Summary
Detta protokoll beskriver en metod som möjliggör encellsanalys av genuttryck på Pseudomonas syringae-populationer odlade inom växtapoplasten.
Abstract
En uppsjö av patogena mikroorganismer attackerar ständigt växter. Artkomplexet Pseudomonas syringae omfattar gramnegativa växtpatogena bakterier av särskild relevans för ett stort antal värdar. P. syringae kommer in i växten från bladytan och multiplicerar snabbt inom apoplasten och bildar mikrokolonier som upptar det intercellulära utrymmet. Det konstitutiva uttrycket av fluorescerande proteiner av bakterierna möjliggör visualisering av mikrokolonierna och övervakning av infektionens utveckling på mikroskopisk nivå. Nya framsteg inom encellsanalys har avslöjat den stora komplexitet som uppnås av klonala isogena bakteriepopulationer. Denna komplexitet, kallad fenotypisk heterogenitet, är konsekvensen av cell-till-cell-skillnader i genuttryck (inte kopplat till genetiska skillnader) bland bakteriesamhället. För att analysera uttrycket av enskilda loci på encellsnivå har transkriptionella fusioner till fluorescerande proteiner använts i stor utsträckning. Under stressförhållanden, såsom de som inträffar under kolonisering av växtapoplasten, differentierar P. syringae i distinkta subpopulationer baserat på det heterogena uttrycket av viktiga virulensgener (dvs Hrp typ III-sekretionssystemet). Emellertid, encellsanalys av en given P. syringae-population som återhämtats från växtvävnad är utmanande på grund av det cellulära skräpet som frigörs under den mekaniska störningen som är inneboende i inokulerings- och bakterieextraktionsprocesserna. Denna rapport beskriver en metod som utvecklats för att övervaka uttrycket av P. syringae-gener av intresse på encellsnivå under koloniseringen av Arabidopsis och bönplantor. Beredningen av växterna och de bakteriesuspensioner som används för inokulering med användning av en vakuumkammare beskrivs. Återhämtningen av endofytiska bakterier från infekterade löv genom apoplastisk vätskeextraktion förklaras också här. Både bakterieinokulerings- och bakterieextraktionsmetoderna är empiriskt optimerade för att minimera växt- och bakteriecellskador, vilket resulterar i bakteriepreparat optimala för mikroskopi och flödescytometrianalys.
Introduction
Patogena bakterier uppvisar skillnader i olika fenotyper, vilket ger upphov till bildandet av subpopulationer inom genetiskt identiska populationer. Detta fenomen är känt som fenotypisk heterogenitet och har föreslagits som en anpassningsstrategi under bakterie-värdinteraktioner1. Nya framsteg inom optisk upplösning av konfokalmikroskop, flödescytometri och mikrofluidik, i kombination med fluorescerande proteiner, har främjat encellsanalyser av bakteriepopulationer2.
Den gramnegativa Pseudomonas syringae är en arketypisk växtpatogen bakterie på grund av både dess akademiska och ekonomiska betydelse3. Livscykeln för P. syringae är kopplad till vattnets kretslopp4. P. syringae kommer in i de intercellulära utrymmena mellan mesofyllcellerna, växtbladets apoplast, genom naturliga öppningar som stomata eller sår5. En gång inom apoplasten förlitar sig P. syringae på typ III-sekretionssystemet (T3SS) och typ III-translokerade effektorer (T3E) för att undertrycka växtimmunitet och manipulera växtcellulära funktioner till förmån för patogenen6. Uttrycket av T3SS och T3E beror på masterregulatorn HrpL, en alternativ sigmafaktor som binder till hrp-boxmotiven i promotorregionen för målgenerna7.
