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Biology

सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया में 5-एथिनिल -2'-डीऑक्सीयूरिडाइन निगमन का उपयोग करके एस-चरण अवधि का निर्धारण

Published: October 21, 2022 doi: 10.3791/64490
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, Université de Montpellier, CNRS

Summary

हम ईडीयू, एक थाइमिडीन एनालॉग का उपयोग करके एस सेरेविसिया में एस-चरण अवधि को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए दो पूरक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसे विवो में शामिल किया जाता है और माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा क्लिक रसायन विज्ञान का उपयोग करके पता लगाया जाता है। यह डीएनए प्रतिकृति की अवधि और उत्परिवर्ती में अनदेखी प्रतिकृति दोषों के आसान लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है।

Abstract

यूकेरियोटिक डीएनए प्रतिकृति एक अत्यधिक विनियमित प्रक्रिया है जो यह सुनिश्चित करती है कि क्रोमोसोम अलगाव से पहले एक कोशिका का आनुवंशिक ब्लूप्रिंट सही ढंग से डुप्लिकेट किया गया है। चूंकि डीएनए संश्लेषण दोष क्रोमोसोम पुनर्व्यवस्था को रेखांकित करते हैं, इसलिए जीनोम अस्थिरता के आधार को समझने के लिए डीएनए प्रतिकृति की निगरानी आवश्यक हो गई है। सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया सेल चक्र विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक शास्त्रीय मॉडल है, लेकिन प्रमुख डीएनए प्रतिकृति पैरामीटर, जैसे कि एस चरण या एस-चरण अवधि में कोशिकाओं का अंश, अभी भी निर्धारित करना मुश्किल है। यह प्रोटोकॉल 5-एथिनाइल-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन (ईडीयू), एक थाइमिडीन एनालॉग, इंजीनियर टीके-एचईएनटी 1 खमीर कोशिकाओं में छोटी और गैर-विषाक्त दालों का उपयोग करता है, इसके बाद माइक्रोस्कोपी और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एकल-कोशिका और जनसंख्या स्तरों दोनों पर उच्च स्थानिक और अस्थायी संकल्प के साथ डीएनए प्रतिकृति के विज़ुअलाइज़ेशन और परिमाणीकरण की अनुमति देने के लिए क्लिक रिएक्शन द्वारा इसका पता लगाया जाता है। यह विधि खमीर उत्परिवर्ती के एस चरण और सेल चक्र प्रगति में पहले से अनदेखी दोषों की पहचान कर सकती है, जिससे जीनोम स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक नए खिलाड़ियों के लक्षण वर्णन की अनुमति मिलती है।

Introduction

माइटोटिक विभाजन के माध्यम से जीनोम स्थिरता दो उत्पादित कोशिका संतानों को गुणसूत्रों के एक पूर्ण और समान सेट के संचरण द्वारा सुनिश्चित की जाती है। यह सेल चक्र के प्रत्येक चरण में एक निश्चित समय में होने वाली घटनाओं की एक श्रृंखला के सटीक समापन पर निर्भर करता है। जी1 में, प्रतिकृति उत्पत्ति को सीडीसी 6 1 सहित कई लाइसेंसिंग कारकों की भर्ती पर लाइसेंस दिया जाताहै। एस चरण में, पूरे जीनोम दोहराव को कई सक्रिय प्रतिकृति उत्पत्ति से शुरू किया जाता है और प्रतिकृति मशीनरी द्वारा किया जाता है जो प्रतिकृति कारखानों2 नामक सूक्ष्म रूप से दृश्यमान फॉसी में इकट्ठा होते हैं। एम चरण में, डुप्लिकेट बहन क्रोमैटिड को माइटोटिक स्पिंडल पर जोड़ा और बायोरिएंटेड किया जाता है ताकि माइटोटिक सेल3 के विपरीत ध्रुवों को उनके अलगाव की अनुमति मिल सके। जीनोम स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए विनियमन, उचित पूर्णता और प्रत्येक चरण की अवधि महत्वपूर्ण है। दरअसल, इनमें से किसी भी चरण से समय से पहले बाहर निकलने से जीनोम अस्थिरता होती है। उदाहरण के लिए, नवोदित खमीर सीडीके अवरोधक एसआईसी1 के विलोपन या जी 1 साइक्लिन के ओवरएक्प्रेशन से प्रेरित एक छोटा जी1 बाद के एस चरण 4,5,6 को बदल देगा। नतीजतन, प्रतिकृति तनाव से जुड़े या नहीं इन विनियमनों के परिणामस्वरूप क्रोमोसोम टूटना, पुनर्व्यवस्था और गलत पृथक्करण 4,5,6 होता है। इसलिए, एस चरण की अवधि की निगरानी और, अधिक व्यापक रूप से, सेल चक्र के अन्य चरणों की अवधि विभिन्न उत्परिवर्ती और विभिन्न तनावपूर्ण स्थितियों में होने वाले दोषों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकती है।

सेल चक्र चरण अवधि को मापने के लिए एक पारंपरिक विधि में सरल डीएनए सामग्री प्रवाह साइटोमेट्री (चित्रा 1 ए) शामिल है और यह एक फिटिंग एल्गोरिदम (अधिकांश साइटोमेट्री सॉफ्टवेयर में उपलब्ध) पर निर्भर करता है जिसका उपयोग आबादी को 1 सी और 2 सी चोटियों से जी1, एस और जी2 + एम चरण अंशों में अलग करने के लिए किया जाता है। अंशों को तब जनसंख्या दोगुना समय 7 से गुणा किया जाताहै। हालांकि, यह विधि केवल अनुमानित मान देती है, किसी दिए गए अंश के भीतर एक सजातीय सेल आकार वितरण की आवश्यकता होती है, और सिंक्रनाइज़ संस्कृतियों पर लागू नहीं होती है। स्तनधारी कोशिकाओं में एस-चरण अवधि का अध्ययन करने के लिए, कई थाइमिडीन एनालॉग विकसित किए गए हैं और व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं, जिसमें ईडीयू भी शामिल है। थाइमिडीन किनेज (इसके बाद टीके के रूप में संदर्भित) द्वारा बाह्य माध्यम और फॉस्फोराइलेशन से उनका उत्थान उन्हें डीएनए संश्लेषण (प्रतिकृति, पुनर्संयोजन, मरम्मत) की साइटों पर शामिल करने के लिए डीएनए पोलीमरेज़ के लिए उपलब्ध कराता है। सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया कोशिकाओं में टीके जीन की अनुपस्थिति को बायपास करने के लिए, खमीर उपभेदों को हर्पीज सिम्प्लेक्स वायरस टीके8 और मानव समतुल्य न्यूक्लियोसाइड ट्रांसपोर्टर (एचईएनटी 1)9 की स्थिर और संवैधानिक अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए इंजीनियर किया गया है। एक बार डीएनए में शामिल होने के बाद, ईडीयू का पता चयनात्मक क्लिक प्रतिक्रिया के माध्यम से लगाया जाता है, जो रासायनिक रूप से एज़ाइड-संशोधित फ्लोरोक्रोम10 के लिए अपने एल्केन मोइटी को जोड़ता है।

यह पेपर डीएनए प्रतिकृति अवधि और गतिशीलता के साथ-साथ सेल चक्र के अन्य चरणों की अवधि को सटीक रूप से कल्पना करने और मापने के लिए ईडीयू के साथ पल्स-लेबल अतुल्यकालिक और तुल्यकालिक टीके-एचईएनटी 1 इंजीनियर कोशिकाओं के लिए दो अनुकूलित व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करता है, जिसमें माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एकल-कोशिका और जनसंख्या दोनों स्तरों पर उच्च स्थानिक और अस्थायी संकल्प होता है।

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Protocol

1 . एस सेरेविसिया सेल संस्कृति

नोट: उपयोग किए गए खमीर उपभेदों को तालिका 1 में सूचीबद्ध किया गया है

नोट: एस-चरण अवधि की निगरानी विभिन्न तरीकों से की जा सकती है। संबोधित किए जाने वाले प्रश्न के आधार पर, जी 1 गिरफ्तारी के बाद कोशिकाओं को अतुल्यकालिक या तुल्यकालिक रूप सेउगाया जा सकता है।

