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Immunology and Infection

Entrar em contato com a Hipersensibilidade como modelo murino de dermatite de contato alérgico

Published: September 26, 2022 doi: 10.3791/64329
Automatic Translation
1, 2, 1, 3
1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

ERRATUM NOTICE

Summary

A hipersensibilidade de contato (CHS) é um modelo experimental de murina de dermatite de contato alérgico (ACD). O CHS baseia-se na sensibilização com hapten reativo pintando a pele raspada do peito e abdômen, com um subsequente desafio da pele do ouvido com um hapten diluído, causando uma reação de inchaço que é avaliada de várias maneiras.

Abstract

A hipersensibilidade de contato (CHS) é um modelo experimental de dermatite de contato alérgico (ACD) que pode ser estudado em camundongos. Este estudo tem como objetivo apresentar um método laboratorial objetivo que possa ajudar a estudar a reação do CHS em camundongos, que pode ser medido e quantificado por vários testes. Para induzir o CHS, no dia "0", os camundongos foram sensibilizados em um local previamente raspado por pintura de pele abdominal com a mistura hapten 2,4,6-trinitrcloobenzeno (TNCB) em uma mistura acetona-etanol, enquanto os ratos de controle negativo foram falsos sensibilizados com a mistura veículo sozinho-acetona-etanol. No dia "4", a espessura da orelha da linha de base foi medida com um micrômetro antes da obtenção de CHS (desafio) pintando ambas as orelhas com TNCB diluído tanto nos grupos de teste quanto de controle. Após 24h, o inchaço da orelha foi medido com um micrômetro. O CHS é um exemplo de resposta imune mediada por células T que causa inchaço no tecido inflamado, atingindo 24 h após o desafio da pele com o mesmo hapten. Aumento do edema de ouvido correlacionado com aumento do peso do ouvido, atividade mieloperoxidase (MPO), concentração pró-inflamatório de citocina nos extratos de ouvido, aumento do espessamento do edematoso no exame histológico e permeabilidade vascular do ouvido. Houve também um aumento na concentração de anticorpos IgG1 específicos do TNP na sera do grupo de teste quando comparado com os camundongos de controle. Além disso, o CHS pode ser transferido com sucesso com as células efeito CHS obtidas de doadores previamente sensibilizados com tncb. As células com efeito CHS foram administradas por via intravenosa em camundongos receptores ingênuos, que foram posteriormente desafiados com o mesmo hapten diluído. O inchaço da orelha foi medido com um micrômetro 24 h depois.

Introduction

A dermatite de contato alérgica (ACD) é uma doença inflamatória da pele comum em países industrializados causada por uma reação de hipersensibilidade tipo IV resultante da exposição a produtos químicos de baixo peso molecular chamados haptens. As substâncias que causam sensibilização de contato em humanos incluem íons de metal pesado (cromo, níquel, ferro, cobalto), terebintina, fragrâncias, corantes e conservantes presentes em cosméticos (por exemplo, p-fenilediamina), algumas drogas (por exemplo, neomicina, benzocaína), antibióticos β-lactam (ou seja, penicilina), produtos químicos produzidos por plantas (pentadecacatechol, substância presente na hera venenosa), bem como hidroquinona utilizada na indústria fotográfica 1,2 . Os agentes etiológicos ACD são muito altos, pois mais de 100.000 produtos químicos são usados apenas na indústria, e 2.000 novos são sintetizados a cada ano. Até o momento, mais de 3.700 moléculas foram identificadas que podem ser contato haptens/alergênicos3. A reação de hipersensibilidade de contato (CHS) é um modelo experimental de ACD que pode ser estudado em camundongos, cobaias e ratos e pode ser induzido pela aplicação da pele tópica de haptens químicos reativos dissolvidos em solventes orgânicos 4,5,6. Este estudo tem como objetivo descrever um método de laboratório objetivo que pode ajudar a estudar a reação do CHS em camundongos, que pode ser medido e quantificado por vários testes.

O CHS consiste em fases de sensibilização (indução) e efeito (desafio). Em modelos animais, os haptens primeiro se ligam covalentemente às proteínas do corpo para criar neoantígenos. Durante a fase de sensibilização, os queratinócitos ativados promovem a migração e a maturação das células dendríticas da pele (SDCs) produzindo o fator de necrose pró-inflamatório citocinas-tumora α (TNF-α) e interleucina 1β (IL-1β)7. As células epidérmicas langerhans (LCs) apresentam antígenos durante as fases 8 de indução e efeito do efetordo CHS. As LCs expostas ao hapten durante a sensibilização promovem a indução tanto das células regulatórias quanto das células9. Evidências crescentes de vários estudos sugerem que as respostas do CHS podem ser mediadas por células Th1 da classe 2 do CD4+ MHC, liberando localmente interferon-γ (IFN-γ) para empregar um infiltrado inflamatório característico, linfócitos Tc1 classe I restritos cd8+ que também podem liberar ifn-γ mas principalmente mediar danos citotóxicos para queratinócitos, e agora também interleucina 17 (IL-17)-produzindo células Th1710, 11 anos.

Vários modelos chs diferentes que empregam várias espécies1 2,13,14 e haptens foram desenvolvidos (uma comparação detalhada de diferentes haptens, solventes e tempo de aplicação é resumida na Tabela 1). O camundongo, uma espécie de laboratório frequentemente utilizada, oferece algumas vantagens no estudo do CHS. Há mais cepas, nocautes (KO) e animais transgênicos entre camundongos em comparação com outras espécies, o que os torna um animal muito atraente15. Além disso, o modelo CHS requer muitos animais, e os ratos são mais econômicos aqui. Modelos animais não imitam ACD em todos os aspectos; em particular, eles mostram crostas e desquamation, o que não é comum para humanos16,17. As características da doença crônica são desafiadoras para se reproduzir, principalmente porque o modelo descrito não assume a aplicação do hapten por um longo período de tempo. No entanto, foi confirmado aqui que muitos dos aspectos significativos da ACD são reproduzidos. Também foi demonstrado que, como em humanos, essas características estão associadas a reações alérgicas locais. A escolha do hapten, seu solvente e sua aplicação delineada neste protocolo foram ditadas pelo fato de que os resultados foram confirmados por inúmeros testes in vitro e que foi testado e modificado em laboratório por muitos anos até que a versão atual fosse estabelecida. Os modelos murinos permitem a análise dos subconjuntos celulares ou citocinas que estão envolvidos no desenvolvimento da ACD e são essenciais para avaliações pré-clínicas de novos tratamentos.

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Protocol

Todos os experimentos apresentados neste artigo foram realizados de acordo com as diretrizes do 1º Comitê De Ética Local em Testes em Animais em Cracóvia. Todos os procedimentos descritos foram realizados de acordo com as recomendações locais, especialmente no que se refere ao uso de cetamina/xilazina como anestésico, utilizando ambos os lados das orelhas para aplicar a substância/hapten, cortando a orelha e coletando sangue por remoção do globo ocular. FORAM utilizados para o presente estudo os camundongos machos e fêmeas BALB/c (haplotype H-2d), CBA/J (H-2k) e C57BL/6 (H-2b), com idade entre 6 e 12 semanas. Para significância estatística, é melhor que cada grupo de camundongos seja composto por 10-12 animais.

1. Preparação animal

  1. Limpe a mesa de operação com uma solução de 70% de etanol antes e depois de todos os procedimentos. Se usar camundongos que requerem condições estéreis, realize todas as operações em um armário de biossegurança.