Genom att generera kromosomlokaliserade transkriptionsfusioner till fluorescerande proteingener nedströms genen av intresse kan man övervaka genuttryck baserat på fluorescensnivåerna som emitteras på encellsnivå8. Med hjälp av denna metod har det fastställts att uttrycket av hrpL är heterogent både inom bakteriekulturer odlade i laboratoriet och inom bakteriepopulationer som återvunnits från växtapoplasten 8,9. Även om genuttrycksanalys på encellsnivå vanligtvis utförs i bakteriekulturer som odlas i laboratoriemedia, kan sådana analyser också utföras på bakteriepopulationer som växer inom växten, vilket ger värdefull information om bildandet av subpopulationer i det naturliga sammanhanget. En potentiell begränsning för analys av bakteriepopulationer extraherade från växten är att klassiska inokuleringsmetoder genom spruttryckinfiltration i apoplasten, följt av bakteriell extraktion genom maceration av bladvävnaden, vanligtvis genererar en stor mängd cellulärt växtskräp som stör nedströmsanalys10. De flesta cellulära skräp består av autofluorescerande fragment av kloroplaster som överlappar GFP-fluorescens, vilket resulterar i vilseledande resultat.
Detta protokoll beskriver processen för att analysera encellsgenuttryckets heterogenitet i två modellpatosystem: det som bildas av P. syringae pv. tomatstam DC3000 och Arabidopsis thaliana (Col-0), och den andra av P. syringae pv. phaseolicola stam 1448A och bönplantor (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). En inokuleringsmetod föreslås baserad på vakuuminfiltration med hjälp av en vakuumkammare och en pump, vilket resulterar i en snabb och skadefri metod för att infiltrera hela blad. Dessutom, som en förbättring av konventionella protokoll, används en mildare metod för att extrahera bakteriepopulationen från apoplasten som signifikant minskar vävnadsstörningar, baserat på extraktion av apoplastvätska genom att applicera cykler av positivt och negativt tryck med en liten mängd volym i en spruta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av växter
- Förbered Arabidopsis Col-0-växter enligt stegen nedan.
- Fyll en kruka med en diameter på 10 cm med en 1: 3 vermikulit-växtsubstratblandning (se materialtabell), tidigare vattnad, och täck krukan med ett 15 cm x 15 cm metallnät med 1,6 mm x 1,6 mm hål. Justera metallnätet till den våta jorden med ett gummiband (figur 1A).
- Så Arabidopsisfrön med en våt tandpetare i hålen i metallnätet. Placera tre till fyra frön på avlägsna platser i krukan (figur 1B, C).
- Täck krukorna med en plastkupol för att bibehålla hög relativ luftfuktighet och inkubera dem i 72 timmar vid 4 °C för skiktning.
OBS: Stratifiering (inkubation vid hög luftfuktighet och låg temperatur, som beskrivs) förbättrar fröets grobarhet och synkronisering. - Överför krukorna till en växttillväxtkammare under korta dagsförhållanden (8 timmar ljus/16 timmar mörkt vid 21 °C, ljusintensitet: 100 μmol · m−2 · s−1, relativ luftfuktighet: 70 %).
- Efter frögroning (8-10 dagar), använd pincetten för att ta bort de flesta plantorna och håll en planta i var och en av krukans positioner (sex plantor / kruka) (figur 1D). Ta bort plastkupolen för att avslöja krukorna.
OBS: Växterna är redo att användas 4-5 veckor efter spiring.
- Förbered Phaseolus vulgaris bönor (cultivar Canadian Wonder) växter.
- Täck botten av en petriskål med en våt bit handdukspapper och lägg bönfrön ovanpå den. Förslut petriskålen med kirurgisk tejp och inkubera vid 28 °C i 3–4 dagar (figur 2A).
- Överför de grodda fröna till en kruka med en diameter på 10 cm fylld med våt 1: 3 vermikulit-växtsubstratblandning.
- Inkubera i en växttillväxtkammare under långa dagsinställningar (16 h ljus/8 h mörkt vid 23 °C, ljusintensitet: 100 μmol·m−2·s−1, relativ luftfuktighet: 70%).
OBS: Växterna är redo att användas 10 dagar efter spiring (figur 2B).
2. Inokulering av Arabidopsis och bönplantor
OBS: I denna studie har stammarna P. syringae pv. tomat DC3000 och P. syringae pv. phaseolicola 1448A användes.
- Förbered P. syringae inoculum.
- Stryk ut P. syringae-stammen av intresse från en glycerolstam på en LB-platta (10 g / L trypton, 5 g / L NaCl, 5 g / L jästextrakt och 16 g / L bakteriologisk agar, se materialtabell) kompletterad med lämpliga antibiotika. Inkubera vid 28 °C i 40–48 timmar.
