Summary
Denne protokol beskriver en metode, der tillader enkeltcelle genekspressionsanalyse på Pseudomonas syringae-populationer dyrket inden for planteapoplasten.
Abstract
En overflod af patogene mikroorganismer angriber konstant planter. Pseudomonas syringae-artskomplekset omfatter gramnegative plantepatogene bakterier af særlig relevans for et stort antal værter. P. syringae kommer ind i planten fra bladoverfladen og multiplicerer hurtigt inden for apoplasten og danner mikrokolonier, der optager det intercellulære rum. Bakteriernes konstitutive ekspression af fluorescerende proteiner muliggør visualisering af mikrokolonierne og overvågning af infektionens udvikling på mikroskopisk niveau. Nylige fremskridt inden for enkeltcelleanalyse har afsløret den store kompleksitet, som klonale isogene bakteriepopulationer når frem til. Denne kompleksitet, kaldet fænotypisk heterogenitet, er konsekvensen af celle-til-celle forskelle i genekspression (ikke knyttet til genetiske forskelle) blandt bakteriesamfundet. For at analysere ekspressionen af individuelle loci på enkeltcelleniveau er transkriptionelle fusioner til fluorescerende proteiner blevet anvendt i vid udstrækning. Under stressforhold, såsom dem, der forekommer under kolonisering af planteapoplasten, differentierer P. syringae sig i forskellige subpopulationer baseret på den heterogene ekspression af nøglevirulensgener (dvs. Hrp type III-sekretionssystemet). Imidlertid er enkeltcelleanalyse af en given P. syringae-population , der er genvundet fra plantevæv, udfordrende på grund af det cellulære affald, der frigives under den mekaniske forstyrrelse, der er iboende i podnings- og bakterieekstraktionsprocesserne. Denne rapport beskriver en metode udviklet til at overvåge ekspressionen af P. syringae-gener af interesse på enkeltcelleniveau under koloniseringen af Arabidopsis og bønneplanter. Fremstillingen af planterne og de bakteriesuspensioner, der anvendes til podning ved hjælp af et vakuumkammer, er beskrevet. Genoprettelsen af endofytiske bakterier fra inficerede blade ved apoplastisk væskeekstraktion forklares også her. Både bakteriepodnings- og bakterieekstraktionsmetoderne er empirisk optimeret for at minimere plante- og bakteriecelleskader, hvilket resulterer i bakterielle præparater, der er optimale til mikroskopi og flowcytometrianalyse.
Introduction
Patogene bakterier udviser forskelle i forskellige fænotyper, hvilket giver anledning til dannelse af subpopulationer inden for genetisk identiske populationer. Dette fænomen er kendt som fænotypisk heterogenitet og er blevet foreslået som en tilpasningsstrategi under bakterie-værtsinteraktioner1. Nylige fremskridt inden for den optiske opløsning af konfokale mikroskoper, flowcytometri og mikrofluidik kombineret med fluorescerende proteiner har fremmet enkeltcelleanalyser af bakteriepopulationer2.
Den gramnegative Pseudomonas syringae er en arketypisk plantepatogen bakterie på grund af både dens akademiske og økonomiske betydning3. Livscyklussen for P. syringae er knyttet til vandcyklussen4. P. syringae kommer ind i de intercellulære rum mellem mesofylcellerne, plantebladets apoplast, gennem naturlige åbninger såsom stomata eller sår5. En gang inden for apoplasten er P. syringae afhængig af type III-sekretionssystemet (T3SS) og de type III-translokerede effektorer (T3E) for at undertrykke planteimmunitet og manipulere plantecellulære funktioner til gavn for patogenet6. Ekspressionen af T3SS og T3E afhænger af masterregulatoren HrpL, en alternativ sigmafaktor, der binder til hrp-box-motiverne i promotorregionen af målgenerne7.