  1. अतुल्यकालिक रूप से बढ़ते एस सेरेविसिया कोशिकाओं से
    नोट: यह विधि एक अतुल्यकालिक रूप से बढ़ती सेल आबादी में एस चरण में कोशिकाओं के प्रतिशत के निर्धारण की अनुमति देती है। दोहरीकरण समय का निर्धारण करके, एस चरण (और अन्य चरणों) की अवधि को विस्तारित किया जा सकता है।
    1. 130 आरपीएम पर कक्षीय आंदोलन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर की संस्कृति के लिए कम सेल एकाग्रता (5 × 104 कोशिकाओं / एमएल) पर सिंथेटिक पूर्ण (एससी) माध्यम में एस सेरेविसिया कोशिकाओं को टीका लगाएं।
      नोट: एकाग्रता को सेल काउंटर के साथ मापा जाता है। दोगुने समय की कुशलतापूर्वक गणना करने के लिए, रात भर की संस्कृति से संस्कृति को टीका लगाने की सिफारिश की जाती है जो अभी भी घातीय चरण में है (यानी, आदर्श रूप से 2 × 107 कोशिकाओं / एमएल से नीचे)। समृद्ध माध्यम (वाईपीडी) में बढ़ती कोशिकाओं की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि ईडीयू का पता लगाना कुशल नहीं है।
    2. अगले दिन, 5 × 10 5कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता पर 20 एमएल ताजा एससी माध्यम में कोशिकाओं को पतला करें।
    3. 120 आरपीएम पर क्षैतिज झटकों के साथ एक हिलते पानी के स्नान में 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को कल्चर करें।
    4. हर घंटे सेल एकाग्रता को मापें जब तक कि यह 1 × 107 कोशिकाओं / एमएल तक न पहुंच जाए।
      नोट: यह कदम समय के साथ सेल एकाग्रता वृद्धि के ग्राफिकल प्रतिनिधित्व करने की अनुमति देता है। दोहरीकरण समय की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सूत्र को तालिका 2 की किंवदंती में समझाया गया है।
    5. ईडीयू लेबलिंग के लिए चरण 2 के समानांतर आगे बढ़ें जब सेल एकाग्रता लगभग 2 × 106-5 × 106 कोशिकाएं / एमएल है।
  2. G1-सिंक्रनाइज़ S. Cerevisiae कोशिकाओं से
    नोट: यह विधि प्रवाह साइटोमेट्री और / या माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के माध्यम से एस चरण कब शुरू और समाप्त होती है, इसका निर्धारण करने की अनुमति देती है।
    1. एससी माध्यम के 10 एमएल में कम सेल एकाग्रता (5 × 104 कोशिकाओं / एमएल) पर 130 आरपीएम पर कक्षीय आंदोलन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर की संस्कृति के लिए एस सेरेविसिया कोशिकाओं को टीका लगाया जाता है।
      नोट: चरण 1.1.1 के बाद नोट्स देखें।
    2. अगले दिन, 2 से 106-3 × × 10 6कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता पर ताजा एससी माध्यम के 20 एमएल में कोशिकाओं को पतला करें।
    3. पानी में पतला α-फैक्टर का 40 μL 1 mg/mL जोड़ें।
    4. 1 घंटे के लिए 130 आरपीएम पर कक्षीय आंदोलन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को कल्चर करें।
    5. पानी में पतला α-फैक्टर के 40 μL को फिर से जोड़ें।
    6. 1 घंटे के लिए 130 आरपीएम पर कक्षीय आंदोलन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को कल्चर करें।
    7. जी1 गिरफ्तारी की निगरानी के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की कल्पना करें। आगे बढ़ें यदि 90% से अधिक कोशिकाएं एक शमू प्रदर्शित करती हैं और अन्य गोल, बिना बुड्ड कोशिकाएं होती हैं।
      नोट: उपयोग की गई पृष्ठभूमि के आधार पर, शमू विज़ुअलाइज़ेशन से पहले कोशिकाओं को सोनिकेट करने की सिफारिश की जाती है। W303 पृष्ठभूमि के लिए, सोनिकेट 2x, हर बार 2 s के लिए, 40-50 के आयाम पर।
    8. 1,500 × ग्राम पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। वैक्यूम पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    9. एससी माध्यम के 20 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    10. चरण 1.2.8-1.2.9 को एक बार दोहराएँ।
      नोट: α-कारक इन चरणों के साथ धोया जाता है, और कोशिकाओं को कोशिका चक्र में जारी किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, वैक्यूम पंप से जुड़े साइड-आर्म फ्लास्क पर फ़नल सेट का उपयोग करके खमीर कोशिकाओं को 1.2 μm नाइट्रोसेल्यूलोज फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करके α-फैक्टर को धोया जा सकता है।
    11. हर 5 मिनट में 2x 1 एमएल कोशिकाओं को इकट्ठा करें और ईडीयू लेबलिंग के लिए चरण 2 पर आगे बढ़ें।
      नोट: ईडीयू के साथ दो ट्यूबों में से केवल एक से कोशिकाओं को पल्स-लेबल करें। गैर-पल्स-लेबल कोशिकाओं का उपयोग एक द्विभिन्नरूपी प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई)-ईडीयू ग्राफ पर ईडीयू-नकारात्मक कोशिकाओं से ईडीयू-पॉजिटिव को अलग करने के लिए किया जाता है।
    12. छोड़ने के 30 मिनट बाद पानी में पतला 1 मिलीग्राम / एमएल α-फैक्टर का 400 μL जोड़ें।
      नोट: α-कारक की यह उच्च खुराक अगले सेल चक्र के जी1 चरण में कोशिकाओं को गिरफ्तार करने और कोशिकाओं को बाद के एस चरण में फिर से प्रवेश करने से रोकने के लिए आवश्यक है।

2. ईडीयू लेबलिंग

  1. सेल कल्चर के 1 एमएल को 2.0 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 10 एमएम ईडीयू का 1 μL होता है। व्युत्क्रमण द्वारा अच्छी तरह मिलाएं।
    नोट: पीआई-ईडीयू द्विभिन्नरूपी एफएसीएस पर ईडीयू-नकारात्मक कोशिकाओं से ईडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं को अलग करने के लिए, एक और 1 एमएल सेल कल्चर को 2.0 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें डीएमएसओ का 1 μL होता है।
  2. हिलते हुए पानी के स्नान में आंदोलन के तहत 30 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: माइक्रोस्कोप के साथ ईडीयू का पता लगाने के लिए तीन मिनट पर्याप्त हैं; प्रवाह साइटोमीटर पर इष्टतम ईडीयू का पता लगाने के लिए 5 मिनट की आवश्यकता होती है।
  3. 100% इथेनॉल के 100 μL के अतिरिक्त प्रतिक्रिया को रोकें।
    1. यदि सेल आकार माप की आवश्यकता है तो 20% पैराफॉर्मलडिहाइड के 100 μL के अतिरिक्त प्रतिक्रिया को रोकें।
      नोट: यदि क्लिक प्रतिक्रिया के बाद आगे के विश्लेषण के लिए माइटोटिक कोशिकाओं की परमाणु वास्तुकला को बरकरार रखा जाना है, तो हम कोशिकाओं को बर्फ पर रखने के बजाय कमरे के तापमान (आरटी) पर 2% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करने की सलाह देते हैं, क्योंकि बाद में सूक्ष्मनलिका डिपोलीमराइजेशन का कारण बनता है।
    2. 100% इथेनॉल के 100 μL को जोड़ने से पहले कोशिकाओं को ठीक करने के लिए 20 झुकाव / मिनट पर एक चर गति रॉकर पर हल्के आंदोलन के तहत आरटी पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को छोड़ दें।

3. सेल निर्धारण और परमेबिलाइजेशन

  1. माइक्रोफ्यूज में 10,000 × ग्राम पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को पेलेट करें। वैक्यूम पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  2. सेल पेलेट को 70% इथेनॉल के 500 μL में पुन: निलंबित करें। भंवर द्वारा अच्छी तरह मिलाएं।
  3. कोशिकाओं को स्थिर करने के लिए एक चर गति रॉकर पर 20 झुकाव / मिनट पर आरटी पर ≥1 घंटे के लिए छोड़ दें।
    नोट: एससी माध्यम में उगाई गई कोशिकाएं अच्छी तरह से गोली नहीं खाती हैं क्योंकि वे माइक्रोफ्यूज दीवारों से चिपके रहते हैं। इथेनॉल के अतिरिक्त पेलेटिंग में सुधार होता है और सेल हानि को कम करता है। कोशिकाओं को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर या -20 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में 10,000 × ग्राम पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को छर्रों से हटाएं। वैक्यूम पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
  5. पीबीएस में 10% इथेनॉल के 500 μL के साथ कोशिकाओं को 2x धोएं।
    नोट: कोशिकाओं से अनिगमित ईडीयू को हटाने के लिए वॉश महत्वपूर्ण हैं।

