンタデカカテコール、ポイズンツタに存在する物質)、ならびに写真産業で使用されるヒドロキノンが含まれる1,2.ACD病因薬は、産業だけで100,000以上の化学物質が使用され、毎年2,000の新しい化学物質が合成されているため、非常に高いです。現在までに、ハプテン/アレルゲンに接触している可能性のある3,700以上の分子が同定されています3。接触過敏反応(CHS)は、マウス、モルモット、ラットで研究することができ、有機溶媒に溶解した反応性化学ハプテンの局所皮膚適用によって誘発され得るACDの実験モデルである4,5,6。この研究は、様々な試験によって測定および定量化することができるマウスにおけるCHS反応を研究するのに役立つかもしれない客観的な実験室法を記述することを目的としている。

CHSは感作(誘導)相とエフェクター(チャレンジ)相からなる。動物モデルでは、ハプテンはまず体内のタンパク質に共有結合してネオ抗原を作り出します。感作期の間、活性化ケラチノサイトは、炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子α(TNF-α)およびインターロイキン1β(IL-1β)7を産生することにより、皮膚樹状細胞(sDC)の遊走および成熟を促進する7。表皮ランゲルハンス細胞(LC)は、CHS誘導およびエフェクター相8の間に抗原を提示する。感作中にハプテンに曝露されたLCは、調節細胞およびエフェクター細胞の両方の誘導を促進する9。いくつかの研究からの証拠の増加は、CHS応答が、CD4+ MHCクラスII制限性Th1細胞、特徴的な炎症性浸潤物を採用するためにインターフェロンγ(IFN-γ)を局所的に放出すること、IFN-γも放出することができるが、ほとんどがケラチノサイトへの細胞傷害性損傷を媒介するCD8+ MHCクラスI制限性Tc1リンパ球、および現在インターロイキン17(IL-17)産生Th17細胞10によって媒介され得ることを示唆している。11.

様々な種1 2、13、14およびハプテンを用いたいくつかの異なるCHSモデルが開発されている(異なるハプテン、溶媒、および適用時間の詳細な比較は表1に要約されている)。頻繁に使用される実験種であるマウスは、CHSの研究においていくつかの利点を提供する。マウスには他の種に比べて系統、ノックアウト(KO)、トランスジェニック動物が多く、非常に魅力的な動物となっています15。さらに、CHSモデルには多くの動物が必要であり、マウスはここでより経済的です。動物モデルは、すべての面でACDを模倣するわけではない。特に、彼らは人間には一般的ではない痂皮と落屑を示しています16,17。慢性疾患の特徴は、主に記載されたモデルが長期間にわたってハプテンの適用を想定していないため、再現が困難である。しかし、ACDの重要な側面の多くが再現されていることがここで確認されています。また、ヒトと同様に、これらの特徴は局所アレルギー反応と関連していることも示されている。このプロトコルで概説されているハプテン、その溶媒、およびその用途の選択は、結果が多数のインビトロ試験によって確認されており、現在のバージョンが確立されるまで長年にわたって実験室で試験および修正されたという事実によって決定された。マウスモデルは、ACDの発症に関与し、新しい治療法の前臨床評価に不可欠な細胞サブセットまたはサイトカインの分析を可能にする。

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Protocol

この記事で紹介したすべての実験は、クラクフの第1回動物実験に関する地方倫理委員会のガイドラインに従って実施されました。記載されているすべての手順は、特にケタミン/キシラジンを麻酔薬として使用すること、耳の両側を使用して物質/ハプテンを塗布すること、耳を切り落とすこと、および眼球除去による血液の採取に関して、地元の勧告に従って実施された。本研究には、生後6~12週のBALB/c(ハプロタイプH-2d)、CBA/J(H-2k)、およびC57BL/6(H-2b)雄および雌マウスが用いられた( 資料表参照)。統計的有意性のためには、マウスの各群が10〜12匹の動物からなる場合が最善である。

1. 動物用製剤

  1. すべての手順の前後に70%エタノール溶液で手術台を清掃してください。無菌条件を必要とするマウスを使用する場合は、すべての操作をバイオセーフティキャビネットで実行してください。

2. 識別のためのマーキングマウス

  1. #0 - マークなし、#2 - 右前足、#3 - 右前足、#4 - 右後足、#5 - 尾の付け根、#6 - 左後足、#7 - 左側、#8 - 左前足。
    注:誘導された反応のために、マウスは耳打ちまたはタグ付けによって古典的にマークすることができない。マウスを標識しながら麻酔をかけなかった。

3. CHSの誘導

メモ: この手順を 図 1 に示します。

  1. 以下の手順に従って感作(誘導)を行います。
    1. 「0」日目に、灰色の石鹸を水で塗り、カミソリの刃で剃ることによって、胸部と腹部(正方形2cm x 2cm)のマウスを剃る。
      注:ハプテンを塗布する前に、皮膚が刺激されないように6時間待ってください。
    2. 5%ハプテン:2,4,6-トリニトロクロロベンゼン(TNCB、 材料表を参照)をアセトン-エタノール混合物(比率1:3)またはビヒクル単独(アセトン-エタノール)で調製する。ガラスバイアルで使用する直前に溶液を調製し、バイアルをアルミニウム箔で覆って光から保護します。
    3. 同じ日に、以前に剃毛したスポットに5%ハプテンの150μLを塗布することによってマウスを感作させる。対照マウスの群において、非特異的炎症反応を評価するためにビヒクルを単独で適用する。動物をケージに戻す前に、30秒待ってハプテンを乾燥させます。
      警告: 手袋を使用してください。TNCBは、ほとんどの人に重度のアレルギー反応を引き起こす。
  2. 惹起(チャレンジ)と耳の腫れ測定を行います。
    1. 「4」日目に、アセトン - エタノール混合物(比1:1)中の0.4%ハプテン:TNCBを調製する。ガラスバイアルで使用する直前に溶液を調製し、バイアルをアルミニウム箔で覆って光から保護します。
    2. 深い麻酔のために、ケタミン(90〜120mg / kg)およびキシラジン(5〜10mg / kg)の混合物の腹腔内(すなわち)注射( 材料表を参照)でマウスを麻酔する。マウスがつま先のつまみで少なくとも5分間完全に麻酔をかけていることを確認します。
    3. 実験群を知らない観察者によってマイクロメーター( 材料表を参照)で耳の厚さ(0時間測定、ベースライン)を測定します。
    4. 両群の耳の両側に0.4%ハプテンを10μL塗布する(試験および対照)。動物をケージに戻す前に、30秒待ってからハプテンを乾燥させます。
    5. ハプテン塗布後24時間の「5」日目に、24時間の測定のためにステップ3.2.2-3.2.3を繰り返します。
    6. ハプテンによるチャレンジの前後の耳介の厚さの差を計算することによってCHS応答を評価する:24時間の耳の厚さ(μm)-0時間の耳の厚さ(μm)。各耳を別々の測定値として数えます。次に、耳の腫れをマイクロメートル(μm)±平均の標準誤差(SEM)で表した(表2、 図3)。

