Summary
Den nåværende protokollen beskriver en metode som tillater enkeltcellegenuttrykksanalyse på Pseudomonas syringae-populasjoner dyrket i planten apoplast.
Abstract
En mengde patogene mikroorganismer angriper stadig planter. Artskomplekset Pseudomonas syringae omfatter gramnegative plantepatogene bakterier av spesiell relevans for et stort antall verter. P. syringae kommer inn i planten fra bladoverflaten og multipliserer raskt i apoplasten, og danner mikrokolonier som opptar det intercellulære rommet. Det konstitutive uttrykket av fluorescerende proteiner av bakteriene muliggjør visualisering av mikrokoloniene og overvåking av utviklingen av infeksjonen på mikroskopisk nivå. Nylige fremskritt innen enkeltcelleanalyse har avslørt den store kompleksiteten som nås av klonale isogene bakteriepopulasjoner. Denne kompleksiteten, referert til som fenotypisk heterogenitet, er konsekvensen av celle-til-celle-forskjeller i genuttrykk (ikke knyttet til genetiske forskjeller) blant bakteriesamfunnet. For å analysere uttrykket av individuelle loci på enkeltcellenivå, har transkripsjonsfusjoner til fluorescerende proteiner blitt mye brukt. Under stressforhold, som de som oppstår under kolonisering av planteapoplasten, skiller P. syringae seg ut i forskjellige subpopulasjoner basert på det heterogene uttrykket av viktige virulensgener (dvs. Hrp type III sekresjonssystem). Imidlertid er enkeltcelleanalyse av en gitt P. syringae-populasjon gjenvunnet fra plantevev utfordrende på grunn av det cellulære rusket som frigjøres under den mekaniske forstyrrelsen som er iboende for inokulasjons- og bakterieekstraksjonsprosessene. Denne rapporten beskriver en metode utviklet for å overvåke ekspresjonen av P. syringae-gener av interesse på enkeltcellenivå under koloniseringen av Arabidopsis og bønneplanter. Fremstillingen av plantene og bakterielle suspensjoner som brukes til inokulering ved hjelp av et vakuumkammer er beskrevet. Utvinningen av endofytiske bakterier fra infiserte blader ved apoplastisk væskeekstraksjon er også forklart her. Både bakteriell inokulasjon og bakteriell ekstraksjonsmetoder er empirisk optimalisert for å minimere plante- og bakteriell celleskade, noe som resulterer i bakterielle preparater som er optimale for mikroskopi og flowcytometrianalyse.
Introduction
Patogene bakterier viser forskjeller i forskjellige fenotyper, noe som gir opphav til dannelse av underpopulasjoner innenfor genetisk identiske populasjoner. Dette fenomenet er kjent som fenotypisk heterogenitet og har blitt foreslått som en tilpasningsstrategi under bakterie-vert-interaksjoner1. Nylige fremskritt i optisk oppløsning av konfokale mikroskoper, flowcytometri og mikrofluidikk, kombinert med fluorescerende proteiner, har fostret enkeltcelleanalyser av bakteriepopulasjoner2.
Den gramnegative Pseudomonas syringae er en arketypisk plantepatogen bakterie på grunn av både dens faglige og økonomiske betydning3. Livssyklusen til P. syringae er knyttet til vannets kretsløp4. P. syringae kommer inn i de intercellulære mellomrommene mellom mesofyllcellene, plantebladapoplasten, gjennom naturlige åpninger som stomata eller sår5. En gang i apoplasten er P. syringae avhengig av type III-sekresjonssystemet (T3SS) og type III-translokerte effektorer (T3E) for å undertrykke planteimmunitet og manipulere plantecellulære funksjoner til fordel for patogenet6. Uttrykket av T3SS og T3E avhenger av masterregulatoren HrpL, en alternativ sigmafaktor som binder seg til hrp-boksmotivene i promotorregionen til målgenene7.
