Summary
Het huidige protocol beschrijft een methode die eencellige genexpressieanalyse mogelijk maakt op Pseudomonas syringae-populaties die in de apoplast van de plant worden gekweekt.
Abstract
Een overvloed aan pathogene micro-organismen vallen voortdurend planten aan. Het Pseudomonas syringae-soortencomplex omvat Gram-negatieve plantpathogene bacteriën van bijzonder belang voor een groot aantal gastheren. P. syringae komt de plant binnen vanaf het bladoppervlak en vermenigvuldigt zich snel binnen de apoplast en vormt microkolonies die de intercellulaire ruimte bezetten. De constitutieve expressie van fluorescerende eiwitten door de bacteriën maakt visualisatie van de microkolonies mogelijk en monitoring van de ontwikkeling van de infectie op microscopisch niveau. Recente ontwikkelingen in eencellige analyse hebben de grote complexiteit aangetoond die wordt bereikt door klonale isogene bacteriële populaties. Deze complexiteit, fenotypische heterogeniteit genoemd, is het gevolg van cel-tot-cel verschillen in genexpressie (niet gekoppeld aan genetische verschillen) tussen de bacteriële gemeenschap. Om de expressie van individuele loci op eencellig niveau te analyseren, zijn transcriptionele fusies met fluorescerende eiwitten op grote schaal gebruikt. Onder stressomstandigheden, zoals die optreden tijdens de kolonisatie van de apoplast van de plant, differentieert P. syringae in verschillende subpopulaties op basis van de heterogene expressie van belangrijke virulentiegenen (d.w.z. het Hrp type III-secretiesysteem). Eencellige analyse van een bepaalde P. syringae-populatie hersteld uit plantenweefsel is echter een uitdaging vanwege het cellulaire puin dat vrijkomt tijdens de mechanische verstoring die inherent is aan de inentings- en bacteriële extractieprocessen. Het huidige rapport beschrijft een methode die is ontwikkeld om de expressie van P. syringae-genen van belang op eencellig niveau te volgen tijdens de kolonisatie van Arabidopsis en bonenplanten. De bereiding van de planten en de bacteriële suspensies die worden gebruikt voor inenting met behulp van een vacuümkamer worden beschreven. Het herstel van endofytische bacteriën uit geïnfecteerde bladeren door apoplastische vloeistofextractie wordt hier ook uitgelegd. Zowel de bacteriële inentings- als de bacteriële extractiemethoden zijn empirisch geoptimaliseerd om schade aan planten en bacteriële cellen te minimaliseren, wat resulteert in bacteriële preparaten die optimaal zijn voor microscopie en flowcytometrie-analyse.
Introduction
Pathogene bacteriën vertonen verschillen in verschillende fenotypen, wat aanleiding geeft tot de vorming van subpopulaties binnen genetisch identieke populaties. Dit fenomeen staat bekend als fenotypische heterogeniteit en is voorgesteld als een aanpassingsstrategie tijdens interacties tussen bacteriënen gastheer 1. Recente ontwikkelingen in de optische resolutie van confocale microscopen, flowcytometrie en microfluïdica, gecombineerd met fluorescerende eiwitten, hebben eencellige analyses van bacteriële populaties bevorderd2.
De Gram-negatieve Pseudomonas syringae is een archetypische plantpathogene bacterie vanwege zowel zijn academische als economische belang3. De levenscyclus van P. syringae is gekoppeld aan de watercyclus4. P. syringae komt de intercellulaire ruimtes tussen de mesofylcellen, de apoplast van het plantenblad, binnen via natuurlijke openingen zoals huidmondjes of wonden5. Eenmaal in de apoplast vertrouwt P. syringae op het type III-secretiesysteem (T3SS) en de type III-getransloceerde effectoren (T3E) om de immuniteit van planten te onderdrukken en de cellulaire functies van planten te manipuleren ten behoeve van de ziekteverwekker6. De expressie van T3SS en T3E is afhankelijk van de hoofdregulator HrpL, een alternatieve sigmafactor die zich bindt aan de hrp-boxmotieven in het promotorgebied van dedoelgenen 7.
