Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bestämning av S-fas varaktighet med användning av 5-etynyl-2'-deoxiuridin inkorporering i Saccharomyces cerevisiae

Published: October 21, 2022 doi: 10.3791/64490
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, Université de Montpellier, CNRS

Summary

Vi beskriver två komplementära protokoll för att exakt bestämma S-fasvaraktighet i S. cerevisiae med hjälp av EdU, en tymidinanalog, som införlivas in vivo och detekteras med hjälp av Click-kemi genom mikroskopi och flödescytometri. Det möjliggör enkel karakterisering av varaktigheten av DNA-replikation och förbisedda replikationsdefekter hos mutanter.

Abstract

Eukaryot DNA-replikation är en mycket reglerad process som säkerställer att den genetiska ritningen av en cell dupliceras korrekt före kromosomsegregering. Eftersom DNA-syntesdefekter ligger till grund för kromosomomarrangemang har övervakning av DNA-replikation blivit avgörande för att förstå grunden för genominstabilitet. Saccharomyces cerevisiae är en klassisk modell för att studera cellcykelreglering, men viktiga DNA-replikationsparametrar, såsom fraktionen av celler i S-fasen eller S-fasens varaktighet, är fortfarande svåra att bestämma. Detta protokoll använder korta och giftfria pulser av 5-etynyl-2'-deoxiuridin (EdU), en tymidinanalog, i konstruerade TK-hENT1-jästceller, följt av dess detektion av Klickreaktion för att möjliggöra visualisering och kvantifiering av DNA-replikation med hög rumslig och tidsmässig upplösning på både encells- och populationsnivå genom mikroskopi och flödescytometri. Denna metod kan identifiera tidigare förbisedda defekter i S-fasen och cellcykelprogressionen hos jästmutanter, vilket möjliggör karakterisering av nya spelare som är avgörande för att säkerställa genomstabilitet.

Introduction

Genomstabilitet genom mitotisk uppdelning säkerställs genom överföring av en komplett och lika uppsättning kromosomer till de två producerade cellavkommorna. Detta är beroende av den exakta slutförandet av en serie händelser som inträffar under en given tid i varje fas av cellcykeln. I G 1 licensieras replikeringsursprunget vid rekrytering av flera licensfaktorer, inklusive Cdc61. I S-fasen initieras duplicering av hela genomet från flera aktiva replikationsursprung och utförs av replikationsmaskiner som samlas i mikroskopiskt synliga foci som heter replikationsfabriker2. I M-fasen är duplicerade systerkromatider fästa och biorienterade på den mitotiska spindeln för att möjliggöra deras segregering till motsatta poler i den mitotiska cellen3. Regleringen, korrekt slutförande och varaktighet för varje fas är nyckeln till att säkerställa genomstabilitet. Faktum är att för tidigt utträde från någon av dessa faser leder till genominstabilitet. Till exempel kommer en kortare G 1 inducerad genom radering av den spirande jäst-CDK-hämmaren Sic1 eller genom överuttryck av G 1-cykliner att förändra den efterföljande S-fasen 4,5,6. Följaktligen resulterar dessa avregleringar, associerade eller inte med replikationsspänning, i kromosombrott, omarrangemang och felsegregering 4,5,6. Därför kan övervakning av varaktigheten av S-fasen och, mer allmänt, varaktigheten av de andra faserna i cellcykeln vara avgörande för att identifiera de defekter som uppstår i olika mutanter och under olika stressiga förhållanden.

En traditionell metod för att mäta cellcykelfasens varaktighet inkluderar enkel DNA-innehållsflödescytometri (figur 1A) och förlitar sig på en passande algoritm (tillgänglig i de flesta cytometriprogram) som används för att separera befolkningen iG1-, S- ochG2 + M-fasfraktioner från 1C- och 2C-topparna. Fraktionerna multipliceras sedan med populationens fördubblingstid7. Denna metod ger emellertid endast uppskattade värden, kräver en homogen cellstorleksfördelning inom en given fraktion och är inte tillämplig på synkroniserade kulturer. För att studera S-fasvaraktigheten i däggdjursceller har flera tymidinanaloger utvecklats och använts i stor utsträckning, inklusive EdU. Deras upptag från det extracellulära mediet och fosforylering med tymidinkinas (nedan kallat TK) gör dem tillgängliga för DNA-polymeraser för att införliva dem på platser för DNA-syntes (replikation, rekombination, reparation). För att kringgå frånvaron av TK-genen i Saccharomyces cerevisiae-celler har jäststammar konstruerats för att möjliggöra stabilt och konstitutivt uttryck av herpes simplexviruset TK8 och den humana jämviktsnukleosidtransportören (hENT1)9. När den väl har införlivats i DNA detekteras EdU via den selektiva Click-reaktionen, som kemiskt kopplar sin alkyne-enhet till azidmodifierade fluorokromer10.

Detta papper ger två optimerade omfattande protokoll för att pulsmärka asynkrona och synkrona TK-hENT1-konstruerade celler med EdU för att exakt visualisera och mäta DNA-replikationsvaraktighet och dynamik, liksom varaktigheten av de andra faserna i cellcykeln, med hög rumslig och tidsmässig upplösning på både encells- och populationsnivå genom mikroskopi och flödescytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. S. cerevisiae cellodling

OBS: De jäststammar som används förtecknas i tabell 1

OBS: S-fasens varaktighet kan övervakas på olika sätt. Beroende på vilken fråga som ska tas upp kan cellerna odlas asynkront eller synkront efter G1-arrestering .

