Summary
يصف البروتوكول الحالي طريقة تسمح بتحليل التعبير الجيني أحادي الخلية على مجموعات محاقن Pseudomonas المزروعة داخل نبات apoplast.
Abstract
عدد كبير من الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض تهاجم النباتات باستمرار. يشمل مجمع أنواع Pseudomonas syringae البكتيريا المسببة للأمراض النباتية سالبة الجرام ذات الأهمية الخاصة لعدد كبير من المضيفين. تدخل P. syringae النبات من سطح الورقة وتتكاثر بسرعة داخل apoplast ، وتشكل مستعمرات دقيقة تشغل الفضاء بين الخلايا. يسمح التعبير التأسيسي للبروتينات الفلورية بواسطة البكتيريا بتصور المستعمرات الدقيقة ومراقبة تطور العدوى على المستوى المجهري. كشفت التطورات الحديثة في تحليل الخلية الواحدة عن التعقيد الكبير الذي وصلت إليه مجموعات البكتيريا المتجانسة المولدة للتنسيج. هذا التعقيد ، الذي يشار إليه باسم عدم التجانس الظاهري ، هو نتيجة للاختلافات من خلية إلى أخرى في التعبير الجيني (غير المرتبط بالاختلافات الجينية) بين المجتمع البكتيري. لتحليل التعبير عن المواقع الفردية على مستوى الخلية الواحدة ، تم استخدام عمليات الاندماج النسخية للبروتينات الفلورية على نطاق واسع. في ظل ظروف الإجهاد ، مثل تلك التي تحدث أثناء استعمار نبات apoplast ، تتمايز P. syringae إلى مجموعات فرعية متميزة بناء على التعبير غير المتجانس لجينات الفوعة الرئيسية (أي نظام إفراز Hrp من النوع الثالث). ومع ذلك ، فإن تحليل الخلية الواحدة لأي مجموعة معينة من P. syringae المستعادة من الأنسجة النباتية يمثل تحديا بسبب الحطام الخلوي المنبعث أثناء الاضطراب الميكانيكي الجوهري لعمليات التلقيح والاستخراج البكتيري. ويفصل هذا التقرير طريقة وضعت لرصد التعبير عن جينات P. syringae ذات الأهمية على مستوى الخلية الواحدة أثناء استعمار نبات الأرابيدوبسيس والفاصوليا. يتم وصف تحضير النباتات والمعلقات البكتيرية المستخدمة للتلقيح باستخدام غرفة مفرغة. كما يتم شرح تعافي البكتيريا الداخلية من الأوراق المصابة عن طريق استخراج السوائل apoplastic هنا. تم تحسين كل من طرق التلقيح البكتيري والاستخراج البكتيري تجريبيا لتقليل تلف الخلايا النباتية والبكتيرية ، مما أدى إلى الاستعدادات البكتيرية المثلى للفحص المجهري وتحليل التدفق الخلوي.
Introduction
تظهر البكتيريا المسببة للأمراض اختلافات في الأنماط الظاهرية المتنوعة ، مما يؤدي إلى تكوين مجموعات فرعية داخل مجموعات متطابقة وراثيا. تعرف هذه الظاهرة باسم عدم التجانس الظاهري وقد تم اقتراحها كاستراتيجية تكيف أثناء التفاعلات بين البكتيرياوالمضيف 1. عززت التطورات الحديثة في الدقة البصرية للمجاهر متحدة البؤر ، وقياس التدفق الخلوي ، والموائع الدقيقة ، جنبا إلى جنب مع البروتينات الفلورية ، تحليلات الخلية الواحدة لمجموعات البكتيريا2.
حقنة Pseudomonas سالبة الجرام هي بكتيريا ممرضة نباتية نموذجية نظرا لأهميتها الأكاديمية والاقتصادية3. ترتبط دورة حياة P. syringae بدورة المياه4. تدخل P. syringae إلى الفراغات بين الخلايا بين خلايا الميزوفيل ، وهي أبوبلاست أوراق النبات ، من خلال فتحات طبيعية مثل الثغور أو الجروح5. بمجرد دخول P. syringae إلى apoplast ، يعتمد على نظام إفراز النوع الثالث (T3SS) والمستجيبات المنقولة من النوع الثالث (T3E) لقمع مناعة النبات والتعامل مع الوظائف الخلوية للنبات لصالح العامل الممرض6. يعتمد التعبير عن T3SS و T3E على المنظم الرئيسي HrpL ، وهو عامل سيجما بديل يرتبط بزخارف صندوق hrp في منطقة المروج للجينات المستهدفة7.