2. Marcando ratos para identificação

  1. Rotule os ratos raspando a pele com uma lâmina de barbear: #0 - sem marcação, #2 - na pata dianteira direita, #3 - no lado direito, #4 - na pata traseira direita, #5 - na base da cauda, #6 - na pata traseira esquerda, #7 - no lado esquerdo, #8 - na pata dianteira esquerda.
    NOTA: Devido à reação induzida, os ratos não podem ser marcados classicamente por socos ou marcações de ouvido. Os ratos não foram anestesiados durante a rotulagem.

3. Indução de CHS

NOTA: Este procedimento é retratado na Figura 1.

  1. Realize a sensibilização (indução) seguindo as etapas abaixo.
    1. No dia "0", raspe os ratos no peito e abdômen (quadrado 2 cm x 2 cm) aplicando sabão cinza com água e raspando com uma lâmina de barbear.
      NOTA: Antes de aplicar hapten, espere 6h para que a pele não fique irritada.
    2. Prepare 5% hapten: 2,4,6-trinitrochlorobenzeno (TNCB, ver Tabela de Materiais) em uma mistura acetona-etanol (razão 1:3) ou somente veículo (acetona-etanol). Prepare soluções pouco antes do uso em um frasco de vidro e proteja-o da luz cobrindo o frasco com papel alumínio.
    3. No mesmo dia, sensibilize os camundongos aplicando 150 μL de 5% hapten no local previamente raspado. No grupo de camundongos de controle, aplique o veículo sozinho para avaliar a reação inflamatória não específica. Antes de colocar o animal de volta na gaiola, espere por 30 s, deixando o hapten secar.
      ATENÇÃO: Use luvas; TNCB causa uma reação alérgica grave na maioria das pessoas.
  2. Realizar a medição de provocação (desafio) e inchaço do ouvido.
    1. No dia "4", prepare-se 0,4% hapten: TNCB em uma mistura acetona-etanol (razão 1:1). Prepare a solução pouco antes de usar em um frasco de vidro e proteja-a da luz cobrindo o frasco com papel alumínio.
    2. Anestesiar os camundongos com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de uma mistura de cetamina (90-120 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg) (ver Tabela de Materiais) para anestesia profunda. Certifique-se de que o mouse está totalmente anestesiado por pelo menos 5 minutos por beliscão do dedo do dedo do dedo.
    3. Meça a espessura da orelha (medição de 0h, linha de base) com um micrômetro (ver Tabela de Materiais) por um observador desconhecendo os grupos experimentais.
    4. Aplique 10 μL de 0,4% hapten em ambos os lados das orelhas em ambos os grupos (teste e controle). Antes de colocar o animal de volta na gaiola, espere por 30 s e deixe o hapten secar.
    5. No dia "5", 24 h após a aplicação do hapten, repita as etapas 3.2.2-3.2.3 para a medição de 24 horas.
    6. Avalie a resposta do CHS calculando a diferença na espessura da aurícula antes e depois do desafio com o hapten: 24 h de espessura da orelha (μm) - 0 h de espessura da orelha (μm). Conte cada orelha como uma medida separada. Em seguida, expresse o inchaço do ouvido em micrômetros (μm) ± erro padrão da média (SEM) (Tabela 2, Figura 3).

4. Biópsias de ouvido

  1. Logo após a medição de 24 horas da espessura da orelha (quando o rato ainda estiver sob anestesia profunda), corte as orelhas o mais perto possível do crânio com uma tesoura. Colete as biópsias do lado distal das orelhas fazendo um soco de 6 mm de diâmetro usando um soco de biópsia (ver Tabela de Materiais).
    1. Meça o peso do ouvido (etapa 4.2) e, adicionalmente, realize um dos seguintes testes na mesma biópsia de ouvido: ensaio mieloperoxidase (MPO) (etapa 4.3) ou medição in vitro da concentração de citocina nos extratos auriculares (por exemplo, IFN-γ, IL-17A, TNF-α [passo 4.4]).
      NOTA: Corte as orelhas antes da coleta de sangue. Após este procedimento, os camundongos devem ser eutanizados (por exemplo, por luxação cervical).
  2. Meça o peso de cada biópsia de ouvido no equilíbrio analítico e expresse-o em miligramas (mg) (Figura 4).
  3. Realize um ensaio mpo seguindo as etapas abaixo.
    1. Prepare o tampão de homogeneização dissolvendo 0,5% de brometo de hexadecilto de etilaamônio em 50 mm de tampão de fosfora DE50mmol KH 2 PO4/Na2HPO4 e ajustando o pH para 6.0 (uso à temperatura ambiente, RT).
    2. Homogeneize as biópsias em tubos de microcentrifusagem de 2 mL com 500 μL de tampão preparado por 10 minutos usando um homogeneizador com contas de aço inoxidável de 5 mm de diâmetro (adicione duas contas/frasco) (ver Tabela de Materiais). Em seguida, esfrie a amostra por 15 minutos a 4 °C e homogeneize-a por mais 10 minutos.
      NOTA: Os tubos de microcentrifuuge têm um fundo redondo para que as contas possam se mover facilmente.
    3. Congele os homogeneizadores a −20 °C por 30 min. Degelo e vórtice (certifique-se de que as amostras estão descongeladas). Repita este procedimento 3x.
    4. Centrifugar os homogeneiza em 3.000 x g para 30 min a 4 °C. Colhe os supernantes com uma pipeta. Expresse a atividade de MPO em unidades (U) por 1 mg de proteína.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. As amostras estão estáveis a -20 °C durante 3 meses.
    5. Para medir a atividade de MPO, realize uma reação enzimática misturando 20 μL de supernante e 200 μL de substrato MPO (0,167 mg/mL de orto-dianisine di hipodroclodo em 50 mmol de KH2PO4/Na2HPO4 tampão com 5 x 10-4% H202) e adicione em placas de fundo plano de 96 poços. Incubar as placas por 20 minutos na RT.
    6. Prepare a curva padrão utilizando 20 μL do padrão MPO em concentrações de 0,008 U até 0,5 U em 200 μL do substrato MPO. Prepare a amostra em branco apenas com o substrato MPO.
      ATENÇÃO: Use uma máscara enquanto trabalha com dihidroclodo orto-dianisine.
      NOTA: As placas devem ser feitas de polipropileno, que tem uma menor capacidade de ligação para que proteínas ou DNA não se liguem.
    7. Meça a densidade óptica (OD) em um comprimento de onda de λ = 460 nm. A reação enzimática é estável por 10 minutos. Leia a atividade de MPO em amostras testadas da curva padrão.
    8. Para medir a concentração proteica, utilize 20 μL do supernante, realize um teste com um kit de ácido bicinchonínico para determinação proteica (ver Tabela de Materiais) e meça o OD em λ = 562 nm (Figura 5).
  4. Realizar medição in vitro de citocinas no extrato auditivo.
    1. Homogeneize as biópsias de ouvido em RT em tubos de microcentrifus de 2 mL com 500 μL de reagente de extração de proteína tecidual (T-PER) por 10 minutos usando um homogeneizador com contas de aço inoxidável de 5 mm de diâmetro (adicione duas contas/frasco). Em seguida, esfrie a amostra por 15 minutos a 4 °C e homogeneize-a por mais 10 minutos.
      NOTA: Os tubos de microcentrifuuge têm um fundo redondo para que as contas possam se mover facilmente.
    2. Centrifugar os homogeneiza em 3.000 x g para 30 min a 4 °C.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. As amostras estão estáveis a -80 °C durante 6 meses.
    3. Avalie os níveis de citocinas utilizando um conjunto ELISA disponível comercialmente (por exemplo, IFN-γ) (ver Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante (Figura 6).