OBS: Användning av antibiotika rekommenderas om stammen av intresse bär på en plasmid eller en genomisk resistensgen. De rekommenderade antibiotikakoncentrationerna för P. syringae är följande: kanamycin (15 μg/ml), gentamycin (10 μg/ml), ampicillin (300 μg/ml) (se materialförteckning). - Skrapa bort bakteriebiomassan och resuspendera i 5 ml 10 mMMgCl2. Mät OD600 och justera till 0,1 genom att tillsätta 10 mM MgCl2.
OBS: En OD600 av 0,1 av en P. syringae-kultur motsvarar 5 x 107 CFU·ml−1. - Utför serieutspädningar till 10 mM MgCl2 för att uppnå en slutlig inokulatkoncentration på 5 x 105 CFU·ml−1. Förbered 200 ml ympning för Arabidopsis-plantorna och 50 ml för bönplantorna.
- Strax före ympning, tillsätt det ytaktiva ämnet Silwett L-77 (se materialtabell) till en slutlig koncentration av 0,02% för böninokulering och 0,01% för Arabidopsis. Observera att Silwett är något skadligt för Arabidopsis-vävnaden.
- Stryk ut P. syringae-stammen av intresse från en glycerolstam på en LB-platta (10 g / L trypton, 5 g / L NaCl, 5 g / L jästextrakt och 16 g / L bakteriologisk agar, se materialtabell) kompletterad med lämpliga antibiotika. Inkubera vid 28 °C i 40–48 timmar.
- Utför vakuuminfiltration.
- För Arabidopsis-infiltration, placera två träpinnar som bildar ett X över krukan (figur 1E) och placera krukan nedåt över en petriskål med en diameter på 14 cm som innehåller 200 ml inokulum (figur 1F).
- För ympning av bönblad, för in bladet i ett 50 ml koniskt centrifugrör som innehåller inokulatet (figur 2C).
- Sätt in plantorna nedsänkta i ymplösningen i en vakuumkammare (figur 1G och figur 2D) och ge en puls på 500 mbar i 30 sekunder för att infiltrera bladen. Upprepa vakuumpulsen 2-3 gånger tills bladet är helt infiltrerat (figur 1H och figur 2E).
- Töm överskottslösningen med ett papper och återför växterna till motsvarande tillväxtkammare.
3. Extraktion av bakterier från apoplasten
- Fyra dagar efter ympningen, skär antingen antenndelen av Arabidopsis-växten eller det inokulerade bladet från bönplantan och placera det i en 20 ml spruta utan nål (figur 2G). För bönblad, rulla bladet på sig själv och lämna det abaxiella ansiktet utåt, som visas i figur 2F.
- Tillsätt tillräckligt med volym destillerat vatten för att täcka vävnaden (vanligtvis 10-15 ml).
- För in kolven och ta bort överflödig luft och luftbubblor inuti sprutan med sprutan i vertikalt läge med spetsen uppåt genom att försiktigt knacka på cylindern tills all luft ligger nära spetsen. Skjut sedan kolven för att ta ut luften. När det finns så lite luft som möjligt inuti sprutan, täck spetsen på sprutcylindern med paraffinfilm.
- Tryck försiktigt in kolven för att generera övertryck tills vävnaden blir mörkare (figur 1I och figur 2H). Dra sedan i kolven för att generera undertryck (figur 1J och figur 2I). Upprepa detta steg 3-5 gånger.
- Ta bort paraffinfilmen och kolven och samla upp vätskan som innehåller de apoplastextraherade bakterierna, som i figur 2J.
4. Encellsanalys av de apoplastextraherade bakterierna
- Visualisera med konfokalmikroskopi genom att följa stegen nedan.
- Förbered en 1,5% agaroslösning i destillerat vatten. När det har smält, lägg till tillräckligt med volym för att fylla utrymmet mellan två mikroskopiglas som ligger sida vid sida och placera en annan bild ovanpå den (figur 3). Låt dem torka i 15 minuter och ta försiktigt bort bilden placerad på toppen. Skär agarosdynan i 5 mm x 5 mm bitar precis före användning med ett blad.