4. 耳生検

  1. 耳の厚さを24時間測定した直後(マウスがまだ深い麻酔下にある場合)に、はさみで頭蓋骨の近くにできるだけ耳を切り落とします。生検パンチを用いて直径6mmのパンチを作って、耳の遠位側から生検を採取する( 材料表参照)。
    1. 耳の重量を測定し(ステップ4.2)、さらに同じ耳生検で以下の試験のいずれかを実行します:ミエロペルオキシダーゼ(MPO)アッセイ(ステップ4.3)または耳抽出物中のサイトカイン濃度の インビトロ 測定(例えば、IFN-γ、IL-17A、TNF-α[ステップ4.4])。
      注:採血前に耳を切ってください。この手順の後、マウスを安楽死させなければならない(例えば、子宮頸部脱臼によって)。
  2. 分析天秤で各耳生検の重量を測定し、ミリグラム(mg)で表します(図4)。
  3. 以下のステップに従ってMPOアッセイを行う。
    1. 0.5%ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを50mmolのリン酸緩衝液KH2PO4/Na2HPO4に溶解し、pHを6.0に調整して均質化緩衝液を調製する(室温、RTで使用)。
    2. 直径5mmのステンレス製ビーズ(ビーズ/バイアルを2個追加)を備えたホモジナイザーを使用して、500 μLの調製バッファーを含む2 mLの微量遠心チューブで生検を10分間ホモジナイズします( 材料表を参照)。次に、サンプルを4°Cで15分間冷却し、さらに10分間均質化する。
      注:マイクロ遠心チューブは、ビーズが簡単に移動できるように丸い底部を備えています。
    3. ホモジネートを−20°Cで30分間凍結する。解凍と渦(サンプルが解凍されていることを確認してください)。この手順を 3 倍繰り返します。
    4. ホモジネートを3,000 x g で4°Cで30分間遠心分離する。 ピペットで上清を収穫する。MPO活性をタンパク質1mg当たりの単位(U)で表す。
      メモ: プロトコルはここで一時停止できます。サンプルは-20°Cで3ヶ月間安定しています。
    5. MPO活性を測定するには、上清20 μLとMPO基質200 μL(50 mmolのKH 2 PO 4/Na2HPO4バッファーに0.167 mg/mLのオルトジアニシン二塩酸塩を5 x 10-4%H20 2)を混合して酵素反応を行い、96ウェル平底プレートに添加します。プレートをRTで20分間インキュベートする。
    6. 200 μLのMPO基質中の0.008 Uから0.5 Uまでの濃度で20 μLのMPO標準物質を用いて標準曲線を作製する。MPO基板のみでブランクサンプルを作製する。
      警告: オルトジアニシン二塩酸塩を使用する際には、マスクを使用してください。
      注:プレートはポリプロピレン製でなければならず、タンパク質やDNAが結合しないように結合能力が低い。
    7. λ=460nmの波長における光学密度(OD)を測定する。酵素反応は10分間安定である。検量線から試験サンプル中のMPO活性を読み取ります。
    8. タンパク質濃度を測定するには、20 μLの上清を使用し、タンパク質測定用ビシンコニン酸キット( 材料表参照)で試験を行い、λ = 562 nmでODを測定します(図5)。
  4. 耳エキス中のサイトカインの インビトロ 測定を行う。
    1. 直径5 mmのステンレス製ビーズ(ビーズ/バイアルを2個追加)を備えたホモジナイザーを使用して、500 μLの組織タンパク質抽出試薬(T-PER)を含む2 mLの微量遠心チューブでRTで耳生検を10分間ホモジナイズします。次に、サンプルを4°Cで15分間冷却し、さらに10分間均質化する。
      注:マイクロ遠心チューブは、ビーズが簡単に移動できるように丸い底部を備えています。
    2. ホモジネートを3,000 x g で4°Cで30分間遠心分離する。
      メモ: プロトコルはここで一時停止できます。サンプルは−80°Cで6ヶ月間安定しています。
    3. 市販のELISAセット(例えば、IFN-γ)を用いてサイトカインレベルを評価し( 材料表を参照)、製造業者の指示に従って(図6)。