من خلال توليد اندماجات نسخية موجودة بالكروموسوم إلى جينات البروتين الفلوري في اتجاه مجرى الجين محل الاهتمام ، يمكن للمرء مراقبة التعبير الجيني بناء على مستويات التألق المنبعثة على مستوى الخليةالواحدة 8. باستخدام هذه الطريقة ، ثبت أن التعبير عن hrpL غير متجانس داخل كل من الثقافات البكتيرية المزروعة في المختبر وداخل المجموعات البكتيرية المستعادة من نبات apoplast 8,9. على الرغم من أن تحليل التعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة يتم إجراؤه عادة في المزارع البكتيرية المزروعة في الوسائط المختبرية ، إلا أنه يمكن أيضا إجراء مثل هذه التحليلات على المجموعات البكتيرية التي تنمو داخل النبات ، وبالتالي توفير معلومات قيمة عن تكوين مجموعات فرعية في السياق الطبيعي. أحد القيود المحتملة لتحليل المجموعات البكتيرية المستخرجة من النبات هو أن طرق التلقيح الكلاسيكية عن طريق تسلل ضغط الحقن إلى الأبوبلاست ، يليها الاستخراج البكتيري عن طريق نقع أنسجة الأوراق ، عادة ما تولد كمية كبيرة من حطام النبات الخلوي الذي يتداخل مع تحليل المصب10. يتكون معظم الحطام الخلوي من شظايا الفلورسنت الذاتي من البلاستيدات الخضراء التي تتداخل مع مضان GFP ، مما يؤدي إلى نتائج مضللة.
يصف البروتوكول الحالي عملية تحليل عدم تجانس التعبير الجيني أحادي الخلية في نظامين مرضيين نموذجيين: النظام الذي تشكله P. syringae pv. سلالة الطماطم DC3000 و Arabidopsis thaliana (Col-0) ، والآخر بواسطة P. syringae الكهروضوئية. سلالة فاسوليكولا 1448A ونباتات الفاصوليا (صنف Phaseolus vulgaris الكندي العجائب). يقترح طريقة التلقيح على أساس التسلل الفراغي باستخدام غرفة فراغ ومضخة ، مما يؤدي إلى طريقة سريعة وخالية من التلف للتسلل إلى الأوراق الكاملة. علاوة على ذلك ، كتحسين للبروتوكولات التقليدية ، يتم استخدام طريقة ألطف لاستخراج البكتيريا من apoplast التي تقلل بشكل كبير من اضطراب الأنسجة ، بناء على استخراج السائل apoplastic عن طريق تطبيق دورات من الضغط الإيجابي والسلبي باستخدام كمية صغيرة من الحجم داخل حقنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد النبات
- قم بإعداد نباتات Arabidopsis Col-0 باتباع الخطوات أدناه.
- املأ أصيصا بقطر 10 سم بمزيج ركيزة نبات الفيرميكوليت 1: 3 (انظر جدول المواد) ، الذي تم سقيه مسبقا ، وقم بتغطية الوعاء بشبكة معدنية مقاس 15 سم × 15 سم بفتحات 1.6 مم × 1.6 مم. اضبط الشبكة المعدنية على التربة الرطبة باستخدام شريط مطاطي (الشكل 1 أ).
- باستخدام مسواك مبلل ، زرع بذور أرابيدوبسيس في ثقوب الشبكة المعدنية. ضع ثلاث إلى أربع بذور في مواضع بعيدة داخل الأصيص (الشكل 1 ب ، ج).
- قم بتغطية الأواني بقبة بلاستيكية للحفاظ على رطوبة نسبية عالية واحتضانها لمدة 72 ساعة عند 4 درجات مئوية للتقسيم الطبقي.
ملاحظة: التقسيم الطبقي (الحضانة في الرطوبة العالية ودرجة الحرارة المنخفضة ، كما هو موضح) يحسن معدل إنبات البذور وتزامنها. - انقل الأواني إلى غرفة نمو النبات في ظروف يوم قصير (8 ساعات فاتحة / 16 ساعة داكنة عند 21 درجة مئوية ، شدة الضوء: 100 ميكرومول · م − 2 · ثانية − 1 ، الرطوبة النسبية: 70٪).
- بعد إنبات البذور (8-10 أيام) ، استخدم الملقط لإزالة معظم الشتلات ، مع الاحتفاظ بشتلة واحدة في كل موضع من مواضع الوعاء (ستة شتلات / وعاء) (الشكل 1 د). قم بإزالة القبة البلاستيكية للكشف عن الأواني.
ملاحظة: ستكون النباتات جاهزة للاستخدام بعد 4-5 أسابيع من الإنبات.