- Parallellt centrifugera 1 ml av de apoplastextraherade bakterierna vid 12 000 x g i 1 minut vid rumstemperatur, avlägsna försiktigt supernatanten med en pipett och återsuspendera pelleten i 20 μL vatten för att koncentrera cellerna. Placera en droppe på 2 μl av de koncentrerade cellerna på ett täckglas på 0,17 mm och täck droppen med en 5 mm x 5 mm bit av agarosdynan som tidigare erhållits i steg 1, såsom visas i figur 3.
- Visualisera bakteriepreparatet under konfokalmikroskopet (se materialtabell). För att identifiera grönfluorescerande bakterier, använd excitationslasern vid 488 nm och ett emissionsfilter som sträcker sig från 500 nm till 550 nm. För att identifiera alla bakterier, använd det ljusa fältet och slå samman båda fälten.
- Bearbeta konfokalbilderna med Fiji (se Materialförteckning). För att göra detta, använd MicrobeJ-plugin för att identifiera bakteriecellens kontur och mäta fluorescensintensiteten inom.
OBS: Bildinsamling från isolerade bakterier (ej grupperade) rekommenderas för denna analys.
- Utför analys med flödescytometri.
- Ta en alikvot av de apoplastextraherade bakteriesuspensionerna för att analysera med hjälp av flödescytometern. Skaffa 100 000 evenemang.
- För att skilja mellan bakterier och växtskräp, analysera apoplasten extraherad från en icke-inokulerad växt och jämför punktdiagrammet som visar dess framåtriktade (FSC) cellstorlek kontra sidospridning (SSC) cellstorlek med den apoplastextraherade bakteriesuspensionen. För att identifiera icke-fluorescerande bakterier, använd apoplasterna extraherade från växterna inokulerade med icke-fluorescerande isogena bakterier och jämför deras fluorescerande utsläpp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uttrycket av typ III-sekretionssystemet är avgörande för bakterietillväxt inom växten. Det tidiga uttrycket av T3SS-gener uppnås genom invecklad reglering, i mitten av vilken är den extracytoplasmatiska funktionen (ECF) sigmafaktor HrpL, nyckelaktivatorn för uttrycket av T3SS-relaterade gener11. En analys av uttrycket av hrpL utfördes tidigare med hjälp av en kromosomlokaliserad transkriptionell fusion till en nedströms promotorlös gfp-gen och genom att följa uttrycksmönstren genom konfokalmikroskopi och flödescytometri9. Dessa fusioner genereras genom homolog rekombinationsmedierad integration av plasmidkodade konstruktioner genererade genom PCR och traditionell kloning och bär de sista 500 basparen av ORF av genen av intresse (inklusive STOP-kodon) och 500 baspar av sekvensen omedelbart nedströms, flankerande ribosombindningsstället och ORF för fluorescensrapportgenen som ska användas (i detta fall GFP), följt av en antibiotikaresistenskassett (i detta fall NPT2-genen som ger resistens mot kanamycin). Således fastställdes att apoplastextraherade P. syringae-populationer som uttrycker T3SS-relaterade gener, inklusive hrpL, är heterogena i planta9. På detta prejudikat visas de representativa resultaten av konfokal fluorescensmikroskopi och flödescytometrianalys av hrpL-uttryck i enskilda bakterieceller i modellstammarna Pph 1448A (Pph) och Pto DC3000 (Pto), extraherade från bladen av antingen böna respektive Arabidopsis efter kolonisering av bladapoplasten (figur 4). I varje stam bär P. syringae kromosomala hrpL-genen en nedströms transkriptionell fusion till en promotorlös gfp-gen som möjliggör övervakning av hrpL-infödd promotoraktivitet genom att följa GFP-uttrycksnivåerna 8,9.