5. 耳組織の組織学

  1. 耳の厚さを24時間測定した直後に、マウスがまだ深く麻酔をかけられたら、はさみでできるだけ頭蓋骨の近くで耳を切り落とします(ステップ4.1)。
    注:この手順の後、マウスを安楽死させる必要があります(例えば、子宮頸部脱臼によって)。
  2. 以下の手順に従って組織ブロックのパラフィン包埋を行う。
    1. 除去直後に、耳を〜10mLの10%ホルマリンに入れ、24時間置く。
    2. 耳を組織処理カセットに入れます。脱水サイクル(RTでそれぞれ70%、90%、100%、30分)、クリアリングサイクル(キシレン3倍、RTで各30分)、およびワックス浸潤サイクル(パラフィン3倍、56°Cでそれぞれ30分)のために、カセットを自動プロセッサ( 材料表を参照)に入れます。
    3. 自動プロセッサーからカセットを取り外し、必要に応じて加温プレートをつかみます。ワックス型に暖かいワックス(ディスペンサーから)を充填します。
    4. 温めた鉗子でカセットからセクションを取り出し、金型に入れます。次に、カセットベースを金型の上部に置き、さらにワックスで塗ります。パラフィンが固化して試験片を含むブロックを形成するように、コールドプレート上の冷水に30分間置く。
    5. 回転ミクロトーム( 材料表を参照)を使用して、厚さ約5μmの切片を切断します。セクションを温かいお風呂に浮かべて平らにします。ガラス顕微鏡スライドに切片を拾います。RTで乾燥させて、セクションがスライドに付着していることを確認します。
      メモ:染色中の組織切片の損失を防ぐために、接着材料やタンパク質コーティングを塗布する必要がなくなるスライドを使用してください。
  3. ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色を行う。
    1. キシレン(4皿)、100%エタノール(無水アルコール)(4皿)、90%エタノール、80%エタノール、70%エタノール、50%エタノール、PBS(3皿)、ヘマトキシリン溶液、エオジン溶液で17の染色皿を準備する。以下の手順に従ってスライドを1つの皿から次の皿に移し、RTですべてを実行します。
      注:各皿の手順は約10倍繰り返すことができます(例えば、20スライドの皿を使用する場合、液体を変えずに200枚の汚れを作ることができます)。
    2. インキュベーター内で65°Cで30分間インキュベートすることにより切片を脱パラフィン化する。スライドをキシレンに30分間浸します。新しいキシレン中で1倍を30分間繰り返します。
    3. スライドを100%エタノールに5分間浸漬する。新しい100%エタノール中で1倍を5分間繰り返します。スライドをエタノール列に、90%、80%、70%、および50%、各希釈液に2分間浸漬する。
    4. スライドをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に5分間浸漬する。ティッシュの周りやスライドの裏側から余分な液体を拭き取ります。
    5. 切片をヘマトキシリン溶液( 材料表を参照)で7〜8分間染色する。断面を傷つけないように、裏側から流水で30秒間洗ってください。手順 5.3.4 を繰り返します。
    6. エオジン溶液( 材料表を参照)でセクションを30秒間染色します。手順 5.3.5 で説明したように洗浄してから、手順 5.3.4 を繰り返します。
    7. スライドを100%エタノール(無水アルコール)に2分間浸漬する。新しい100%エタノール中で1倍を2分間繰り返します。
    8. スライドをキシレンに5分間浸します。新しいキシレンで1xを5分間繰り返します。
    9. RT でセクションを 15 分間空気乾燥させます。カバースリップに取り付け用媒体 ( 材料表を参照) を 1 滴加え、セクションの上部に置きます。
  4. 倍率20倍または40倍の光学顕微鏡で断面を調べ、画像を撮影します(図7)。

6. 血管透過性試験

注:耳の厚さ測定と交互に、血管透過性試験を行うことができます。

  1. 「0」日目にマウスを感作し(ステップ3.1.1-3.1.3)、次いで「4」日目にマウスを麻酔し(ステップ3.2.2)、耳に直接ハプテンを塗布し(ステップ3.2.4)、0時間の耳測定を省略する。
  2. チャレンジ後23時間で、マウスを麻酔する(ステップ3.2.2)。
  3. 静脈内(すなわち)8.3 μL/g体重の1%エバンスブルー染料( 材料表を参照)をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に注入する。
  4. エバンスブルー注射後、マウスを再び深い麻酔(ステップ3.2.2)-1時間後に麻酔する。
  5. 耳生検を採取する(ステップ4.1)。
    注:この手順の後、マウスを安楽死させる必要があります(例えば、子宮頸部脱臼によって)。
  6. 組織から色素を抽出し、1mLのホルムアミドを含むチューブにイヤーパンチを入れ、5%CO2 の雰囲気中で37°Cで18時間インキュベートする。
  7. 生検を 3,000 x g で RT で 3 分間遠心分離します。上清をピペットで回収します。
  8. ホルムアミドを含むブランクに対して96ウェル平底プレートでλ=565nmの波長でODを測定する。色は24時間安定しています。標準曲線から試験サンプルの濃度を読み取ります(0.2~30 μgの色素/mLホルムアミドの範囲のエバンスブルーの濃度を使用)(図8)。
    注:プレートはポリプロピレン製でなければならず、タンパク質やDNAが結合しないように結合能力が低い。

血清採取および抗TNP免疫グロブリン(IgG1)抗体測定

  1. 耳生検を採取した後(ステップ4.1)、マウスがまだ深い麻酔下にあるときは、ピンセットで眼球を取り出し、マウスに穏やかな圧力をかけ、眼窩後洞からチューブに血液を採取する(血清を得るためのゲル付きバイアル、 材料表を参照)。血液を採取する別の方法は、注射器で心臓を穿刺し、血液を収集することである。
    注:耳を取り外した後、血液を採取する必要があります。血液パラメータの潜在的な違いのために、同じ出血方法が研究全体にわたって使用されなければならない18。この手順の後、マウスを安楽死させなければならない(例えば、子宮頸部脱臼によって)。
  2. 最低6倍に反転させ、血液が凝固するまで30分待ってから、RTで1,300-2,000 x g で10分間遠心分離します。
    メモ: プロトコルはここで一時停止できます。サンプルは−20°Cで6ヶ月間安定です。
  3. 96ウェル平底プレートを、10 μg/mLの協奏でDPBSに溶解した2,4,6-トリニトロフェニル(TNP-BSA)と結合させた50 μLのウシ血清アルブミンでコーティングします。次に、DPBS(バックグラウンド)に溶解したウシ血清アルブミン(BSA)のみを10μg/mLの濃度で2枚目のプレートをコーティングします。4°Cで一晩インキュベートする。
    注:マウス血清にはBSAに対する抗体(Abs)が含まれているため、サンプルを両方のプレートでテストする必要があり、次に計算を行う必要があります(OD TNP-BSA - OD BSA)。
  4. プレートを0.05%Tween 20を含む300μLのDPBSで洗浄します。3 倍繰り返します。
  5. アッセイ希釈剤(AD)を調製する:1%BSAを含むDPBS。RT で 1 時間 AD でウェルをブロックし、もう一度洗浄します (ステップ 7.4)。
  6. 内部標準物質(iSTD)を調製する:マウスをTNCBで感作し(ステップ3.1.1-3.1.3)、感作後10日目にすべてのドナーから血清を収集してポーリングする(ステップ7.1およびステップ7.2)。
  7. 標準曲線を作製するためにADで希釈した段階的な濃度のiSTDの50μLをプレートに加える( 表3に記載)。50 μLの血清サンプルをプレートに加える。両方のプレート(TNP−BSAおよびBSAコーティング)で各サンプルおよび標準曲線を試験する。RTで2時間インキュベートし、プレートを洗浄します(ステップ7.4)。
  8. ADで1:250に希釈したビオチン化抗マウスIgG1モノクローナル抗体(mAb、 材料表を参照)を50μL加え、RTで1時間インキュベートする(ステップ7.4)。
  9. ADで1:2000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼストレプトアビジン(HRDストレプトアビジン、 材料表参照)50μLを加え、暗所でRTで30分間インキュベートする。プレートを洗う(ステップ7.4)。
  10. 50 μLのTMB基質( 材料表を参照)を加え、暗所でRTで30分間インキュベートします。
  11. 25 μLの1 MH2SO4を添加することによって酵素反応を停止させる;反応は30分間安定である。
  12. 波長λ = 450 nm、バックグラウンド570 nmでODを測定します(バックグラウンドは450 nmの測定ごとに差し引く必要があります)。結果を提示するときは、サンプルおよび標準曲線のTNP-BSAからBSA測定値を差し引く。そして、標準曲線に従って抗体の単位(U)を算出する(図9)。