  1. Från asynkront växande S. cerevisiae-celler
    OBS: Denna metod möjliggör bestämning av procentandelen celler i S-fasen i en asynkront växande cellpopulation. Genom att bestämma fördubblingstiden kan varaktigheten av S-fasen (och de andra faserna) extrapoleras.
    1. Inokulera S. cerevisiae-celler i 10 ml syntetiskt komplett (SC) medium vid låg cellkoncentration (5 × 104 celler/ml) för en odling över natten vid 30 °C med orbitalomrörning vid 130 rpm.
      OBS: Koncentrationen mäts med en cellräknare. För att effektivt beräkna fördubblingstiderna rekommenderas att inokulera kulturen från en nattkultur som fortfarande befinner sig i exponentiell fas (dvs. helst under 2 × 107 celler / ml). Växande celler i rikt medium (YPD) rekommenderas inte, eftersom EdU-detektion inte är effektiv.
    2. Späd cellerna i 20 ml färskt SC-medium följande dag i den slutliga koncentrationen av 5 × 105 celler/ml.
    3. Odla cellerna vid 30 °C i ett skakande vattenbad med horisontell skakning vid 120 rpm.
    4. Mät cellkoncentrationen varje timme tills den når 1 × 107 celler/ml.
      OBS: Detta steg gör det möjligt att göra en grafisk representation av cellkoncentrationen öka över tiden. Formeln som används för att beräkna fördubblingstiderna förklaras i förklaringen till tabell 2.
    5. Fortsätt parallellt till steg 2 för EdU-märkning när cellkoncentrationen är cirka 2 × 10 6-5 × 106 celler / ml.
  2. Från G 1-synkroniserade S. cerevisiae-celler
    OBS: Denna metod gör det möjligt att bestämma när S-fasen börjar och avslutas med hjälp av flödescytometri och/eller mikroskopianalyser.
    1. Inokulera S. cerevisiae-celler i 10 ml SC-medium vid en låg cellkoncentration (5 × 104 celler/ml) för en nattodling vid 30 °C med orbitalomrörning vid 130 rpm.
      OBS: Se anmärkningarna efter steg 1.1.1.
    2. Späd cellerna i 20 ml färskt SC-medium följande dag i en slutlig koncentration av 2 × 10 6-3 × 106 celler/ml.
    3. Tillsätt 40 μl 1 mg/ml α-faktor utspädd i vatten.
    4. Odla cellerna vid 30 °C med orbital agitation vid 130 rpm i 1 h.
    5. Tillsätt igen 40 μl 1 mg/ml α-faktor utspädd i vatten.
    6. Odla cellerna vid 30 °C med orbital agitation vid 130 rpm i 1 h.
    7. Visualisera cellerna under ett ljusmikroskop för att övervaka G1-arrestering . Fortsätt om mer än 90% av cellerna visar en shmoo och de andra är rundade, oböjda celler.
      OBS: Beroende på vilken bakgrund som används rekommenderas det att sonikera cellerna före shmoo-visualisering. För W303-bakgrunden, sonicate 2x, för 2 s varje gång, vid en amplitud på 40-50.
    8. Centrifugera i 3 min vid 1 500 × g. Kassera supernatanten med en vakuumpipett.
    9. Återsuspendera cellerna i 20 ml SC-medium.
    10. Upprepa steg 1.2.8-1.2.9 en gång.
      OBS: α-faktorn tvättas bort med dessa steg, och cellerna frigörs i cellcykeln. Alternativt kan α-faktorn tvättas bort genom filtrering av jästcellerna med ett 1,2 μm nitrocellulosafilter med hjälp av en tratt på en sidoarmkolv ansluten till en vakuumpump.
    11. Samla 1 ml celler 2x var 5: e minut och fortsätt till steg 2 för EdU-märkning.
      OBS: Pulsmärk cellerna från endast ett av de två rören med EdU. De icke-pulsmärkta cellerna används för att skilja EdU-positiva från EdU-negativa celler på en bivariat propidiumjodid (PI) -EdU-graf.
    12. Tillsätt 400 μl 1 mg/ml α-faktor utspädd i vatten 30 min efter frisättningen.
      OBS: Denna höga dos av α-faktor krävs för att arrestera cellerna i G1-fasen i nästa cellcykel och för att förhindra att cellerna åter går in i den efterföljande S-fasen.

2. EdU-märkning

  1. Överför 1 ml cellodling till ett 2,0 ml mikrofugerör innehållande 1 μL 10 mM EdU. Blanda väl genom inversion.
    OBS: För att skilja de EdU-positiva cellerna från de EdU-negativa cellerna på en PI-EdU bivariat FACS, överför ytterligare 1 ml cellodling till ett 2,0 ml mikrofugerör innehållande 1 μL DMSO.
  2. Inkubera i 3-5 min vid 30 °C under omrörning i ett skakande vattenbad.
    OBS: Tre minuter räcker för EdU-detektion med ett mikroskop; 5 min krävs för optimal EdU-detektion på en flödescytometer.
  3. Stoppa reaktionen med tillsats av 100 μL 100% etanol.
    1. Stoppa reaktionen med tillsats av 100 μL 20% paraformaldehyd om cellstorleksmätning krävs.
      OBS: Om de mitotiska cellernas kärnarkitektur ska hållas intakt för ytterligare analyser efter Click-reaktionen, rekommenderar vi att du fixerar celler med 2% paraformaldehyd vid rumstemperatur (RT) snarare än att lägga cellerna på is, eftersom den senare orsakar mikrotubulidepolymerisation.
    2. Låt cellerna stå i 20 minuter vid RT under mild omrörning på en vippa med variabel hastighet vid 20 lutningar/min för att fixera cellerna innan 100 μl 100 % etanol tillsätts.