Door chromosoom-gelokaliseerde transcriptionele fusies te genereren naar fluorescerende eiwitgenen stroomafwaarts van het gen van belang, kan men genexpressie volgen op basis van de fluorescentieniveaus die worden uitgezonden op het niveau van één cel8. Met behulp van deze methode is vastgesteld dat de expressie van hrpL heterogeen is, zowel binnen bacterieculturen die in het laboratorium worden gekweekt als binnen bacteriepopulaties die zijn hersteld uit de plant apoplast 8,9. Hoewel genexpressieanalyse op eencellig niveau meestal wordt uitgevoerd in bacterieculturen die in laboratoriummedia worden gekweekt, kunnen dergelijke analyses ook worden uitgevoerd op bacteriepopulaties die in de plant groeien, waardoor waardevolle informatie wordt verkregen over de vorming van subpopulaties in de natuurlijke context. Een mogelijke beperking voor de analyse van bacteriële populaties die uit de plant worden geëxtraheerd, is dat klassieke inentingsmethoden door infiltratie van de spuitdruk in de apoplast, gevolgd door bacteriële extractie door maceratie van het bladweefsel, meestal een grote hoeveelheid cellulair plantenresten genereren die de stroomafwaartse analyse verstoort10. Het meeste cellulaire puin bestaat uit autofluorescerende fragmenten van chloroplasten die overlappen met GFP-fluorescentie, wat resulteert in misleidende resultaten.
Het huidige protocol beschrijft het proces van het analyseren van heterogeniteit van eencellige genexpressie in twee modelpathosystemen: die gevormd door de P. syringae pv. tomatenstam DC3000 en Arabidopsis thaliana (Col-0), en de andere door de P. syringae pv. phaseolicola stam 1448A en bonenplanten (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). Een inentingsmethode wordt voorgesteld op basis van vacuüminfiltratie met behulp van een vacuümkamer en een pomp, wat resulteert in een snelle en schadevrije methode om hele bladeren te infiltreren. Bovendien wordt, als een verbetering van conventionele protocollen, een zachtere methode gebruikt om de bacteriële populatie uit de apoplast te extraheren die weefselverstoring aanzienlijk vermindert, gebaseerd op de extractie van apoplastische vloeistof door cycli van positieve en negatieve druk toe te passen met behulp van een kleine hoeveelheid volume in een spuit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plantvoorbereiding
- Bereid Arabidopsis Col-0 planten voor volgens de onderstaande stappen.
- Vul een pot met een diameter van 10 cm met een 1:3 vermiculiet-plantensubstraatmengsel (zie materiaaltabel), eerder bewaterd, en bedek de pot met een metalen gaas van 15 cm x 15 cm met gaten van 1,6 mm x 1,6 mm. Pas het metalen gaas aan op de natte grond met behulp van een elastiekje (figuur 1A).
- Zaai met een natte tandenstoker Arabidopsis-zaden in de gaten van het metalen gaas. Plaats drie tot vier zaden op verre plaatsen in de pot (figuur 1B, C).
- Bedek de potten met een plastic koepel om een hoge relatieve luchtvochtigheid te behouden en incuber ze gedurende 72 uur bij 4 °C voor stratificatie.
OPMERKING: Stratificatie (incubatie bij hoge luchtvochtigheid en lage temperatuur, zoals beschreven) verbetert de kiemsnelheid en synchronisatie van de zaden. - Breng de potten over naar een plantengroeikamer onder omstandigheden van korte dagen (8 uur licht/16 uur donker bij 21 °C, lichtintensiteit: 100 μmol·m−2·s−1, relatieve vochtigheid: 70%).
- Gebruik na het ontkiemen van het zaad (8-10 dagen) het pincet om de meeste zaailingen te verwijderen en houd één zaailing in elk van de posities van de pot (zes zaailingen / pot) (figuur 1D). Verwijder de plastic koepel om de potten bloot te leggen.
OPMERKING: De planten zijn 4-5 weken na ontkieming klaar voor gebruik.
- Bereid Phaseolus vulgaris bonen (cultivar Canadian Wonder) planten.
- Bedek de bodem van een petrischaaltje met een nat stuk handdoekpapier en leg de bonenpitten erop. Sluit de petrischaal af met chirurgische tape en incubeer gedurende 3-4 dagen bij 28 °C (figuur 2A).