- تحضير نباتات فول فاسولوس فولغاريس (الصنف الكندي العجيب).
- غطي قاع طبق بتري بقطعة مبللة من ورق المنشفة ، وضع بذور الفاصوليا فوقه. ختم طبق بتري بشريط جراحي واحتضانه عند 28 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام (الشكل 2 أ).
- انقل البذور النابتة إلى إناء قطره 10 سم مملوء بمزيج الركيزة الرطب 1: 3 من نبات الفيرميكوليت.
- احتضان في غرفة نمو النبات تحت إعدادات اليوم الطويل (16 ساعة ضوء / 8 ساعات مظلمة عند 23 درجة مئوية ، شدة الضوء: 100 ميكرومول · م − 2 · ثانية − 1 ، الرطوبة النسبية: 70٪).
ملاحظة: ستكون النباتات جاهزة للاستخدام بعد 10 أيام من الإنبات (الشكل 2 ب).
2. تلقيح نباتات أرابيدوبسيس والفاصوليا
ملاحظة: في هذه الدراسة ، سلالات P. syringae pv. الطماطم DC3000 و P. syringae الكهروضوئية. تم استخدام فاسوليكولا 1448A.
- تحضير لقاح P. syringae.
- قم بإخراج سلالة P. syringae ذات الأهمية من مخزون الجلسرين -80 درجة مئوية على صفيحة LB (10 جم / لتر تريبتون ، 5 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 5 جم / لتر مستخلص خميرة ، و 16 جم / لتر أجار بكتريولوجي ، انظر جدول المواد) مكملة بالمضادات الحيوية المناسبة. احتضان في 28 درجة مئوية لمدة 40-48 ساعة.
ملاحظة: يوصى باستخدام المضادات الحيوية إذا كانت السلالة محل الاهتمام تحمل بلازميد أو جين مقاومة جينومية. تركيزات المضادات الحيوية الموصى بها ل P. syringae هي كما يلي: كاناميسين (15 ميكروغرام / مل) ، جنتاميسين (10 ميكروغرام / مل) ، أمبيسلين (300 ميكروغرام / مل) (انظر جدول المواد). - كشط الكتلة الحيوية البكتيرية وإعادة تعليقها في 5 مل من 10 mM MgCl2. قم بقياس OD600 واضبطه على 0.1 بإضافة 10 mM MgCl2.
ملاحظة: OD600 من 0.1 من P. syringae المستنبتة يتوافق مع 5 × 107 CFU · mL − 1. - قم بإجراء التخفيفات التسلسلية إلى 10 mM MgCl2 للوصول إلى تركيز اللقاح النهائي 5 × 105 CFU · mL − 1. تحضير 200 مل من اللقاح لنباتات أرابيدوبسيس و 50 مل لنباتات الفاصوليا.
- قبل التلقيح مباشرة ، أضف الفاعل بالسطح Silwett L-77 (انظر جدول المواد) إلى تركيز نهائي قدره 0.02٪ لتلقيح الفاصوليا و 0.01٪ ل Arabidopsis. لاحظ أن Silwett ضار إلى حد ما بأنسجة Arabidopsis.
- قم بإخراج سلالة P. syringae ذات الأهمية من مخزون الجلسرين -80 درجة مئوية على صفيحة LB (10 جم / لتر تريبتون ، 5 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 5 جم / لتر مستخلص خميرة ، و 16 جم / لتر أجار بكتريولوجي ، انظر جدول المواد) مكملة بالمضادات الحيوية المناسبة. احتضان في 28 درجة مئوية لمدة 40-48 ساعة.
- أداء تسلل فراغ.
- لتسلل Arabidopsis ، ضع اثنين من العصي الخشبية لتشكيل X فوق القدر (الشكل 1E) ، ووضع القدر متجها لأسفل فوق طبق بتري قطره 14 سم يحتوي على لقاح 200 مل (الشكل 1F).
- لتلقيح أوراق الفاصوليا ، أدخل الورقة في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل يحتوي على اللقاح (الشكل 2C).
- أدخل النباتات المغمورة في محلول اللقاح في غرفة مفرغة (الشكل 1G والشكل 2D) وأعط نبضة 500 ملي بار لمدة 30 ثانية للتسلل إلى الأوراق. كرر نبضة الفراغ 2-3 مرات حتى تتسلل الورقة تماما (الشكل 1H والشكل 2E).
- استنزاف محلول اللقاح الزائد بقطعة من الورق وأعد النباتات إلى غرفة النمو المقابلة لها.