4. क्लिक-इट प्रतिक्रिया

  1. साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए
    1. माइक्रोफ्यूज में 10,000 × ग्राम पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को पेलेट करें। वैक्यूम पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    2. 200 मिलीग्राम /एमएल आरएनएस ए और 0.2 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन के युक्त पीबीएस के 200 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
    3. कभी-कभी झटकों (या रात भर 37 डिग्री सेल्सियस) के साथ 50 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में 10,000 × ग्राम पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को छर्रों से हटाएं। वैक्यूम पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    5. कोशिकाओं को पीबीएस के 500 μL के साथ धोएं।
    6. माइक्रोफ्यूज में 10,000 × ग्राम पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को पेलेट करें। वैक्यूम पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    7. पीबीएस + 1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के 200 μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। आरटी पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: लंबे समय आवश्यक नहीं हैं और क्लिक प्रतिक्रियाओं की दक्षता के लिए भी हानिकारक हैं।
    8. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में 10,000 × ग्राम पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को छर्रों से हटाएं। वैक्यूम पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    9. पीबीएस + 1% बीएसए के 300 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
    10. कोशिकाओं को दो ट्यूबों के बीच वितरित करें: क्लिक प्रतिक्रिया के लिए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 200 μL और Sytox ग्रीन स्टेनिंग के लिए एक अन्य 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 100 μL।
    11. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में 10,000 × ग्राम पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को छर्रों से हटाएं। वैक्यूम पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    12. साइटॉक्स ग्रीन स्टेनिंग के लिए
      नोट: हम उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए सामग्री संदर्भ प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए साइटॉक्स ग्रीन स्टेनिंग (क्लिक के बिना) के लिए एक एलिकोट लेने की अत्यधिक सलाह देते हैं। दरअसल, क्लिक प्रतिक्रिया दृढ़ता से इंटरकैलेंट फ्लोरेसेंस को बुझाती है, जिसमें साइटॉक्स ग्रीन और पीआई फ्लोरेसेंस शामिल हैं। नतीजतन, क्लिक प्रतिक्रिया डीएनए सामग्री के पढ़ने को विकृत कर सकती है।
      1. पीबीएस के 100 μL में सेल गोली को पुन: निलंबित करें।
      2. 10-30 μL (सेल एकाग्रता के आधार पर) को एक प्रवाह साइटोमीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, और 0.5 μM Sytox Green का 300 μL होता है।
      3. सोनिकेट 2x, हर बार 2 सेकंड के लिए, 40-50 के आयाम पर।
      4. प्रवाह साइटोमीटर पर नमूने संसाधित करने तक अंधेरे में छोड़ दें।
        नोट: कोशिकाओं को कुछ दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इस स्तर पर रखा जा सकता है।
    13. क्लिक प्रतिक्रिया के लिए
      1. अभिकर्मकों को निम्नलिखित क्रम में मिलाकर ताजा एज़ाइड डाई बफर तैयार करें (एक ट्यूब के लिए मात्रा): पीबीएस का 36 μL, 0.2 M CuSO4 का 2 μL, 2 mM Cy5 Azide का 0.2 μL, और 1 M एस्कॉर्बिक एसिड का 2 μL।
        नोट: एज़ाइड डाई बफर का मास्टर मिश्रण तैयार करना संभव है। अभिकर्मकों को उसी क्रम में मिश्रित किया जाना चाहिए जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है।
      2. सेल पेलेट को 40 μL ताजा एज़ाइड डाई मिश्रण के साथ पुन: निलंबित करें। 60 मिनट के लिए अंधेरे में आरटी में इनक्यूबेट करें।
      3. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में 10,000 × ग्राम पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को पेलेट करें। वैक्यूम पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
      4. पीबीएस में 10% इथेनॉल के 300 μL के साथ कोशिकाओं को 3x धोएं।
        नोट: सभी घुलनशील ईडीयू-Cy5 एज़ाइड को खत्म करने के लिए वॉश महत्वपूर्ण हैं।
      5. पीबीएस में कोशिकाओं को 50 μg / mL PI के 100 μL में पुन: निलंबित करें। अंधेरे में 10 मिनट के लिए छोड़ दें।
      6. सेल सस्पेंशन के 10-30 μL (सेल एकाग्रता के आधार पर) को एक प्रवाह साइटोमीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 का 300 μL होता है।
      7. सोनिकेट 2x, हर बार 2 सेकंड के लिए, 40-50 के आयाम पर।
      8. साइटोमीटर पर नमूने संसाधित करने तक अंधेरे में छोड़ दें।
        नोट: कोशिकाओं को कुछ दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इस स्तर पर रखा जा सकता है।
    14. 488 एनएम और 530/30 बीपी फिल्टर पर उत्तेजना नीले लेजर का उपयोग करके साइटॉक्स ग्रीन नमूने पढ़ें। विशिष्ट परिणामों के लिए चित्रा 1 ए देखें। 488 एनएम पर उत्तेजना नीले लेजर और पीआई (एक्स-अक्ष) के लिए 615/20 बीपी फिल्टर और 640 एनएम और 660/20 बीपी फिल्टर (वाई-अक्ष) पर एक उत्तेजना लाल लेजर का उपयोग करके डॉट प्लॉट पर द्विभिन्नरूपी पीआई-ईडीयू नमूने पढ़ें। विशिष्ट परिणामों के लिए चित्र 1B देखें।
      नोट: चित्रा 1 सी ईडीयू-नकारात्मक कोशिकाओं के लिए विशिष्ट पीआई-ईडीयू द्विभिन्नरूपी एफएसीएस परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है। यह ईडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं से ईडीयू-नकारात्मक कोशिकाओं के भेदभाव की अनुमति देता है।
  2. माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए
    1. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में 10,000 × ग्राम पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को छर्रों से हटाएं। वैक्यूम पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    2. पीबीएस + 1% बीएसए के 200 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। आरटी पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. माइक्रोफ्यूज में 10,000 × ग्राम पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को गोली मार दें। वैक्यूम पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    4. अभिकर्मकों को निम्नलिखित क्रम में मिलाकर ताजा एज़ाइड डाई बफर तैयार करें (एक ट्यूब के लिए मात्रा): पीबीएस का 36 μL, 0.2 M CuSO4 का 2 μL, 2 mM Dy-530 azide का 0.2 μL, 1 M एस्कॉर्बिक एसिड का 2 μL।
      नोट: उपरोक्त क्रम में अभिकर्मकों को मिलाकर अज़ाइड डाई बफर का एक मास्टर मिश्रण ताजा तैयार किया जा सकता है।
    5. पैलेट को 40 μL ताजा एज़ाइड डाई बफर के साथ पुन: निलंबित करें। 60 मिनट के लिए अंधेरे में आरटी में इनक्यूबेट करें।
    6. माइक्रोफ्यूज में 10,000 × ग्राम पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को छर्रों से हटा दें। वैक्यूम पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    7. पीबीएस में 10% इथेनॉल के 300 μL के साथ कोशिकाओं को 2x धोएं।
      नोट: सभी घुलनशील डीवाई -530 एज़ाइड को खत्म करने के लिए वॉश महत्वपूर्ण हैं।
    8. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में 10,000 × ग्राम पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को गोली मार दें। वैक्यूम पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    9. पीबीएस में कोशिकाओं को 0.5 μg/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के 100 μL में पुन: निलंबित किया जाता है। कमरे के तापमान पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए छोड़ दें।
    10. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में 10,000 × ग्राम पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को छर्रों से हटाएं। वैक्यूम पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    11. अतिरिक्त DAPI को हटाने के लिए 300 μL PBS के साथ धो लें।
    12. माइक्रोफ्यूज में 10,000 × ग्राम पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को गोली मार दें। वैक्यूम पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    13. सेल एकाग्रता के आधार पर पीबीएस के 10-50 μL के साथ गोली को फिर से निलंबित करें।
    14. सोनिकेट 2x, हर बार 2 सेकंड के लिए, 40-50 के आयाम पर।
      नोट: कोशिकाओं को कुछ दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इस स्तर पर रखा जा सकता है।
    15. ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कोशिकाओं का पिपेट 1.7 μL और एक साफ कवरलिप के साथ कवर करें।
    16. तुरंत DAPI और TexasRed या Cy3 फिल्टर के साथ एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें।