- Breng de gekiemde zaden over in een pot met een diameter van 10 cm gevuld met natte 1:3 vermiculiet-plant substraatmix.
- Incubeer in een plantengroeikamer onder langdurige omgevingen (16 uur licht/8 uur donker bij 23 °C, lichtintensiteit: 100 μmol·m−2·s−1, relatieve vochtigheid: 70%).
OPMERKING: De planten zijn 10 dagen na ontkieming klaar voor gebruik (figuur 2B).
2. Inenting van Arabidopsis en bonenplanten
OPMERKING: In deze studie hebben de stammen P. syringae pv. tomaat DC3000 en P. syringae pv. phaseolicola 1448A werden gebruikt.
- Bereid het P. syringae inoculum.
- Streep de P. syringae-stam van belang uit een glycerolvoorraad van −80 °C op een LB-plaat (10 g/L trypton, 5 g/L NaCl, 5 g/L gistextract en 16 g/L bacteriologische agar, zie tabel met materialen) aangevuld met de juiste antibiotica. Incubeer bij 28 °C gedurende 40-48 uur.
OPMERKING: Het gebruik van antibiotica wordt aanbevolen als de betreffende stam een plasmide of een genomisch resistentiegen draagt. De aanbevolen antibioticaconcentraties voor P. syringae zijn als volgt: kanamycine (15 μg/ml), gentamycine (10 μg/ml), ampicilline (300 μg/ml) (zie materiaaltabel). - Schraap de bacteriële biomassa eruit en resuspensie in 5 ml van 10 mM MgCl2. Meet de OD600 en stel in op 0,1 door 10 mM MgCl2 toe te voegen.
OPMERKING: Een OD600 van 0,1 van een P. syringae cultuur komt overeen met 5 x 107 CFU·ml−1. - Voer seriële verdunningen uit tot 10 mM MgCl2 om een uiteindelijke entconcentratie van 5 x 105 CFU·ml−1 te bereiken. Bereid 200 ml entmateriaal voor de Arabidopsis-planten en 50 ml voor de bonenplanten.
- Voeg vlak voor de inenting de oppervlakteactieve stof Silwett L-77 (zie materiaaltabel) toe aan een eindconcentratie van 0,02% voor boneninenting en 0,01% voor Arabidopsis. Merk op dat Silwett enigszins schadelijk is voor het Arabidopsis-weefsel.
- Streep de P. syringae-stam van belang uit een glycerolvoorraad van −80 °C op een LB-plaat (10 g/L trypton, 5 g/L NaCl, 5 g/L gistextract en 16 g/L bacteriologische agar, zie tabel met materialen) aangevuld met de juiste antibiotica. Incubeer bij 28 °C gedurende 40-48 uur.
- Voer vacuüminfiltratie uit.
- Voor Arabidopsis-infiltratie plaatst u twee houten stokken die een X vormen over de pot (figuur 1E) en plaatst u de pot met de voorkant naar beneden over een petrischaal met een diameter van 14 cm met het entmateriaal van 200 ml (figuur 1F).
- Voor inenting van bonenbladeren brengt u het blad in een conische centrifugebuis van 50 ml met het entmateriaal (figuur 2C).
- Steek de in de entoplossing ondergedompelde planten in een vacuümkamer (figuur 1G en figuur 2D) en geef gedurende 30 s een puls van 500 mbar om de bladeren te infiltreren. Herhaal de vacuümpuls 2-3 keer totdat het blad volledig is geïnfiltreerd (figuur 1H en figuur 2E).
- Giet de overtollige entoplossing af met een stuk papier en breng de planten terug naar hun overeenkomstige groeikamer.
3. Extractie van bacteriën uit de apoplast
- Snijd vier dagen na inenting het bovengrondse deel van de Arabidopsis-plant of het geënte blad van de bonenplant en plaats het in een spuit van 20 ml zonder naald (figuur 2G). Voor bonenbladeren rolt u het blad op zichzelf en laat u het abaxiale gezicht naar buiten, zoals weergegeven in figuur 2F.