Ved å generere kromosomlokaliserte transkripsjonsfusjoner til fluorescerende proteingener nedstrøms for genet av interesse, kan man overvåke genuttrykk basert på fluorescensnivåene som sendes ut på enkeltcellenivå8. Ved hjelp av denne metoden har det blitt fastslått at uttrykket av hrpL er heterogent både innenfor bakteriekulturer dyrket i laboratoriet og innenfor bakteriepopulasjoner gjenvunnet fra planten apoplast 8,9. Selv om genekspresjonsanalyse på enkeltcellenivå vanligvis utføres i bakteriekulturer dyrket i laboratoriemedier, kan slike analyser også utføres på bakteriepopulasjoner som vokser i planten, og gir dermed verdifull informasjon om dannelsen av underpopulasjoner i naturlig sammenheng. En potensiell begrensning for analysen av bakteriepopulasjoner ekstrahert fra planten er at klassiske inokulasjonsmetoder ved sprøytetrykkinfiltrasjon i apoplasten, etterfulgt av bakteriell ekstraksjon ved maserasjon av bladvevet, vanligvis genererer en stor mengde cellulært planteavfall som forstyrrer nedstrømsanalyse10. De fleste cellulære rusk består av autofluorescerende fragmenter av kloroplaster som overlapper med GFP-fluorescens, noe som resulterer i misvisende resultater.
Den foreliggende protokollen beskriver prosessen med å analysere encellet genuttrykksheterogenitet i to modellpatosystemer: den som dannes av P. syringae pv. tomatstamme DC3000 og Arabidopsis thaliana (Col-0), og den andre av P. syringae pv. phaseolicola stamme 1448A og bønneplanter (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). En inokulasjonsmetode foreslås basert på vakuuminfiltrasjon ved hjelp av et vakuumkammer og en pumpe, noe som resulterer i en rask og skadefri metode for å infiltrere hele blader. Videre, som en forbedring av konvensjonelle protokoller, brukes en mildere metode for å trekke ut bakteriepopulasjonen fra apoplasten som signifikant reduserer vevsforstyrrelser, basert på ekstraksjon av apoplastisk væske ved å anvende sykluser med positivt og negativt trykk ved hjelp av en liten mengde volum i en sprøyte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plant forberedelse
- Forbered Arabidopsis Col-0 planter ved å følge trinnene nedenfor.
- Fyll en gryte med en 10 cm diameter pott med en 1: 3 vermikulitt-plante substratblanding (se materialfortegnelse), tidligere vannet, og dekk potten med et 15 cm x 15 cm metallnett med 1,6 mm x 1,6 mm hull. Juster metallnettet til den våte jorden ved hjelp av et gummibånd (figur 1A).
- Med en våt tannpirker, så Arabidopsis frø inn i hullene i metallnettet. Plasser tre til fire frø i fjerne posisjoner i potten (figur 1B, C).
- Dekk pottene med en plastkuppel for å opprettholde høy relativ luftfuktighet og inkuber dem i 72 timer ved 4 °C for lagdeling.
MERK: Stratifisering (inkubasjon ved høy luftfuktighet og lav temperatur, som beskrevet) forbedrer spiringshastigheten og synkroniseringen av frøene. - Overfør pottene til et plantevekstkammer under kortdagsforhold (8 timer lys/16 timer mørkt ved 21 °C, lysintensitet: 100 μmol·m−2·s−1, relativ fuktighet: 70 %).
- Etter frøspiring (8-10 dager), bruk pinsetten til å fjerne de fleste plantene, og hold en frøplante i hver av pottens posisjoner (seks frøplanter / potten) (figur 1D). Fjern plastkuppelen for å avdekke pottene.
MERK: Plantene vil være klare til bruk 4-5 uker etter spiring.
- Forbered Phaseolus vulgaris bønne (cultivar Canadian Wonder) planter.