5. Histologia do tecido auditivo

  1. Logo após a medição de 24h da espessura da orelha, quando o rato ainda estiver profundamente anestesiado, corte as orelhas o mais perto possível do crânio com a tesoura (passo 4.1).
    NOTA: Após este procedimento, os camundongos devem ser eutanizados (por exemplo, por luxação cervical).
  2. Realize a incorporação de parafinas dos blocos de tecido seguindo as etapas abaixo.
    1. Logo após a remoção, coloque o ouvido em ~10 mL de 10% de formalina por 24 h.
    2. Coloque as orelhas em uma fita de processamento de tecido. Coloque os em um processador automatizado (ver Tabela de Materiais) para ciclos de desidratação (álcool 70%, 90%, 100%, 30 min cada na RT), ciclos de limpeza (xileno 3x, 30 min cada na RT) e ciclos de infiltração de cera (parafina 3x, 30 min cada a 56 °C).
    3. Remova as fitas do processador automatizado e segure a placa de aquecimento até que seja necessário. Encha o molde de cera com cera quente (do dispensador).
    4. Remova as seções do com fórceps aquecidos e coloque-as no molde; em seguida, coloque a base de na parte superior do molde e, em seguida, encha com mais cera. Coloque-o em água gelada em uma placa fria por 30 minutos para que a parafina se solidifique para formar um bloco contendo o espécime.
    5. Use um microtome rotativo (ver Tabela de Materiais) para cortar seções de ~5 μm de espessura. Flutue as seções em um banho quente para achatá-las. Pegue as seções em um deslizamento de microscópio de vidro. Deixe-os secar em RT para garantir que as seções aderam ao slide.
      NOTA: Use lâminas que eliminem a necessidade de aplicar materiais adesivos ou revestimentos proteicos para evitar a perda de seções teciduais durante a coloração.
  3. Realizar hematoxilina e eosina (H&E) coloração.
    1. Prepare 17 pratos de coloração com os seguintes: xileno (quatro pratos), 100% etanol (álcool absoluto) (quatro pratos), 90% etanol, 80% etanol, 70% etanol, 50% etanol, PBS (três pratos), solução de hematoxylina, solução de eosina. Transfira os slides de um prato para o outro de acordo com as etapas abaixo e execute tudo no RT.
      NOTA: O procedimento em cada prato pode ser repetido aproximadamente 10x (por exemplo, se um prato de 20 slides for usado, 200 manchas podem ser feitas sem alterar os fluidos).
    2. Desparafinar as seções por incubação a 65 °C por 30 min na incubadora. Mergulhe os slides em xileno por 30 minutos. Repita 1x em novo xileno por 30 min.
    3. Mergulhe os slides em 100% etanol por 5 min. Repita 1x em novo 100% etanol por 5 min. Mergulhe os slides na linha do etanol, 90%, 80%, 70% e 50%, por 2 minutos em cada diluição.
    4. Mergulhe os slides em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) por 5 min. Limpe o excesso de líquido ao redor do tecido e parte de trás das lâminas.
    5. Manche as seções na solução de hematoxilina (ver Tabela de Materiais) por 7-8 min. Lave em água corrente por 30 s do lado inverso para não danificar as seções. Repita o passo 5.3.4.
    6. Colorique as seções com solução de eosin (ver Tabela de Materiais) para 30 s. Lave como mencionado na etapa 5.3.5 e, em seguida, repita o passo 5.3.4.
    7. Mergulhe os slides em 100 % de etanol (álcool absoluto) por 2 min. Repita 1x em novo 100% etanol por 2 min.
    8. Mergulhe os slides em xileno por 5 minutos. Repita 1x em novo xileno por 5 min.
    9. Deixe as seções secarem por 15 minutos no RT. Adicione uma gota de meio de montagem (ver Tabela de Materiais) em um deslizamento de tampa e, em seguida, coloque-o na parte superior da seção.
  4. Examine a seção sob um microscópio leve sob uma ampliação de 20x ou 40x, e capture imagens (Figura 7).

6. Teste de permeabilidade vascular

NOTA: Alternadamente para a medição da espessura da orelha, um teste de permeabilidade vascular pode ser realizado.

  1. Sensibilize os camundongos no dia "0" (etapas 3.1.1-3.1.3), e depois, no dia "4", anestesia os camundongos (passo 3.2.2) e aplique diretamente hapten nas orelhas (passo 3.2.4), omitindo a medição de ouvido de 0h.
  2. Às 23h após o desafio, anestesia os ratos (passo 3.2.2).
  3. Injete por via intravenosa (i.v.) 8,3 μL/g de peso corporal de 1% de corante azul Evans (ver Tabela de Materiais) em Salina Tamponada de Fosfato (DPBS) de Dulbecco.
  4. Anestesiar os camundongos novamente profunda (passo 3.2.2)-1 h após a injeção azul de Evans.
  5. Coletar biópsias de ouvido (etapa 4.1).
    NOTA: Após este procedimento, os camundongos devem ser eutanizados (por exemplo, por luxação cervical).
  6. Extrair o corante do tecido, colocar socos de ouvido nos tubos contendo 1 mL de formamide e incubar a 37 °C na atmosfera de 5% de CO2 por 18 h.
  7. Centrifugar as biópsias a 3.000 x g por 3 min na RT. Colete os supernantes com uma pipeta.
  8. Meça o OD em um comprimento de onda de λ = 565 nm em placas de fundo plano de 96 poços contra um vazio contendo formamida. A cor é estável por 24 h. Leia a concentração das amostras de teste da curva padrão (use as concentrações de azul Evans variando de 0,2-30 μg de corante/mL formamide) (Figura 8).
    NOTA: As placas devem ser feitas de polipropileno, que tem uma menor capacidade de ligação para que proteínas ou DNA não se liguem.