8. CHSエフェクター細胞の養子移入

メモ: この手順を 図 2 に示します。

  1. ドナー(1人のドナー:1レシピエントの比率で):「0」日目にTNCBでマウスを感作する(ステップ3.1.1-3.1.3)。
  2. 「4」日目に、マウスの深い麻酔を麻酔する(ステップ3.2.2)。
  3. 腋窩および鼠径リンパ節(ALN)および脾臓(SPL)を鉗子で単離する。1 つのバイアルの ALN と別のバイアルの SPL を一緒にプールします。
    注:各腋窩の胸筋の後ろに1つの腋窩リンパ節があります。股関節領域の1つの鼠径リンパ節は、3つの血管の隣に位置している。脾臓は、腸と胃の後ろの体の左側に位置しています19.バイオセーフティキャビネット内の滅菌ツールを使用して、滅菌状態を維持します。この手順の後、マウスを安楽死させなければならない(例えば、子宮頸部脱臼によって)。
  4. 2つの顕微鏡スライドのつや消し端の間のマッシュ組織。細胞懸濁液を孔径70μmのセルストレーナーに通します( 材料表を参照)。
  5. 1%ウシ胎児血清(FBS)を添加したDPBSで細胞を洗浄する。遠心分離機を300 x g で4°Cで10分間遠心分離する。 上清をデカントし、残りの細胞ペレットを1〜5.0mLのDPBSに再懸濁する。
  6. 血球計数器20 を用いて生細胞をトリパンブルーで計数し、10 μLの細胞懸濁液を90〜990 μL(細胞数に応じて)のトリパンブルーと混合する。細胞数を計算する際には希釈率を考慮に入れてください(10x-100x)。
  7. ALNとSPLの混合物(比1:1):200μLのDPBS中で8.0 x106 〜7.0 x 107 /マウスを調製する。
  8. レシピエント(ナイーブ同系マウス):ナイーブレシピエントマウスを麻酔し(ステップ3.2.2)、CHSエフェクター細胞の調製混合物をi.v.に注射する(ステップ8.7)。対照群のマウスでは、細胞を注入しないでください。
  9. チャレンジの前(0時間)と後(24時間)に耳の厚さを測定します(ステップ3.2.1-3.2.6)(図10)。
  10. さらに、単離されたCHSエフェクター細胞について試験を実施する(例えば、細胞表現型決定またはフローサイトメトリーによるCHSエフェクター細胞による産生サイトカインの測定)。細胞培養物も確立することができ、抗原の存在下で増殖するCHSエフェクター細胞の能力、または培養上清中に分泌されたサイトカインの量を21、22 (データは提示されていない)評価することができる。
    注:追加のテストを実行するには、それに応じてより多くの細胞ドナーが必要です。

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Representative Results

CHS誘導のために、動物を、150μLの5%TNCBまたは偽物を用いて、ビヒクル単独で感作した皮膚塗装(腹部) を介して 感作した。「4」日目に、TNCBで以前に接触感作したマウス(試験群)および対照群マウス(偽感作)の両マウスにおいて、0.4%TNCBの10 μLによる接触塗装(チャレンジ)により両耳の耳膨潤応答を誘導した。提示されたデータは、TNCBで感作し、4日後にチャレンジしたマウスが、同様にチャレンジされた偽感作マウスと比較して有意に増加した耳の腫れを発症したことを示している(図3、 表2、試験対対照群)。耳の腫れの結果は、さらなる研究において完全に検証され、マイクロメーターで決定された耳水腫の増加が、増加した耳の重量(図4)、MPO活性(図5)、耳抽出物中のIFN-γ濃度(図6)、組織学的検査における浮腫性真皮の肥厚の増加(図7)、および耳血管透過性(図8).TNP特異的IgG1抗体の濃度の増加は、対照動物と比較した場合、試験マウスの血清においても見出された(図9)。

T細胞媒介性免疫応答の例として、CHSはまた、ナイーブ同系レシピエントマウスに移入され得る。ドナーはTNCB適用によって感作され、続いて、CHSエフェクター細胞がナイーブレシピエントマウスにi.v.投与され、ナイーブレシピエントマウスはハプテンで挑戦され、24時間後にCHSについて試験された(図10)。TNCBで以前に感作されたドナーからCHSエフェクター細胞を投与された動物は、チャレンジのみを受けた(細胞を受けなかった)動物と比較して、有意に増加した耳の腫れを示した。