- Dekk bunnen av en petriskål med et vått stykke håndklepapir, og legg bønnefrøene på toppen av det. Forsegl petriskålen med kirurgisk tape og rug ved 28 °C i 3–4 dager (figur 2A).
- Overfør de spirede frøene til en 10 cm diameter gryte fylt med våt 1: 3 vermikulitt-plante substratblanding.
- Inkuber i et plantevekstkammer under langdagsinnstillinger (16 t lys / 8 timer mørkt ved 23 ° C, lysintensitet: 100 μmol · m - 2 · S - 1, relativ fuktighet: 70%).
MERK: Plantene vil være klare til bruk 10 dager etter spiring (figur 2B).
2. Inokulering av Arabidopsis og bønneplanter
MERK: I denne studien, stammer P. syringae pv. tomat DC3000 og P. sprøyte pv. phaseolicola 1448A ble brukt.
- Forbered P. syringae inoculum.
- Strek ut P. syringae-stammen av interesse fra en -80 ° C glyserolbestand på en LB-plate (10 g / L trypton, 5 g / L NaCl, 5 g / L gjærekstrakt og 16 g / L bakteriologisk agar, se materialtabell) supplert med passende antibiotika. Inkuber ved 28 °C i 40–48 timer.
MERK: Bruk av antibiotika anbefales hvis stammen av interesse bærer et plasmid eller et genomisk resistensgen. Anbefalte antibiotikakonsentrasjoner for P. syringae er som følger: kanamycin (15 μg/ml), gentamycin (10 μg/ml), ampicillin (300 μg/ml) (se materialliste). - Skrap ut bakteriebiomassen og resuspender i 5 ml 10 mM MgCl2. Mål OD600 og juster til 0,1 ved å legge til 10 mM MgCl2.
MERK: En OD600 på 0,1 av en P. sprøytedyrkning tilsvarer 5 x 107 CFU·ml−1. - Utfør seriefortynninger i 10 mM MgCl2 for å nå en endelig inokulumkonsentrasjon på 5 x 105 CFU·ml−1. Forbered 200 ml inokulum for Arabidopsis-plantene og 50 ml for bønneplantene.
- Rett før inokulering, tilsett overflateaktivt middel Silwett L-77 (se materialtabell) til en endelig konsentrasjon på 0,02% for bønneinokulasjon og 0,01% for Arabidopsis. Merk at Silwett er noe skadelig for Arabidopsis-vevet.
- Strek ut P. syringae-stammen av interesse fra en -80 ° C glyserolbestand på en LB-plate (10 g / L trypton, 5 g / L NaCl, 5 g / L gjærekstrakt og 16 g / L bakteriologisk agar, se materialtabell) supplert med passende antibiotika. Inkuber ved 28 °C i 40–48 timer.
- Utfør vakuuminfiltrasjon.
- For Arabidopsis-infiltrasjon, plasser to trepinner som danner en X over potten (figur 1E), og plasser potten vendt ned over en 14 cm diameter petriskål som inneholder 200 ml inokulum (figur 1F).
- For bønnebladinokulasjon, introduser bladet i et 50 ml konisk sentrifugerør som inneholder inokulumet (figur 2C).
- Sett plantene nedsenket i inokulumoppløsningen inn i et vakuumkammer (figur 1G og figur 2D) og gi en puls på 500 mbar i 30 s for å infiltrere bladene. Gjenta vakuumpulsen 2-3 ganger til bladet er fullstendig infiltrert (figur 1H og figur 2E).
- Tøm overflødig inokulumoppløsning med et stykke papir og returner plantene til deres tilsvarende vekstkammer.
3. Ekstraksjon av bakterier fra apoplasten
- Fire dager etter inokulering, kutt enten luftdelen av Arabidopsis-planten eller det inokulerte bladet fra bønneplanten og legg den i en 20 ml sprøyte uten nål (figur 2G). For bønneblader, rull bladet på seg selv, og la det abaxiale ansiktet utover, som vist i figur 2F.