3. Cellfixering och permeabilisering

  1. Pellera cellerna i 2 minuter vid 10 000 × g i en mikrofuge. Ta bort supernatanten med en vakuumpipett.
  2. Återsuspendera cellpelleten i 500 μl 70% etanol. Blanda väl genom att virvla.
  3. Låt stå i ≥1 h vid RT vid 20 lutningar/min på en vippa med variabel hastighet för att permeabilisera cellerna.
    OBS: Celler som odlas i SC-medium pelleterar inte bra eftersom de tenderar att hålla fast vid mikrofugeväggarna. Tillsatsen av etanol förbättrar pelleteringen och minskar cellförlusten. Cellerna kan förvaras vid 4 °C över natten eller under längre perioder vid −20 °C.
  4. Pellera cellerna i 2 minuter vid 10 000 × g i en mikrocentrifug. Kassera supernatanten med en vakuumpipett.
  5. Tvätta cellerna 2x med 500 μL 10% etanol i PBS.
    OBS: Tvättarna är avgörande för att ta bort oinkorporerad EdU från cellerna.

4. Klicka-det-reaktion

  1. För cytometrianalys
    1. Pellera cellerna i 2 minuter vid 10 000 × g i en mikrofuge. Kassera supernatanten med en vakuumpipett.
    2. Återsuspendera pelleten i 200 μl PBS innehållande 0,1 mg/ml RNas A och 0,2 mg/ml proteinas K.
    3. Inkubera i 1–2 timmar vid 50 °C vid tillfällig skakning (eller över natten vid 37 °C).
    4. Pellera cellerna i 2 minuter vid 10 000 × g i en mikrocentrifug. Kassera supernatanten med en vakuumpipett.
    5. Tvätta cellerna med 500 μL PBS.
    6. Pellera cellerna i 2 minuter vid 10 000 × g i en mikrofuge. Kassera supernatanten med en vakuumpipett.
    7. Återsuspendera cellpelleten i 200 μl PBS + 1% bovint serumalbumin (BSA). Inkubera i 30 minuter vid RT.
      OBS: Längre tider är inte nödvändiga och är till och med skadliga för effektiviteten hos klickreaktioner.
    8. Pellera cellerna i 2 minuter vid 10 000 × g i en mikrocentrifug. Kassera supernatanten med en vakuumpipett.
    9. Återsuspendera pelleten i 300 μL PBS + 1% BSA.
    10. Fördela cellerna mellan två rör: 200 μL i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör för Click-reaktionen och 100 μL i ett annat 1,5 ml mikrocentrifugrör för Sytox Green-färgning.
    11. Pellera cellerna i 2 minuter vid 10 000 × g i en mikrocentrifug. Kassera supernatanten med en vakuumpipett.
    12. För Sytox grön färgning
      OBS: Vi rekommenderar starkt att du tar en alikvot för Sytox Green-färgning (utan klick) för att få högkvalitativa referensprofiler för DNA-innehåll. Faktum är att Click-reaktionen starkt släcker interkalant fluorescens, inklusive Sytox Green och PI-fluorescens. Följaktligen kan klickreaktionen snedvrida läsningen av DNA-innehåll.
      1. Återsuspendera cellpelleten i 100 μl PBS.
      2. Överför 10-30 μL (beroende på cellkoncentrationen) till ett flödescytometerrör innehållande 300 μL 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 och 0,5 μM Sytox Green.
      3. Sonicate 2x, för 2 s varje gång, vid en amplitud av 40-50.
      4. Lämna i mörkret tills du bearbetar proverna på en flödescytometer.
        OBS: Cellerna kan förvaras i detta skede vid 4 °C i några dagar.
    13. För klickreaktionen
      1. Bered färsk azidfärgbuffert genom att blanda reagenserna i följande ordning (kvantitet för ett rör): 36 μl PBS, 2 μl 0,2 m CuSO4, 0,2 μl 2 mM cy5-azid och 2 μl 1 m askorbinsyra.
        OBS: Det är möjligt att förbereda en masterblandning av Azide Dye-bufferten. Reagenserna måste blandas i samma ordning som det som nämns ovan.
      2. Återsuspendera cellpelleten med 40 μL nygjord azidfärgblandning. Inkubera vid RT i mörkret i 60 min.
      3. Pellera cellerna i 2 minuter vid 10 000 × g i en mikrocentrifug. Kassera supernatanten med en vakuumpipett.
      4. Tvätta cellerna 3x med 300 μL 10% etanol i PBS.
        OBS: Tvättarna är avgörande för att eliminera all löslig EdU-Cy5-azid.
      5. Återsuspendera cellerna i 100 μl av 50 μg / ml PI i PBS. Låt stå i 10 min i mörkret.
      6. Överför 10-30 μL av cellsuspensionen (beroende på cellkoncentrationen) till ett flödescytometerrör innehållande 300 μL 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.
      7. Sonicate 2x, för 2 s varje gång, vid en amplitud av 40-50.
      8. Lämna i mörkret tills du bearbetar proverna på en cytometer.
        OBS: Cellerna kan förvaras i detta skede vid 4 °C i några dagar.
    14. Läs Sytox Green-proverna med en excitationsblå laser vid 488 nm och ett 530/30 BP-filter. Se figur 1A för typiska resultat. Läs de bivariata PI-EdU-proverna på en punktplott med en excitationsblå laser vid 488 nm och ett 615/20 BP-filter för PI (x-axeln) och en excitationsröd laser vid 640 nm och ett 660/20 BP-filter (y-axel). Se figur 1B för typiska resultat.
      OBS: Figur 1C representerar det typiska PI-EdU-bivariata FACS-resultatet för EdU-negativa celler. Det möjliggör diskriminering av de EdU-negativa cellerna från de EdU-positiva cellerna.
  2. För mikroskopianalys
    1. Pellera cellerna i 2 minuter vid 10 000 × g i en mikrocentrifug. Kassera supernatanten med en vakuumpipett.
    2. Återsuspendera pelleten i 200 μL PBS + 1% BSA. Inkubera i 30 minuter vid RT.
    3. Pelletera cellerna i 2 minuter vid 10 000 × g i en mikrofuge. Kassera supernatanten med en vakuumpipett.
    4. Bered färsk azidfärgbuffert genom att blanda reagenserna i följande ordning (kvantitet för ett rör): 36 μL PBS, 2 μL 0,2 M CuSO4, 0,2 μL 2 mM Dy-530 azid, 2 μL 1 M askorbinsyra.
      OBS: En huvudblandning av Azide Dye-bufferten kan framställas färsk genom att blanda reagenserna i ovannämnda ordning.
    5. Återsuspendera pelleten med 40 μl nytillverkad azidfärgbuffert. Inkubera vid RT i mörkret i 60 min.
    6. Pellera cellerna i 2 minuter vid 10 000 × g i en mikrofuge. Kassera supernatanten med en vakuumpipett.
    7. Tvätta cellerna 2x med 300 μL 10% etanol i PBS.
      OBS: Tvättarna är avgörande för att eliminera all löslig Dy-530 azid.
    8. Pellera cellerna i 2 minuter vid 10 000 × g i en mikrocentrifug. Kassera supernatanten med en vakuumpipett.
    9. Återsuspendera cellerna i 100 μl 0,5 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i PBS. Låt stå i 30 min i mörkret vid rumstemperatur.
    10. Pelletera cellerna i 2 minuter vid 10 000 × g i en mikrocentrifug. Kassera supernatanten med en vakuumpipett.
    11. Tvätta med 300 μL PBS för att ta bort överskott av DAPI.
    12. Pelletera cellerna i 2 minuter vid 10 000 × g i en mikrofuge. Kassera supernatanten med en vakuumpipett.
    13. Återsuspendera pelleten med 10-50 μL PBS beroende på cellkoncentrationen.
    14. Sonicate 2x, för 2 s varje gång, vid en amplitud av 40-50.
      OBS: Cellerna kan förvaras i detta skede vid 4 °C i några dagar.
    15. Pipettera 1,7 μL av cellerna på ett glasmikroskopglas och täck med en ren täckglas.
    16. Observera omedelbart under ett fluorescensmikroskop med DAPI- och TexasRed- eller Cy3-filter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att bestämma S-fasvaraktigheten och, mer allmänt, varaktigheten av G 1 och G2 + M (protokollsteg 1.1) odlades S. cerevisiae W303 vildtypsceller (WT, tabell 1) asynkront i SC-medium i 7 timmar. Varje timme övervakades cellkoncentrationen för att bestämma fördubblingstiden (figur 2B). Under dessa tillväxtförhållanden var den beräknade fördubblingstiden 120 min ± 13 min vid 25 °C (tabell 2). När cellerna befann sig i exponentiell fas (2 × 10 6-5 × 106 celler/ml) pulsmärktes en alikvot av celler med EdU (10 μM) i 5 minuter för att peka ut cellerna i S-fasen och bestämma andelen celler som befann sig i faserna G1, S och G2 + M. Tre populationer av celler observerades i en bivariat EdU-PI-cytometeranalys (figur 1B). Diskrimineringen mellan de EdU-negativa och EdU-positiva populationerna gjordes med hjälp av ett kontrollexperiment där cellerna inte pulsmärktes med EdU utan Click-reaktionen utfördes (figur 1C). De två EdU-negativa populationerna i de nedre vänstra och de nedre högra områdena som skilde sig åt i PI-intensitet motsvarade två gånger G1 respektive G2 + M (figur 1B,C). Därför motsvarade den övre populationen (med en intensitet >1× 10 4-2 × 104) de EdU-positiva cellerna som befann sig i S-fasen vid pulstiden (figur 1B). Därför var 27% ± 5% av cellpopulationen i G 1-fasen, 29% ± 3% var i S-fasen och 44% ± 2% var i G2 + M. Eftersom fördubblingstiden var 120 min ± 13 min under dessa förhållanden extrapolerade vi att G1-, S- och G 2 + M-faserna varade 32 min ± 4 min, 35 min ± 6 min respektive 53 min ± 7 min vid 25 °C (tabell2 och tabell 3).