Apoplastextraherade bakterier kan användas för olika analyser. Här extraherades 300 μL av de ovan nämnda rapportbakteriestammarna från apoplasten av infekterade Arabidopsis- eller bönplantor och användes för datainsamling med hjälp av ett flödescytometersystem (se materialtabell). Laseremission vid 488 nm och FITC-filtret användes för GFP-detektering. Flödescytometrianalys visar fluorescensfördelningen i enskilda bakterieceller inom populationen. Heterogent uttryck av hrpL kan tydligt observeras genom flödescytometri i Arabidopsis apoplastextraherad Pto och i bönapoplastextraherad Pph, inklusive HrpLOFF (som inte uttrycker GFP) bakterier, och dessa resultat stöds av mikroskopisk undersökning av motsvarande prover (figur 4). Punktdiagrammen (vänstra paneler) visar fördelningen av fluorescensintensiteten för GFP kontra cellstorleken i befolkningen (figur 4A), medan histogrammen visar fluorescensintensiteten för GFP kontra cellantal (figur 4B). Dessa två olika grafiska representationer av cytometridata gör det möjligt för forskaren att skapa subtila visuella nyanser och ge kompletterande information. Som kontroll för bakteriell autofluorescens användes motsvarande icke-GFP-vildtypsstam (övre panelen i figur 4A och grått histogram i figur 4B). Detta gör det möjligt att identifiera grafområdet där icke-GFP-bakterier inom befolkningen visas. Flödescytometrianalyser genererar också kvantitativa data. Som ett exempel extraheras procentandelarna av HrpLON (fluorescerande) celler i apoplastextraherade Pto- och Pph-populationer. Figur 4C visar hur HrpLON-procenten var högre än motsvarande procentandelar av HrpLOFF (icke-fluorescerande) celler i dessa populationer, särskilt i PTO-modellen. Dessa data kan också användas för att beräkna genomsnittlig eller median fluorescens för hela befolkningen. I detta speciella experiment erhölls den genomsnittliga GFP-fluorescensintensiteten, som var högre för PTO-populationen än för Pph, i linje med dess högre andel ON-celler. De genomsnittliga nivåerna utgör data på befolkningsnivå jämförbara med data som erhållits genom icke-encellstekniker såsom RT-q, PCR eller RNAseq. Slutligen visas också den robusta variationskoefficienten (RCV)12, beräknad som den tredje kvartilen minus den första kvartilen dividerad med medianen. RCV används ofta i flödescytometristudier för att uppskatta datadispersion (dvs. heterogenitet av uttrycket inom populationen)13. I den aktuella studien var RCV något högre för Pph än för Pto, även om skillnaden inte var tillräcklig för att karakterisera fördelningen av uttrycket inom populationerna av dessa två stammar som signifikant olika. Heterogeniteten i hrpL-uttrycket kan bekräftas visuellt med konfokalmikroskopibilderna (figur 4D). Användningen av agarkuddar för mikroskopiberedning resulterar i enklare visualisering och högre kvalitetsbilder av de enskilda cellerna eftersom det skjuter bakterierna på ett enda lager och förhindrar bakteriell rörelse. De inokulerings- och bakterieextraktionsprocedurer som beskrivs i detta protokoll minimerar mängden växtskräp i bakteriepreparatet, vilket möjliggör analys av bakterieuttryck med dessa olika tekniker (figur 4).
Figur 1: Bakteriell inokulering och apoplastextraktion med Arabidopsis-växter. (A) Förberedelse av krukan med metallnätet ordentligt fastsatt. b) Så frön med en tandpetare för att fördela dem enligt punkt C. d) Arabidopsis-plantor färdiga för ympning. (E) Två träpinnar underlättar nedsänkningen av växterna i bakterielösningen utan att nå krukan eller jorden (F). (G) Ensemblen kan placeras inuti vakuumkammaren. (H) De infiltrerade bladen blir mörkare efter att vakuumet släppts från kammaren. (I) De fristående bladen placeras i en 20 ml spruta och täcks med vatten. (J) Cykler med positivt och negativt tryck resulterar i extraktion av apoplastiska bakterier. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bakteriell inokulering och apoplastextraktion med bönplantor. (A) Groning av bönfrön i petriskålar klädda med vått toalettpapper. B) Bönplanta klar för ympning. (C) Bönblad nedsänkt i bakterielösningen i ett 50 ml rör. (D) Bladen ympas inuti en vakuumkammare tills vävnaden blir mörkare (E). (F) Bönbladet rullas, läggs i en 20 ml spruta och täcks med vatten (G). (H) Cykler med positivt och negativt tryck (I) resulterar i extraktion av apoplastiska bakterier som kan återvinnas i ett rör (J). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Schematisk framställning av agardynans inställning och beredning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Analys av apoplastextraherade bakterier erhållna från Arabidopsis eller bönblad 4 dagar efter inokulering med P. syringae pv. tomat (Pto) respektive P. syringae pv. phaseolicola (Pph). Uttryck av hrpL::gfp övervakas som GFP-fluorescens. (A) Flödescytometrianalys representeras som ett punktdiagram (framåtspridning [cellstorlek] kontra GFP-fluorescensintensitet). Icke-GFP-bakterier indikerar en vildtypstam av antingen Pto eller Pph. Den vertikala linjen avgränsar 99% av icke-GFP-populationen. (B) Flödescytometrianalys representeras som histogram (cellantal kontra GFP-fluorescensintensitet). Det grå histogrammet representerar den icke-GFP-stammen. (C) Kvantitativa data genererades från flödescytometrianalysen. Procentandelen PÅ- och AV-celler beräknas baserat på fördelningen som visas i punktdiagrammet. Medelvärdet indikerar den genomsnittliga fluorescensen som erhållits i experimentet. Den robusta variationskoefficienten (RCV) beräknas som den tredje kvartilen minus den första kvartilen dividerad med medianen. (D) Fluorescensmikroskopibilder som visar heterogena nivåer av GFP associerade med uttrycket av hrpL. De vita pilarna markerar bakterier som uppvisar låga nivåer eller ingen GFP-fluorescens. Skalstapel: 3 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som presenteras här beskriver ett icke-invasivt förfarande som möjliggör infiltration av bakterier i växtbladvävnaden, vilket möjliggör snabb inokulering av stora volymer samtidigt som vävnadsstörningar minimeras. En av egenskaperna hos P. syringae-artkomplexet är förmågan att överleva och sprida sig inuti växtapoplasten och på växtytan som epifyt14. Således kan möjligheten att bakterierna extraherade med hjälp av detta protokoll endast kommer från växtapoplasten inte uteslutas. Det har dock tidigare visats med hjälp av konfokalmikroskopi att andelen bakterier på bladytan är märkbart liten jämfört med bakterietillväxten inuti växtblad5. Detta kan kontrolleras genom mikroskopisk undersökning av bladytan före extraktion. Dessutom har P. syringae-stammarna som används som modell i detta protokoll, Pto DC3000 och Pph 1448A, visat sig fungera som svaga epifiter15, vilket representerar en irrelevant andel av de extraherade bakterierna. Om metoden skall kunna anpassas till andra patosystem kan det dock bli nödvändigt att i detta protokoll lägga till en föregående etapp för dekontaminering av bladytan.
Traditionella inokuleringsmetoder, såsom bladinfiltration med en spruta16, orsakar större, svårbedömd vävnadsskada på inokuleringsstället, vilket resulterar i vävnadsnekros. Dessutom är mängden skada mycket varierande mellan olika inokuleringspunkter. Olika växtarter varierar också i sin tolerans mot bladinfiltration. Till exempel är Arabidopsisblad lätta att infiltrera, medan bönblad är mer motstridiga. Tillväxtförhållandena påverkar också toleransnivån mot infiltration av en viss art. Mer skonsamma traditionella inokuleringsmetoder, såsom bladdopp eller bladspray, vilket resulterar i en mer naturlig och skadefri bakterieinträde och kolonisering av vävnaden, begränsar emellertid i sig storleken på de erhållna bakteriepopulationerna, ofta under tröskeln som krävs för efterföljande analys av de apoplastiska bakterieproverna5 . Den föreslagna inokuleringsmetoden minskar signifikant aktiveringen av nekros i de inokulerade områdena till följd av spruttryck samtidigt som man undviker begränsning av bakterieprovstorlek och ger ett enkelt, reproducerbart och snabbt sätt att inokulera betydande bladområden.