- Tilsett nok volum destillert vann til å dekke vevet (vanligvis 10-15 ml).
- Sett inn stempelet, og med sprøyten i vertikal stilling med spissen pekende oppover, fjern overflødig luft og luftbobler inne i sprøyten ved å banke forsiktig på sylinderen til all luften er plassert nær spissen. Skyv deretter stempelet for å ta luften ut. Når det er så lite luft som mulig inne i sprøyten, dekk spissen av sprøytesylinderen med parafinfilm.
- Trykk forsiktig på stempelet for å generere positivt trykk til vevet blir mørkere (figur 1I og figur 2H). Trekk deretter i stempelet for å generere undertrykk (figur 1J og figur 2I). Gjenta dette trinnet 3-5 ganger.
- Fjern parafinfilmen og stempelet og samle opp væsken som inneholder de apoplastekstraherte bakteriene, som i figur 2J.
4. Enkeltcelleanalyse av apoplastekstraherte bakterier
- Visualiser ved konfokalmikroskopi ved å følge trinnene nedenfor.
- Forbered en 1,5% agaroseløsning i destillert vann. Når smeltet, tilsett nok volum til å fylle mellomrommet mellom to mikroskopilysbilder satt ved siden av hverandre og plasser et annet lysbilde på toppen av det (figur 3). La dem tørke i 15 min og fjern lysbildet forsiktig plassert på toppen. Bruk et blad til å kutte agaroseputen i 5 mm x 5 mm biter rett før bruk.
- Parallelt, sentrifuge 1 ml av apoplast-ekstraherte bakterier ved 12.000 x g i 1 min ved romtemperatur, fjern forsiktig supernatanten ved hjelp av en pipette, og resuspender pelleten i 20 μL vann for å konsentrere cellene. Plasser en dråpe på 2 μL av de konsentrerte cellene på en 0,17 mm dekkslipp og dekk dråpen med et 5 mm x 5 mm stykke agarosepute som tidligere er oppnådd i trinn 1, som vist i figur 3.
- Visualiser bakteriepreparatet under konfokalmikroskopet (se materialtabell). For å identifisere grønnfluorescerende bakterier, bruk eksitasjonslaseren ved 488 nm og et utslippsfilter fra 500 nm til 550 nm. For å identifisere alle bakteriene, bruk det lyse feltet og slå sammen begge feltene.
- Behandle de konfokale bildene ved hjelp av Fiji (se Materialfortegnelse). For å gjøre dette, bruk MicrobeJ-plugin for å identifisere konturen til bakteriecellen og måle fluorescensintensiteten innenfor.
MERK: Bildeopptak fra isolerte bakterier (ikke gruppert) anbefales for denne analysen.
- Utfør analyse ved flowcytometri.
- Ta en aliquot av apoplast-ekstraherte bakteriesuspensjoner for å analysere ved hjelp av flow-cytometeret. Skaff deg 100 000 arrangementer.