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Representative Results

एस-चरण अवधि निर्धारित करने के लिए और, अधिक व्यापक रूप से, जी1 और जी2 + एम (प्रोटोकॉल चरण 1.1), एस सेरेविसिया डब्ल्यू 303 जंगली प्रकार की कोशिकाओं (डब्ल्यूटी, तालिका 1) को 7 घंटे के लिए एससी माध्यम में अतुल्यकालिक रूप से उगाया गया था। हर घंटे, दोहरीकरण समय निर्धारित करने के लिए सेल एकाग्रता की निगरानी की गई (चित्रा 2 बी)। इन विकास स्थितियों में, गणना की गई दोहरीकरण समय 25 डिग्री सेल्सियस पर 120 मिनट ± 13 मिनट था (तालिका 2)। जब कोशिकाएं घातीय चरण (2 × 106-5 × 106 कोशिकाओं / एमएल) में थीं, तो कोशिकाओं के एक एलिकोट को एस चरण में कोशिकाओं को एकल करने और जी 1, एस और जी2 + एम चरणों में कोशिकाओं के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए 5 मिनट के लिए ईडीयू (10 μM) के साथ पल्स-लेबल किया गया था। कोशिकाओं की तीन आबादी को द्विभिन्नरूपी ईडीयू-पीआई साइटोमीटर विश्लेषण (चित्रा 1 बी) में देखा गया था। ईडीयू-नकारात्मक और ईडीयू-पॉजिटिव आबादी के बीच भेदभाव एक नियंत्रण प्रयोग का उपयोग करके किया गया था जिसमें कोशिकाओं को ईडीयू के साथ पल्स-लेबल नहीं किया गया था, लेकिन क्लिक प्रतिक्रिया की गई थी (चित्रा 1 सी)। नीचे-बाएं और नीचे-दाएं क्षेत्रों में दो ईडीयू-नकारात्मक आबादी जो पीआई तीव्रता में दो गुना भिन्न थी, क्रमशः जी1 और जी2 + एम के अनुरूप थी (चित्रा 1 बी, सी)। इसलिए, ऊपरी आबादी (तीव्रता >1× 104-2 × 104) के साथ) ईडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं के अनुरूप थी जो पल्स के समय एस चरण में थीं (चित्रा 1 बी)। इसलिए, सेल आबादी ± 5% का 27% जी1 चरण में था, 29% ± 3% एस चरण में था, और 2% ± 44% जी2 + एम में था। चूंकि इन स्थितियों में दोगुना होने का समय 120 मिनट ± 13 मिनट था, हमने निष्कर्ष निकाला कि जी1, एस, और जी2 + एम चरण क्रमशः 32 मिनट ± 4 मिनट, 35 मिनट ± 6 मिनट और 53 मिनट ± 7 मिनट तक चले, 25 डिग्री सेल्सियस (तालिका 2 और तालिका 3)।

इसके बाद, हमने इस विधि को मान्य करने का लक्ष्य रखा और दिखाया कि यह डीएनए प्रतिकृति दोषों के साथ उत्परिवर्ती की पहचान करने के लिए पर्याप्त संवेदनशील है जिन्हें अब तक अनदेखा किया गया है। हमने तर्क दिया कि डीएनए प्रतिकृति में शामिल कारकों के असमर्थ हानि-ऑफ-फ़ंक्शन एलील आदर्श सत्यापन नियंत्रण होंगे। इसलिए, हमने तापमान-संवेदनशील सीडीसी 6-1 उत्परिवर्ती (तालिका 1)11) वाले खमीर तनाव का उपयोग किया। सीडीसी 6 एक आवश्यक लाइसेंसिंग कारक है जिसे ओआरसी-बाध्य गुणसूत्र साइटों पर प्रीरेप्लिकेशन कॉम्प्लेक्स (प्रीआरसी) को इकट्ठा करने के लिए एम और जी1 के अंत में व्यक्त किया जाता है जिसे बाद में प्रतिकृति उत्पत्ति के रूप में उपयोग किया जा सकता है। इसलिए, अनुमेय तापमान पर, इसकी एस-चरण अवधि डब्ल्यूटी के समान होनी चाहिए, जबकि प्रतिबंधात्मक तापमान पर, कोई डीएनए प्रतिकृति नहीं होनी चाहिए क्योंकि कोईमूल लाइसेंस प्राप्त नहीं है। हालांकि, एक अर्ध-अनुमेय तापमान पर, जहां कम मूल लाइसेंस प्राप्त हैं लेकिन सेल व्यवहार्यता प्रदान करने के लिए पर्याप्त हैं (हमारे अप्रकाशित डेटा; बारबा टेना एट अल, तैयारी में, हमने प्रत्येक चरण के लिए अलग-अलग अवधि का अनुमान लगाया। जैसा कि अपेक्षित था, ड्रॉप परीक्षणों के आधार पर, सीडीसी 6-1 कोशिकाएं अनुमेय तापमान (यानी, 25 डिग्री सेल्सियस, चित्रा 2 ए) पर डब्ल्यूटी कोशिकाओं के समान बढ़ीं, जो एक ही दोहरीकरण समय (चित्रा 2 बी और तालिका 2) प्रदर्शित करती हैं, लेकिन 34 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2 ए) पर या उससे ऊपर मृत थीं। रुचि के अनुसार, अर्ध-अनुमेय तापमान (यानी, 28 डिग्री सेल्सियस) पर, सीडीसी 6-1 व्यवहार्य था (28 डिग्री सेल्सियस, चित्रा 2 ए)। हालांकि, डबलिंग समय डब्ल्यूटी (चित्रा 2 बी और तालिका 2) की तुलना में लंबा था, और प्रत्येक चरण की अवधि अलग थी। दरअसल, सीडीसी 6-1 में, जी1 थोड़ा छोटा था (12 मिनट ± 1 मिनट बनाम 16 मिनट ± 2 मिनट), जबकि एस चरण थोड़ा बढ़ा हुआ था (34 मिनट ± 4 मिनट बनाम 29 मिनट ± 5 मिनट), और जी2 + एम चरण डब्ल्यूटी की तुलना में काफी लंबा था (77 मिनट ± 4 मिनट बनाम 45 मिनट ± 3 मिनट) डब्ल्यूटी (चित्रा 2 सी, चित्रा 2 सी, चित्रा 2 सी) की तुलना में। डी और तालिका 3)। एस चरण, आश्चर्यजनक रूप से, बहुत अधिक विस्तारित नहीं किया गया था, लेकिन ईडीयू सिग्नल की औसत तीव्रता 25% (चित्रा 2 सी, डी) से कम हो गई थी, जो कम मूल से शुरू किए गए एस चरण के अनुरूप है। इसके अलावा, जबकि ईडीयू-पॉजिटिव डब्ल्यूटी कोशिकाओं को प्रारंभिक (एस 1) और देर से एस (एस 2) चरणों (चित्रा 2 सी, पूरक चित्रा एस 1 ए, प्रारंभिक [एस 1] और देर से एस [एस 2] चरणों के बीच समरूप रूप से वितरित किया गया था, जो ऊपरी द्वार में ऊर्ध्वाधर डैश लाइन के साथ सीमांकित थे), ईडीयू-पॉजिटिव सीडीसी 6-1 कोशिकाओं का 65% देर से एस चरण (चित्रा 2 डी, पूरक चित्रा एस 1 बी) में जमा हुआ था। एस और जी 2 + एम आबादी (चित्रा2 डी) के बीच कोई स्पष्ट अंतर नहीं था, यह सुझाव देते हुए कि कोशिकाओं ने जी2 चरण में प्रवेश करने से पहले एस चरण को पूरा करने के लिए संघर्ष किया। इसलिए, यह विधि एस चरण (अवधि और / या वितरण) और सेल चक्र चरण अवधि में दोषों के साथ उत्परिवर्ती की पहचान करने के लिए उपयुक्त और संवेदनशील है।