Ved at generere kromosomlokaliserede transkriptionelle fusioner til fluorescerende proteingener nedstrøms for genet af interesse, kan man overvåge genekspression baseret på fluorescensniveauerne udsendt på enkeltcelleniveau8. Ved hjælp af denne metode er det blevet fastslået, at ekspressionen af hrpL er heterogen både inden for bakteriekulturer dyrket i laboratoriet og inden for bakteriepopulationer genvundet fra planten apoplast 8,9. Selvom genekspressionsanalyse på enkeltcelleniveau typisk udføres i bakteriekulturer dyrket i laboratoriemedier, kan sådanne analyser også udføres på bakteriepopulationer, der vokser i planten, hvilket giver værdifuld information om dannelsen af subpopulationer i den naturlige sammenhæng. En potentiel begrænsning for analysen af bakteriepopulationer ekstraheret fra planten er, at klassiske podningsmetoder ved sprøjtetrykinfiltration i apoplasten efterfulgt af bakterieekstraktion ved maceration af bladvævet typisk genererer en stor mængde cellulært planteaffald, der forstyrrer nedstrømsanalyse10. De fleste cellulære affald består af autofluorescerende fragmenter af kloroplaster, der overlapper GFP-fluorescens, hvilket resulterer i vildledende resultater.
Denne protokol beskriver processen med at analysere enkeltcelle genekspressionsheterogenitet i to modelpatosystemer: den dannet af P. syringae pv. tomatstamme DC3000 og Arabidopsis thaliana (Col-0), og den anden af P. syringae pv. phaseolicola stamme 1448A og bønneplanter (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). Der foreslås en podningsmetode baseret på vakuuminfiltration ved hjælp af et vakuumkammer og en pumpe, hvilket resulterer i en hurtig og skadefri metode til at infiltrere hele blade. Som en forbedring af konventionelle protokoller anvendes desuden en blidere metode til at ekstrahere bakteriepopulationen fra apoplasten, der signifikant reducerer vævsforstyrrelse, baseret på ekstraktion af apoplastisk væske ved at anvende cyklusser med positivt og negativt tryk ved hjælp af en lille mængde volumen i en sprøjte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af planter
- Forbered Arabidopsis Col-0 planter ved at følge nedenstående trin.
- Fyld en krukke med en diameter på 10 cm med en 1:3 vermiculit-plantesubstratblanding (se materialetabel), der tidligere er vandet, og dæk potten med et 15 cm x 15 cm metalnet med 1,6 mm x 1,6 mm huller. Juster metalnettet til den våde jord ved hjælp af et gummibånd (figur 1A).
- Med et vådt tandstikker så Arabidopsis-frø i hullerne i metalnet. Placer tre til fire frø i fjerne positioner i potten (figur 1B, C).
- Gryderne dækkes med en plastkuppel for at opretholde høj relativ luftfugtighed, og de inkuberes i 72 timer ved 4 °C til stratificering.
BEMÆRK: Stratificering (inkubation ved høj luftfugtighed og lav temperatur som beskrevet) forbedrer spiringshastigheden og synkroniseringen af frøene. - Overfør potterne til et plantevækstkammer under korte dagsforhold (8 timers lys/16 timer mørkt ved 21 °C, lysintensitet: 100 μmol·m−2·s−1, relativ luftfugtighed: 70%).
- Efter frøspiring (8-10 dage) skal du bruge pincetten til at fjerne de fleste frøplanter og holde en frøplante i hver af pottens positioner (seks frøplanter / gryde) (figur 1D). Fjern plastkuplen for at afdække gryderne.
BEMÆRK: Planterne vil være klar til brug 4-5 uger efter spiring.
- Forbered Phaseolus vulgaris bønne (cultivar Canadian Wonder) planter.
- Dæk bunden af en petriskål med et vådt stykke håndklædepapir, og læg bønnefrøene oven på det. Petriskålen forsegles med kirurgisk tape og inkuberes ved 28 °C i 3-4 dage (figur 2A).
- Overfør de spirede frø til en 10 cm diameter gryde fyldt med våd 1: 3 vermiculit-plante substratblanding.
- Inkuberes i et plantevækstkammer under lange dagindstillinger (16 timer lys/8 timer mørkt ved 23 °C, lysintensitet: 100 μmol·m-2·s-1, relativ luftfugtighed: 70%).
BEMÆRK: Planterne vil være klar til brug 10 dage efter spiring (figur 2B).
2. Inokulering af Arabidopsis og bønneplanter
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev stammerne P. syringae pv. tomat DC3000 og P. syringae pv. phaseolicola 1448A blev anvendt.
- Forbered P. syringae inokulum.
- Stribe P. syringae-stammen af interesse fra en -80 °C glycerolstamme ud på en LB-plade (10 g / L trypton, 5 g / L NaCl, 5 g / L gærekstrakt og 16 g / L bakteriologisk agar, se materialetabel) suppleret med passende antibiotika. Der inkuberes ved 28 °C i 40-48 timer.