- For å diskriminere mellom bakterier og planteavfall, analyser apoplasten ekstrahert fra en ikke-inokulert plante og sammenlign punktplottet som viser dens fremoverspredning (FSC) cellestørrelse versus sidespredning (SSC) cellestørrelse med den apoplastekstraherte bakterielle suspensjonen. For å identifisere ikke-fluorescerende bakterier, bruk apoplastene ekstrahert fra plantene inokulert med ikke-fluorescerende isogene bakterier og sammenlign deres fluorescerende utslipp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ekspresjonen av type III-sekresjonssystemet er avgjørende for bakterievekst i planten. Det rettidige uttrykket av T3SS-gener oppnås gjennom intrikat regulering, i sentrum av hvilken er den ekstracytoplasmatiske funksjonen (ECF) sigmafaktor HrpL, nøkkelaktivatoren for ekspresjonen av T3SS-relaterte gener11. En analyse av ekspresjonen av hrpL ble tidligere utført ved hjelp av en kromosomlokalisert transkripsjonsfusjon til et nedstrøms promotorløst gfp-gen og ved å følge ekspresjonsmønstrene ved konfokalmikroskopi og flowcytometri9. Disse fusjonene genereres gjennom homolog rekombinasjonsmediert integrasjon av plasmidkodede konstruksjoner generert gjennom PCR og tradisjonell kloning og bærer de siste 500 baseparene av ORF av genet av interesse (inkludert STOP-kodonet) og 500 basepar av sekvensen umiddelbart nedstrøms, flankerer ribosombindingsstedet og ORF av fluorescensreportergenet som skal brukes (i dette tilfellet, GFP), etterfulgt av en antibiotikaresistenskassett (i dette tilfellet NPT2-genet som gir resistens mot kanamycin). Dermed ble det fastslått at apoplastekstraherte P. syringae-populasjoner som uttrykker T3SS-relaterte gener, inkludert hrpL, er heterogene i planta9. På denne presedensen er de representative resultatene av konfokal fluorescensmikroskopi og flowcytometrianalyse av hrpL-uttrykk vist i individuelle bakterieceller i modellstammene Pph 1448A (Pph) og Pto DC3000 (Pto), ekstrahert fra bladene av henholdsvis bønne eller Arabidopsis etter kolonisering av bladapoplasten (figur 4). I hver stamme bærer P. syringae-kromosomalt hrpL-genet en nedstrøms transkripsjonsfusjon til et promotorløst gfp-gen som gjør det mulig å overvåke hrpL-innfødt promotoraktivitet ved å følge GFP-ekspresjonsnivåene 8,9.
Apoplast-ekstraherte bakterier kan brukes til ulike analyser. Her ble 300 μL av de ovennevnte reporterbakteriestammene ekstrahert fra apoplasten av infiserte Arabidopsis eller bønneplanter og brukt til datainnsamling ved hjelp av et flowcytometersystem (se materialtabell). Laserutslipp ved 488 nm og FITC-filteret ble brukt til GFP-deteksjon. Flowcytometrianalyse viser fluorescensfordelingen i de enkelte bakterieceller i populasjonen. Heterogen ekspresjon av hrpL kan tydelig observeres ved flowcytometri i Arabidopsis apoplastekstrahert Pto og i bønneapoplastekstrahert Pph, inkludert HrpLOFF (not expressing GFP) bakterier, og disse resultatene støttes av mikroskopisk undersøkelse av de tilsvarende prøvene (figur 4). Punktplottgrafene (venstre paneler) viser fordelingen av fluorescensintensitet av GFP versus cellestørrelse i befolkningen (figur 4A), mens histogrammene viser fluorescensintensiteten av GFP versus celletall (figur 4B). Disse to forskjellige grafiske representasjonene av cytometridata gjør det mulig for forskeren å etablere subtile visuelle nyanser og gi komplementær informasjon. Som kontroll for bakteriell autofluorescens ble den tilsvarende ikke-GFP-villtypestammen brukt (øvre panel i figur 4A og grått histogram i figur 4B). Dette gjør det mulig å identifisere grafområdet der ikke-GFP-bakterier i befolkningen vises. Flowcytometrianalyser genererer også kvantitative data. Som et eksempel ekstraheres prosentandelen av HrpLON (fluorescerende) celler i apoplastekstraherte Pto- og