3. استخراج البكتيريا من apoplast
- بعد أربعة أيام من التلقيح ، اقطع إما الجزء الجوي من نبات Arabidopsis أو الورقة الملقحة من نبات الفاصوليا وضعها في حقنة سعة 20 مل بدون إبرة (الشكل 2G). بالنسبة لأوراق الفاصوليا ، لف الورقة على نفسها ، مع ترك الوجه المحوري للخارج ، كما هو موضح في الشكل 2F.
- أضف كمية كافية من الماء المقطر لتغطية الأنسجة (عادة 10-15 مل).
- أدخل المكبس ، ومع وضع المحقنة في الوضع الرأسي مع توجيه الطرف لأعلى ، قم بإزالة الهواء الزائد وفقاعات الهواء داخل المحقنة عن طريق النقر برفق على البرميل حتى يقع كل الهواء بالقرب من الحافة. حرك ثم المكبس لإخراج الهواء. بمجرد وجود أقل قدر ممكن من الهواء داخل المحقنة ، قم بتغطية طرف برميل المحقنة بغشاء البارافين.
- اضغط بعناية على المكبس لتوليد ضغط إيجابي حتى يصبح النسيج أغمق (الشكل 1I والشكل 2H). ثم اسحب المكبس لتوليد ضغط سلبي (الشكل 1J والشكل 2I). كرر هذه الخطوة 3-5 مرات.
- قم بإزالة غشاء البارافين والمكبس واجمع السائل الذي يحتوي على البكتيريا المستخرجة من الأبوبلاست ، كما في الشكل 2J.
4. تحليل الخلية الواحدة للبكتيريا المستخرجة من أبوبلاست
- تصور عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر باتباع الخطوات أدناه.
- تحضير محلول أغاروز 1.5 ٪ في الماء المقطر. بمجرد الذوبان ، أضف حجما كافيا لملء الفراغ بين شريحتين مجهريتين جنبا إلى جنب وضع شريحة أخرى فوقها (الشكل 3). اتركها تجف لمدة 15 دقيقة وقم بإزالة الشريحة الموضوعة في الأعلى بعناية. باستخدام شفرة ، قم بقطع وسادة الأغاروز إلى قطع 5 مم × 5 مم قبل الاستخدام مباشرة.
- بالتوازي مع ذلك ، فإن أجهزة الطرد المركزي 1 مل من البكتيريا المستخرجة من أبوبلاست عند 12000 × جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة ، وأعد تعليق الحبيبات إلى 20 ميكرولتر من الماء لتركيز الخلايا. ضع قطرة 2 ميكرولتر من الخلايا المركزة على غطاء 0.17 مم وقم بتغطية القطرة بقطعة 5 مم × 5 مم من وسادة الأغاروز التي تم الحصول عليها مسبقا في الخطوة 1 ، كما هو موضح في الشكل 3.
- تصور التحضير البكتيري تحت المجهر متحد البؤر (انظر جدول المواد). لتحديد البكتيريا الفلورية الخضراء ، استخدم ليزر الإثارة عند 488 نانومتر ومرشح انبعاث يتراوح من 500 نانومتر إلى 550 نانومتر. لتحديد جميع البكتيريا ، استخدم الحقل الساطع وادمج كلا الحقلين.
- معالجة الصور متحدة البؤر باستخدام فيجي (انظر جدول المواد). للقيام بذلك ، استخدم المكون الإضافي MicrobeJ لتحديد محيط الخلية البكتيرية وقياس شدة التألق بداخلها.
ملاحظة: يوصى بالحصول على الصور من البكتيريا المعزولة (غير المجمعة) لهذا التحليل.
- إجراء التحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي.
- خذ حصة من معلقات البكتيريا المستخرجة من apoplast لتحليلها باستخدام مقياس التدفق الخلوي. الحصول على 100000 حدث.