- Voeg voldoende volume gedestilleerd water toe om het weefsel te bedekken (meestal 10-15 ml).
- Plaats de zuiger en verwijder met de spuit in de verticale positie met de punt naar boven gericht de overtollige lucht en luchtbellen in de spuit door zachtjes op de cilinder te tikken totdat alle lucht zich in de buurt van de punt bevindt. Schuif vervolgens de zuiger om de lucht eruit te halen. Zodra er zo min mogelijk lucht in de spuit zit, bedek je de punt van het spuitvat met paraffinefilm.
- Druk voorzichtig op de zuiger om positieve druk te genereren totdat het weefsel donkerder wordt (figuur 1I en figuur 2H). Trek vervolgens aan de zuiger om negatieve druk te genereren (figuur 1J en figuur 2I). Herhaal deze stap 3-5 keer.
- Verwijder de paraffinefilm en de zuiger en vang de vloeistof op die de met apoplast geëxtraheerde bacteriën bevat, zoals in figuur 2J.
4. Eencellige analyse van de apoplast-geëxtraheerde bacteriën
- Visualiseer door confocale microscopie volgens de onderstaande stappen.
- Bereid een 1,5% agarose-oplossing in gedestilleerd water. Eenmaal gesmolten, voeg je voldoende volume toe om de ruimte tussen twee naast elkaar geplaatste microscopiedia's te vullen en plaats je er nog een dia bovenop (figuur 3). Laat ze 15 minuten drogen en verwijder voorzichtig de schuif die op de bovenkant is geplaatst. Snijd met een mesje de agarose pad vlak voor gebruik in stukjes van 5 mm x 5 mm.
- Centrifugeer parallel 1 ml van de apoplast-geëxtraheerde bacteriën bij 12.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur, verwijder het supernatant voorzichtig met behulp van een pipet en resuspensie de pellet in 20 μL water om de cellen te concentreren. Plaats een druppel van 2 μL van de geconcentreerde cellen op een dekplaat van 0,17 mm en bedek de druppel met een stuk van 5 mm x 5 mm van het agarosekussen dat eerder in stap 1 is verkregen, zoals weergegeven in figuur 3.
- Visualiseer het bacteriepreparaat onder de confocale microscoop (zie materiaaltabel). Om groen-fluorescerende bacteriën te identificeren, gebruikt u de excitatielaser bij 488 nm en een emissiefilter van 500 nm tot 550 nm. Om alle bacteriën te identificeren, gebruikt u het heldere veld en voegt u beide velden samen.
- Verwerk de confocale beelden met Fiji (zie Materiaaltabel). Gebruik hiervoor de MicrobeJ-plug-in om de contouren van de bacteriële cel te identificeren en de fluorescentie-intensiteit binnenin te meten.
OPMERKING: Beeldacquisitie van geïsoleerde bacteriën (niet geclusterd) wordt aanbevolen voor deze analyse.
- Voer analyse uit met behulp van flowcytometrie.
- Neem een aliquot van de apoplast-geëxtraheerde bacteriesuspensies om te analyseren met behulp van de flow-cytometer. Verwerf 100.000 evenementen.