CHS反応は複雑なメカニズムを持ち、様々な細胞を巻き込んでいます。抗原提示およびT/B細胞活性化は、末梢リンパ器官(例えば、ALNおよびSPL)において起こる。CHSエフェクター細胞はCD4+を枯渇させたが、養子細胞移入前にCD8+細胞は枯渇しなかったため、レシピエントマウスではCHS反応が存在しないことが決定された。これらの細胞は、IFN-γ(T-box転写因子TBX21、Tbet+)およびIL-17A(レチノイン酸受容体関連孤児核内受容体γ、RORγT+)に対して陽性であることが判明した(補足図1)。

代表的な実験から提示された結果は、8〜12週齢でC57BL/6およびCBA/J雄および雌マウスで実施された。動物23の使用、特に減少における3R規則に従って、この記事の目的のために、実験の結果が動物の小群で示されている。グラフ中のデータはSEM±平均として示しており、統計的有意性は p <0.05に設定した。グラフはPrismソフトウェアを使用して描画されました( 材料表を参照)。

Figure 1
図1:CHSの誘導 感作、チャレンジ、耳の測定。略語:CHS=接触過敏反応;TNCB=2,4,6-トリニトロクロロベンゼン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:CHSエフェクター細胞の養子移入。 略語:ALNs=腋窩および鼠径リンパ節;CHS = 接触過敏反応;i.v. = 静脈内;SPL = 脾臓;TNCB=2,4,6-トリニトロクロロベンゼン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:マイクロメーターによる耳の腫れの測定によるTNCBへのCHSの代表的な評価。 マウスをTNCB(試験群)または偽(対照群)感作し、続いて挑戦した。耳介の厚さをチャレンジ前後で測定し、24時間の耳の厚さ(μm)から0時間の耳の厚さ(μm)を差し引くことにより、耳の腫れの差を計算した。耳の腫れはSEM±平均として表され、****p <0.0001、n=10マウス/群( 表2からのデータ)。略語:CHS=接触過敏反応;SEM = 平均の標準誤差;TNCB=2,4,6-トリニトロクロロベンゼン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:耳の重さの測定によるCHSの代表的な評価。 耳の重さは、耳の腫れに対応するパラメータの1つです。マウスをTNCB(試験群)または偽(対照群)感作し、続いて挑戦した。チャレンジ後24時間で、取り外した耳から直径6mmのパンチを採取した。パンチは、分析実験室の天秤に計量された。耳の重量はSEM±平均としてミリグラム(mg)で表され、***p <0.001、n = 10マウス/群であった。略語:CHS=接触過敏反応;SEM = 平均の標準誤差;TNCB=2,4,6-トリニトロクロロベンゼン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:MPO活性の代表的な評価 組織抽出物中のMPO活性の増加は、耳の炎症と相関する。TNCB感作マウス(試験群)および偽感作マウス(対照群)をチャレンジした。チャレンジ後24時間で、耳を摘出し、直径6mmの耳のパンチを抽出して処理した。MPO活性は、タンパク質含有量あたりのU(タンパク質のU/g)で表されます。SEM±平均として表示された結果、**p <0.01、n = 5-6マウス/群。略語:CHS=接触過敏反応;MPO = ミエロペルオキシダーゼ;SEM = 平均の標準誤差;TNCB=2,4,6-トリニトロクロロベンゼン;U = 単位。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:耳エキス中のサイトカイン産生−IFN−γ濃度の代表的な評価。 マウスをTNCB(試験群)または偽(対照群)感作し、続いて挑戦した。チャレンジ後24時間で、耳を摘出し、直径6mmの耳のパンチを採取した。IFN−γの濃度を、ELISAにより組織ホモジネート中で決定した。結果はSEM±平均として示され、*p <0.05、n = 5マウス/グループであった。略語:CHS=接触過敏反応;IFN-γ = インターフェロンガンマ;SEM = 平均の標準誤差;TNCB=2,4,6-トリニトロクロロベンゼン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:耳組織の代表的な組織像。ヘマトキシリンおよびエオジン染色。マウスをTNCB(試験群)または偽(対照群)感作し、続いて挑戦した。(A-C)試験群における組織学的検査は、主に真皮における炎症性細胞(単核球および多形核球)の濃度の有意な増加に現れ、表皮における微小膿瘍形成を伴った。浮腫性真皮の肥厚および肥厚した過形成性表皮も認められた。(D-E)制御グループ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 8
図8:代表的な血管透過性試験。 観察された耳組織浮腫は、血管透過性の増大の結果である。血管透過性の変化を決定するために、マウスをTNCB(試験群)または偽(対照群)感作し、次いで4日後にチャレンジした。チャレンジの23時間後に、エバンスブルーを注射し、エバンスブルー注射の1時間後に動物を安楽死させ、直径6mmの耳のパンチを行った。結果はSEM±平均として示され、**p <0.01、n = 5マウス/群であった。略語:CHS=接触過敏反応;SEM = 平均の標準誤差;TNCB=2,4,6-トリニトロクロロベンゼン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 9
図9:代表的な抗TNP IgG1抗体測定。 血清中の抗TNP IgG1抗体の濃度を、偽感作(対照)およびTNCB感作(試験群)マウスにおいてハプテンTNCBによるチャレンジの24時間後に測定した。採取した血清をELISAにより抗体濃度について試験した。結果はSEM±平均として示され、***p <0.001、n = 10マウス/グループであった。略語:CHS=接触過敏反応;IgG1=免疫グロブリンGサブクラス1;SEM = 平均の標準誤差;TNCB=2,4,6-トリニトロクロロベンゼン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 10
図10:CHSエフェクター細胞の代表的な養子移入。 CHSエフェクター細胞を、TNCBで感作したドナーから得た。次に、回収した免疫細胞をナイーブ同系レシピエントに注射し、すなわち、CHSエフェクター期の惹起について挑戦した。対照群のマウスは、チャレンジの前にいかなる細胞も受けなかった。耳介の厚さは、チャレンジの前後に測定した。SEM±平均として示された結果、***p <0.001、n = 7マウス/グループ。略語:CHS=接触過敏反応;SEM = 平均の標準誤差;TNCB=2,4,6-トリニトロクロロベンゼン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