BEMÆRK: Brug af antibiotika anbefales, hvis stammen af interesse bærer et plasmid eller et genomisk resistensgen. De anbefalede antibiotikakoncentrationer for P. syringae er som følger: kanamycin (15 μg/ml), gentamycin (10 μg/ml), ampicillin (300 μg/ml) (se materialetabel). - Bakteriebiomassen skrabes ud og resuspenderes i 5 ml 10 mMMgCl2. OD600 måles, og der justeres til 0,1 ved at tilsætte 10 mMMgCl2.
BEMÆRK: En OD600 på 0,1 af en P. syringae-kultur svarer til 5 x 107 CFU·ml−1. - Der udføres serielle fortyndinger i 10 mMMgCl2 for at nå en endelig podekoncentration på 5 x 105 CFU·ml−1. Forbered 200 ml podning til Arabidopsis-planterne og 50 ml til bønneplanterne.
- Lige før podning tilsættes det overfladeaktive stof Silwett L-77 (se materialetabellen) til en endelig koncentration på 0,02% til bønnepodning og 0,01% til arabidopsis. Bemærk, at Silwett er noget skadeligt for Arabidopsis-vævet.
- Stribe P. syringae-stammen af interesse fra en -80 °C glycerolstamme ud på en LB-plade (10 g / L trypton, 5 g / L NaCl, 5 g / L gærekstrakt og 16 g / L bakteriologisk agar, se materialetabel) suppleret med passende antibiotika. Der inkuberes ved 28 °C i 40-48 timer.
- Udfør vakuuminfiltration.
- Til Arabidopsis-infiltration placeres to træpinde, der danner et X, over gryden (figur 1E), og gryden placeres nedad over en petriskål med en diameter på 14 cm, der indeholder 200 ml podemateriale (figur 1F).
- Ved podning af bønneblade indføres bladet i et 50 ml konisk centrifugerør indeholdende podematerialet (figur 2C).
- Indsæt planterne nedsænket i inokulumopløsningen i et vakuumkammer (figur 1G og figur 2D) og giv en puls på 500 mbar i 30 s for at infiltrere bladene. Gentag vakuumpulsen 2-3 gange, indtil bladet er helt infiltreret (figur 1H og figur 2E).
- Tøm overskydende inokulumopløsning med et stykke papir og returner planterne til deres tilsvarende vækstkammer.
3. Ekstraktion af bakterier fra apoplasten
- Fire dage efter podningen skæres enten den luftige del af Arabidopsis-planten eller det podede blad fra bønneplanten og anbringes i en 20 ml sprøjte uden nål (figur 2G). For bønneblade rulles bladet på sig selv og efterlader den abaxiale overflade udad, som vist i figur 2F.
- Tilsæt nok volumen destilleret vand til at dække vævet (normalt 10-15 ml).
- Indsæt stemplet, og med sprøjten lodret med spidsen pegende opad fjernes overskydende luft og luftbobler inde i sprøjten ved forsigtigt at banke på cylinderen, indtil al luften er placeret nær spidsen. Skub derefter stemplet for at tage luften ud. Når der er så lidt luft som muligt inde i sprøjten, skal du dække spidsen af sprøjtecylinderen med paraffinfilm.
- Tryk forsigtigt på stemplet for at generere positivt tryk, indtil vævet bliver mørkere (figur 1I og figur 2H). Træk derefter i stemplet for at generere undertryk (figur 1J og figur 2I). Gentag dette trin 3-5 gange.
- Paraffinfilmen og stemplet fjernes, og væsken indeholdende de apoplastekstraherede bakterier opsamles, som vist i figur 2J.
4. Enkeltcelleanalyse af de apoplastekstraherede bakterier
- Visualiser ved konfokalmikroskopi ved at følge nedenstående trin.
- Forbered en 1,5% agaroseopløsning i destilleret vand. Når den er smeltet, skal du tilføje nok volumen til at udfylde mellemrummet mellem to mikroskopi-dias side om side og placere et andet dias ovenpå det (figur 3). Lad dem tørre i 15 minutter, og fjern forsigtigt glideren, der er placeret øverst. Brug et blad til at skære agarosepuden i stykker på 5 mm x 5 mm lige før brug.