- للتمييز بين البكتيريا وحطام النبات ، قم بتحليل apoplast المستخرج من نبات غير ملقح وقارن الرسم البياني النقطي الذي يوضح حجم خلية التشتت الأمامي (FSC) مقابل حجم خلية التشتت الجانبي (SSC) مع حجم المعلق البكتيري المستخرج من أبوبلاست. لتحديد البكتيريا غير الفلورية ، استخدم apoplasts المستخرجة من النباتات الملقحة بالبكتيريا متساوية المنشأ غير الفلورية وقارن انبعاثاتها الفلورية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يعد التعبير عن نظام الإفراز من النوع الثالث ضروريا لنمو البكتيريا داخل النبات. يتم تحقيق التعبير في الوقت المناسب عن جينات T3SS من خلال التنظيم المعقد ، وفي مركزه عامل سيغما للوظيفة خارج الهيولى (ECF) HrpL ، المنشط الرئيسي للتعبير عن الجينات المرتبطة ب T3SS11. تم إجراء تحليل للتعبير عن hrpL سابقا باستخدام اندماج نسخي موجود بالكروموسوم إلى جين gfp غير المروج للمصب وباتباع أنماط التعبير عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر وقياس التدفق الخلوي9. يتم إنشاء هذه الاندماجات من خلال التكامل بوساطة إعادة التركيب المتماثل للتركيبات المشفرة بالبلازميد المتولدة من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل والاستنساخ التقليدي وتحمل آخر 500 زوج أساسي من ORF للجين محل الاهتمام (بما في ذلك كودون STOP) و 500 زوج قاعدة من التسلسل مباشرة في اتجاه مجرى النهر ، محاطة بموقع ربط الريبوسوم و ORF لجين مراسل التألق الذي سيتم استخدامه (في هذه الحالة ، GFP) ، متبوعا بشريط كاسيت مقاوم للمضادات الحيوية (في هذه الحالة ، يمنح جين NPT2 مقاومة للكاناميسين). وهكذا ، ثبت أن مجموعات P. syringae المستخرجة من apoplast والتي تعبر عن الجينات المرتبطة ب T3SS ، بما في ذلك hrpL ، غير متجانسة في النبات9. في هذه السابقة ، تظهر النتائج التمثيلية للفحص المجهري الفلوري متحد البؤر وتحليل قياس التدفق الخلوي لتعبير hrpL في الخلايا البكتيرية الفردية للسلالات النموذجية Pph 1448A (Pph) و Pto DC3000 (Pto) ، المستخرجة من أوراق الفول أو أرابيدوبسيس ، على التوالي ، بعد استعمار أبوبلاست الأوراق (الشكل 4). في كل سلالة ، يحمل جين P. syringae chromosomal hrpL اندماجا نسخيا في اتجاه مجرى النهر إلى جين gfp عديم المروج يسمح بمراقبة نشاط المروج الأصلي ل hrpL باتباع مستويات تعبير GFP 8,9.
يمكن استخدام البكتيريا المستخرجة من أبوبلاست لإجراء تحليلات مختلفة. هنا ، تم استخراج 300 ميكرولتر من السلالات البكتيرية المذكورة أعلاه من apoplast من نباتات Arabidopsis أو الفاصوليا المصابة واستخدامها للحصول على البيانات باستخدام نظام مقياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد). انبعاث الليزر عند 488 نانومتر وتم استخدام مرشح FITC للكشف عن GFP. يظهر تحليل قياس التدفق الخلوي توزيع التألق في الخلايا البكتيرية الفردية داخل السكان. يمكن ملاحظة التعبير غير المتجانس ل hrpL بوضوح عن طريق قياس التدفق الخلوي في Pto المستخرج من Arabidopsis apoplast وفي Pph المستخرج من حبوب الفاصوليا ، بما في ذلك بكتيريا HrpLOFF (لا تعبر عن GFP) ، وهذه النتائج مدعومة بالفحص المجهري للعينات المقابلة (الشكل 4). تظهر الرسوم البيانية للرسم النقطي (اللوحات اليسرى) توزيع شدة مضان GFP مقابل حجم الخلية في السكان (الشكل 4A) ، بينما تظهر الرسوم البيانية شدة مضان GFP مقابل عدد الخلايا (الشكل 4B). يسمح هذان التمثيلان الرسوميان المختلفان لبيانات القياس الخلوي للباحث بإنشاء فروق دقيقة بصرية دقيقة وتقديم معلومات تكميلية. كعنصر تحكم في التألق الذاتي البكتيري ، تم استخدام السلالة البرية المقابلة غير GFP (اللوحة العلوية في الشكل 4A والرسم البياني الرمادي في الشكل 4B). يسمح هذا بتحديد منطقة الرسم البياني حيث يتم عرض البكتيريا غير GFP داخل السكان. تولد تحليلات قياس التدفق الخلوي