Därefter syftade vi till att validera denna metod och visa att den är tillräckligt känslig för att identifiera mutanter med DNA-replikationsdefekter som hittills har förbisetts. Vi resonerade att avstämbara alleler med funktionsförlust av de faktorer som är involverade i DNA-replikation skulle vara idealiska valideringskontroller. Därför använde vi en jäststam som innehöll en temperaturkänslig cdc6-1-mutant (tabell 1)11. Cdc6 är en viktig licensfaktor som uttrycks i sena M och G1 för att montera prereplicationskomplex (preRC) på ORC-bundna kromosomplatser som senare kan användas som replikeringsursprung. Därför, vid en tillåten temperatur, bör dess S-fasvaraktighet vara densamma som för WT, medan vid en restriktiv temperatur bör ingen DNA-replikation ske eftersom inget ursprung är licensierat12. Men vid en semi-tillåtande temperatur, där färre ursprung är licensierade men det finns tillräckligt för att ge cellviabilitet (våra opublicerade data; Barba Tena et al., under förberedelse), förväntade vi oss olika varaktigheter för varje fas. Som förväntat, baserat på dropptester, växte cdc6-1-cellerna på samma sätt som WT-celler vid en tillåten temperatur (dvs. 25 °C, figur 2A), som visar samma fördubblingstid (figur 2B och tabell 2), men var döda vid eller över 34 °C (figur 2A). Av intresse, vid en halvtillåten temperatur (dvs. 28 °C), var cdc6-1 livskraftig (28 °C, figur 2A). Fördubblingstiden var dock längre än för WT (figur 2B och tabell 2), och varaktigheten för varje fas var annorlunda. Faktum är att i cdc6-1 var G 1 något kortare (12 min ±1 min mot 16 min ± 2 min), medan S-fasen förlängdes något (34 min ± 4 min mot 29 min ± 5 min), och G2 + M-fasen var betydligt längre (77 min ± 4 min mot 45 min ± 3 min) jämfört med WT (Figur 2C, D och tabell 3). S-fasen förlängdes överraskande nog inte särskilt mycket, men medelintensiteten för EdU-signalen minskade med 25% (figur 2C,D), vilket överensstämmer med en S-fas initierad från färre ursprung. Dessutom, medan de EdU-positiva WT-cellerna fördelades homogent mellan de tidiga (S1) och sena S (S2) faserna (figur 2C, kompletterande figur S1A, tidiga [S1] och sena S [S2] faser avgränsade med en vertikal streckad linje i den övre porten), 65% av de EdU-positiva cdc6-1-cellerna ackumulerade i den sena S-fasen (figur 2D, kompletterande figur S1B). Det fanns inte ens någon tydlig skillnad mellan S- ochG2 + M-populationerna (figur 2D), vilket tyder på att cellerna kämpade för att slutföra S-fasen innan de gick in i G 2-fasen. Därför är denna metod lämplig och känslig för att identifiera mutanter med defekter i S-fasen (varaktighet och/eller fördelning) och i cellcykelfasens varaktighet.