マウスのひずみ 感作液(用量)
剃毛された腹部に		 惹起液(用量)
耳の両側に/ s		 感作・惹起日 参照
BALB/c (H-2d);C57BL/6 (H-2b)
TCRδ-/-, β2m-/-, CD1d-/- (B10 PL (H-2 u バックグラウンド)		 アセトン-オリーブオイル混合物中の0.5%DNFBの25μL(比率4:1) アセトン-オリーブオイル混合物中の0.1%DNFBの5μL(比率4:1) 0 / 5 22
C57BL/6 (H-2b) アセトン-オリーブオイル混合物中の0.5%DNFBの50μL(比率4:1) アセトン-オリーブオイル混合物中の0.2%DNFBの25μL(比率4:1) 0 / 5 32
C57BL/6 (H2b);IL-17A-/- (C57BL/6 バックグラウンド) アセトン-エタノール混合物中の5%TNCB150μL(比1:3) オリーブオイル - アセトン混合物中の0.4%TNCBの10μL(比1:1) 0 / 4 33
CBA/J (H-2k);C57BL/6 (H-2b)
TLR2-/-, MyD88-/-, IL-17A-/- (C57BL/ 6 バックグラウンド)		 アセトン-エタノール混合物中の5%TNP-Cl(TNCB)150μL(比1:3) オリーブオイル - アセトン混合物中の0.4%TNP-Cl(TNCB)10μl(比1:1) 0 / 4 21
C57BL/6 (H-2b);BALB/c (H-2d) アセトン中の1%TNCBを25μL含有 アセトン中の0.1または0.2%TNCBの10μL(および1%までより高い) 0 / 7 34
C57BL/6 (H-2b);TLR2-/-/ TLR4-/-
(C57BL/6背景のダブルノックアウトマウス)		 アセトン中の3%TNCBを100μL含有 アセトン中の1%TNCBの20μL(耳の裏側だけ) 0 / 5 31
C57BL/6 (H-2b)
MHCクラスII欠損マウス(C57BL/6バックグラウンド)		 アセトン-オリーブオイル混合物中の3%TNCB100μL(比率4:1) アセトン - オリーブオイル混合物中の0.5または1%TNCBの20μL(比率4:1) 0 / 6 35
C57BL/6 (H-2b) アセトン中の7%TNCBを100μL含有 20 μL 1 % TNCB アセトン中 0 / 5 36
C57BL/6 (H-2b) 100 μL 3 % OX エタノール中 エタノール中の20 μL 1 % OX 0 / 5
C57BL/6 (H-2b);CD4-/-, CD8-/- (C57BL/ 6 背景) アセトン - オリーブオイル中の0.5%DNFBの25μL(比率4:1) アセトン - オリーブオイル中の0.2%DNFBの10μL(比率4:1) 0 / 5 10
C57BL/6 (H-2b);CD4-/-, CD8-/- (C57BL/ 6 背景) 150 μL の 3 % OX アルコール - アセトン中 (比率 3:1) 10 μL アルコール - アセトン中の1% OX(比率3:1) 0 / 5
C57BL/6 (H-2b);C3H/HeN (H-2k);TLR4-/- (C3H/HeJの背景);MyD88-/- (C57BL/6 背景) 100 mg/耳 10 % NiCl2 の白い ワセリンの両耳の背側 10 % NiCl2 白色ワセリン中 0,1,2 / 23, 24 37
NOD (H-2g7) MyD88-/- (NOD の背景) アセトンおよびフタル酸ジブチル中の0.5%FITCの400μLの アセトンおよびフタル酸ジブチル中の0.1%FITCの10μLの 0 / 5 25

表1:様々な研究におけるCHSモデルの比較。 略語:DNFB=1-フルオロ-2,4-ジニトロベンゼン;FITC=フルオレセインイソチオシアネート;NiCl2 = 塩化ニッケル (II) ;TNCB=2,4,6-トリニトロクロロベンゼン;TNP-Cl=トリニトロフェニルクロリド;OX = オキサゾロン。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

制御グループ (負) 試験区(CHS反応)
マウス#耳:L、R 0 時間の耳の厚さ [μm] 24時間耳の厚さ[μm] 24 時間 – 0 時間の耳の厚さ [μm] マウス#耳:L、R 0 時間の耳の厚さ [μm] 24時間耳の厚さ[μm] 24 時間 – 0 時間の耳の厚さ [μm]
1リットル 365 380 15 1リットル 345 427.5 82.5
1 R 335 380 45 1 R 340 455 115
2リットル 345 355 10 2リットル 355 475 120
2 R 327.5 352.5 25 2 R 342.5 457.5 115
3リットル 340 370 30 3リットル 340 460 120
3 R 325 355 30 3 R 345 495 150
4リットル 335 380 45 4リットル 357.5 432.5 75
4 R 340 350 10 4 R 335 402.5 67.5
5リットル 350 380 30 5リットル 335 387.5 52.5
5 R 337.5 360 22.5 5 R 335 425 90
6リットル 335 365 30 6リットル 350 430 80
6 R 340 375 35 6 R 342.5 405 62.5
7リットル 345 337.5 0 7リットル 340 502.5 162.5
7 R 345 335 0 7 R 327.5 447.5 120
8リットル 370 380 10 8リットル 327.5 515 187.5
8 R 375 355 0 8 R 327.5 540 212.5
9リットル 385 370 0 9リットル 330 415 85
9 R 342.5 362.5 20 9 R 327.5 390 62.5
10リットル 307.5 340 32.5 10リットル 337.5 445 107.5
10 R 325 350 25 10 R 352.5 455 102.5
意味する 20.75 意味する 108.5
± SEM 3.245 ± SEM 9.565

表2:CHSのエフェクター相における耳の厚さの差を算出した代表例。 ハプテンによるチャレンジ前後の耳介の厚さの差を計算する:24時間の耳の厚さ(μm)-0時間の耳の厚さ(μm)。各耳は別々の測定値としてカウントされます。耳の腫れはSEM±マイクロメートル(μm)で表され、n=20である。省略形: L = 左;R = 右。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ADによるiSTD希釈 抗TNP IgG1 Ab (U/mL)
100倍 250
200倍速 125
400倍速 62.5
800倍速 31.25
1600倍速 15.63
3200倍速 7.8
ADのみ 0