यह निर्धारित करने के लिए एक पूरक विधि तैयार की गई थी कि कोशिकाएं अपनी डीएनए प्रतिकृति कब शुरू और समाप्त करती हैं और सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं (प्रोटोकॉल चरण 1.2) का उपयोग करके एस-चरण अवधि का अनुमान लगाती हैं। इसके लिए, जी1 में सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं के साथ α-कारक का उपयोग करके, कोशिकाओं को एससी माध्यम में जारी किया गया और हर 5 मिनट में एकत्र किया गया। एस चरण की अवधि उस समय के आधार पर लगभग 25 मिनट हो सकती है जब डीएनए सामग्री साइटॉक्स ग्रीन फ्लो साइटोमीटर प्रोफाइल (चित्रा 3 ए) पर 1 सी से 2 सी तक बदल गई थी। हालांकि, यह अनुमान इस बात पर निर्भर करता है कि आबादी के एक महत्वपूर्ण सेल अंश ने एफएसीएस प्रोफाइल में देखे जाने के लिए पर्याप्त साइटॉक्स ग्रीन को कब शामिल किया है। इस विधि के साथ प्रारंभिक और देर से प्रतिकृति घटनाओं का पता नहीं लगाया जा सकता है। सटीक रूप से परिभाषित करने के लिए कि एस चरण कब शुरू होता है और समाप्त होता है और यह कितने समय तक रहता है, एस-चरण कोशिकाओं को जी 1 रिलीज के बाद हर 5 मिनट के लिए ईडीयू (10 एसएम) के साथ पल्स-लेबलिंग पर कोशिकाओं के एक एलिकोट से अलग कियागया था। जैसा कि अपेक्षित था, रिलीज के बाद पहले 10 मिनट के भीतर, सभी कोशिकाएं नीचे-बाएं क्षेत्र में थीं (यानी, जी1, चित्रा 3 बी, पूरक चित्रा एस 2 में)। रिलीज के पंद्रह मिनट बाद, ईडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं का एक अंश पहले से ही पता लगाया गया था (पूरक चित्रा एस 2 और पूरक चित्रा एस 3, ईडीयू-उपचारित और ईडीयू-मुक्त कोशिकाओं में पहली दो पंक्तियों की तुलना करें), यह दर्शाता है कि एस चरण शुरू हो गया था (चित्रा 3 सी)। एस चरण के माध्यम से प्रगति को सेल क्लाउड द्वारा पहले ऊपर की ओर और फिर बाईवेरिएट पीआई-ईडीयू ग्राफ (चित्रा 3 डी-एफ) में दाईं ओर बढ़ते हुए देखा गया था। अंत में, रिलीज से 35 मिनट बाद, कोशिकाओं का एक अंश ईडीयू-नकारात्मक था, लेकिन डीएनए की मात्रा दोगुनी थी, यह दर्शाता है कि उन कोशिकाओं ने एस चरण पूरा कर लिया था और जी2 + एम चरण (चित्रा 3 जी) में थे। इस प्रकार, एस चरण इन स्थितियों में 20 मिनट तक रहता है। ध्यान दें, साइटॉक्स ग्रीन के साथ पाए गए डीएनए सामग्री के ओवरले के साथ देखे गए उच्च सिंक्रनाइज़ के बावजूद, यह सुझाव देते हुए कि रिलीज के 40 मिनट बाद पूरी आबादी में एस चरण समाप्त हो गया था, द्विभिन्नरूपी विश्लेषण से पता चला कि कुछ कोशिकाओं ने रिलीज के 60 मिनट बाद एस चरण समाप्त कर दिया था और रिलीज के 65 मिनट बाद पूरी आबादी के लिए एस चरण पूरा हो गया था (चित्रा 3 एच, चित्रा 3 एच, मैं और पूरक चित्रा एस 2)।

इसके अतिरिक्त, माइक्रोस्कोपी द्वारा एस चरण और डीएनए संश्लेषण की निगरानी की जा सकती है। प्रत्येक सक्रिय प्रतिकृति उत्पत्ति से, डीएनए संश्लेषण दो टेथर्ड रिप्लिसोम द्वारा किया जाता है, जिससे एक परमाणु प्रतिकृति फोकस बनता है, जिसके बाद माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रतिकृति कारक और / या ऑपरेटर सरणी के टैग किए गए संस्करण की इमेजिंग की जा सकती है और फ्लोरोसेंट प्रोटीन 2,13 से जुड़े उनके संबंधित दमनकारी। वैकल्पिक रूप से, थाइमिडीन एनालॉग्स14,15 का उपयोग करके माइक्रोस्कोपी द्वारा डीएनए संश्लेषण का पता लगाया जा सकता है। हमने डीएनए संश्लेषण से गुजरने वाले उप-परमाणु डीएनए क्षेत्रों की निगरानी के लिए ईडीयू का उपयोग किया। इसके लिए, हमने 28 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए ईडीयू (10 μM) के साथ एसिंक्रोनस डब्ल्यूटी और सीडीसी 6-1 कोशिकाओं को पल्स-लेबल किया और क्लिक प्रतिक्रिया के बाद उन्हें चित्रित किया। हम डीएनए संश्लेषण दर के आधार पर और 3 मिनट ईडीयू पल्स के दौरान सेल चक्र में सेल प्रगति के आधार पर ईडीयू सिग्नल तीव्रता में भिन्नता का पता लगाने की उम्मीद कर रहे थे (यानी, एस चरण में पूरे 3 मिनट बिताने वाली कोशिकाएं पल्स के दौरान एस चरण में प्रवेश करने या बाहर निकलने वालों की तुलना में एक मजबूत संकेत प्रदर्शित करेंगी)। तदनुसार, डब्ल्यूटी एस-चरण कोशिकाओं ने अपने नाभिक में एक ईडीयू संकेत प्रदर्शित किया जो तीव्रता में भिन्न था (चित्रा 4 ए)। एस-चरण अवधि को इस विश्लेषण से आसानी से निकाला जा सकता है। दरअसल, यह दो जैविक प्रतिकृतियों से निर्धारित किया गया था (कम से कम 150 कोशिकाओं की गणना की गई थी), कि 34% ± 3% और 38% ± 3% डब्ल्यूटी और सीडीसी 6-1 कोशिकाएं क्रमशः ईडीयू पॉजिटिव थीं। जैसा कि इन विकास स्थितियों में, डब्ल्यूटी और सीडीसी 6-1 कोशिकाओं के लिए दोहरीकरण समय क्रमशः 90 मिनट और 123 मिनट था (तालिका 2), हमने निष्कर्ष निकाला कि एस चरण क्रमशः 31 मिनट और 47 मिनट तक चला। पूर्व परिणाम हमारे एफएसीएस विश्लेषण (तालिका 3) से प्राप्त के अनुरूप है, यह दर्शाता है कि माइक्रोस्कोपी द्वारा ईडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं का पता लगाने से एस-चरण अवधि का निर्धारण होता है। ध्यान दें, उत्तरार्द्ध हमारे एफएसीएस विश्लेषणों से निकाले गए एस-चरण अवधि से अधिक है क्योंकि एस और जी2 + एम आबादी (चित्रा 2 डी) के बीच कोई स्पष्ट अंतर नहीं था। ईडीयू फॉसी को डब्ल्यूटी कोशिकाओं (चित्रा 4 बी) में आसानी से देखा गया था, लेकिन सीडीसी 6-1 कोशिकाओं (चित्रा 4 सी) में मंद और कम थे। इस संभावना को खारिज करने के लिए कि डब्ल्यूटी और सीडीसी 6-1 कोशिकाओं के बीच ईडीयू सिग्नल तीव्रता अंतर एस चरण के चरण पर निर्भर करता है, तीव्रता को सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं से निर्धारित किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, सीडीसी 6-1 कोशिकाओं (चित्रा 4 डी) में औसत ईडीयू सिग्नल तीव्रता तीन गुना कम थी, जो कम प्रतिकृति उत्पत्ति से शुरू की गई डीएनए प्रतिकृति के अनुरूप थी। ईडीयू सिग्नल नाभिक तक ही सीमित था, एक मजबूत डीएपीआई सिग्नल के साथ सह-स्थानीयकरण, और गोलाकार पैटर्न में आयोजित किया गया था, जो परमाणु क्षेत्रों या प्रतिकृति कारखानों में डीएनए प्रतिकृति के संगठन के अनुरूप था। महत्वपूर्ण रूप से, ईडीयू केवल अनब्यूडेड या छोटे-बुडेड कोशिकाओं में पाया गया था और बड़ी कलियों वाली कोशिकाओं में कभी मौजूद नहीं था, यह दर्शाता है कि डब्ल्यूटी खमीर कोशिकाओं ने माइटोसिस में प्रवेश करने तक प्रतिकृति समाप्त कर दी थी। इसलिए, यह विधि एक उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन पर डीएनए प्रतिकृति की कल्पना करने के साथ-साथ हल्के डीएनए प्रतिकृति दोषों का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए संवेदनशील है।