7. Coleta de soro e imunoglobulina anti-TNP (IgG1) medição de anticorpos

  1. Depois de coletar biópsias de ouvido (etapa 4.1), quando o rato ainda estiver sob anestesia profunda, remova o globo ocular com pinças, coloque pressão suave sobre o rato e colete sangue do seio retro-orbital no tubo (frasco com gel para obtenção de soro, consulte Tabela de Materiais). Um método alternativo de coleta de sangue pode ser perfurar o coração com uma seringa e coletar o sangue.
    NOTA: O sangue deve ser coletado após a remoção das orelhas. O mesmo método de sangramento deve ser utilizado em todo um estudo devido a possíveis diferenças nos parâmetrossanguíneos 18. Após este procedimento, os camundongos devem ser eutanizados (por exemplo, por luxação cervical).
  2. Inverta um mínimo de 6x, espere 30 min para o sangue coagular e, em seguida, centrífugas em 1.300-2.000 x g por 10 minutos na RT.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. A amostra está estável a -20 °C durante 6 meses.
  3. Cubra uma placa de fundo plano de 96 poços com 50 μL de albumina de soro bovino conjugada com 2,4,6-trinitrophenyl (TNP-BSA) dissolvida em DPBS na concertação de 10 μg/mL. Em seguida, cubra a segunda placa com albumina de soro bovino (BSA) isoladamente dissolvida em DPBS (fundo) a uma concentração de 10 μg/mL. Incubar durante a noite a 4 °C.
    NOTA: O soro do rato contém anticorpos (Abs) contra bsa, por isso as amostras precisam ser testadas em ambas as placas, e em seguida, um cálculo deve ser feito (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. Lave as placas com 300 μL de DPBS contendo 0,05% Tween 20. Repita 3x.
  5. Prepare o dilatente do ensaio (AD): DPBS contendo 1% de BSA. Bloqueie os poços com AD por 1h no RT. Lave novamente (passo 7.4).
  6. Preparar um padrão interno (iSTD): sensibilizar os camundongos com TNCB (etapas 3.1.1-3.1.3) e, 10 dias após a sensibilização, coletar e votar o soro de todos os doadores (etapa 7.1 e passo 7.2).
  7. Adicione à placa 50 μL de concentrações classificadas de iSTD diluídas com AD para fazer a curva padrão (descrita na Tabela 3). Adicione à placa 50 μL de amostras de soro. Teste cada amostra e curva padrão em ambas as placas (revestidas de TNP-BSA e BSA). Incubar por 2 h na RT. Lave as placas (etapa 7.4).
  8. Adicionar 50 μL de anticorpo monoclonal anti-rato IgG1 biotinilado (mAb, ver Tabela de Materiais) diluído 1:250 com AD e incubar por 1h no RT. Lave novamente (passo 7.4).
  9. Adicione 50 μL de rabanete peroxidase streptavidin (HRD streptavidin, ver Tabela de Materiais) diluído 1:2000 com D.C., e incubar por 30 minutos no RT no escuro. Lave a placa (passo 7.4).
  10. Adicione 50 μL de substrato TMB (ver Tabela de Materiais) e incubar por 30 min no RT no escuro.
  11. Pare a reação enzimática adicionando 25 μL de 1 M H2SO4; a reação é estável por 30 minutos.
  12. Meça o OD em um comprimento de onda de λ = 450 nm e um fundo de 570 nm (o fundo deve ser subtraído a cada medição de 450 nm). Ao apresentar os resultados, subtraia as medidas de BSA do TNP-BSA para amostras e a curva padrão. Em seguida, calcule a unidade (U) de anticorpos de acordo com a curva padrão (Figura 9).

8. Transferência adotiva das células com efeito CHS

NOTA: Este procedimento é retratado na Figura 2.

  1. Doadores (na proporção de um doador:1 receptor): sensibilizar camundongos com TNCB no dia "0" (etapas 3.1.1-3.1.3).
  2. No dia "4", anestesia a anestesia profunda dos ratos (passo 3.2.2).
  3. Isole com fórceps os linfonodos axilares e inguinais (ALNs) e baços (SPLs). Juntar as ALNs em um frasco e as SPLs em outro.
    NOTA: Há um linfonodo axilar atrás do músculo peitoral em cada axila. Um linfonodo inguinal na região do quadril está situado ao lado de três vasos sanguíneos. O baço está localizado no lado esquerdo do corpo atrás do intestino e estômago19. Trabalhe com ferramentas estéreis em um armário de biossegurança para manter condições estéreis. Após este procedimento, os camundongos devem ser eutanizados (por exemplo, por luxação cervical).
  4. Mash tecido entre as extremidades foscos de dois slides microscópio. Passe a suspensão da célula através de um coador de células com um tamanho de poros de 70 μm (ver Tabela de Materiais).
  5. Lave as células com DPBS suplementadas com 1% de soro bovino fetal (FBS). Centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C. Decante o supernatante e resuspenda a pelota de célula restante em 1-5,0 mL de DPBS.
  6. Conte as células vivas usando um hemocitômetro20 com azul Trypan, e misture 10 μL da suspensão celular com 90-990 μL (dependendo do número celular) do azul Trypan. Leve em conta a diluição ao calcular o número da célula (10x-100x).
  7. Prepare uma mistura de ALNs e SPLs (razão 1:1): 8,0 x 106 até 7,0 x 107/mouse em 200 μL de DPBS.
  8. Receptores (camundongos síndicos ingênuos): anestesiam camundongos ingênuos (passo 3.2.2) e injetam i.v. com uma mistura preparada das células com efeito CHS (passo 8.7). No grupo controle de camundongos, não injete nenhuma célula.
  9. Meça a espessura da orelha antes (0h) e depois (24h) o desafio (etapas 3.2.1-3.2.6) (Figura 10).
  10. Além disso, realize testes em células isoladas de efeito CHS (por exemplo, fenotipagem celular ou a medição de citocinas produzidas pelas células efeito CHS por citometria de fluxo). Culturas celulares também podem ser estabelecidas, e a capacidade das células com efeito CHS de proliferar na presença do antígeno ou da quantidade de citocinas secretadas na cultura sobrenatantes pode ser avaliada21,22 (dados não apresentados).
    NOTA: A realização de testes adicionais requer correspondentemente mais doadores de células.

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Representative Results

Para indução de CHS, os animais foram sensibilizados através da pintura da pele (abdominal) com 150 μL de 5% de TNCB ou farsa sensibilizada apenas com o veículo. No dia "4", as respostas de inchaço de ouvido de ambas as orelhas foram induzidas pela pintura de contato (desafio) com 10 μL de 0,4% de TNCB em ambos os camundongos anteriormente em contato sensibilizado com tncb (grupo de teste) e os ratos do grupo controle (falsos sensibilizados). Os dados apresentados descrevem que os camundongos sensibilizados com o TNCB e desafiados 4 dias depois desenvolveram um inchaço de ouvido significativamente aumentado em comparação com os dessensibilizados (Figura 3, Tabela 2, teste vs. grupo de controle). Os resultados do inchaço do ouvido foram completamente validados em estudos posteriores, destacando que um aumento do edema de ouvido determinado com um micrômetro acordado com o peso do ouvido aumentado (Figura 4), atividade de MPO (Figura 5), ifn-γ concentração nos extratos de ouvido (Figura 6), aumento do espessamento do edematoso no exame histológico (Figura 7) e permeabilidade vascular do ouvido (Figura 8 ). Um aumento na concentração de anticorpos IgG1 específicos do TNP também foi encontrado no sera dos camundongos de teste quando comparado com os animais de controle (Figura 9).

Como exemplo de resposta imune mediada por células T, o CHS também pode ser transferido para camundongos beneficiários sinênicos ingênuos. Os doadores foram sensibilizados pelo aplicativo TNCB e, posteriormente, as células com efeito de CHS foram administradas i.v. nos camundongos receptores ingênuos, que foram desafiados com o hapten e testados para CHS 24 h depois (Figura 10). Os animais que receberam as células efeitos do CHS de doadores previamente sensibilizados com TNCB apresentaram aumento significativo do inchaço do ouvido em comparação com animais que foram desafiados apenas (não receberam nenhuma célula).

A reação do CHS tem um mecanismo complexo e envolve várias células. A apresentação de antígeno e a ativação de células T/B ocorrem nos órgãos linfáticos periféricos (por exemplo, ALNs e SPL). Foi determinado que as células com efeito CHS esgotadas de células CD4+ mas não CD8+ antes da transferência celular adotiva resultaram na ausência da reação chs nos camundongos receptores. Essas células foram consideradas positivas para IFN-γ (fator de transcrição da caixa T TBX21, Tbet+) e IL-17A (receptor nuclear órfão relacionado ao receptor de ácido retinóico gama, RORγT+) (Figura Suplementar 1).

Os resultados apresentados dos experimentos representativos foram realizados em camundongos C57BL/6 e CBA/J masculino e feminino com idade entre 8 e 12 semanas de idade. Seguindo as regras 3R no uso de animais23, especialmente a redução, para efeitos deste artigo, os resultados dos experimentos são mostrados em pequenos grupos de animais. Os dados nos gráficos são mostrados como média ± SEM. A significância estatística foi definida em p < 0,05. Os gráficos foram desenhados utilizando o software Prism (ver Tabela de Materiais).