- Parallelt centrifugeres 1 ml af de apoplastekstraherede bakterier ved 12.000 x g i 1 min ved stuetemperatur, supernatanten fjernes forsigtigt med en pipette, og pelleten resuspenderes i 20 μL vand for at koncentrere cellerne. En dråbe på 2 μL af de koncentrerede celler anbringes på et 0,17 mm dæksel, og dråben dækkes med et 5 mm x 5 mm stykke agarosepude, der tidligere er opnået i trin 1, som vist i figur 3.
- Visualiser bakteriepræparatet under det konfokale mikroskop (se materialetabel). For at identificere grønfluorescerende bakterier skal du bruge excitationslaseren ved 488 nm og et emissionsfilter fra 500 nm til 550 nm. For at identificere alle bakterierne skal du bruge det lyse felt og fusionere begge felter.
- Behandl de konfokale billeder ved hjælp af Fiji (se materialetabel). For at gøre dette skal du bruge MicrobeJ-pluginet til at identificere bakteriecellens kontur og måle fluorescensintensiteten indeni.
BEMÆRK: Billedoptagelse fra isolerede bakterier (ikke grupperet) anbefales til denne analyse.
- Udfør analyse ved flowcytometri.
- Tag en prøve af de apoplastekstraherede bakteriesuspensioner for at analysere ved hjælp af flowcytometeret. Få 100.000 events.
- For at skelne mellem bakterier og planteaffald skal du analysere apoplasten ekstraheret fra en ikke-inokuleret plante og sammenligne prikplottet, der viser dets fremadrettede scatter (FSC) cellestørrelse versus side scatter (SSC) cellestørrelse med den apoplastekstraherede bakterielle suspension. For at identificere ikke-fluorescerende bakterier skal du bruge apoplasterne ekstraheret fra planterne podet med ikke-fluorescerende isogene bakterier og sammenligne deres fluorescerende emissioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ekspressionen af type III-sekretionssystemet er afgørende for bakterievækst i planten. Den rettidige ekspression af T3SS-gener opnås gennem indviklet regulering, hvis centrum er den ekstracytoplasmatiske funktion (ECF) sigmafaktor HrpL, nøgleaktivatoren for ekspressionen af T3SS-relaterede gener11. En analyse af ekspressionen af hrpL blev tidligere udført under anvendelse af en kromosomlokaliseret transkriptionel fusion til et nedstrøms promotorløst gfp-gen og ved at følge ekspressionsmønstrene ved konfokalmikroskopi og flowcytometri9. Disse fusioner genereres gennem homolog rekombinationsmedieret integration af plasmidkodede konstruktioner genereret gennem PCR og traditionel kloning og bærer de sidste 500 basepar af ORF af det pågældende gen (inklusive STOP-kodonet) og 500 basepar af sekvensen umiddelbart nedstrøms, der flankerer ribosombindingsstedet og ORF for fluorescensreportergenet, der skal anvendes (i dette tilfælde GFP), efterfulgt af en antibiotikaresistenskassette (i dette tilfælde NPT2-genet, der giver resistens over for kanamycin). Det blev således fastslået, at apoplastekstraherede P. syringae-populationer, der udtrykker T3SS-relaterede gener, herunder hrpL, er heterogene i planta9. På denne præcedens vises de repræsentative resultater af konfokal fluorescensmikroskopi og flowcytometrianalyse af hrpL-ekspression i individuelle bakterieceller af modelstammerne Pph 1448A (Pph) og Pto DC3000 (Pto), ekstraheret fra bladene af henholdsvis bønne eller Arabidopsis efter kolonisering af bladapoplasten (figur 4). I hver stamme bærer P. syringae-kromosomalt hrpL-genet en nedstrøms transkriptionel fusion til et promotorløst gfp-gen, der muliggør overvågning af hrpL's native promotoraktivitet ved at følge GFP-ekspressionsniveauerne 8,9.