Figure 1
(बी, सी) प्रतिनिधि ईडीयू-पीआई द्विभिन्नरूपी एफएसीएस विश्लेषण 25 डिग्री सेल्सियस पर उगाए गए डब्ल्यूटी कोशिकाओं के लिए और ईडीयू (10 μM) या डीएमएसओ के 1 μL के साथ 5 मिनट के लिए पल्स-लेबल वाली डब्ल्यूटी कोशिकाओं के लिए विश्लेषण करता है। दोनों विश्लेषणों में बहुभुज समान थे। सी का उपयोग ईडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं से ईडीयू-नकारात्मक को चित्रित करने के लिए किया गया था (आम तौर पर, सीमा तीव्रता >1× 104-2 × 10 4) पर निर्धारित कीजाती है। शीर्ष बहुभुज गेट ने ईडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं (एस-चरण अंश) को चित्रित किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: अतुल्यकालिक कोशिका आबादी मेंG1, S, और G2 + M सेल चक्र चरणों में कोशिकाओं का अंश। (A) WT और cdc6-1 उपभेदों को समृद्ध माध्यम पर क्रमिक पांच गुना कमजोर पड़ने पर देखा गया और या तो 25 °C, 28 °C, या 34 °C पर उगाया गया। (B) जनसंख्या दोगुनी होने का समय। अतुल्यकालिक डब्ल्यूटी और सीडीसी 6-1 कोशिकाओं को 25 डिग्री सेल्सियस या 28 डिग्री सेल्सियस पर उगाया गया था, और सेल एकाग्रता को 7 घंटे के लिए हर घंटे मापा गया था। एस-चरण अंश से जनसंख्या दोगुनी होने के समय को गुणा करने से एस-चरण अवधि मिलती है। ईडीयू-पॉजिटिव और ईडीयू-नकारात्मक कोशिकाओं की औसत तीव्रता की गणना संबंधित बहुभुज में प्रत्येक मूल्य की तीव्रता के औसत के रूप में की गई थी। डब्ल्यूटी और सीडीसी 6-1 ईडीयू-नकारात्मक कोशिकाओं (क्रमशः 5,077 और 4,454) की औसत तीव्रता को 1 तक सामान्यीकृत किया गया था। डब्ल्यूटी और सीडीसी 6-1 ईडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं (क्रमशः 52,604 और 36,141) की औसत तीव्रता को प्रत्येक तनाव के लिए उपयोग किए जाने वाले सामान्यीकरण कारक द्वारा विभाजित किया गया था। प्राप्त मान क्रमशः 10.4 और 8.1 थे (यानी, 25% की कमी, जैसा कि पाठ में उल्लेख किया गया है)। संक्षिप्तरूप: डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; ईडीयू = 5-एथिनाइल -2'-डीऑक्सीयूरिडाइन; एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग; पीआई = प्रोपिडियम आयोडाइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं पर एस-चरण अवधि का निर्धारण। (ए) 28 डिग्री सेल्सियस पर α-कारक रिलीज के बाद डब्ल्यूटी कोशिकाओं की डीएनए सामग्री का समय पाठ्यक्रम विश्लेषण। संकेतित समय ईडीयू पल्स (5 मिनट) की अवधि को ध्यान में रखता है। (B-I) ईडीयू-पीआई द्विभिन्नरूपी एफएसीएस सिंक्रनाइज़ डब्ल्यूटी कोशिकाओं के लिए ईडीयू (10 μM) के साथ 5 मिनट के लिए पल्स-लेबल के लिए विश्लेषण करता है और जी1 गिरफ्तारी से रिहाई के बाद संकेतित समय पर एकत्र किया जाता है। संक्षिप्तरूप: डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; ईडीयू = 5-एथिनाइल -2'-डीऑक्सीयूरिडाइन; एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग; पीआई = प्रोपिडियम आयोडाइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: माइक्रोस्कोपी द्वारा ईडीयू का पता लगाना और परिमाणीकरण। अतुल्यकालिक डब्ल्यूटी और सीडीसी 6-1 उपभेदों को 28 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए उगाया गया था, और फिर ईडीयू (10 μM) के साथ 3 मिनट के लिए पल्स-लेबल किया गया था और पर्याप्त उत्तेजना / उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग करके वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया गया था। (ए) डब्ल्यूटी और सीडीसी 6-1 के लिए डब्ल्यूटी और (बी, सी) व्यक्तिगत कोशिकाओं के लिए वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी से प्रतिनिधि छवियां डीआईसी द्वारा कल्पना की गई और डीएपीआई या ईडीयू के लिए दागदार हैं, जैसा कि संकेत दिया गया है। (A) और (B, C) में स्केल सलाखों क्रमशः 10 μm और 2 μm हैं। (डी) जी 1 गिरफ्तारी से रिहाई के बाद सिंक्रोनस डब्ल्यूटी और सीडीसी 6-1 कोशिकाओं पर ईडीयू तीव्रता माप 28 डिग्री सेल्सियस 30 मिनट पर विकसित हुआ। ग्राफ तीन जैविक प्रतिकृतियों की पूलिंग का प्रतिनिधित्व करता है (प्रत्येक जैविक प्रतिकृति में कम से कम 50 कोशिकाओं की गणना की गई थी)। औसत ± एसडी ग्राफ पर प्रदर्शित होते हैं। डब्ल्यूटी और सीडीसी 6-1 कोशिकाओं के बीच एक अप्रकाशित दो पूंछ वाला टी-परीक्षण **** (पी < 0.0001) द्वारा इंगित किया गया है। संक्षिप्तरूप: डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; ईडीयू = 5-एथिनाइल -2'-डीऑक्सीयूरिडाइन; डीआईसी = अंतर हस्तक्षेप विपरीत; DAPI = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल; A.U. = मनमानी इकाइयाँ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नाम जीनोटाइप आंकड़े और तालिकाएँ
WT (E3087): MATA, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3:: URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 चित्र 1, चित्र 2A, B, C, चित्र 3, चित्र 4A, B, D, Supp चित्र 1,2,3 सारणी2,3
सीडीसी 6-1 (ई 5956): MATA, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3:: URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 चित्र 2A, B, D, चित्र 4 C, D, Supp चित्र 1, सारणी 2,3
टीके + (E1000): MATA, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3:: URA3/ GPD-TK(7x) चित्र 4
टीके + एचईएनटी + (ई 2031): MATA, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3:: URA3/GPD-TK (7x), AUR1c::ADH-hENT1 चित्र 4
hENT+ (E2031): MATA, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, AUR1c::ADH-hENT1, RAD52-GFP, URA3::mCherry-TUB1 चित्र 4
सीडीसी 6-1 TK + hENT + (E3968): MATA, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3:: URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 चित्र 4
W303-1A (E001): एमएटीए, एडीई 2-1, टीआरपी 1-1, कैन 1-100, ल्यू 2-3,112, हिस 3-11,15, आरएडी 5, यूआरए 3-1 चित्र 4

तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग किए गए उपभेदों की सूची।

WT सीडीसी 6-1
25 °C 28 °C 25 °C 28 °C
दोहरीकरण समय (मिनट) 120 90 118 123
एसडी ± 13 मिनट ± 3 मिनट ± 10 मिनट ± 6 मिनट

तालिका 2: डब्ल्यूटी और सीडीसी 6-1 उपभेदों का औसत दोगुना समय 25 डिग्री सेल्सियस और 28 डिग्री सेल्सियस पर उगाया जाता है। दोहरीकरण समय की गणना निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके तीन जैविक प्रतिकृतियों (प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लिए चार तकनीकी प्रतिकृतियां) से की गई थी: Δt × ln(2)/ln(Cf/Ci), जहां Cf और Ci क्रमशः अंतिम और प्रारंभिक सेल सांद्रता के अनुरूप हैं, और Nt tf और ti के बीच के मिनटों के अंतर से मेल खाता है, जब Cf और Ci मापा गया था, क्रमशः।