Figure 1
Figura 1: Indução de CHS. Sensibilização, desafio e medição do ouvido. Abreviaturas: CHS = reação de hipersensibilidade de contato; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Transferência adotiva das células com efeito CHS. Abreviaturas: ALNs =linfonodos axilares e inguinais; CHS = reação de hipersensibilidade de contato; i.v. = por via intravenosa; SPLs = baços; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Avaliação representativa do CHS para TNCB pela medição do inchaço do ouvido com um micrômetro. Os camundongos foram TNCB (grupo de teste) ou sham (grupo controle) sensibilizados e posteriormente desafiados. A espessura da aurícula foi medida antes e depois do desafio, e as diferenças no inchaço do ouvido foram calculadas subtraindo a espessura da orelha de 0 h (μm) da espessura da orelha de 24h (μm). O inchaço da orelha foi expresso como média ± SEM, ****p < 0,0001, n = 10 ratos/grupo (dados da Tabela 2). Abreviaturas: CHS = reação de hipersensibilidade de contato; SEM = erro padrão da média; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Avaliação representativa do CHS pela medição do peso do ouvido. O peso do ouvido é um dos parâmetros que corresponde ao inchaço do ouvido. Os camundongos foram TNCB (grupo de teste) ou sham (grupo controle) sensibilizados e posteriormente desafiados. Às 24 horas após o desafio, socos de 6 mm de diâmetro foram retirados das orelhas removidas. Os socos foram pesados em um equilíbrio laboratorial analítico. O peso do ouvido foi expresso em miligramas (mg) como média ± SEM, ***p < 0,001, n = 10 ratos/grupo. Abreviaturas: CHS = reação de hipersensibilidade de contato; SEM = erro padrão da média; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Avaliação representativa da atividade do MPO. O aumento da atividade de MPO nos extratos teciduais correlaciona-se com a inflamação do ouvido. Os camundongos sensibilizados pelo TNCB (grupo de teste) e os camundongos de sensibilidade falsa (grupo controle) foram desafiados. Às 24 horas após o desafio, as orelhas foram removidas, e socos de 6 mm de diâmetro da orelha foram extraídos e processados. A atividade de MPO é expressa em U por teor de proteína (U/g de proteína). Resultados apresentados como ± MÉDIOS SEM, **p < 0,01, n = 5-6 ratos/ grupo. Abreviaturas: CHS = reação de hipersensibilidade de contato; MPO = mieloperoxidase; SEM = erro padrão da média; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene; U = unidades. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Avaliação representativa da produção de citocina-IFN-γ concentração em extratos de ouvido. Os camundongos foram TNCB (grupo de teste) ou sham (grupo controle) sensibilizados e posteriormente desafiados. Às 24 horas após o desafio, as orelhas foram removidas, e socos de 6 mm de diâmetro da orelha foram levados. A concentração de IFN-γ foi determinada em homogeneizadores teciduais pela ELISA. Resultados apresentados como média ± SEM, *p < 0,05, n = 5 ratos/grupo. Abreviaturas: CHS = reação de hipersensibilidade de contato; IFN-γ = interferon gama; SEM = erro padrão da média; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Histologia representativa do tecido auditivo. Hematoxilina e eosina. Os camundongos foram TNCB (grupo de teste) ou sham (grupo controle) sensibilizados e posteriormente desafiados. (A-C) O exame histológico no grupo de teste manifestou-se em uma concentração significativamente maior de células inflamatórias (células mononucleares e polimorfonucleares), principalmente na derme, com formação de microabscess na epiderme. O espessamento da derme edematoso e uma epiderme hiperplástica espessa também foram notados. (D-E) Grupo de controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Teste de permeabilidade vascular representativa. O edema do tecido auditivo observado é resultado do aumento da permeabilidade vascular. Para determinar mudanças na permeabilidade vascular, os camundongos foram sensibilizados pelo TNCB (grupo de teste) ou sham (grupo controle) e depois desafiados 4 dias depois. Às 23 horas após o desafio, evans azul foi injetado, e, 1h após a injeção azul de Evans, os animais foram eutanizados, e socos de 6 mm de diâmetro da orelha foram feitos. Resultados apresentados como ± SEM médios, **p < 0,01, n = 5 ratos/grupo. Abreviaturas: CHS = reação de hipersensibilidade de contato; SEM = erro padrão da média; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Medição representativa de anticorpos anti-TNP IgG1. A concentração de anticorpos anti-TNP IgG1 no soro foi medida 24 h após o desafio com hapten TNCB em falso sensibilizado (controle) e em camundongos sensibilizados (grupo de teste) tncb. Os sera coletados foram testados para concentração de anticorpos pela ELISA. Resultados apresentados como ± SEM médios, ***p < 0,001, n = 10 ratos/grupo. Abreviaturas: CHS = reação de hipersensibilidade de contato; IgG1 = imunoglobulina G subclasse 1; SEM = erro padrão da média; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10: Transferência adotiva representativa das células efeito CHS. As células com efeito CHS foram obtidas de doadores sensibilizados com TNCB. Em seguida, as células imunes coletadas foram injetadas, i.v., em receptores sinégenos ingênuos, que foram desafiados para a obtenção da fase do efeito CHS. O grupo controle de camundongos não recebeu nenhuma célula antes do desafio. A espessura da aurícula foi medida antes e depois do desafio. Resultados apresentados como ± SEM médios, ***p < 0,001, n = 7 ratos/grupo. Abreviaturas: CHS = reação de hipersensibilidade de contato; SEM = erro padrão da média; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tensão do rato Solução de sensibilização (dose)
no abdômen raspado		 Solução de elicitação (dose)
em ambos os lados da orelha/s		 Dia de sensibilização/realização Refs
BALB/c (H-2d); C57BL/6 (H-2b)
TCRδ-/-, β2m-/-, CD1d-/- (B10 PL (H-2u fundo)		 25 μL de 0,5 % DNFB na mistura acetona-azeite (razão 4:1) 5 μL de 0,1 % DNFB na mistura acetona-azeite (razão 4:1) 0 / 5 22
C57BL/6 (H-2b) 50 μL de 0,5 % DNFB na mistura acetona-azeite (razão 4:1) 25 μL de 0,2 % DNFB na mistura acetona-azeite (razão 4:1) 0 / 5 32
C57BL/6 (H2b); IL-17A-/- (C57BL/6 de fundo) 150 μL de 5% TNCB na mistura acetona-etanol (razão 1:3) 10 μL de 0,4 % TNCB na mistura azeite de oliva-acetona (razão 1:1) 0 / 4 33
CBA/J (H-2k); C57BL/6 (H-2b)
TLR2-/-, MyD88-/-, IL-17A-/- (C57BL/6 de fundo)		 150 μL de 5 % TNP-CL (TNCB) em uma mistura acetona-etanol (razão 1:3) 10 μl de 0,4 % TNP-CL (TNCB) na mistura azeite de oliva-acetona (razão 1:1) 0 / 4 21
C57BL/6 (H-2b); BALB/c (H-2d) 25 μL de 1 % TNCB em uma acetona 10 μL de 0,1 ou 0,2 % TNCB em acetona (e superior até 1 %) 0 / 7 34
C57BL/6 (H-2b); TLR2-/-/ TLR4-/-
(ratos duplo-knockout em C57BL/6 fundo)		 100 μL de 3 % TNCB em acetona 20 μL de 1 % TNCB em uma acetona (apenas no lado de trás das orelhas) 0 / 5 31
C57BL/6 (H-2b)
Camundongos com deficiência de CLASSE II MHC (C57BL/6 de fundo)		 100 μL de 3 % TNCB na mistura acetona-azeite (razão 4:1) 20 μL de 0,5 ou 1 % TNCB na mistura acetona-azeite (razão 4:1) 0 / 6 35
C57BL/6 (H-2b) 100 μL de 7 % TNCB em acetona 20 μL 1 % TNCB em uma acetona 0 / 5 36
C57BL/6 (H-2b) 100 μL 3 % OX no etanol 20 μL 1 % OX em um etanol 0 / 5
C57BL/6 (H-2b); CD4-/-, CD8-/- (C57BL/6 de fundo) 25 μL de 0,5 % DNFB em acetona-azeite (razão 4:1) 10 μL de 0,2 % DNFB em acetona-azeite (razão 4:1) 0 / 5 10
C57BL/6 (H-2b); CD4-/-, CD8-/- (C57BL/6 de fundo) 150 μL de 3 % OX em álcool-acetona (razão 3:1) 10 μL 1% OX em álcool-acetona (razão 3:1) 0 / 5
C57BL/6 (H-2b); C3H/HeN (H-2k); TLR4-/- (fundo C3H/Hej); MyD88-/- (C57BL/6 de fundo) 100 mg/orelha de 10 % NiCl2 em petrolatum branco no lado dorsal de ambas as orelhas 10 % NiCl2 em petrolatum branco 0,1,2 / 23, 24 37
NOD (H-2g7) MyD88-/- (fundo NOD) 400 μL de 0,5 % FITC em acetona e ftalato de dibutil 10 μL de 0,1 % FITC em acetona e ftalato de dibutil 0 / 5 25