Vissa tekniker som kräver inokulering av stora vävnadsområden kan vara mycket tids- och arbetskrävande, vilket ökar risken för att orsaka vävnadsskada. Genom att tillämpa denna metod kan vi inokulera fem eller fler Arabidopsis-växter , eller ett helt bönblad, i bara ett steg utan att kompromissa med vävnadsintegriteten. Denna teknik kan anpassas för att inokulera ett större antal växter eller till andra växtarter av agronomiskt eller akademiskt intresse, såsom Nicotiana benthamiana, tomat eller sojabönor. Koncentrationen av ytaktivt ämne, som används för att minska ytvattenspänningen för att underlätta infiltrationen av bakteriesuspensionen, måste justeras och testas i förväg beroende på växtarten, eftersom högre koncentrationer av ytaktivt ämne i vissa fall kan leda till vävnadsnekros. Mängden tryck som appliceras och inokuleringsprocessens varaktighet måste också anpassas till det motstånd som växtbladet erbjuder hos olika arter för att säkerställa optimala resultat.
När det gäller apoplastutvinning minimerar den nuvarande metoden också vävnadsstörningar, vilket minskar mängden växtskräp som finns i det extraherade provet. Detta möjliggör renare prover, vilket resulterar i effektivare analys genom olika tekniker såsom RNA-seq, flödescytometri eller mikroskopi, som visas i exemplet. Återhämtning av den patogena bakteriepopulationen från dess apoplastiska miljö med minimal vävnads- och växtcellsstörning är utmanande. P. syringae koloniserar apoplastens intercellulära utrymmen och bildar mikrokolonier. Användning av en extracellulär patogen, såsom P. syringae, möjliggör metoder som den som presenteras här, eftersom vävnads- och cellstörningar inte krävs för bakteriell återhämtning. Omgångarna av positivt och negativt tryck stör mikrokolonierna, sprider bakterierna och tillåter deras enkla och snabba extraktion genom naturliga öppningar (stomata), vilket undviker förändringar i genuttryck som kan följa långa inkubationstider, såsom de som krävs för mer skonsamma metoder för apoplastisk återhämtning. Mikroskopisk undersökning av kvarvarande växtvävnad stöder avlägsnandet av större delen av bakteriepopulationen. Apoplastiska vätskeextraktionsprotokoll har använts i stor utsträckning för att studera komplexiteten hos den apoplastiska vätskan17. Dessa protokoll innehåller ett sista steg av centrifugering för att ytterligare rena den apoplastiska vätskan som återvinns. Här användes istället mjuka cykler av positivt och negativt tryck med sprutkolven, vilket minskade provkontaminering med värdcellulärt skräp samtidigt som det hade mycket liten inverkan på effektiviteten av bakteriell återhämtning. En klassisk mild bakteriell extraktionsmetod består av inkubation av bladskivor eller plantor med ett ytaktivt medel i 1-2 h18. Denna metod är inte lika effektiv som den som presenteras här för att extrahera bakterier; Dess huvudsakliga begränsning för genuttrycksanalys är emellertid effekten av den erforderliga inkubationstiden på befolkningens uttrycksprofil. Den metod som härmed presenteras möjliggör snabb återhämtning och omedelbar analys av den apoplastiska populationen, vilket minskar risken för att kringgå genuttrycksresultat på cellulär nivå.
Fenotypisk heterogenitet hos patogena bakterier har studerats i stor utsträckning med användning av homogena laboratoriemedier. Att studera bakteriepopulationer som odlas i sin naturliga nisch är ofta begränsade på grund av tekniska hinder, såsom svårigheten att återställa bakteriepopulationer utan överdriven kontaminering med värdcellskräp som stör nedströms encellsanalyser. Denna kombinerade metod för ympning och extraktion möjliggör helt och hållet generering av stora apoplastiska populationer av bakteriella patogener för encellsanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av projektbidrag RTI2018-095069-B-I00 finansierat av MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ och av "ERDP: Ett sätt att skapa Europa". JSR finansierades av Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. finansierades av Project Grant P18-RT-2398 från Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
- Weigel, W. A., Dersch, P. Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy. Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).
- Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Morris, C. E., et al. The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle. The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).
- Rufián, J. S., et al. Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains. Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).
- Macho, A. P. Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity. New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).
- Xiao, Y., Hutcheson, S. W. A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae. Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).
- Rufián, J. S., et al. Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae. Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).
- Rufian, J. S., et al. Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host. Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
- Fouts, D. E., et al. Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).
- Huber, P. J. Robust Statistics. , Wiley. New York, NY. (1981).
- Freed, N. E., et al. A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise. PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).
- Hirano, S. S., Upper, C. D. Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).
- Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization. Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).
- Liu, X., et al. Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).
- O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example. Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).