- Om onderscheid te maken tussen bacteriën en plantenresten, analyseert u de apoplast die is geëxtraheerd uit een niet-geënte plant en vergelijkt u de dot plot met de forward scatter (FSC) celgrootte versus side scatter (SSC) celgrootte met die van de apoplast-geëxtraheerde bacteriële suspensie. Om niet-fluorescerende bacteriën te identificeren, gebruikt u de apoplasten die zijn geëxtraheerd uit de planten die zijn ingeënt met niet-fluorescerende isogene bacteriën en vergelijkt u hun fluorescerende emissies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De expressie van het type III secretiesysteem is essentieel voor de bacteriegroei in de plant. De tijdige expressie van T3SS-genen wordt bereikt door ingewikkelde regulatie, met als middelpunt de extracytoplasmatische functie (ECF) sigmafactor HrpL, de belangrijkste activator van de expressie van T3SS-gerelateerde genen11. Een analyse van de expressie van hrpL werd eerder uitgevoerd met behulp van een chromosoom-gelokaliseerde transcriptionele fusie naar een downstream promotorloos gfp-gen en door de expressiepatronen te volgen door confocale microscopie en flowcytometrie9. Deze fusies worden gegenereerd door homologe recombinatie-gemedieerde integratie van plasmide-gecodeerde constructen gegenereerd door PCR en traditioneel klonen en dragen de laatste 500 basenparen van de ORF van het gen van belang (inclusief het STOP-codon) en 500 basenparen van de sequentie onmiddellijk stroomafwaarts, flankerend de ribosoombindingsplaats en de ORF van het te gebruiken fluorescentiereportergen (in dit geval, GFP), gevolgd door een antibioticaresistentiecassette (in dit geval het NPT2-gen dat resistentie tegen kanamycine verleent). Zo werd vastgesteld dat apoplast-geëxtraheerde P. syringae-populaties die T3SS-gerelateerde genen tot expressie brengen, waaronder hrpL, heterogeen zijn in planta9. Op basis van dit precedent worden de representatieve resultaten van confocale fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie-analyse van hrpL-expressie getoond in individuele bacteriële cellen van de modelstammen Pph 1448A (Pph) en Pto DC3000 (Pto), geëxtraheerd uit de bladeren van respectievelijk bonen of Arabidopsis na kolonisatie van de bladapoplast (figuur 4). In elke stam draagt het P. syringae chromosomale hrpL-gen een downstream transcriptionele fusie naar een promotorloos gfp-gen dat het mogelijk maakt om de hrpL native promoter-activiteit te volgen door de GFP-expressieniveaus 8,9 te volgen.
Apoplast-geëxtraheerde bacteriën kunnen worden gebruikt voor verschillende analyses. Hier werd 300 μL van de bovengenoemde reporter-bacteriestammen geëxtraheerd uit de apoplast van geïnfecteerde Arabidopsis of bonenplanten en gebruikt voor gegevensverzameling met behulp van een flowcytometersysteem (zie tabel met materialen). Laseremissie bij 488 nm en het FITC-filter werd gebruikt voor GFP-detectie. Flowcytometrie-analyse toont de fluorescentieverdeling in individuele bacteriële cellen binnen de populatie. Heterogene expressie van hrpL kan duidelijk worden waargenomen door flowcytometrie in Arabidopsis apoplast-geëxtraheerde Pto en in bonenapoplast-geëxtraheerde Pph, inclusief HrpLOFF (niet tot expressie brengende GFP) bacteriën, en deze resultaten worden ondersteund door microscopisch onderzoek van de overeenkomstige monsters (figuur 4). De dot plot grafieken (linker panelen) tonen de verdeling van de fluorescentie-intensiteit van GFP versus celgrootte in de populatie (figuur 4A), terwijl de histogrammen de fluorescentie-intensiteit van GFP versus celtellingen tonen (figuur 4B). Deze twee verschillende grafische weergaven van cytometriegegevens stellen de onderzoeker in staat om subtiele visuele nuances vast te stellen en aanvullende informatie te bieden. Als controle voor bacteriële autofluorescentie werd de overeenkomstige niet-GFP wild-type stam gebruikt (bovenste paneel in figuur 4A en grijs histogram in figuur 4B). Dit maakt het mogelijk om het grafiekgebied te identificeren waar niet-GFP-bacteriën binnen de populatie worden weergegeven. Flowcytometrie-analyses genereren ook kwantitatieve gegevens. Als voorbeeld worden de percentages HrpLON (fluorescerende) cellen geëxtraheerd in apoplast-geëxtraheerde