Apoplast-ekstraherede bakterier kan bruges til forskellige analyser. Her blev 300 μL af de ovennævnte reporterbakteriestammer ekstraheret fra apoplasten af inficerede Arabidopsis- eller bønneplanter og anvendt til dataindsamling ved hjælp af et flowcytometersystem (se materialetabel). Laseremission ved 488 nm og FITC-filteret blev brugt til GFP-detektion. Flowcytometrianalyse viser fluorescensfordelingen i individuelle bakterieceller i befolkningen. Heterogen ekspression af hrpL kan tydeligt observeres ved flowcytometri i Arabidopsis apoplast-ekstraheret Pto og i bønneapoplast-ekstraheret Pph, herunder HrpL OFF (ikke udtrykker GFP) bakterier, og disse resultater understøttes af mikroskopisk undersøgelse af de tilsvarende prøver (figur 4). Prikplotgraferne (venstre paneler) viser fordelingen af fluorescensintensitet af GFP versus cellestørrelse i populationen (figur 4A), mens histogrammerne viser fluorescensintensiteten af GFP versus celletal (figur 4B). Disse to forskellige grafiske repræsentationer af cytometridata giver forskeren mulighed for at etablere subtile visuelle nuancer og give supplerende information. Som kontrol for bakteriel autofluorescens blev den tilsvarende ikke-GFP vildtypestamme anvendt (øverste panel i figur 4A og gråt histogram i figur 4B). Dette gør det muligt at identificere grafområdet, hvor ikke-GFP-bakterier i befolkningen vises. Flowcytometrianalyser genererer også kvantitative data. Som et eksempel ekstraheres procentdelene af HrpLON (fluorescerende) celler i apoplastekstraherede Pto- og Pph-populationer. Figur 4C viser, hvordan HrpLON-procenterne var højere end de tilsvarende procentdele af HrpLOFF-celler (ikke-fluorescerende) i disse populationer, især i Pto-modellen. Disse data kan også bruges til at beregne den gennemsnitlige eller mediane fluorescens for hele befolkningen. I dette særlige eksperiment blev den gennemsnitlige GFP-fluorescensintensitet opnået, hvilket var højere for Pto-populationen end for Pph, i overensstemmelse med dens højere procentdel af ON-celler. De gennemsnitlige niveauer udgør data på populationsniveau, der kan sammenlignes med data opnået ved hjælp af ikke-enkeltcelleteknikker såsom RT-q, PCR eller RNAseq. Endelig vises også den robuste variationskoefficient (RCV)12, beregnet som den tredje kvartil minus den første kvartil divideret med medianen. RCV anvendes ofte i flowcytometriundersøgelser til at estimere datadispersion (dvs. heterogenitet af ekspressionen inden for populationen)13. I den aktuelle undersøgelse var RCV lidt højere for Pph end for Pto, selvom forskellen ikke var tilstrækkelig til at karakterisere fordelingen af ekspressionen inden for populationerne af disse to stammer som signifikant forskellige. Heterogeniteten af hrpL-ekspression kan bekræftes visuelt med de konfokale mikroskopibilleder (figur 4D). Brugen af agarpuder til mikroskopiforberedelse resulterer i lettere visualisering og billeder af højere kvalitet af de enkelte celler, da det skubber bakterierne på et enkelt lag og forhindrer bakteriel bevægelse. De podnings- og bakterieekstraktionsprocedurer, der er beskrevet i denne protokol, minimerer mængden af planteaffald i bakteriepræparatet, hvilket muliggør analyse af bakteriel ekspression ved hjælp af disse forskellige teknikker (figur 4).
Figur 1: Bakteriel podning og apoplastekstraktion ved hjælp af Arabidopsis-planter. (A) Klargøring af gryden med metalnet korrekt fastgjort. B) Såning af frø ved hjælp af en tandstikker til at fordele dem som angivet i punkt C. D) Arabidopsis-planter, der er klar til podning. (E) To træpinde letter nedsænkningen af planterne i bakterieopløsningen uden at nå potten eller jorden (F). (G) Ensemblet kan anbringes inde i vakuumkammeret. (H) De infiltrerede blade bliver mørkere efter frigivelse af vakuumet fra kammeret. (I) De løsrevne blade anbringes i en 20 ml sprøjte og dækkes med vand. (J) Cyklusser med positivt og negativt tryk resulterer i ekstraktion af apoplastiske bakterier. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Bakteriel podning og apoplastekstraktion ved hjælp af bønneplanter. (A) Spiring af bønnefrø i petriskåle foret med vådt toiletpapir. B) Bønneplante klar til podning. C) Bønneblad nedsænket i bakterieopløsningen indeholdt i et 50 ml rør. (D) Bladene podes inde i et vakuumkammer, indtil vævet bliver mørkere (E). (F) Bønnebladet rulles, anbringes i en 20 ml sprøjte og dækkes med vand (G). (H) Cyklusser med positivt og negativt tryk (I) resulterer i ekstraktion af de apoplastiske bakterier, der kan genvindes i et rør (J). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Skematisk gengivelse af agarpudens indstilling og klargøring. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Analyse af de apoplastekstraherede bakterier opnået fra Arabidopsis eller bønneblade 4 dage efter podning med henholdsvis P. syringae pv. tomat (Pto) eller P. syringae pv. phaseolicola (Pph). Ekspression af hrpL::gfp overvåges som GFP-fluorescens. (A) Flowcytometrianalyse er repræsenteret som et prikplot (fremadrettet spredning [cellestørrelse] vs. GFP-fluorescensintensitet). Ikke-GFP-bakterier indikerer en vildtypestamme af enten Pto eller Pph. Den lodrette linje afgrænser 99% af populationen uden for GFP. (B) Flowcytometrianalyse er repræsenteret som histogrammer (celletal vs. GFP-fluorescensintensitet). Det grå histogram repræsenterer ikke-GFP-stammen. (C) Der blev genereret kvantitative data fra flowcytometrianalysen. Procentdelen af ON- og OFF-celler beregnes ud fra den fordeling, der vises i punktplottet. Gennemsnittet angiver den gennemsnitlige fluorescens, der er opnået i forsøget. Den robuste variationskoefficient (RCV) beregnes som den tredje kvartil minus den første kvartil divideret med medianen. (D) Fluorescensmikroskopibilleder, der viser heterogene niveauer af GFP forbundet med ekspressionen af hrpL. De hvide pile fremhæver bakterier, der viser lave niveauer eller ingen GFP-fluorescens. Skalabjælke: 3 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden, der præsenteres her, beskriver en ikke-invasiv procedure, der tillader infiltration af bakterier i plantens bladvæv, hvilket muliggør hurtig podning af store mængder, samtidig med at vævsforstyrrelse minimeres. Et af kendetegnene ved P. syringae-artskomplekset er evnen til at overleve og sprede sig inde i planteapoplasten og på planteoverfladen som epifyt14. Således kan muligheden for, at bakterierne ekstraheret ved hjælp af denne protokol kun kommer fra planteapoplasten, ikke udelukkes. Det er dog tidligere påvist ved konfokalmikroskopi, at andelen af bakterier på bladoverfladen er markant mindre sammenlignet med bakterievæksten inde i plantebladet5. Dette kan kontrolleres ved mikroskopisk undersøgelse af bladoverfladen inden ekstraktion. Desuden har P. syringae-stammerne , der anvendes som model i denne protokol, Pto DC3000 og Pph 1448A, vist sig at fungere som svage epiphites15, der repræsenterer en irrelevant andel af de ekstraherede bakterier. Hvis metoden skal tilpasses andre patosystemer, kan det dog være nødvendigt at tilføje et forudgående trin med dekontaminering af bladoverfladen til denne protokol.
Traditionelle podningsmetoder, såsom bladinfiltration ved hjælp af en sprøjte16, forårsager større, svært estimeret vævsskade på podningsstedet, hvilket resulterer i vævsnekrose. Desuden er mængden af skade meget variabel mellem forskellige podningspunkter. Forskellige plantearter varierer også i deres tolerance over for bladinfiltration. For eksempel er Arabidopsis-blade lette at infiltrere, mens bønneblade er mere genstridige. Vækstbetingelser påvirker også toleranceniveauet over for infiltration af en given art. Mere skånsomme traditionelle podningsmetoder, såsom bladdyp eller bladspray, hvilket resulterer i en mere naturlig og skadefri bakteriel indtrængen og kolonisering af vævet, begrænser imidlertid i sagens natur størrelsen af de opnåede bakteriepopulationer, ofte under den tærskel, der kræves til efterfølgende analyse af de apoplastiske bakterieprøver5 . Den foreslåede podningsmetode reducerer signifikant aktiveringen af nekrose i de podede områder som følge af sprøjtetryk, samtidig med at bakterieprøvestørrelsesbegrænsning undgås, og giver en nem, reproducerbar og hurtig måde at inokulere betydelige bladområder på.
Nogle teknikker, der kræver podning af store vævsområder, kan være meget tids- og arbejdskrævende, hvilket øger chancerne for at påføre vævsskade. Ved at anvende denne metode kan vi inokulere fem eller flere Arabidopsis-planter eller et helt bønneblad i kun et trin uden at gå på kompromis med vævsintegriteten. Denne teknik kan tilpasses til podning af et større antal planter eller til andre plantearter af agronomisk eller akademisk interesse, såsom Nicotiana benthamiana, tomat eller sojabønne. Koncentrationen af det overfladeaktive stof, der anvendes til at reducere overfladevandets spænding for at lette infiltrationen af bakteriesuspensionen, skal justeres og testes på forhånd afhængigt af plantearten, da højere koncentrationer af det overfladeaktive stof i nogle tilfælde kan resultere i vævsnekrose. Mængden af påført tryk og varigheden af podningsprocessen skal også justeres til den modstand, som plantebladet tilbyder i forskellige arter for at sikre optimale resultater.