أيضا بيانات كمية. على سبيل المثال ، يتم استخراج النسب المئوية لخلايا HrpLON (الفلورسنت) في مجموعات Pto و Pph المستخرجة من أبوبلااست. يوضح الشكل 4C كيف كانت نسب HrpLON أعلى من النسب المئوية المقابلة لخلايا HrpLOFF (غير الفلورية) في هذه المجموعات السكانية ، لا سيما في نموذج Pto. يمكن أيضا استخدام هذه البيانات لحساب متوسط أو متوسط التألق لجميع السكان. في هذه التجربة بالذات ، تم الحصول على متوسط كثافة مضان GFP ، والذي كان أعلى بالنسبة لسكان Pto منه ل Pph ، تمشيا مع النسبة المئوية الأعلى من خلايا ON. تشكل المستويات المتوسطة بيانات على مستوى السكان يمكن مقارنتها بالبيانات التي تم الحصول عليها من خلال تقنيات غير الخلية المفردة مثل RT-qPCR أو RNAseq. أخيرا ، يظهر أيضا معامل التغير القوي (RCV)12 ، المحسوب على أنه الربع الثالث مطروحا منه الربع الأول مقسوما على الوسيط. غالبا ما يستخدم RCV في دراسات قياس التدفق الخلوي لتقدير تشتت البيانات (أي عدم تجانس التعبير داخل السكان)13. في الدراسة الحالية ، كان RCV أعلى قليلا بالنسبة ل Pph منه بالنسبة ل Pto ، على الرغم من أن الاختلاف لم يكن كافيا لتوصيف توزيع التعبير داخل مجموعات هاتين السلالتين على أنه مختلف بشكل كبير. يمكن تأكيد عدم تجانس تعبير hrpL بصريا باستخدام صور الفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 4D). يؤدي استخدام وسادات الآجار لإعداد الفحص المجهري إلى تصور أسهل وصور عالية الجودة للخلايا الفردية لأنها تدفع البكتيريا إلى طبقة واحدة وتمنع حركة البكتيريا. تقلل إجراءات التلقيح والاستخراج البكتيري الموصوفة في هذا البروتوكول من كمية بقايا النبات داخل المستحضر البكتيري ، مما يسمح بتحليل التعبير البكتيري بهذه التقنيات المختلفة (الشكل 4).
الشكل 1: التلقيح البكتيري واستخلاص الأبوبلاست باستخدام نباتات الأرابيدوبسيس. (أ) تحضير القدر مع ربط الشبكة المعدنية بشكل صحيح. ب: بذر البذور باستخدام عود أسنان لتوزيعها كما هو موضح في (ج). د: نباتات أرابيدوبسيس جاهزة للتلقيح. (ه) عصوان خشبيان يسهلان غمر النباتات في المحلول البكتيري دون الوصول إلى الإناء أو التربة (F). (ز) يمكن وضع المجموعة داخل غرفة التفريغ. (ح) تصبح الأوراق المتسللة أغمق بعد إطلاق الفراغ من الحجرة. (ط) توضع الأوراق المنفصلة في محقنة سعة 20 مل وتغطى بالماء. (J) تؤدي دورات الضغط الإيجابي والسلبي إلى استخراج البكتيريا المرتدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التلقيح البكتيري واستخلاص الأبوبلاست باستخدام نباتات الفاصوليا. أ: إنبات بذور الفاصوليا في أطباق بتري مبطنة بورق تواليت مبلل. ب: نبات الفاصوليا جاهز للتلقيح. ج: ورقة الفاصوليا مغمورة في محلول بكتيري موجود في أنبوب حجمه 50 mL. د: تحقن الأوراق داخل حجرة مفرغة حتى يصبح النسيج أغمق (ه). (و) تلف ورقة الفاصوليا وتوضع داخل محقنة سعة 20 مل وتغطى بالماء (G). (H) تؤدي دورات الضغط الإيجابي والسالب (I) إلى استخراج البكتيريا apoplastic التي يمكن استعادتها في أنبوب (J). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تمثيل تخطيطي لإعداد وإعداد وسادة أجار. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تحليل البكتيريا المستخلصة من أبوبلاست التي تم الحصول عليها من نبات الأرابيدوبسيس أو أوراق الفاصوليا بعد 4 أيام من التلقيح باستخدام P. syringae pv. الطماطم (Pto) أو P. syringae pv. phaseolicola (Pph) ، على التوالي. يتم مراقبة التعبير عن hrpL :: gfp على أنه مضان GFP. (أ) يتم تمثيل تحليل قياس التدفق الخلوي كمخطط نقطي (التشتت الأمامي [حجم الخلية] مقابل شدة مضان GFP). تشير البكتيريا غير GFP إلى سلالة من النوع البري إما من Pto أو Pph. يحدد الخط العمودي 99٪ من السكان غير التابعين ل GFP. (ب) يتم تمثيل تحليل قياس التدفق الخلوي في صورة مخططات تكرارية (عدد الخلايا