Tabela 1: Comparação do modelo CHS em diversos estudos. Abreviaturas: DNFB = 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno; FITC = isocitonato de fluoresceína; NiCl2 = cloreto de níquel (II); TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene; TNP-Cl = cloreto de trinitrofenil; OX = oxazolona. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Grupo de controle (negativo) Grupo de teste (reação chs)
Mouse # orelha: L, R 0 h de espessura da orelha [μm] 24 h de espessura da orelha [μm] 24 h – 0h de espessura da orelha [μm] Mouse # orelha: L, R 0 h de espessura da orelha [μm] 24 h de espessura da orelha [μm] 24 h – 0h de espessura da orelha [μm]
1 L 365 380 15 1 L 345 427.5 82.5
1 R 335 380 45 1 R 340 455 115
2 L 345 355 10 2 L 355 475 120
2 R 327.5 352.5 25 2 R 342.5 457.5 115
3 L 340 370 30 3 L 340 460 120
3 R 325 355 30 3 R 345 495 150
4 L 335 380 45 4 L 357.5 432.5 75
4 R 340 350 10 4 R 335 402.5 67.5
5 L 350 380 30 5 L 335 387.5 52.5
5 R 337.5 360 22.5 5 R 335 425 90
6 L 335 365 30 6 L 350 430 80
6 R 340 375 35 6 R 342.5 405 62.5
7 L 345 337.5 0 7 L 340 502.5 162.5
7 R 345 335 0 7 R 327.5 447.5 120
8 L 370 380 10 8 L 327.5 515 187.5
8 R 375 355 0 8 R 327.5 540 212.5
9 L 385 370 0 9 L 330 415 85
9 R 342.5 362.5 20 9 R 327.5 390 62.5
10 L 307.5 340 32.5 10 L 337.5 445 107.5
10 R 325 350 25 10 R 352.5 455 102.5
Significar 20.75 Significar 108.5
± SEM 3.245 ± SEM 9.565

Tabela 2: Exemplo representativo de calcular a diferença na espessura do ouvido na fase efetiva do CHS. Calculando a diferença na espessura da aurícula antes e depois do desafio com o hapten: 24h de espessura da orelha (μm) - 0 h de espessura da orelha (μm). Cada orelha conta como uma medida separada. Inchaço auricular expresso em micrômetros (μm) ± SEM, n = 20. Abreviaturas: L = esquerda; R = à direita. Clique aqui para baixar esta Tabela.

diluição do iSTD com AD anti-TNP IgG1 Ab (U/mL)
100x 250
200x 125
400x 62.5
800x 31.25
1600x 15.63
3200x 7.8
apenas AD 0

Tabela 3: Preparação das diferentes concentrações de iSTD para a curva padrão para medição anti-TNP IgG1 Ab. A diluição de 100x iSTD foi presumida como sendo 250 U de abreviaturas anti-TNP IgG1: Ab = anticorpo; AD = ensaio diluído; iSTD = padrão interno; IgG1 = imunoglobulina G subclasse 1; TNP = 2,4,6-trinitrophenyl; U = unidades. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Figura suplementar 1: O fenótipo das células com efeito CHS. As células com efeito CHS foram obtidas a partir de ALNs e SPLs dos doadores, que foram previamente sensibilizadas com TNCB. (A) Empregando a técnica MACS, as células com efeito CHS (ALNs e SPLs inteiros) foram esgotadas de células CD4+ ou CD8+. Posteriormente, a transferência celular adotiva foi realizada antes da obtenção da fase do efeito CHS. O inchaço do ouvido foi expresso como ± MÉDIOS SEM. (B-E) Utilizando uma técnica de citometria de fluxo, as células chs-effector e ingênua (obtidas de camundongos ingênuos) foram manchadas para IFN-γ, Tbet, IL-17A e RORγt antes da análise. As celas foram fechadas para a população TCRβ+CD4+. Resultados apresentados como média ± SEM, ***p < 0,001, **p < 0,01, * p < 0,05, n = 4-6 ratos/grupo. Abreviaturas: ALNs = linfonodos axilares e inguinais; CD4 = cluster de diferenciação 4; CHS = reação de hipersensibilidade de contato; IFN-γ = interferon gama; IL = interleucina; MACS = classificação celular ativada por magnético; ns = não significativo; RORγt = receptor nuclear órfão retinóico-ácido-receptor gama; SEM = erro padrão da média; SPLs = baços; Tbet = Fator de transcrição da caixa T TBX21; TCRβ = T cell receptor beta; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeno. Clique aqui para baixar este Arquivo.

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Discussion

O CHS é induzido através de haptens, que se ligam a antígenos auto-proteína na pele, criando neoantígenos. O CHS é mediado pelo recrutamento extravascular local de células T com efeito de antígeno circulante, o que resulta em inchaço no tecido desafiado, atingindo 24 h após a exposição da pele secundária ao mesmo hapten6. O inchaço do tecido é causado principalmente pela infiltração de leucócitos e deposição de fibrina dependente de leucócitos24. Essas alterações podem ser detectadas com um micrômetro medindo o inchaço da orelha de camundongos temtensizados e desafiados versus falsos sensibilizados e desafiados.

O CHS também pode ser determinado pela comparação do peso do ouvido. Em seguida, os socos de ouvido utilizados para a determinação do peso do ouvido podem ser usados para novos testes. Os infiltrados celulares nas orelhas inflamadas consistem em linfócitos T produtores de citocinas e neutrófilos mpo positivos. Nos homogeneizadores do tecido auditivo, vários parâmetros podem ser medidos, como a atividade de MPO ou a concentração de citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, TNF-α, IFN-γ, IL-17A ou outros) utilizando o teste ELISA ou a expressão do citocina mRNA na pele usando o teste qPCR25. Além disso, as alterações de permeabilidade do vaso podem ser avaliadas usando o teste azul evans21,26.