表3:抗TNP IgG1 Ab測定のための標準曲線のための異なる濃度のiSTDの調製。 100倍のiSTD希釈は、抗TNP IgG1 Abの250Uであると仮定した。AD=アッセイ希釈剤;iSTD = 内部標準;IgG1=免疫グロブリンGサブクラス1;TNP=2,4,6-トリニトロフェニル;U = 単位。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図1:CHSエフェクター細胞の表現型。CHSエフェクター細胞は、以前にTNCBで感作されたドナーのALNおよびSPLから得られた。(A)MACS技術を用いて、CHSエフェクター細胞(ALN全体およびSPL)はCD4+またはCD8+細胞のいずれかを枯渇させた。続いて、CHSエフェクター期の惹起の前に養子細胞導入を実施した。(B-E)フローサイトメトリー技術を用いて、CHSエフェクターおよびナイーブ(ナイーブマウスから得られた)細胞を、分析前にIFN-±、Tbet、IL-17A、およびRORγtについて染色し、γした。細胞をTCRβ+CD4+集団についてゲーティングした。SEM±平均として示された結果、***p<0.001、**p<0.01、* p<0.05、n = 4-6マウス/グループ。略語:ALNs=腋窩および鼠径リンパ節;CD4 = 分化4のクラスター;CHS = 接触過敏反応;IFN-γ = インターフェロンガンマ;IL = インターロイキン;MACS = 磁気活性化セルソーティング;ns = 有意でない。RORγt=レチノイン酸受容体関連孤児核内受容体γ;SEM = 平均の標準誤差;SPL = 脾臓;Tbet = Tボックス転写因子TBX21;TCRβ=T細胞受容体ベータ;TNCB=2,4,6-トリニトロクロロベンゼン。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

CHSは、皮膚中の自己タンパク質抗原に結合し、ネオ抗原を生成するハプテン を介して 誘導される。CHSは、循環抗原特異的CHSエフェクターT細胞の局所的な血管外動員によって媒介され、これは、チャレンジ組織において腫脹をもたらし、二次皮膚を同じハプテンに曝露してから24時間後にピークに達する6。組織の腫脹は、主に、白血球および白血球依存性フィブリン沈着24の浸潤によって引き起こされる。これらの変化は、ハプテン感作およびチャレンジドマウスと偽感作およびチャレンジドマウスの耳の腫れを測定するマイクロメーターで検出することができる。

CHSはまた、耳の重さの比較によって決定することができる。次いで、耳重量決定のために利用される耳パンチを、さらなる試験に使用することができる。炎症を起こした耳に浸潤する細胞は、サイトカイン産生Tリンパ球およびMPO陽性好中球からなる。耳組織ホモジネートにおいて、MPO活性または炎症誘発性サイトカイン(例えば、TNF−α、IFN−γ、IL−17A、またはその他)の濃度などの様々なパラメータをELISA試験を用いて、またはqPCR試験25を用いた皮膚におけるサイトカインmRNAの発現を測定することができる。さらに、血管透過性変化は、エバンスブルー試験21、26を用いて評価することができる。

炎症を起こした耳組織では、観察された変化を in vitro 試験で補完することもでき、T細胞増殖およびサイトカイン産生を強調する。これは、ハプテン結合タンパク質抗原22、27の存在下でALNsを培養することによって容易に達成することができる。感作されたがチャレンジされていないマウスから単離されたALNによるサイトカイン分泌の評価は、それらの誘導の代わりにCHSエフェクター細胞によるサイトカイン産生に関する詳細を提供する。

制限
多くのマイクロメーターは、異なる精度で耳の腫れを測定します。たとえば、最も低い圧力はスプリングノギスによって加えられるため、結果は実際の厚さの耳の測定値を最もよく反映しているようです。しかし、ミツトヨのようなより多くの圧力を加えるマイクロメーターは、浮腫形成の初期段階で耳に蓄積する流体をよりしっかりと圧縮する可能性が高い。CHSの二相性の性質は、より多くの圧力が加えられるため、このようなマイクロメータを使用してより明確に視覚化することができる。これは、軽い圧力28のスプリングキャリパーを使用する場合に、より困難である。それにもかかわらず、いくつかの研究では、耳の厚さをノギス29で測定した。また、観察者の経験は、観察者が実験群に気づいていなくても、主観的な感情によって影響を受ける可能性のある正確な測定を保証します。

マイクロメーターで耳の腫れの測定を確認するのに役立つ代替方法がここで説明されており、提示されたデータはより信頼性が高く、主観的ではありません。ただし、CHS を評価するためのこれらの代替戦略は、ある時点でしか使用できません。マイクロメータ測定は、様々な時点で繰り返すことができ、CHS動力学の研究を可能にする。

変更
私たちの研究室で使用するCHS反応を研究するためのプロトコルは、ハプテンの用量、惹起と感作の両方に使用される溶媒組成、および反応が評価される時点など、他の研究室で使用されるプロトコルとは大きく異なります。耳の厚さは、異なる時点(例えば、チャレンジ後2時間、24時間、48時間、および72時間)で測定することができる10、30。 表1は、異なる実験モデル、特に動物系統、ハプテン、および様々な研究10、21、22、26、31、32、33、34、35、36、37で使用された感作/チャレンジ時間の違いを示す。.CHSプロトコルはまた、マウスの腹部の以前の剃毛なしで実施され得る。

次の違いは、惹起(チャレンジ)自体の実行に関するものです。典型的であるように、感作は、剃毛されたマウスの腹部皮膚をハプテンまたはビヒクル単独で塗ることによって行われる。続いて、両方の群において、片耳を各耳側に希釈ハプテンで挑戦する。対照として、対向耳は車両単体10、31と同量で塗装されている。