Pto- en Pph-populaties. Figuur 4C laat zien hoe de HrpLON-percentages hoger waren dan de overeenkomstige percentages HrpLOFF (niet-fluorescerende) cellen in deze populaties, met name in het Pto-model. Deze gegevens kunnen ook worden gebruikt om de gemiddelde of mediane fluorescentie voor de hele populatie te berekenen. In dit specifieke experiment werd de gemiddelde GFP-fluorescentie-intensiteit verkregen, die hoger was voor de Pto-populatie dan voor Pph, in overeenstemming met het hogere percentage ON-cellen. De gemiddelde niveaus zijn gegevens op populatieniveau die vergelijkbaar zijn met gegevens die zijn verkregen via niet-eencellige technieken zoals RT-q, PCR of RNAseq. Ten slotte wordt ook de robuuste variatiecoëfficiënt (RCV)12, berekend als het derde kwartiel minus het eerste kwartiel gedeeld door de mediaan, weergegeven. De RCV wordt vaak gebruikt in flowcytometriestudies om de gegevensdispersie te schatten (d.w.z. heterogeniteit van de expressie binnen de populatie)13. In de huidige studie was de RCV iets hoger voor Pph dan voor Pto, hoewel het verschil niet voldoende was om de verdeling van de expressie binnen de populaties van deze twee stammen als significant verschillend te karakteriseren. De heterogeniteit van hrpL-expressie kan visueel worden bevestigd met de confocale microscopiebeelden (figuur 4D). Het gebruik van agarpads voor microscopievoorbereiding resulteert in eenvoudigere visualisatie en afbeeldingen van hogere kwaliteit van de individuele cellen, omdat het de bacteriën op een enkele laag duwt en bacteriële beweging voorkomt. De inentings- en bacteriële extractieprocedures die in dit protocol worden beschreven, minimaliseren de hoeveelheid plantenresten in het bacteriële preparaat, waardoor de analyse van bacteriële expressie met deze verschillende technieken mogelijk is (figuur 4).
Figuur 1: Bacteriële inenting en apoplastextractie met behulp van Arabidopsis-planten. (A) Bereiding van de pot met het metalen gaas goed bevestigd. B) Zaaien van zaden met behulp van een tandenstoker om ze te verdelen zoals aangegeven onder C). (D) Arabidopsis-planten die klaar zijn voor inenting. (E) Twee houten stokken vergemakkelijken de onderdompeling van de planten in de bacteriële oplossing zonder de pot of de grond te bereiken (F). (G) Het ensemble kan in de vacuümkamer worden geplaatst. (H) De geïnfiltreerde bladeren worden donkerder nadat het vacuüm uit de kamer is losgelaten. (I) De losgemaakte bladeren worden in een spuit van 20 ml geplaatst en bedekt met water. (J) Cycli van positieve en negatieve druk resulteren in de extractie van de apoplastische bacteriën. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bacteriële inenting en apoplastextractie met behulp van bonenplanten. (A) Ontkieming van bonenzaad in petrischalen bekleed met nat toiletpapier. (B) Bonenplant klaar voor inenting. (C) Bonenblad ondergedompeld in de bacteriële oplossing in een buis van 50 ml. (D) De bladeren worden in een vacuümkamer ingeënt totdat het weefsel donkerder wordt (E). (F) Het bonenblad wordt gerold, in een spuit van 20 ml gedaan en bedekt met water (G). (H) Cycli van positieve en negatieve druk (I) resulteren in de extractie van de apoplastische bacteriën die kunnen worden teruggewonnen in een buis (J). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schematische weergave van de instelling en bereiding van het agarpad. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Analyse van de apoplast-geëxtraheerde bacteriën verkregen uit Arabidopsis of bonenbladeren 4 dagen na inenting met respectievelijk P. syringae pv. tomaat (Pto) of P. syringae pv. phaseolicola (Pph). Expressie van hrpL::gfp wordt gemonitord als GFP-fluorescentie. (A) Flowcytometrie-analyse wordt weergegeven als een dot plot (forward scatter [celgrootte] vs. GFP-fluorescentie-intensiteit). Niet-GFP-bacteriën duiden op een wild-type stam van Pto of Pph. De verticale lijn begrenst 99% van de niet-GFP-populatie. (B) Flowcytometrie-analyse wordt weergegeven als histogrammen (celtellingen vs. GFP-fluorescentie-intensiteit). Het grijze histogram vertegenwoordigt de niet-GFP-stam. (C) Kwantitatieve gegevens werden gegenereerd uit de flowcytometrie-analyse. Het percentage