مقابل شدة مضان GFP). يمثل الرسم البياني الرمادي السلالة غير GFP. (ج) تم توليد البيانات الكمية من تحليل قياس التدفق الخلوي. يتم حساب النسبة المئوية لخلايا ON و OFF بناء على التوزيع الموضح في الرسم النقطي. يشير المتوسط إلى متوسط التألق الذي تم الحصول عليه في التجربة. يتم حساب معامل الاختلاف القوي (RCV) على أنه الربع الثالث مطروحا منه الربع الأول مقسوما على الوسيط. (د) صور مجهرية مضان تظهر مستويات غير متجانسة من GFP مرتبطة بالتعبير عن hrpL. تسلط الأسهم البيضاء الضوء على البكتيريا التي تظهر مستويات منخفضة أو لا تظهر مضان GFP. شريط المقياس: 3 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصف الطريقة المعروضة هنا إجراء غير جراحي يسمح بتسلل البكتيريا إلى الأنسجة الورقية النباتية ، مما يسمح بالتلقيح السريع لكميات كبيرة مع تقليل اضطراب الأنسجة. واحدة من خصائص مجمع أنواع P. syringae هي القدرة على البقاء والتكاثر داخل apoplast النبات وعلى سطح النبات كما epiphyte14. وبالتالي ، لا يمكن استبعاد احتمال أن البكتيريا المستخرجة باستخدام البروتوكول الحالي تأتي فقط من نبات apoplast. ومع ذلك ، فقد ثبت سابقا باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر أن نسبة البكتيريا على سطح الورقة طفيفة بشكل ملحوظ مقارنة بالنمو البكتيري داخل ورقةالنبات 5. يمكن التحقق من ذلك عن طريق الفحص المجهري لسطح الورقة قبل الاستخراج. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن سلالات P. syringae المستخدمة كنموذج في البروتوكول الحالي ، Pto DC3000 و Pph 1448A ، تعمل على أنها ضعيفة15 ، تمثل نسبة غير ذات صلة من البكتيريا المستخرجة. ومع ذلك ، إذا كان سيتم تكييف الطريقة مع أنظمة مرضية أخرى ، فقد يتعين إضافة خطوة مسبقة لإزالة التلوث من سطح الورقة إلى البروتوكول الحالي.
تتسبب طرق التلقيح التقليدية ، مثل تسلل الأوراق باستخدام حقنة16 ، في تلف الأنسجة بشكل أكبر يصعب تقديره في موقع التلقيح ، مما يؤدي إلى نخر الأنسجة. علاوة على ذلك ، فإن مقدار الضرر متغير للغاية بين نقاط التلقيح المختلفة. أيضا ، تختلف الأنواع النباتية المختلفة في تحملها لتسلل الأوراق. على سبيل المثال ، من السهل تسلل أوراق Arabidopsis ، في حين أن أوراق الفاصوليا أكثر تمردا. تؤثر ظروف النمو أيضا على مستوى التسامح مع تسلل نوع معين. ومع ذلك ، فإن طرق التلقيح التقليدية الأكثر رقة ، مثل غمس الأوراق أو رش الأوراق ، مما يؤدي إلى دخول بكتيري أكثر طبيعية وخالية من الضرر واستعمار الأنسجة ، تحد بطبيعتها من حجم المجموعات البكتيرية التي تم الحصول عليها ، وغالبا ما تكون أقل من العتبة المطلوبة للتحليل اللاحق للعينات البكتيرية apoplastic5 . تقلل طريقة التلقيح المقترحة بشكل كبير من تنشيط النخر في المناطق الملقحة الناتجة عن ضغط الحقن مع تجنب تحديد حجم العينة البكتيرية وتوفر طريقة سهلة وقابلة للتكرار وسريعة لتلقيح مناطق كبيرة من الأوراق.
بعض التقنيات التي تتطلب تلقيح مناطق الأنسجة الكبيرة يمكن أن تستغرق وقتا طويلا وعمالة ، مما يزيد من فرص إلحاق تلف الأنسجة. من خلال تطبيق هذه الطريقة ، يمكننا تلقيح خمسة أو أكثر من نباتات Arabidopsis ، أو ورقة حبة كاملة ، في خطوة واحدة فقط دون المساس بسلامة الأنسجة. يمكن تكييف هذه التقنية لتلقيح عدد أكبر من النباتات أو لأنواع نباتية أخرى ذات أهمية زراعية أو أكاديمية ، مثل Nicotiana benthamiana أو الطماطم أو فول الصويا. يجب تعديل تركيز الفاعل بالسطح ، المستخدم لتقليل توتر المياه السطحية لتسهيل تسلل المعلق البكتيري ، واختباره مسبقا اعتمادا على الأنواع النباتية ، حيث يمكن أن تؤدي التركيزات الأعلى من الفاعل بالسطح إلى نخر الأنسجة في بعض الحالات. أيضا ، يجب ضبط مقدار الضغط المطبق ومدة عملية التلقيح وفقا للمقاومة التي توفرها ورقة النبات في الأنواع المختلفة لضمان أفضل النتائج.