重要なステップ
最も重要な瞬間は、テスト結果がそれに依存するため、CHSをトリガーすることです。(1)ハプテン溶液は非常に揮発性で光に敏感であるため、しっかりと閉じて光から保護する必要があり、使用中は動物の皮膚に素早く塗布して蒸発しないようにする必要があります。(2)ハプテンを腹部の皮膚に塗布した後、マウスが寝具に塗ったり、足で耳に塗布したりする可能性があるため、動物がケージに戻る前に乾燥させる必要があります(耳介の厚さの測定は不十分かもしれません)。(3)マウスの尾部を耐溶剤性マーカーでマーキングするなど、動物を標識する様々な方法も知られている。しかし、マーカー中に存在する色素は、(研究されていない)ハプテンになり、CHSを誘発する可能性がある。したがって、本研究では、反応に影響を及ぼさないマーキング方法が選択された。(4)シェービング方法を選択することは、皮膚を刺激する可能性があるため、非常に重要です。このプロトコルでは、灰色の石鹸はなだめるような性質を持っているため、使用されました。それはその抗菌効果によって助けられる軽度の切り傷および萎縮した創傷の治療を加速する。それは皮膚の腫れや炎症を和らげます。

動物の使用(系統および性別)を含む実験手順のさらなる調査および標準化は、異なる研究の結果を比較するために必要とされる。

CHSモデルでは、多くの異なる環境要因および生物学的機能を有する新規物質を試験することができる。このモデルは、試験した因子がT細胞依存性免疫応答を調節するかどうかを研究者が示したい場合に有用であり得る。

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Disclosures

著者らには開示するものは何もありません。

Acknowledgments

この研究は、subvention SUBZによって支持された。ヴロツワフの医科大学のA020.22.060, ポーランド, 科学高等教育省からの助成金によって N N401 545940 MSとIP2012 0443 72 MMSに.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% ethanol Merck KGaA, Darmstadt, Germany 65350-M for surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropylene Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655101 for MPO and Evans blue measurement - plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 179124
Aluminum foil Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z185140
Analytical balance Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany PRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processor MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India MTP-E-212 automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum) Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA BD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determination Merck KGaA, Darmstadt, Germany BCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1 Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 553441
BSA (bovine serum albumine) Merck KGaA, Darmstadt, Germany A9418 protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μm BIOLOGIX, China 15-1070 suitable for 50 mL tubes
Coverslip VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-1583 24 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 14190144 no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histology Merck KGaA, Darmstadt, Germany 6522 mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers - straight Animalab, Poznan, Poland 11251-10FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers - bent Animalab, Poznan, Poland 11272-50FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholic Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,086 polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,094 polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.07017
Ethanol 96% Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.59010
Evans blue Merck KGaA, Darmstadt, Germany E2129
FBS (fetal bovine serum) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA A3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10% Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT501128
Formamide 99.5% (GC) Merck KGaA, Darmstadt, Germany F7503
Freezer -20 °C Bosch, Germany GSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °C Bosch, Germany KGV36V10 mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost Plus VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad Prism GraphPad Software Inc. v. 9.4.0
Grey soap Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland Bialy jelen soap bar grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.60313
Harris hematoxylin solution Merck KGaA, Darmstadt, Germany HHS16
Hemocytometer VWR, Avantor, U.S.A 612-5719 manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromide Merck KGaA, Darmstadt, Germany H5882
Homogenizer QIAGEN Hilden, Germany Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin) Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA SA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202) Merck KGaA, Darmstadt, Germany H1009
Incubator Heracell 150i Thermo Electron LED Gmbh, Germany 41071068 37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland cat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.05108
Laboratory Centrifuge Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany B00013899 speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory Centrifuge Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany 75002425 speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2) VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 111-0917 for working with ortho-dianisine dihydrochloride
Mice Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland CBA/J, C57BL/6
Micrometer Mitutoyo, Tokyo, Japan 193-111 digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test) Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655061 with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectives Leica Microsystems CMS GmbH, Germany DM1000, 294011-082007 histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard) Merck KGaA, Darmstadt, Germany M6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate) Merck KGaA, Darmstadt, Germany S9390
Olive-oil Merck KGaA, Darmstadt, Germany 75343 pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555138
Ortho-dianisine dihydrochloride Merck KGaA, Darmstadt, Germany D3252
Paraffin wax Merck KGaA, Darmstadt, Germany 76242 beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 20012027 pH 7.2, mammalian cell culture
ph meter Elmetron, Poland CP-401
Pipettes, variable volume with tips Merck KGaA, Darmstadt, Germany EP3123000900-1EA 3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor blade VWR, Radnor, Pennsylvania, United States PERS94-0462 scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtome MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK HIS-202A
Scissors - straight, sharp / sharp Animalab, Poznan, Poland 14060-10FST Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27056 black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
Spectrophotometer BioTek Instruments, U.S.A 201446 universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 - 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 - 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rack Merck KGaA, Darmstadt, Germany S6141 e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA 33-36
Surgical scissors Animalab, Poznan, Poland 52138-46 surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettes Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z672122 tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene) Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan C0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl) Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA T-5050
T-PER (tissue protein extration reagent) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 78510
Tubes 15 mL sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430055 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430290 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tween 20 Merck KGaA, Darmstadt, Germany P1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27173 for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bath AJL Electronic, Poland LW102
Wax (paraffin) dispenser VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland cat.# not avaliable
Xylene (histological grade) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 534056

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References

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免疫学と感染症 第187号 マウスモデル アレルギー性接触皮膚炎 (ACD) 接触過敏症 (CHS) 耳の腫れ 血管透過性 ミエロペルオキシダーゼ (MPO) サイトカイン 2,4,6-トリニトロクロロベンゼン (TNCB) ハプテン

Erratum

Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 01/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Figure 1
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 1
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

Figure 2
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 2
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

アレルギー性接触皮膚炎のマウスモデルとしての接触過敏症
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Zemelka-Wiacek, M.,… More

Zemelka-Wiacek, M., Majewska-Szczepanik, M., Gajdanowicz, P., Szczepanik, M. Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. J. Vis. Exp. (187), e64329, doi:10.3791/64329 (2022).

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