No tecido auditivo inflamado, as alterações observadas também podem ser complementadas com testes in vitro, destacando a proliferação de células T e a produção de citocinas. Isso pode ser facilmente realizado por alns culminando na presença de antígenos proteicos conjugadoshapten 22,27. A avaliação da secreção de citocinas por ALNs isoladas de camundongos sensibilizados, mas não desafiados, fornece detalhes sobre a produção de citocinas pelas células efeito CHS no lugar de sua indução.

Limitações
Muitos micrômetros medem o inchaço do ouvido com precisão diferente. Por exemplo, a menor pressão é exercida por uma pinça de mola, então parece que os resultados refletirão melhor a medição real da espessura do ouvido. No entanto, micrômetros que exercem mais pressão, como Mitutoyo, são propensos a comprimir mais fortemente o fluido que se acumula nas orelhas na fase inicial da formação de edema. A natureza bifásica do CHS pode ser visualizada mais claramente usando tais micrômetros porque mais pressão é exercida. Isso é mais difícil quando se usa uma pinça de mola com pressão de luz28. No entanto, em alguns estudos, a espessura das orelhas foi medida com uma pinça29. Além disso, a experiência do observador garante medições precisas, que podem ser influenciadas por sentimentos subjetivos, mesmo que o observador desconheça os grupos experimentais.

Métodos alternativos foram descritos aqui que podem ajudar a confirmar as medidas do inchaço do ouvido com um micrômetro, tornando os dados apresentados mais confiáveis e menos subjetivos. No entanto, essas estratégias alternativas para avaliar o CHS só podem ser utilizadas em um ponto do tempo. As medições de micrômetros podem ser repetidas em vários pontos de tempo, permitindo o estudo da cinética CHS.

Modificações
O protocolo para estudar a reação do CHS que usamos em nosso laboratório difere significativamente daqueles utilizados em outros laboratórios, incluindo a dose de hapten e a composição do solvente utilizada tanto para a captação quanto para a sensibilização, bem como o ponto de tempo em que a reação é avaliada. A espessura da orelha pode ser medida em diferentes pontos de tempo (por exemplo, 2h, 24h, 48h e 72h após o desafio)10,30. A Tabela 1 apresenta diferentes modelos experimentais, particularmente as diferenças na cepa animal, hapten, e os tempos de sensibilização/desafio utilizados em diversos estudos 10,21,22,26,31,32,33,34,35,36,37 . O protocolo CHS também pode ser conduzido sem a barba prévia do abdômen dos camundongos.

A próxima diferença diz respeito à execução da própria provocação (desafio). Como é típico, a sensibilização é feita pintando a pele do abdômen de camundongos raspados com o hapten ou apenas o veículo. Posteriormente, em ambos os grupos, um ouvido é desafiado com hapten diluído em cada lado da orelha. Como controle, a orelha oposta é pintada com uma quantidade idêntica de veículoapenas 10,31.

Passos críticos
O momento mais crítico é acionar o CHS, pois os resultados dos testes dependem dele. (1) A solução Hapten é muito volátil e sensível à luz, por isso deve ser bem fechada e protegida da luz, e quando em uso, deve ser rapidamente aplicada à pele dos animais para que não evapore. (2) Após aplicar o hapten na pele do abdômen, ele deve ser seco antes que o animal retorne à gaiola porque os ratos podem manchá-lo contra a cama ou aplicá-la nas orelhas com suas patas (então a medida da espessura da aurícula pode ser inadequada). (3) Vários métodos de rotulagem de animais, como a marcação de caudas de rato com um marcador resistente a solventes, também são conhecidos. No entanto, os corantes presentes no marcador podem (não estudados) tornar-se um hapten e desencadear CHS. Portanto, neste estudo, foi escolhido um método de marcação que não afeta a reação. (4) Escolher um método de barbear é muito importante, pois pode irritar a pele. Neste protocolo, um sabão cinza foi usado porque tem propriedades reconfortantes; acelera o tratamento de pequenos cortes e feridas apodrecidas, que é ajudada por seus efeitos antibacterianos. Alivia o inchaço e a inflamação da pele.

Investigações adicionais e padronização dos procedimentos experimentais, incluindo o uso de animais (cepa e sexo), são necessárias para comparar os resultados de diferentes estudos.

Muitos fatores ambientais diferentes e novas substâncias com funções biológicas podem ser testadas no modelo CHS. Este modelo pode ser útil se os pesquisadores quiserem mostrar se fatores testados modulam as respostas imunes dependentes de células T.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este estudo foi apoiado pela subvenção SUBZ. A020.22.060 da Universidade Médica de Wroclaw, Polônia, e por subvenções do Ministério da Ciência e Educação Superior N401 545940 para MS e IP2012 0443 72 para MMS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% ethanol Merck KGaA, Darmstadt, Germany 65350-M for surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropylene Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655101 for MPO and Evans blue measurement - plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 179124
Aluminum foil Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z185140
Analytical balance Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany PRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processor MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India MTP-E-212 automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum) Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA BD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determination Merck KGaA, Darmstadt, Germany BCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1 Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 553441
BSA (bovine serum albumine) Merck KGaA, Darmstadt, Germany A9418 protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μm BIOLOGIX, China 15-1070 suitable for 50 mL tubes
Coverslip VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-1583 24 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 14190144 no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histology Merck KGaA, Darmstadt, Germany 6522 mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers - straight Animalab, Poznan, Poland 11251-10FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers - bent Animalab, Poznan, Poland 11272-50FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholic Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,086 polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,094 polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.07017
Ethanol 96% Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.59010
Evans blue Merck KGaA, Darmstadt, Germany E2129
FBS (fetal bovine serum) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA A3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10% Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT501128
Formamide 99.5% (GC) Merck KGaA, Darmstadt, Germany F7503
Freezer -20 °C Bosch, Germany GSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °C Bosch, Germany KGV36V10 mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost Plus VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad Prism GraphPad Software Inc. v. 9.4.0
Grey soap Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland Bialy jelen soap bar grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.60313
Harris hematoxylin solution Merck KGaA, Darmstadt, Germany HHS16
Hemocytometer VWR, Avantor, U.S.A 612-5719 manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromide Merck KGaA, Darmstadt, Germany H5882
Homogenizer QIAGEN Hilden, Germany Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin) Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA SA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202) Merck KGaA, Darmstadt, Germany H1009
Incubator Heracell 150i Thermo Electron LED Gmbh, Germany 41071068 37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland cat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.05108
Laboratory Centrifuge Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany B00013899 speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory Centrifuge Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany 75002425 speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2) VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 111-0917 for working with ortho-dianisine dihydrochloride
Mice Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland CBA/J, C57BL/6
Micrometer Mitutoyo, Tokyo, Japan 193-111 digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test) Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655061 with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectives Leica Microsystems CMS GmbH, Germany DM1000, 294011-082007 histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard) Merck KGaA, Darmstadt, Germany M6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate) Merck KGaA, Darmstadt, Germany S9390
Olive-oil Merck KGaA, Darmstadt, Germany 75343 pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555138
Ortho-dianisine dihydrochloride Merck KGaA, Darmstadt, Germany D3252
Paraffin wax Merck KGaA, Darmstadt, Germany 76242 beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 20012027 pH 7.2, mammalian cell culture
ph meter Elmetron, Poland CP-401
Pipettes, variable volume with tips Merck KGaA, Darmstadt, Germany EP3123000900-1EA 3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor blade VWR, Radnor, Pennsylvania, United States PERS94-0462 scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtome MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK HIS-202A
Scissors - straight, sharp / sharp Animalab, Poznan, Poland 14060-10FST Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27056 black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
Spectrophotometer BioTek Instruments, U.S.A 201446 universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 - 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 - 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rack Merck KGaA, Darmstadt, Germany S6141 e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA 33-36
Surgical scissors Animalab, Poznan, Poland 52138-46 surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettes Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z672122 tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene) Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan C0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl) Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA T-5050
T-PER (tissue protein extration reagent) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 78510
Tubes 15 mL sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430055 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430290 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tween 20 Merck KGaA, Darmstadt, Germany P1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27173 for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bath AJL Electronic, Poland LW102
Wax (paraffin) dispenser VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland cat.# not avaliable
Xylene (histological grade) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 534056