Pph-populasjoner. Figur 4C viser hvordan HrpLON-prosentene var høyere enn de tilsvarende prosentandelene av HrpLOFF (ikke-fluorescerende) celler i disse populasjonene, spesielt i Pto-modellen. Disse dataene kan også brukes til å beregne gjennomsnittlig eller median fluorescens for hele befolkningen. I dette spesielle eksperimentet ble den gjennomsnittlige GFP-fluorescensintensiteten oppnådd, noe som var høyere for Pto-populasjonen enn for Pph, i tråd med den høyere prosentandelen ON-celler. Gjennomsnittsnivåene utgjør data på populasjonsnivå som kan sammenlignes med data oppnådd gjennom ikke-enkeltcelleteknikker som RT-q, PCR eller RNAseq. Til slutt vises også den robuste variasjonskoeffisienten (RCV)12, beregnet som tredje kvartil minus første kvartil dividert med medianen. RCV brukes ofte i flowcytometristudier for å estimere dataspredning (dvs. heterogenitet av uttrykket i populasjonen)13. I den nåværende studien var RCV litt høyere for Pph enn for Pto, selv om forskjellen ikke var tilstrekkelig til å karakterisere fordelingen av uttrykket i populasjonene av disse to stammene som signifikant forskjellig. Heterogeniteten av hrpL-uttrykk kan bekreftes visuelt med konfokalmikroskopibildene (figur 4D). Bruken av agarputer for mikroskopipreparering resulterer i enklere visualisering og bilder av høyere kvalitet av de enkelte cellene siden det skyver bakteriene på et enkelt lag og forhindrer bakteriell bevegelse. Inokulasjons- og bakterieekstraksjonsprosedyrene beskrevet i denne protokollen minimerer mengden planteavfall i bakteriepreparatet, og tillater dermed analyse av bakterieuttrykk ved disse forskjellige teknikkene (figur 4).
Figur 1: Bakteriell inokulasjon og apoplastekstraksjon ved bruk av Arabidopsis-planter. (A) Klargjøring av gryten med metallnettet riktig festet. (B) Såing frø ved hjelp av en tannpirker for å fordele dem som angitt i (C). (D) Arabidopsis planter klar for inokulering. (E) To trepinner letter nedsenking av plantene i bakterieløsningen uten å nå potten eller jorden (F). (G) Ensemblet kan settes inn i vakuumkammeret. (H) De infiltrerte bladene blir mørkere etter å ha sluppet vakuumet fra kammeret. (I) De frittliggende bladene plasseres i en 20 ml sprøyte og dekkes med vann. (J) Sykluser med positivt og negativt trykk resulterer i ekstraksjon av apoplastiske bakterier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bakteriell inokulasjon og apoplastekstraksjon ved bruk av bønneplanter. (A) Spiring av bønnefrø i petriskåler foret med vått toalettpapir. (B) Bønneplante klar for inokulering. (C) Bønneblad nedsenket i bakterieoppløsningen i et 50 ml rør. (D) Bladene inokuleres inne i et vakuumkammer til vevet blir mørkere (E). (F) Bønnebladet rulles, legges i en 20 ml sprøyte og dekkes med vann (G). (H) Sykluser med positivt og negativt trykk (I) resulterer i ekstraksjon av apoplastiske bakterier som kan gjenvinnes i et rør (J). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjematisk fremstilling av innstillingen og forberedelsen av agarputen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Analyse av apoplastekstraherte bakterier oppnådd fra Arabidopsis eller bønneblader 4 dager etter inokulering med henholdsvis P. syringae pv. tomat (Pto) eller P. syringae pv. phaseolicola (Pph). Ekspresjon av hrpL::gfp overvåkes som GFP-fluorescens. (A) Flowcytometrianalyse er representert som et punktplott (fremoverspredning [cellestørrelse] vs. GFP-fluorescensintensitet). Ikke-GFP-bakterier indikerer en villtypestamme av enten Pto eller Pph. Den vertikale linjen avgrenser 99% av ikke-GFP-populasjonen. (B) Flowcytometrianalyse er representert som histogrammer (celletall vs. GFP-fluorescensintensitet). Det grå histogrammet representerer ikke-GFP-stammen. (C) Kvantitative data ble generert fra flowcytometrianalysen. Prosentandelen