AAN- en UIT-cellen wordt berekend op basis van de verdeling die wordt weergegeven in de dotplot. Het gemiddelde geeft de gemiddelde fluorescentie aan die in het experiment is verkregen. De robuuste variatiecoëfficiënt (RCV) wordt berekend als het derde kwartiel minus het eerste kwartiel gedeeld door de mediaan. (D) Fluorescentiemicroscopiebeelden die heterogene niveaus van GFP tonen die geassocieerd zijn met de expressie van hrpL. De witte pijlen markeren bacteriën met lage niveaus of geen GFP-fluorescentie. Schaalbalk: 3 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde methode beschrijft een niet-invasieve procedure die de infiltratie van bacteriën in het bladweefsel van planten mogelijk maakt, waardoor de snelle inenting van grote volumes mogelijk is en tegelijkertijd weefselverstoring wordt geminimaliseerd. Een van de kenmerken van het P. syringae-soortencomplex is het vermogen om te overleven en zich te vermenigvuldigen in de plantenapoplast en op het plantoppervlak als epifyt14. De mogelijkheid dat de bacteriën die volgens het huidige protocol worden geëxtraheerd, alleen afkomstig zijn van de apoplast van de plant, kan dus niet worden uitgesloten. Eerder werd echter met behulp van confocale microscopie aangetoond dat het aandeel bacteriën op het bladoppervlak opmerkelijk klein is in vergelijking met de bacteriegroei in het plantenblad5. Dit kan worden gecontroleerd door microscopisch onderzoek van het bladoppervlak voorafgaand aan extractie. Bovendien is aangetoond dat de P. syringae-stammen die in dit protocol als model worden gebruikt, Pto DC3000 en Pph 1448A, presteren als zwakke epifieten15, die een irrelevant deel van de geëxtraheerde bacteriën vertegenwoordigen. Om de methode echter aan te passen aan andere pathosystemen, kan het nodig zijn een voorafgaande stap van decontaminatie van het bladoppervlak aan dit protocol toe te voegen.
Traditionele inentingsmethoden, zoals bladinfiltratie met een spuit16, veroorzaken grotere, moeilijk in te schatten weefselschade op de inentingsplaats, wat resulteert in weefselnecrose. Bovendien is de hoeveelheid schade zeer variabel tussen verschillende inentingspunten. Ook variëren verschillende plantensoorten in hun tolerantie voor bladinfiltratie. Arabidopsis-bladeren zijn bijvoorbeeld gemakkelijk te infiltreren, terwijl bonenbladeren meer recalcitrant zijn. Groeiomstandigheden beïnvloeden ook het niveau van tolerantie voor infiltratie van een bepaalde soort. Zachtere traditionele inentingsmethoden, zoals bladdip of bladspray, resulterend in een meer natuurlijke en schadevrije bacteriële binnenkomst en kolonisatie van het weefsel, beperken echter inherent de grootte van de verkregen bacteriepopulaties, vaak onder de drempel die nodig is voor latere analyse van de apoplastische bacteriële monsters5 . De voorgestelde inentingsmethode vermindert de activering van necrose in de geënte gebieden als gevolg van spuitdruk aanzienlijk, terwijl beperking van de bacteriële monstergrootte wordt vermeden en biedt een eenvoudige, reproduceerbare en snelle manier om aanzienlijke bladgebieden te enten.
Sommige technieken die de inenting van grote weefselgebieden vereisen, kunnen zeer tijdrovend en arbeidsintensief zijn, waardoor de kans op het toebrengen van weefselschade toeneemt. Door deze methode toe te passen, kunnen we vijf of meer Arabidopsis-planten , of een heel bonenblad, in slechts één stap enten zonder de weefselintegriteit in gevaar te brengen. Deze techniek kan worden aangepast om een groter aantal planten te enten of aan andere plantensoorten van agronomisch of academisch belang, zoals Nicotiana benthamiana, tomaat of soja. De concentratie van de oppervlakteactieve stof, die wordt gebruikt om de spanning van het oppervlaktewater te verminderen om de infiltratie van de bacteriële suspensie te vergemakkelijken, moet vooraf worden aangepast en getest, afhankelijk van de plantensoort, omdat hogere concentraties van de oppervlakteactieve stof in sommige gevallen kunnen leiden tot weefselnecrose. Ook moeten de hoeveelheid uitgeoefende druk en de duur van het inentingsproces worden aangepast aan de weerstand die het plantenblad bij verschillende soorten biedt om optimale resultaten te garanderen.