WT सीडीसी 6-1
25 °C 28 °C 25 °C 28 °C
प्रतिशत अवधि
(न्यूनतम)		 प्रतिशत अवधि
(न्यूनतम)		 प्रतिशत अवधि
(न्यूनतम)		 प्रतिशत अवधि
(न्यूनतम)
G1 27 32 18 16 13 16 10 12
S 29 35 32 29 28 34 28 34
G2 + M 44 53 50 45 59 71 62 77
एसडी जी1 ±5 ±4 ±3 ±2 ±2 ±1 ±1 ±1
एसडी एस ±3 ±6 ±5 ±5 ±5 ±7 ±4 ±4
SD G2 + M ±2 ±7 ±4 ±3 ±4 ±4 ±6 ±4

तालिका 3: डब्ल्यूटी और सीडीसी 6-1 कोशिकाओं में कोशिकाओं के औसत अंश और जी1, एस और जी2 + एम चरणों की अवधि 25 डिग्री सेल्सियस और 28 डिग्री सेल्सियस पर विकसित होती है। कोशिकाओं के अंशों को तीन जैविक प्रतिकृतियों (प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लिए दो तकनीकी प्रतिकृतियां) से निर्धारित किया गया था। 28 डिग्री सेल्सियस पर उगाए गए डब्ल्यूटी और सीडीसी 6-1 कोशिकाओं के बीच जी 1, एस और जी 2 + एम अवधि में अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण थे (अप्रकाशित दो पूंछ वाले टी-टेस्ट, पी < 0.1)।

पूरक चित्रा एस 1: डब्ल्यूटी और सीडीसी 6-1 कोशिकाओं में प्रारंभिक और बाद के एस चरणों में कोशिकाओं का अंश 28 डिग्री सेल्सियस पर उगाया गया। प्रारंभिक और उत्तरार्ध एस चरणों के लिए क्रमशः S1 और S2 नामक दो समान बहुभुजों को EDU-पॉजिटिव कोशिकाओं के अंश में खींचा गया था ताकि इसे 28 °C पर विकसित WT कोशिकाओं और 28 °C पर विकसित (B) cdc6-1 कोशिकाओं के लिए EdU-PI द्विभिन्नरूपी FACS विश्लेषण पर दो हिस्सों में विभाजित किया जा सके। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा एस 2: ईडीयू-पीआई द्विभिन्नरूपी एफएसीएस द्वारा कल्पना की गई जी1 गिरफ्तारी से रिलीज के बाद ईडीयू पल्स-लेबल कोशिकाओं की सेल चक्र प्रगति। कोशिकाओं के एक एलिकोट को 28 डिग्री सेल्सियस पर α-कारक गिरफ्तारी से रिलीज के बाद हर 5 मिनट में 10 μM EdU के साथ 5 मिनट के लिए पल्स-लेबल किया गया था, जैसा कि संकेत दिया गया है। संक्षिप्तरूप: ईडीयू = 5-एथिनिल -2'-डीऑक्सीयूरिडिन; एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग; पीआई = प्रोपिडियम आयोडाइड। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 3: ईडीयू-पीआई द्विभिन्नरूपी एफएसीएस द्वारा कल्पना की गई जी1 गिरफ्तारी से रिहाई के बाद डीएमएसओ-उपचारित कोशिकाओं की कोशिका चक्र प्रगति। यह पूरक चित्रा 2 के समान है, लेकिन कोशिकाओं को 1 μL DMSO (डाइमिथाइल सल्फोक्साइड) के साथ 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 4: टीके एचईएनटी 1 खमीर कोशिकाओं में बीआरडीयू और ईडीयू विषाक्तता। संकेतित जीनोटाइप की कोशिकाओं को वाईपीडी प्लेटों पर पांच गुना सीरियल कमजोर पड़ने में देखा गया था, जिसमें बीआरडीयू या ईडीयू की बढ़ती सांद्रता थी और 30 डिग्री सेल्सियस पर 40 घंटे के लिए उगाया गया था। संक्षेप: डीएमएसओ = डाइमिथाइल सल्फोक्साइड; बीआरडीयू = ब्रोमोडॉक्स्यूरिडिन; एडु = 5-एथिनिल-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन; टीके = थाइमिडीन काइनेज; एचईएनटी 1 = मानव समतुल्य न्यूक्लियोसाइड ट्रांसपोर्टर। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

खमीर कोशिका चक्र अध्ययन के लिए एक प्रमुख मॉडल जीव है, फिर भी इसके एस चरण का लक्षण वर्णन लंबे समय से बहिर्जात न्यूक्लियोसाइड को शामिल करने में असमर्थता से बाधित है, जैसे कि बीआरडीयू, जिसका उपयोग डीएनए प्रतिकृति के ट्रेसर के रूप में किया जाता है। खमीर को हर्पीज सिम्प्लेक्स थाइमिडीन किनेज (टीके) की उच्च अभिव्यक्ति के साथ लैस करना और मानव न्यूक्लियोसाइड ट्रांसपोर्टर (एचईएनटी) के अलावा इस समस्या को काफी हद तक हल किया है15,16. ईडीयू बीआरडीयू की तुलना में अधिक बहुमुखी है क्योंकि छोटे फ्लोरोसेंट एज़ाइड और क्लिक रसायन विज्ञान के साथ इसका पता लगाना एंटी-बीआरडीयू एंटीबॉडी17 के विपरीत, परमेबिलाइज्ड खमीर कोशिकाओं और एफएसीएस विश्लेषण के लिए उत्तरदायी है। यहां, हमने इस टीके-एचईएनटी 1 स्ट्रेन में ईडीयू लेबलिंग और डिटेक्शन की शर्तों को अनुकूलित किया और दिखाया कि पहले से पता नहीं लगाए गए प्रतिकृति दोषों को एफएसीएस या माइक्रोस्कोपी द्वारा इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है।

उपकरणों का उपयोग करके एक जैविक तंत्र का अध्ययन करना जो एक ही तंत्र के साथ हस्तक्षेप कर सकता है जीव विज्ञान में एक आम मुद्दा है। जैसा कि ईडीयू का एक ज्ञात साइटोटोक्सिक प्रभाव है, हमने ईडीयू सांद्रता की खोज की जो इंजीनियर टीके-एचईएनटी 1 तनाव के पुराने संपर्क में विषाक्त नहीं हैं और 10 μM को एक उपयुक्त खुराक पाया। टीके-एचईएनटी 1 कोशिकाएं 25 μM EdU पर प्रसार करने में विफल रहती हैं, जबकि TK-अकेला या hENT1-अकेला कोशिकाएं आसानी से 100 μM EdU (पूरक चित्रा S4) का सामना करती हैं। यद्यपि खमीर कोशिकाएं बीआरडीयू की तुलना में ईडीयू के प्रति काफी अधिक संवेदनशील हैं, हमने पाया कि ईडीयू एक्सपोजर के बाद दूसरे सेल चक्र के बाद ही प्रसार में कमी आई है, यह सुझाव देते हुए कि सेल प्रसार को प्रभावित करने के लिए इसे दोनों किस्में पर शामिल करने की आवश्यकता है (डेटा नहीं दिखाया गया है)। सुरक्षित पक्ष पर बने रहने के लिए, हमने इस प्रोटोकॉल में 10 μM EdU का उपयोग किया, जिसमें केवल छोटी दालें (माइक्रोस्कोपी के लिए 3 मिनट; FACS के लिए 5 मिनट) थीं, और पाया कि यह इस अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग करके अच्छी पहचान के लिए उपयुक्त था।

डीएनए प्रतिकृति में सूक्ष्म दोष क्रोमोसोम पुनर्व्यवस्था पर एक मजबूत प्रभाव डाल सकते हैं। इसलिए, इन सूक्ष्म दोषों का पता लगाने में सक्षम तकनीकों और प्रोटोकॉल का विकास क्रोमोसोमल विपथन के एटियलजि को उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां, हम दिखाते हैं कि ईडीयू निगमन और पहचान का यह अनुकूलित प्रोटोकॉल सिग्नल तीव्रता (चित्रा 2 और चित्रा 4) में तीन गुना कमी तक माप सकता है, यह दर्शाता है कि 28 डिग्री सेल्सियस पर उगाए गए तापमान-संवेदनशील सीडीसी 6-1 कोशिकाओं में डीएनए संश्लेषण की दर कम हो जाती है, जो अभी तक प्लेट व्यवहार्यता परख (चित्रा 2 ए) पर कोई दोष नहीं दिखाती है। ). इस प्रकार, ईडीयू निगमन और परिमाणीकरण के इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य उत्परिवर्ती को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है जिनके लिए प्रतिकृति दोषों का शुरू में संदेह नहीं है। इसके अतिरिक्त, माइटोटिक डीएनए संश्लेषण (एमआईडीएएस), मियोटिक पुनर्संयोजन-निर्भर डीएनए संश्लेषण, या अन्य लंबे-पथ डीएनए संश्लेषण का पता लगाना उपयोगी हो सकता है।