av PÅ- og AV-celler beregnes basert på fordelingen som vises i punktdiagrammet. Gjennomsnittet indikerer gjennomsnittlig fluorescens oppnådd i forsøket. Den robuste variasjonskoeffisienten (RCV) beregnes som tredje kvartil minus første kvartil dividert med medianen. (D) Fluorescensmikroskopibilder som viser heterogene nivåer av GFP assosiert med uttrykket av hrpL. De hvite pilene markerer bakterier som viser lave nivåer eller ingen GFP-fluorescens. Skala bar: 3 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som presenteres her beskriver en ikke-invasiv prosedyre som tillater infiltrering av bakterier i plantebladvevet, noe som muliggjør rask inokulering av store volumer samtidig som vevsforstyrrelser minimeres. Et av egenskapene til P. syringae-artskomplekset er evnen til å overleve og proliferere inne i planteapoplasten og på planteoverflaten som epifyt14. Dermed kan muligheten for at bakteriene ekstrahert ved hjelp av denne protokollen bare kommer fra planten apoplast ikke utelukkes. Imidlertid ble det tidligere demonstrert ved hjelp av konfokalmikroskopi at andelen bakterier på bladoverflaten er betydelig mindre sammenlignet med bakterieveksten inne i plantebladet5. Dette kan kontrolleres ved mikroskopisk undersøkelse av bladoverflaten før ekstraksjon. Videre har P. syringae-stammene som brukes som modell i den nåværende protokollen, Pto DC3000 og Pph 1448A, vist seg å fungere som svake epifitter15, som representerer en irrelevant andel av de ekstraherte bakteriene. Likevel, hvis metoden skal tilpasses andre patosystemer, kan det hende at et tidligere trinn med dekontaminering av bladoverflaten må legges til den nåværende protokollen.
Tradisjonelle inokulasjonsmetoder, som bladinfiltrasjon ved hjelp av en sprøyte16, forårsaker større, vanskelig å estimere vevskader på inokulasjonsstedet, noe som resulterer i vevnekrose. Videre er skadeomfanget svært variabelt mellom forskjellige inokulasjonspunkter. Også forskjellige plantearter varierer i deres toleranse for bladinfiltrasjon. For eksempel er Arabidopsis-bladene enkle å infiltrere, mens bønnebladene er mer gjenstridige. Vekstforhold påvirker også toleransenivået for infiltrasjon av en gitt art. Mer skånsomme tradisjonelle inokulasjonsmetoder, som bladdypp eller bladspray, noe som resulterer i en mer naturlig og skadefri bakteriell oppføring og kolonisering av vevet, begrenser imidlertid iboende størrelsen på de oppnådde bakteriepopulasjonene, ofte under terskelen som kreves for etterfølgende analyse av de apoplastiske bakterieprøvene5 . Den foreslåtte inokulasjonsmetoden reduserer signifikant aktiveringen av nekrose i de inokulerte områdene som følge av sprøytetrykk, samtidig som man unngår bakteriell prøvestørrelsesbegrensning og gir en enkel, reproduserbar og rask måte å inokulere betydelige bladområder på.
Noen teknikker som krever inokulering av store vevsområder kan være svært tid- og arbeidskrevende, noe som øker sjansene for å forårsake vevskader. Ved å bruke denne metoden kan vi inokulere fem eller flere Arabidopsis-planter , eller et helt bønneblad, i bare ett trinn uten å kompromittere vevets integritet. Denne teknikken kan tilpasses for å inokulere et større antall planter eller til andre plantearter av agronomisk eller akademisk interesse, som Nicotiana benthamiana, tomat eller soyabønne. Konsentrasjonen av surfaktanten, som brukes til å redusere spenningen i overflatevannet for å lette infiltrasjonen av bakteriesuspensjonen, må justeres og testes på forhånd avhengig av plantearten, da høyere konsentrasjoner av surfaktanten i noen tilfeller kan resultere i vevnekrose. Også mengden trykk som påføres og varigheten av inokulasjonsprosessen må tilpasses motstanden som plantebladet tilbyr i forskjellige arter for å sikre optimale resultater.