En kompletterande metod utformades för att bestämma när celler börjar och avslutar sin DNA-replikation och uppskatta S-fasvaraktigheten med hjälp av synkroniserade celler (protokollsteg 1.2). För detta ändamål, med hjälp av α-faktor med synkroniserade celler i G1, släpptes celler i SC-medium och samlades var 5: e minut. Varaktigheten av S-fasen kan vara cirka 25 minuter baserat på den tidpunkt då DNA-innehållet ändrades från 1C till 2C på Sytox Green-flödescytometerprofilen (figur 3A). Denna uppskattning beror dock på när en betydande cellfraktion av befolkningen har införlivat tillräckligt med Sytox Green för att ses i FACS-profilen. De tidiga och sena replikeringshändelserna kan inte identifieras med den här metoden. För att exakt definiera när S-fasen börjar och slutar och hur länge den varar, utpekades S-fasceller från en alikvot av celler vid pulsmärkning med EdU (10 μM) i 5 minuter var 5: e minut efter G 1-frisättningen. Som förväntat, inom de första 10 minuterna efter frisättningen, var alla celler i det nedre vänstra området (dvs. i G1, figur 3B, kompletterande figur S2). Femton minuter efter frisättningen upptäcktes redan en bråkdel av EdU-positiva celler (jämför de två första raderna i kompletterande figur S2 och kompletterande figur S3, EdU-behandlade respektive EdU-fria celler), vilket indikerar att S-fasen hade börjat (figur 3C). Progressionen genom S-fasen sågs genom att cellmolnet först rörde sig uppåt och sedan åt höger i den bivariata PI-EdU-grafen (figur 3D-F). Slutligen, 35 minuter från frisättningen, var en bråkdel av cellerna EdU-negativa men med dubbelt så mycket DNA, vilket indikerar att dessa celler hade slutfört S-fasen och befann sig i G2 + M-fasen (figur 3G). Således varar S-fasen 20 minuter under dessa förhållanden. Observera att trots den höga synkronisering som observerats med överlagringen av DNA-innehåll som upptäcktes med Sytox Green, vilket tyder på att S-fasen var över i hela populationen 40 minuter efter frisättningen, visade de bivariata analyserna att vissa celler avslutade S-fasen 60 min efter frisättningen och att S-fasen var klar för hela populationen 65 min efter frisättningen (figur 3H, I och kompletterande figur S2).

Dessutom kan S-fasen och DNA-syntesen övervakas med mikroskopi. Från varje aktiverat replikationsursprung utförs DNA-syntes av två bundna replisomer, som bildar ett kärnreplikationsfokus som kan följas av mikroskopi genom att avbilda en taggad version av en replikationsfaktor och/eller operatörsuppsättning och deras motsvarande repressor smält till ett fluorescerande protein 2,13. Alternativt kan DNA-syntes detekteras genom mikroskopi med användning av tymidinanaloger14,15. Vi använde EdU för att övervaka de subnukleära DNA-regionerna som genomgår DNA-syntes. För detta ändamål pulsmärkte vi asynkrona WT- och cdc6-1-celler med EdU (10 μM) i 3 minuter vid 28 ° C och avbildade dem efter klickreaktionen. Vi förväntade oss att upptäcka variationer i EdU-signalintensiteterna beroende på DNA-synteshastigheten och på cellprogressionen i cellcykeln under 3 min EdU-pulsen (dvs. celler som spenderar hela 3 minuter i S-fasen kommer att visa en starkare signal än de som går in i eller ut ur S-fasen under pulsen). Följaktligen visade WT S-fasceller en EdU-signal i sin kärna som varierade i intensitet (figur 4A). S-fasens varaktighet kan enkelt extrapoleras från denna analys. Det bestämdes faktiskt från två biologiska replikat (minst 150 celler räknades), att 34% ± 3% och 38% ± 3% av WT- och cdc6-1-cellerna var EdU-positiva. Som under dessa tillväxtförhållanden var fördubblingstiden 90 min respektive 123 min för WT- respektive cdc6-1-cellerna (tabell 2), vi extrapolerade att S-fasen varade i 31 min respektive 47 min. Det förstnämnda resultatet är i linje med det som erhållits från våra FACS-analyser (tabell 3), vilket indikerar att detektion av EdU-positiva celler genom mikroskopi möjliggör bestämning av S-fasens varaktighet. Observera att den senare är högre än S-fasvaraktigheten som extrapolerats från våra FACS-analyser eftersom det inte fanns någon tydlig skillnad mellan S-och G2 + M-populationerna (figur 2D). EdU-foci observerades lätt i WT-cellerna (figur 4B) men var svagare och färre i cdc6-1-cellerna (figur 4C). För att utesluta möjligheten att EdU-signalintensitetsskillnaden mellan WT- och cdc6-1-cellerna berodde på steget i S-fasen, kvantifierades intensiteten från synkroniserade celler. Som förväntat var den genomsnittliga EdU-signalintensiteten tre gånger lägre i cdc6-1-cellerna (figur 4D), i överensstämmelse med DNA-replikation initierad från färre replikationsursprung. EdU-signalen var begränsad till kärnan, samlokaliserad med en stark DAPI-signal och organiserad i globulära mönster, i överensstämmelse med organisationen av DNA-replikation i kärnregioner eller replikationsfabriker. Viktigt är att EdU endast detekterades i oböjda eller småknoppade celler och aldrig närvarande i celler med stora knoppar, vilket indikerar att WT-jästcellerna hade avslutat replikationen när de gick in i mitos. Denna metod är därför känslig för att visualisera DNA-replikation med hög rumslig upplösning, liksom för att detektera och kvantifiera milda DNA-replikationsdefekter.