एक दोष यह है कि ईडीयू का पता केवल निश्चित कोशिकाओं पर किया जा सकता है, पीसीएनए-जीएफपी या डीएनए प्रतिकृति के अन्य फ्लोरोसेंट रीडआउट के साथ लाइव विश्लेषण को शामिल किया जा सकता है, जो इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले लेजर बीम की उच्च फोटोटॉक्सिसिटी से पीड़ित हैं। सिंथेटिक माध्यम में बढ़ती कोशिकाएं सर्वोत्तम पहचान के लिए महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि वाईपीडी अवशेष क्लिक प्रतिक्रिया को काफी शांत करते हैं। दिलचस्प बात यह है कि सिंक्रनाइज़ आबादी पर द्विभिन्नरूपी ईडीयू-पीआई एफएसीएस विश्लेषण का उपयोग करके एस-चरण कोशिकाओं को अलग करने से एकल कोशिकाओं में एस चरण की अवधि का अनुमान 20 मिनट तक हो जाता है (चित्रा 3, पूरक चित्रा एस 2, और पूरक चित्रा एस 3)। हालांकि, यहां तक कि जब α-कारक रिलीज के बाद सिंक्रनाइज़ शास्त्रीय साइटॉक्स ग्रीन एफएसीएस विश्लेषण (चित्रा 3 ए) के रूप में लगभग सही दिखाई देता है, तो यह द्विभिन्नरूपी ईडीयू-पीआई एफएसीएस विश्लेषण से स्पष्ट हो जाता है कि कोशिकाएं अपेक्षाकृत अतुल्यकालिक रूप से एस चरण में प्रवेश करती हैं (चित्रा 3 बी-आई)।

यहां, हम एकल-कोशिका और जनसंख्या दोनों स्तरों पर तुल्यकालिक और अतुल्यकालिक कोशिकाओं पर प्रवाह साइटोमेट्री और माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एस-चरण अवधि निर्धारित करने के लिए तीन तरीकों का वर्णन करते हैं। जनसंख्या स्तर पर अतुल्यकालिक डब्ल्यूटी कोशिकाओं में निर्धारित औसत एस-चरण अवधि क्रमशः 29 मिनट और 31 मिनट पर फ्लो साइटोमेट्री और माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके समान हैं, जबकि हमारे सिंक्रनाइज़ एकल सेल-आधारित दृष्टिकोण से पता चलता है कि अवधि 20 मिनट जितनी कम हो सकती है (चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4, और तालिका 3)। ). इन मूल्यों के बीच विसंगति आश्चर्यजनक है लेकिन आसानी से समझाया जा सकता है। दरअसल, हमारे एकल सेल-आधारित दृष्टिकोण के साथ, एस-चरण की अवधि शुरुआती घटनाओं (यानी, एस चरण में प्रवेश करने और बाहर निकलने वाली पहली कोशिकाओं, चित्रा 3 सी, जी) के आधार पर निर्धारित की गई थी, लेकिन इसका मतलब यह नहीं है कि एस चरण आबादी के भीतर हर कोशिका में 20 मिनट तक रहता है। ये डेटा अप्रत्याशित धारणा का समर्थन करेंगे कि कोशिकाओं के बीच एस-चरण अवधि में विषमता का एक निश्चित स्तर है।

बेहतर प्रोटोकॉल या नई तकनीकें लंबे समय से चली आ रही हठधर्मिता या नए विचारों को उखाड़ फेंक सकती हैं। तीन ऐसे हैं जो ये डेटा चुनौती देते हैं। सबसे पहले, यह माना जाता है कि डीएनए संश्लेषण एस सेरेविसिया में कली उद्भव के साथ सहवर्ती है। चित्रा 4 ए-सी से पता चलता है कि 3 मिनट के लेबलिंग अंतराल के बावजूद, बिना बुड्ड और छोटे-बुडेड कोशिकाओं में ईडीयू धुंधलापन सबसे मजबूत है, यह दर्शाता है कि एस चरण स्पष्ट रूप से नवोदित होने से पहले शुरू होता है, जैसा कि पहलेदिखाया गया था। दूसरा, यह बताया गया है कि खमीर कोशिकाओं में जी2 चरण नहीं होता है, जिसमें माइटोटिक स्पिंडल डीएनए संश्लेषण के रूप में एक ही समय में बनते हैं। एफएसीएस (चित्रा 3, पूरक चित्रा एस 2, और पूरक चित्रा एस 3) या माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4) द्वारा संवेदनशील ईडीयू का पता लगाने के साथ संयुक्त बहुत छोटी दालें सटीक रूप से निर्धारित करने की अनुमति देती हैं कि एकल कोशिकाओं में एस चरण कब शुरू होता है और समाप्त होता है। ऐसा करके, हमने पाया कि थोक डीएनए संश्लेषण α-कारक रिलीज (चित्रा 3, पूरक चित्रा एस 2, और पूरक चित्रा एस 3) के बाद 40 मिनट समाप्त होता है, जबकि लघु माइटोटिक स्पिंडल केवल 20 मिनट बाद16 (डेटा नहीं दिखाया गया है) बनाते हैं। हम निष्कर्ष निकालते हैं कि खमीर कोशिकाओं में जी2 चरण होता है। तीसरा, यह हाल ही में प्रस्तावित किया गया था कि 30% तक खमीर कोशिकाएं एनाफ़ेज़-टेलोफेज़18 में डीएनए संश्लेषण पूरा करती हैं। इस अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने एनाफ़ेज़ / टेलोफेज स्पिंडल (डेटा नहीं दिखाया गया) प्रदर्शित करने वाली कोशिकाओं में ईडीयू निगमन का पता नहीं लगाया, लेकिन हम इस बात से इनकार नहीं कर सकते कि डीएनए संश्लेषण की यह दूसरी लहर पहचान की उपयोग की गई सीमा से नीचे है। मजबूत सिग्नल / शोर अनुपात को देखते हुए, हम बाद के विकल्प को असंभव मानते हैं।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

लेखक वित्तीय सहायता (अनुदान एएनआर-18-सीई12-0018-01) के लिए जे.डी.डी.बी.टी. और एजेंस नेशनल े पोर ला रेचरचे (एएनआर) को पीएचडी फैलोशिप के लिए एजेंस नेशनल डी ला रेचरचे (एएनआर) और एसोसिएशन पोर ला रेचरचे (एएनआर) को स्वीकार करना चाहते हैं। साइटोमेट्री और माइक्रोस्कोपी मोंटपेलियर एमआरआई बायोकैम्पस इमेजिंग सुविधा में किए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-factor  Genescript RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA) Euromedex 04-100--812-E
Copper sulfate Sigma C1297
DAPI Sigma D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) Interchim FP-JV6320 Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide Dyomics  530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Carbosynth NE08701
Ethanol absolute Carlo Erba reagents P013A10D16 or equivalent
L- ascorbic acid Sigma A4544
Propidium iodide Sigma P4864
Proteinase K Euromedex EU0090
Rnase SIGMA R5000
Sytox Green Invitrogen S-7020
Equipment
Cell counter OLS CASY
Flow cytometer Agilent NovoSampler Pro
Shaking incubator Infors 444-4230 or equivalent
Shaking water bath Julabo SW22 or equivalent
Sonicator Sonics Vibra cell
Wide-field microscopy Leica THUNDER Imager or equivalent

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References

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जीव विज्ञान अंक 188
<em>सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया</em> में 5-एथिनिल -2'-डीऑक्सीयूरिडाइन निगमन का उपयोग करके एस-चरण अवधि का निर्धारण
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Barba Tena, J. d. D., Schwob, E.,… More

Barba Tena, J. d. D., Schwob, E., Talarek, N. Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (188), e64490, doi:10.3791/64490 (2022).

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