Med hensyn til apoplastekstraksjon minimerer den nåværende metoden også vevsforstyrrelser, og reduserer dermed mengden planteavfall som er tilstede i den ekstraherte prøven. Dette muliggjør renere prøver, noe som resulterer i mer effektiv analyse gjennom forskjellige teknikker som RNA-seq, flowcytometri eller mikroskopi, som vist i eksemplet. Gjenoppretting av den patogene bakteriepopulasjonen fra sitt apoplastiske miljø med minimal vevs- og plantecelleforstyrrelse er utfordrende. P. syringae koloniserer apoplastens intercellulære rom og danner mikrokolonier. Bruk av et ekstracellulært patogen, som P. syringae, tillater metoder som den som presenteres her, siden vev og celleforstyrrelser ikke er nødvendig for bakteriell gjenoppretting. Rundene med positivt og negativt trykk forstyrrer mikrokoloniene, sprer bakteriene og tillater enkel og rask ekstraksjon gjennom naturlige åpninger (stomata), og unngår enhver endring i genuttrykk som kan følge med lange inkubasjonstider, som de som kreves for mer milde metoder for apoplastisk gjenoppretting. Mikroskopisk undersøkelse av rester av plantevev støtter fjerning av det meste av bakteriepopulasjonen. Apoplastiske væskeekstraksjonsprotokoller har blitt mye brukt til å studere kompleksiteten til apoplastisk væske17. Disse protokollene inneholder et siste trinn med sentrifugering for ytterligere å rydde opp apoplastisk væske gjenvunnet. Her ble milde sykluser med positivt og negativt trykk ved bruk av sprøytestempelet brukt i stedet, og dermed redusert prøveforurensning med vertscellulært rusk, samtidig som det hadde svært liten innvirkning på effektiviteten av bakteriell utvinning. En klassisk mild bakteriell ekstraksjonsmetode består av inkubering av bladskiver eller frøplanter med et overflateaktivt middel i 1-2 timer18. Denne metoden er ikke like effektiv som den som presenteres her for å trekke ut bakterier; Imidlertid er dens viktigste begrensning for genekspresjonsanalyse effekten av den nødvendige inkubasjonstiden på befolkningens ekspresjonsprofil. Metoden som herved presenteres muliggjør rask gjenoppretting og umiddelbar analyse av den apoplastiske populasjonen, og reduserer dermed risikoen for å omgå genuttrykksresultater på mobilnivå.
Fenotypisk heterogenitet hos patogene bakterier har blitt mye studert ved bruk av homogene laboratoriemedier. Studier av bakteriepopulasjoner dyrket i sin naturlige nisje er ofte begrenset på grunn av tekniske barrierer, for eksempel vanskeligheten med å gjenopprette bakteriepopulasjoner uten overflødig forurensning med vertscelleavfall som forstyrrer nedstrøms enkeltcelleanalyser. Denne kombinerte metoden for inokulering og ekstraksjon tillater helt generering av store apoplastiske populasjoner av bakterielle patogener for enkeltcelleanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Project Grant RTI2018-095069-B-I00 finansiert av MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ og av "ERDP A way of making Europe". J.S.R. ble finansiert av Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. ble finansiert av Project Grant P18-RT-2398 fra Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
- Weigel, W. A., Dersch, P. Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy. Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).
- Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Morris, C. E., et al. The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle. The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).
- Rufián, J. S., et al. Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains. Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).
- Macho, A. P. Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity. New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).
- Xiao, Y., Hutcheson, S. W. A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae. Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).
- Rufián, J. S., et al. Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae. Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).
- Rufian, J. S., et al. Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host. Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
- Fouts, D. E., et al. Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).
- Huber, P. J. Robust Statistics. , Wiley. New York, NY. (1981).
- Freed, N. E., et al. A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise. PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).
- Hirano, S. S., Upper, C. D. Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).
- Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization. Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).
- Liu, X., et al. Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).
- O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example. Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).