Figure 1
Figur 1: Representativa FACS-analyser. (A) Representativa Sytox Green FACS-analyser för WT-celler som odlas vid 25 °C. (B,C) Representativa EdU-PI-bivariata FACS-analyser för WT-celler som odlas vid 25 °C och pulsmärks i 5 minuter med EdU (10 μM) eller 1 μL DMSO. Polygonerna var desamma i båda analyserna. C användes för att avgränsa EdU-negativet från de EdU-positiva cellerna (i allmänhet sätts gränsen till en intensitet >1× 10 4-2 × 104). Den övre polygonporten avgränsade de EdU-positiva cellerna (S-fasfraktion). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Fraktion av celler i cellcykelfaserna G 1, S och G2 + M i asynkrona cellpopulationer. (A) WT- och cdc6-1-stammar upptäcktes vid seriella femfaldiga utspädningar på rikt medium och odlades antingen vid 25 °C, 28 °C eller 34 °C. (B) Fördubblingstiden för populationen. Asynkrona WT- och cdc6-1-celler odlades vid 25 °C eller 28 °C, och cellkoncentrationen mättes varje timme i 7 timmar. (C,D) EdU-PI bivariat FACS-analys av WT- och cdc6-1-celler odlade vid 28 °C och pulsmärkta i 5 min med EdU (10 μM). Att multiplicera populationens fördubblingstid med S-fasfraktionen ger S-fasens varaktighet. Medelintensiteterna för de EdU-positiva och EdU-negativa cellerna beräknades som medelvärdet av intensiteten för varje värde i motsvarande polygon. Medelintensiteterna för de WT- och cdc6-1 EdU-negativa cellerna (5 077 respektive 4 454) normaliserades till 1. Medelintensiteterna för de WT- och cdc6-1 EdU-positiva cellerna (52 604 respektive 36 141) dividerades med normaliseringsfaktorn som användes för varje stam. De erhållna värdena var 10,4 respektive 8,1 (dvs. en minskning med 25%, som nämns i texten). Förkortningar: WT = vildtyp; EdU = 5-etynyl-2'-deoxiuridin; FACS = fluorescensaktiverad cellsortering; PI = propidiumjodid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Bestämning av S-fasvaraktigheten på synkroniserade celler. (A) Tidsförloppsanalys av DNA-halten i WT-celler efter α-faktorfrisättning vid 28 °C. Den angivna tiden tar hänsyn till varaktigheten av EdU-pulsen (5 min). (B-I) EdU-PI bivariata FACS-analyser för synkroniserade WT-celler pulsmärkta i 5 minuter med EdU (10 μM) och uppsamlade vid de angivna tiderna efter frisättningen från G1-arrestering. Förkortningar: WT = vildtyp; EdU = 5-etynyl-2'-deoxiuridin; FACS = fluorescensaktiverad cellsortering; PI = propidiumjodid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: EdU-detektion och kvantifiering med mikroskopi. Asynkrona WT- och cdc6-1-stammar odlades i 2 timmar vid 28 °C och pulsmärktes sedan i 3 minuter med EdU (10 μM) och avbildades med bredfältsmikroskopi med hjälp av adekvata excitations-/emissionsfilter. (A) Representativa bilder från bredfältsmikroskopi för WT och (B,C) enskilda celler för WT och cdc6-1 visualiserade av DIC och färgade med DAPI eller för EdU, enligt anvisningarna. Skalstrecken i (A) och (B,C) är 10 μm respektive 2 μm. D) Mätningar av EdU-intensitet på synkrona WT- och cdc6-1-celler som odlas vid 28 °C 30 minuter efter frisättningen från G1-stoppet. Grafen representerar sammanslagningen av tre biologiska replikat (minst 50 celler räknades i varje biologiskt replikat). Medelvärde ± SD visas i diagrammet. Ett oparat tvåsidigt t-test mellan WT- och cdc6-1-celler indikeras med **** (p < 0,0001). Förkortningar: WT = vildtyp; EdU = 5-etynyl-2'-deoxiuridin; DIC = differentiell interferenskontrast; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; A.U. = godtyckliga enheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Namn Genotyp Figurer och tabeller
WT (E3087): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 Fig.1, Fig.2A,B,C, Fig3, Fig.4A,B,D, Supp Fig.1,2,3 Tabeller2,3
cdc6-1 (E5956): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 Fig.2A,B,D, Fig.4 C,D, Supp Fig.1, Tabeller2,3
TK+ (E1000): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x) Supp Fig.4
TK+ hENT+ (E2031): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 Supp Fig.4
hENT+ (E2031): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, AUR1c::ADH-hENT1, RAD52-GFP, URA3::mCherry-TUB1 Supp Fig.4
CDC6-1 TK+ hENT+ (E3968): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 Supp Fig.4
W303-1A (E001): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3-1 Supp Fig.4

Tabell 1: Förteckning över de stammar som använts i denna studie.