فيما يتعلق باستخراج apoplast ، فإن الطريقة الحالية تقلل أيضا من اضطراب الأنسجة ، وبالتالي تقليل كمية بقايا النبات الموجودة في العينة المستخرجة. وهذا يسمح بعينات أنظف ، مما يؤدي إلى تحليل أكثر كفاءة من خلال تقنيات مختلفة مثل RNA-seq أو قياس التدفق الخلوي أو الفحص المجهري ، كما هو موضح في المثال. يعد تعافي البكتيريا المسببة للأمراض من بيئتها المرتجلة مع الحد الأدنى من اضطراب الأنسجة والخلايا النباتية أمرا صعبا. P. syringae يستعمر المساحات بين الخلايا من apoplast ، وتشكيل microcolonies. يسمح استخدام مسبب مرض خارج الخلية، مثل P. syringae، بطرق مثل تلك المعروضة هنا؛ لأن اضطراب الأنسجة والخلايا ليس مطلوبا للتعافي البكتيري. تؤدي جولات الضغط الإيجابي والسلبي إلى تعطيل المستعمرات الدقيقة ، وتشتيت البكتيريا والسماح باستخراجها السهل والسريع من خلال الفتحات الطبيعية (الثغور) ، وتجنب أي تغيير في التعبير الجيني قد يصاحب أوقات الحضانة الطويلة ، مثل تلك المطلوبة لطرق أكثر رقة لاستعادة الأوسم. الفحص المجهري للأنسجة النباتية المتبقية يدعم إزالة معظم السكان البكتيريا. تم استخدام بروتوكولات استخراج السوائل apoplastic على نطاق واسع لدراسة تعقيد السائل apoplastic17. تحتوي هذه البروتوكولات على خطوة أخيرة من الطرد المركزي لمزيد من التنظيف للسائل الرشودي المسترد. هنا ، تم استخدام دورات لطيفة من الضغط الإيجابي والسلبي باستخدام مكبس المحقنة بدلا من ذلك ، وبالتالي تقليل تلوث العينة بالحطام الخلوي المضيف مع وجود تأثير ضئيل للغاية على كفاءة الانتعاش البكتيري. تتكون إحدى طرق الاستخراج البكتيري اللطيفة الكلاسيكية من حضانة أقراص الأوراق أو الشتلات باستخدام خافض للتوتر السطحي لمدة 1-2 ساعة18. هذه الطريقة ليست فعالة مثل تلك المعروضة هنا لاستخراج البكتيريا. ومع ذلك ، فإن القيد الرئيسي لتحليل التعبير الجيني هو تأثير وقت الحضانة المطلوب على ملف تعريف التعبير للسكان. تسمح الطريقة المقدمة هنا بالشفاء السريع والتحليل الفوري للسكان الأوساخ ، وبالتالي تقليل خطر تجاوز نتائج التعبير الجيني على المستوى الخلوي.
تمت دراسة عدم التجانس الظاهري في البكتيريا المسببة للأمراض على نطاق واسع باستخدام وسائط مختبرية متجانسة. غالبا ما تكون دراسة المجموعات البكتيرية المزروعة في مكانها الطبيعي محدودة بسبب الحواجز التقنية ، مثل صعوبة استعادة مجموعات البكتيريا دون تلوث زائد بحطام الخلية المضيفة الذي يتداخل مع تحليلات الخلية المفردة في المصب. تسمح هذه الطريقة المشتركة للتلقيح والاستخراج تماما بتوليد مجموعات كبيرة من مسببات الأمراض البكتيرية لتحليل الخلية الواحدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منحة المشروع RTI2018-095069-B-I00 بتمويل من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 / ومن قبل "ERDP طريقة لصنع أوروبا". تم تمويل JSR من قبل خطة Andaluz de Investigación و Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). تم تمويل N.L.P. من خلال منحة المشروع P18-RT-2398 من خطة Andaluz de Investigación و Desarrollo e Innovación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
- Weigel, W. A., Dersch, P. Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy. Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).
- Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Morris, C. E., et al. The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle. The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).
- Rufián, J. S., et al. Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains. Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).
- Macho, A. P. Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity. New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).
- Xiao, Y., Hutcheson, S. W. A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae. Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).
- Rufián, J. S., et al. Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae. Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).
- Rufian, J. S., et al. Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host. Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
- Fouts, D. E., et al. Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).
- Huber, P. J. Robust Statistics. , Wiley. New York, NY. (1981).
- Freed, N. E., et al. A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise. PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).
- Hirano, S. S., Upper, C. D. Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).
- Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization. Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).
- Liu, X., et al. Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).
- O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example. Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).