Med hensyn til apoplastekstraktion minimerer den nuværende metode også vævsforstyrrelser, hvilket reducerer mængden af planteaffald, der er til stede i den ekstraherede prøve. Dette giver mulighed for renere prøver, hvilket resulterer i mere effektiv analyse gennem forskellige teknikker såsom RNA-seq, flowcytometri eller mikroskopi, som vist i eksemplet. Genopretning af den patogene bakteriepopulation fra dets apoplastiske miljø med minimal vævs- og plantecelleforstyrrelse er udfordrende. P. syringae koloniserer apoplastens intercellulære rum og danner mikrokolonier. Brug af et ekstracellulært patogen, såsom P. syringae, giver mulighed for metoder som den, der præsenteres her, da vævs- og celleforstyrrelser ikke er nødvendige for bakteriel genopretning. Runder af positivt og negativt tryk forstyrrer mikrokolonierne, spreder bakterierne og tillader deres lette og hurtige ekstraktion gennem naturlige åbninger (stomata), hvilket undgår enhver ændring i genekspression, der kan ledsage lange inkubationstider, såsom dem, der kræves til mere blide metoder til apoplastisk genopretning. Mikroskopisk undersøgelse af det resterende plantevæv understøtter fjernelsen af det meste af bakteriepopulationen. Apoplastiske væskeekstraktionsprotokoller er blevet brugt i vid udstrækning til at studere kompleksiteten af den apoplastiske væske17. Disse protokoller indeholder et sidste trin i centrifugeringen for yderligere at rydde op i den genvundne apoplastiske væske. Her blev der i stedet anvendt blide cyklusser med positivt og negativt tryk ved hjælp af sprøjtestemplet, hvilket reducerede prøvekontaminering med værtscellulært affald, samtidig med at det havde meget lille indflydelse på effektiviteten af bakteriel genvinding. En klassisk blid bakterieekstraktionsmetode består af inkubation af bladskiver eller frøplanter med et overfladeaktivt middel i 1-2 timer18. Denne metode er ikke så effektiv som den, der præsenteres her, til at ekstrahere bakterier; Den væsentligste begrænsning for genekspressionsanalyse er imidlertid virkningen af den krævede inkubationstid på populationens ekspressionsprofil. Den hermed præsenterede metode giver mulighed for hurtig genopretning og øjeblikkelig analyse af den apoplastiske population, hvilket reducerer risikoen for at omgå genekspressionsresultater på celleniveau.
Fænotypisk heterogenitet i patogene bakterier er blevet bredt undersøgt ved anvendelse af homogene laboratoriemedier. Undersøgelse af bakteriepopulationer dyrket i deres naturlige niche er ofte begrænset på grund af tekniske barrierer, såsom vanskeligheden ved at genvinde bakteriepopulationer uden overskydende forurening med værtscelleaffald, der forstyrrer nedstrøms enkeltcelleanalyser. Denne kombinerede metode til podning og ekstraktion tillader i det hele taget dannelsen af store apoplastiske populationer af bakterielle patogener til enkeltcelleanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af projekttilskud RTI2018-095069-B-I00 finansieret af MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ og af "ERDP: A way of making Europe". J.S.R. blev finansieret af Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. blev finansieret af Project Grant P18-RT-2398 fra Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
- Weigel, W. A., Dersch, P. Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy. Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).
- Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Morris, C. E., et al. The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle. The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).
- Rufián, J. S., et al. Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains. Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).
- Macho, A. P. Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity. New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).
- Xiao, Y., Hutcheson, S. W. A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae. Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).
- Rufián, J. S., et al. Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae. Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).
- Rufian, J. S., et al. Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host. Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
- Fouts, D. E., et al. Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).
- Huber, P. J. Robust Statistics. , Wiley. New York, NY. (1981).
- Freed, N. E., et al. A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise. PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).
- Hirano, S. S., Upper, C. D. Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).
- Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization. Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).
- Liu, X., et al. Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).
- O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example. Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).