WT CDC6-1
25 °C 28 °C 25 °C 28 °C
Fördubblingstid (min) 120 90 118 123
SD ± 13 minuter ± 3 minuter ± 10 minuter ± 6 minuter

Tabell 2: Genomsnittliga fördubblingstider för WT- och cdc6-1-stammar som odlas vid 25 °C och 28 °C. Dubbleringstiderna beräknades utifrån tre biologiska replikat (fyra tekniska replikat för varje biologiskt replikat) med hjälp av följande formel: Δt × ln(2)/ln(Cf/Ci), där Cf och Ci motsvarar de slutliga respektive initiala cellkoncentrationerna och Δt motsvarar skillnaden i minuter mellan tf och ti, när Cf och Ci mättes, respektive.

WT CDC6-1
25 °C 28 °C 25 °C 28 °C
Procent Varaktighet
(min)		 Procent Varaktighet
(min)		 Procent Varaktighet
(min)		 Procent Varaktighet
(min)
G1 27 32 18 16 13 16 10 12
S 29 35 32 29 28 34 28 34
G2+M 44 53 50 45 59 71 62 77
SD G1 ±5 ±4 ±3 ±2 ±2 ±1 ±1 ±1
SD S ±3 ±6 ±5 ±5 ±5 ±7 ±4 ±4
SD G2+M ±2 ±7 ±4 ±3 ±4 ±4 ±6 ±4

Tabell 3: Genomsnittliga fraktioner av celler och varaktighet för G 1-, S- och G2 + M-faserna i WT- och cdc6-1-celler som odlas vid 25 °C och 28 °C. Fraktionerna av celler bestämdes från tre biologiska replikat (två tekniska replikat för varje biologiskt replikat). Skillnaderna i G 1, S och G2 + M varaktighet mellan WT- och cdc6-1-cellerna som odlades vid 28 ° C var statistiskt signifikanta (oparat tvåsidigt t-test, p <0,1).

Kompletterande figur S1: Fraktion av celler i tidiga och sena S-faser i WT- och cdc6-1-celler som odlas vid 28 °C. Två identiska polygoner med namnet S1 och S2 för de tidiga respektive sena S-faserna drogs i fraktionen av EdU-positiva celler för att dela upp den i två halvor på EdU-PI-bivariata FACS-analyser för (A) WT-celler odlade vid 28 ° C och (B) cdc6-1-celler odlade vid 28 ° C. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S2: Cellcykelprogression av EdU-pulsmärkta celler efter frisättning från G1-arrestering visualiserad av EdU-PI bivariat FACS. En alikvot av celler pulsmärktes i 5 minuter med 10 μM EdU var 5: e minut efter frisättning från α-faktorstopp vid 28 ° C och fram till 80 min, som indikerat. Förkortningar: EdU = 5-etynyl-2'-deoxiuridin; FACS = fluorescensaktiverad cellsortering; PI = propidiumjodid. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S3: Cellcykelprogression av DMSO-behandlade celler efter frisättning från G1-arrestering visualiserad av EdU-PI bivariat FACS. Detta är detsamma som kompletterande figur 2, men cellerna inkuberades i 5 minuter med 1 μL DMSO (dimetylsulfoxid). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S4: BrdU- och EdU-toxicitet i TK hENT1-jästceller. Celler av den angivna genotypen upptäcktes i femfaldiga seriella utspädningar på YDD-plattor innehållande ökande koncentrationer av BrdU eller EdU och odlades i 40 timmar vid 30 °C. Förkortningar: DMSO = dimetylsulfoxid; BrdU = bromodeoxyuridin; Edu = 5-etynyl-2'-deoxiuridin; TK = tymidinkinas; hENT1 = human jämviktsnukleosidtransportör. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Jäst är en utmärkt modellorganism för cellcykelstudier, men karakteriseringen av dess S-fas har länge hindrats av dess oförmåga att införliva exogena nukleosider, såsom BrdU, som används som spårämnen för DNA-replikation. Att utrusta jäst med ett högt uttryck av herpes simplextymidinkinas (TK) och tillsats av en human nukleosidtransportör (hENT) har till stor del löst detta problem15,16. EdU är mer mångsidig än BrdU eftersom dess detektion med liten fluorescerande azid och Click-kemi är mottaglig för permeabiliserade jästceller och FACS-analys, till skillnad från anti-BrdU-antikroppar17. Här optimerade vi villkoren för EdU-märkning och detektering i denna TK-hENT1-stam och visade att tidigare oupptäckta replikationsdefekter kan kvantifieras med hjälp av detta protokoll med FACS eller mikroskopi.

Att studera en biologisk mekanism med hjälp av verktyg som kan störa samma mekanism är ett vanligt problem i biologin. Eftersom EdU har en känd cytotoxisk effekt sökte vi efter EdU-koncentrationer som inte är toxiska vid kronisk exponering för den konstruerade TK-hENT1-stammen och fann att 10 μM var en lämplig dos. TK-hENT1-celler misslyckas med att sprida sig vid 25 μM EdU, medan TK-ensamma eller hENT1-ensamma celler lätt tål 100 μM EdU (kompletterande figur S4). Även om jästceller är betydligt känsligare för EdU än BrdU, fann vi att spridningen minskade först efter den andra cellcykeln efter EdU-exponering, vilket tyder på att den måste införlivas på båda trådarna för att påverka cellproliferation (data visas inte). För att förbli på den säkra sidan använde vi 10 μM EdU i hela detta protokoll, med endast korta pulser (3 min för mikroskopi; 5 min för FACS), och fann att detta var lämpligt för bra detektering med detta optimerade protokoll.

Subtila defekter i DNA-replikation kan ha en stark inverkan på kromosomomläggningar4. Därför är utvecklingen av tekniker och protokoll som kan upptäcka dessa subtila defekter nyckeln till att avslöja etiologin för kromosomavvikelser. Här visar vi att detta optimerade protokoll för EdU-inkorporering och detektion kan mäta upp till en trefaldig minskning av signalintensiteten (figur 2 och figur 4), vilket indikerar att DNA-synteshastigheten reduceras i temperaturkänsliga cdc6-1-celler som odlas vid 28 ° C, som ännu inte visar några defekter på plattans viabilitetsanalyser (figur 2A ). Detta protokoll för EdU-inkorporering och kvantifiering kan således användas för att screena andra mutanter för vilka replikationsdefekter inte misstänks initialt. Dessutom kan det vara användbart att detektera mitotisk DNA-syntes (MiDAS), meiotisk rekombinationsberoende DNA-syntes eller annan DNA-syntes i långkanalen.