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References

  1. Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
  2. Hertl, M., et al. Predominance of epidermal CD8+ T lymphocytes in bullous cutaneous reactions caused by beta-lactam antibiotics. The Journal of Investigative Dermatology. 101 (6), 794-799 (1993).
  3. Martin, S. F. T lymphocyte-mediated immune responses to chemical haptens and metal ions: implications for allergic and autoimmune disease. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (3), 186-198 (2004).
  4. Takeyoshi, M., Iida, K., Suzuki, K., Yamazaki, S. Skin sensitization potency of isoeugenol and its dimers evaluated by a non-radioisotopic modification of the local lymph node assay and guinea pig maximization test. Journal of Applied Toxicology. 28 (4), 530-534 (2008).
  5. Nakamura, K., Aizawa, M. Studies on the genetic control of picryl chloride contact hypersensitivity reaction in inbred rats. Transplantation Proceedings. 13 (2), 1400-1403 (1981).
  6. Asherson, G. L., Ptak, W. Contact and delayed hypersensitivity in the mouse. I. Active sensitization and passive transfer. Immunology. 15 (3), 405-416 (1968).
  7. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 133 (2), 303-315 (2013).
  8. Kaplan, D. H., Jenison, M. C., Saeland, S., Shlomchik, W. D., Shlomchik, M. J. Epidermal langerhans cell-deficient mice develop enhanced contact hypersensitivity. Immunity. 23 (6), 611-620 (2005).
  9. Wang, L., et al. Langerin expressing cells promote skin immune responses under defined conditions. Journal of Immunology. 180 (7), 4722-4727 (2008).
  10. Wang, B., et al. CD4+ Th1 and CD8+ type 1 cytotoxic T cells both play a crucial role in the full development of contact hypersensitivity. Journal of Immunology. 165 (12), 6783-6790 (2000).
  11. Mori, T., et al. Cutaneous hypersensitivities to hapten are controlled by IFN-gamma-upregulated keratinocyte Th1 chemokines and IFN-gamma-downregulated langerhans cell Th2 chemokines. The Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1719-1727 (2008).
  12. Peszkowski, M. J., Warfvinge, G., Larsson, A. Allergic and irritant contact responses to DNFB in BN and LEW rat strains with different TH1/TH2 profiles. Acta Dermato-Venereologica. 74 (5), 371-374 (1994).
  13. Henningsen, S. J., Mickell, J., Zachariae, H. Plasma kinins in dinitrochlorobenzene contact dermatitis of guinea-pigs. Acta Allergologica. 25 (5), 327-331 (1970).
  14. Maibach, H. I., Maguire, H. C. Elicitation of delayed hypersensitivity (DNCB contact dermatitis) in markedly panleukopenic guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 41, 123-127 (1963).
  15. Martel, B. C., Lovato, P., Bäumer, W., Olivry, T. Translational animal models of atopic dermatitis for preclinical studies. The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (3), 389-402 (2017).
  16. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 129 (1), 31-40 (2009).
  17. Li, Y. Z., Lu, X. Y., Jiang, W., Li, L. F. Anti-inflammatory effect of qingpeng ointment in atopic dermatitis-like murine model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2013, 907016 (2013).
  18. Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Experimental Hematology. 44 (2), 132-137 (2016).
  19. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50765 (2013).
  20. Vlab, A. Hemocytometer - Counting of Cells. Amrita University. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=MKS0KM3lr90 (2011).
  21. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. International Archives of Allergy and Immunology. 164 (2), 122-136 (2014).
  22. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunology and Cell Biology. 90 (8), 784-795 (2012).
  23. Directive 2010/63 / EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , Available from: https://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:En:PDF (2010).
  24. Colvin, R. B., Dvorak, H. F. Role of the clotting system in cell-mediated hypersensitivity. II. Kinetics of fibrinogen/fibrin accumulation and vascular permeability changes in tuberculin and cutaneous basophil hypersensitivity reactions. Journal of Immunology. 114, 377-387 (1975).
  25. Szczepanik, M., et al. Regulation of contact sensitivity in non-obese diabetic (NOD) mice by innate immunity. Contact Dermatitis. 79 (4), 197-207 (2018).
  26. Askenase, P. W., Majewska-Szczepanik, M., Kerfoot, S., Szczepanik, M. Participation of iNKT cells in the early and late components of Tc1-mediated DNFB contact sensitivity: Cooperative role of γδ-T cells. Scandinavian Journal of Immunology. 73 (5), 465-477 (2011).
  27. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacological Reports. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  28. Van Loveren, H., et al. Use of micrometers and calipers to measure various components of delayed-type hypersensitivity ear swelling reactions in mice. Journal of Immunological Methods. 67 (2), 311-319 (1984).
  29. Tsuji, R. F., et al. B cell-dependent T cell responses: IgM antibodies are required to elicit contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 196 (10), 1277-1290 (2002).
  30. Campos, R. A., et al. Cutaneous immunization rapidly activates liver invariant Valpha14 NKT cells stimulating B-1 B cells to initiate T cell recruitment for elicitation of contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1785-1796 (2003).
  31. Rühl-Muth, A. C., Maler, M. D., Esser, P. R., Martin, S. F. Feeding of a fat-enriched diet causes the loss of resistance to contact hypersensitivity. Contact Dermatitis. 85 (4), 398-406 (2021).
  32. Bour, H., et al. histocompatibility complex class I-restricted CD8+ T cells and class II-restricted CD4+ T cells, respectively, mediate and regulate contact sensitivity to dinitrofluorobenzene. European Journal of Immunology. 25 (11), 3006-3010 (1995).
  33. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  34. Katagiri, K., Arakawa, S., Kurahashi, R., Hatano, Y. Impaired contact hypersensitivity in diet-induced obese mice. Journal of Dermatological Science. 46 (2), 117-126 (2007).
  35. Bouloc, A., Cavani, A., Katz, S. I. Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells. The Journal of Investigative Dermatology. 111 (1), 44-49 (1998).
  36. Martin, S., et al. Peptide immunization indicates that CD8+ T cells are the dominant effector cells in trinitrophenyl-specific contact hypersensitivity. The Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 260-266 (2000).
  37. Vennegaard, M. T., et al. Epicutaneous exposure to nickel induces nickel allergy in mice via a MyD88-dependent and interleukin-1-dependent pathway. Contact Dermatitis. 71 (4), 224-232 (2014).

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Imunologia e Infecção Problema 187 Modelo Murine dermatite de contato alérgico (ACD) hipersensibilidade de contato (CHS) inchaço no ouvido permeabilidade vascular mieloperoxidase (MPO) citocinas 2,4,6-trinitrochlorobenzene (TNCB) hapten

Erratum

Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 01/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Figure 1
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 1
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

Figure 2
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 2
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

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Zemelka-Wiacek, M., Majewska-Szczepanik, M., Gajdanowicz, P., Szczepanik, M. Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. J. Vis. Exp. (187), e64329, doi:10.3791/64329 (2022).

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