Met betrekking tot apoplastextractie minimaliseert de huidige methode ook weefselverstoring, waardoor de hoeveelheid plantenresten in het geëxtraheerde monster wordt verminderd. Dit maakt schonere monsters mogelijk, wat resulteert in een efficiëntere analyse via verschillende technieken zoals RNA-seq, flowcytometrie of microscopie, zoals getoond in het voorbeeld. Herstel van de pathogene bacteriepopulatie uit zijn apoplastische omgeving met minimale verstoring van weefsel- en plantencellen is een uitdaging. P. syringae koloniseert de intercellulaire ruimten van de apoplast en vormt microkolonies. Het gebruik van een extracellulaire ziekteverwekker, zoals P. syringae, maakt methoden mogelijk zoals hier gepresenteerd, omdat weefsel- en celverstoring niet nodig is voor bacterieel herstel. De rondes van positieve en negatieve druk verstoren de microkolonies, verspreiden de bacteriën en maken hun gemakkelijke en snelle extractie door natuurlijke openingen (huidmondjes) mogelijk, waardoor elke verandering in genexpressie wordt vermeden die gepaard kan gaan met lange incubatietijden, zoals die nodig zijn voor zachtere methoden van apoplastisch herstel. Microscopisch onderzoek van het overgebleven plantenweefsel ondersteunt de verwijdering van het grootste deel van de bacteriepopulatie. Apoplastische vloeistofextractieprotocollen zijn op grote schaal gebruikt om de complexiteit van de apoplastische vloeistof te bestuderen17. Deze protocollen bevatten een laatste stap van centrifugeren om de teruggewonnen apoplastische vloeistof verder op te ruimen. Hier werden in plaats daarvan zachte cycli van positieve en negatieve druk met behulp van de zuiger van de spuit gebruikt, waardoor monsterverontreiniging met gastheer-cellulair puin werd verminderd, terwijl het zeer weinig invloed had op de efficiëntie van bacterieel herstel. Een klassieke zachte bacteriële extractiemethode bestaat uit de incubatie van bladschijven of zaailingen met een oppervlakteactieve stof gedurende 1-2 uur18. Deze methode is niet zo efficiënt als degene die hier wordt gepresenteerd om bacteriën te extraheren; De belangrijkste beperking voor genexpressieanalyse is echter het effect van de vereiste incubatietijd op het expressieprofiel van de populatie. De hierbij gepresenteerde methode maakt een snel herstel en onmiddellijke analyse van de apoplastische populatie mogelijk, waardoor het risico op het omzeilen van genexpressieresultaten op cellulair niveau wordt verminderd.
Fenotypische heterogeniteit in pathogene bacteriën is op grote schaal bestudeerd met behulp van homogene laboratoriummedia. Het bestuderen van bacteriepopulaties die in hun natuurlijke niche worden gekweekt, is vaak beperkt vanwege technische barrières, zoals de moeilijkheid om bacteriepopulaties te herstellen zonder overmatige besmetting met gastheercelresten die interfereren met downstream eencellige analyses. Deze gecombineerde methode van inenting en extractie maakt het mogelijk om grote apoplastische populaties van bacteriële pathogenen te genereren voor eencellige analyses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door projectsubsidie RTI2018-095069-B-I00, gefinancierd door MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ en door "ERDP: A way of making Europe". J.S.R. werd gefinancierd door Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. werd gefinancierd door Project Grant P18-RT-2398 van Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
- Weigel, W. A., Dersch, P. Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy. Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).
- Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Morris, C. E., et al. The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle. The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).
- Rufián, J. S., et al. Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains. Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).
- Macho, A. P. Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity. New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).
- Xiao, Y., Hutcheson, S. W. A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae. Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).
- Rufián, J. S., et al. Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae. Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).
- Rufian, J. S., et al. Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host. Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
- Fouts, D. E., et al. Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).
- Huber, P. J. Robust Statistics. , Wiley. New York, NY. (1981).
- Freed, N. E., et al. A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise. PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).
- Hirano, S. S., Upper, C. D. Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).
- Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization. Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).
- Liu, X., et al. Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).
- O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example. Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).