En nackdel är att EdU-detektion endast kan utföras på fasta celler, vilket utesluter liveanalys som med PCNA-GFP eller andra fluorescerande avläsningar av DNA-replikation, som lider av den höga fototoxiciteten hos laserstrålarna som används för avbildning. Växande celler i ett syntetiskt medium är avgörande för bästa detektion, eftersom YLD-rester verkar släcka klickreaktionen avsevärt. Intressant är att särskiljning av S-fascellerna med hjälp av bivariat EdU-PI FACS-analys på synkroniserade populationer möjliggör uppskattning av varaktigheten av S-fasen till 20 min i enskilda celler (figur 3, kompletterande figur S2 och kompletterande figur S3). Men även när synkronisering efter α-faktorfrisättning verkar så nästan perfekt som i klassisk Sytox Green FACS-analys (figur 3A), blir det tydligt från bivariat EdU-PI FACS-analys att celler går in i S-fasen relativt asynkront (Figur 3B-I).

Här beskriver vi tre metoder för att bestämma S-fasvaraktighet med hjälp av flödescytometri och mikroskopi på synkrona och asynkrona celler på både encells- och populationsnivå. De genomsnittliga S-fasvaraktigheterna som bestäms i asynkrona WT-celler på populationsnivå är likartade med hjälp av flödescytometri och mikroskopi, vid 29 min respektive 31 min, medan vår synkroniserade encellsbaserade metod visar att varaktigheten kan vara så kort som 20 min (figur 2, figur 3, figur 4 och tabell 3 ). Skillnaden mellan dessa värden är överraskande men kan lätt förklaras. Med vårt enda cellbaserade tillvägagångssätt bestämdes S-fasvaraktigheten baserat på de tidigaste händelserna (dvs. de första cellerna som kommer in och ut ur S-fasen, figur 3C, G), men det innebär inte att S-fasen varar 20 minuter i varje cell inom en population. Dessa data skulle stödja den oväntade uppfattningen att det finns en viss nivå av heterogenitet i S-fasvaraktighet mellan celler.

Förbättrade protokoll eller nya tekniker kan omkullkasta långvariga dogmer eller nya idéer. Det finns tre som dessa data utmanar. För det första antas det att DNA-syntes är samtidig med knoppuppkomst i S. cerevisiae. Figur 4A-C visar att EdU-färgning är starkast i oböjda och småknoppade celler, trots 3 minuters märkningsfördröjning, vilket indikerar att S-fasen tydligt börjar före spirande, som visats tidigare16. För det andra rapporteras att jästceller inte har en G2-fas, med mitotiska spindlar som bildas samtidigt som DNA-syntesen. De mycket korta pulserna i kombination med känslig EdU-detektion med FACS (figur 3, kompletterande figur S2 och kompletterande figur S3) eller mikroskopi (figur 4) gör det möjligt att bestämma exakt när S-fasen börjar och slutar i enskilda celler. Genom att göra det fann vi att bulk-DNA-syntesen avslutas 40 minuter efter α-faktorfrisättning (figur 3, kompletterande figur S2 och kompletterande figur S3), medan korta mitotiska spindlar endast bildas 20 minuter senare16 (data visas inte). Vi drar slutsatsen att jästceller har en G2-fas. För det tredje föreslogs det nyligen att upp till 30% av jästcellerna slutför DNA-syntesen i anafas-telofas18. Med hjälp av detta optimerade protokoll detekterade vi inte EdU-införlivande i celler som visar en anafas / telofasspindel (data visas inte), men vi kan inte utesluta att denna andra våg av DNA-syntes ligger under den använda detektionströskeln. Med tanke på det starka signal/brusförhållandet anser vi att det senare alternativet är osannolikt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna vill erkänna Agence Nationale de la Recherche (ANR) och Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) för doktorandstipendierna till J.D.D.B.T. och Agence Nationale pour la Recherche (ANR) för ekonomiskt stöd (bidrag ANR-18-CE12-0018-01). Cytometri och mikroskopi utfördes vid Montpellier MRI BioCampus bildanläggning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-factor  Genescript RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA) Euromedex 04-100--812-E
Copper sulfate Sigma C1297
DAPI Sigma D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) Interchim FP-JV6320 Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide Dyomics  530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Carbosynth NE08701
Ethanol absolute Carlo Erba reagents P013A10D16 or equivalent
L- ascorbic acid Sigma A4544
Propidium iodide Sigma P4864
Proteinase K Euromedex EU0090
Rnase SIGMA R5000
Sytox Green Invitrogen S-7020
Equipment
Cell counter OLS CASY
Flow cytometer Agilent NovoSampler Pro
Shaking incubator Infors 444-4230 or equivalent
Shaking water bath Julabo SW22 or equivalent
Sonicator Sonics Vibra cell
Wide-field microscopy Leica THUNDER Imager or equivalent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).
  2. Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
  3. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  4. Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
  5. Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
  6. Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
  7. Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
  8. McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
  9. Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120 (2003).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  11. Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
  12. Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
  13. Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
  14. Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
  15. Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
  16. Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
  17. Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
  18. Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267 (2020).

Tags

Biologi utgåva 188
Bestämning av S-fas varaktighet med användning av 5-etynyl-2'-deoxiuridin inkorporering i <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barba Tena, J. d. D., Schwob, E.,… More

Barba Tena, J. d. D., Schwob, E., Talarek, N. Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (188), e64490, doi:10.3791/64490 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter