Summary
В настоящем протоколе описывается способ, который позволяет проводить анализ экспрессии одноклеточных генов в популяциях Pseudomonas syringae , выращенных в апопласте растения.
Abstract
Множество патогенных микроорганизмов постоянно атакуют растения. Видовой комплекс Pseudomonas syringae включает грамотрицательные растительно-патогенные бактерии, имеющие особое значение для широкого круга хозяев. P. syringae проникает в растение с поверхности листа и быстро размножается внутри апопласта, образуя микроколонии, занимающие межклеточное пространство. Конститутивная экспрессия флуоресцентных белков бактериями позволяет визуализировать микроколонии и отслеживать развитие инфекции на микроскопическом уровне. Последние достижения в области анализа отдельных клеток выявили большую сложность, достигаемую клональными изогенными бактериальными популяциями. Эта сложность, называемая фенотипической гетерогенностью, является следствием межклеточных различий в экспрессии генов (не связанных с генетическими различиями) среди бактериального сообщества. Для анализа экспрессии отдельных локусов на одноклеточном уровне широко использовались транскрипционные слияния с флуоресцентными белками. В стрессовых условиях, таких как те, которые возникают во время колонизации растительного апопласта, P. syringae дифференцируется в отдельные субпопуляции, основанные на гетерогенной экспрессии ключевых генов вирулентности (т.е. системы секреции Hrp типа III). Тем не менее, одноклеточный анализ любой данной популяции P. syringae , извлеченной из растительной ткани, затруднен из-за клеточного мусора, высвобождаемого во время механического разрушения, присущего процессам инокуляции и бактериальной экстракции. В настоящем докладе подробно описывается метод, разработанный для мониторинга экспрессии генов P. syringae , представляющих интерес, на одноклеточном уровне во время колонизации арабидопсиса и бобовых растений. Описана подготовка растений и бактериальных суспензий, используемых для инокуляции с помощью вакуумной камеры. Здесь также объясняется восстановление эндофитных бактерий из зараженных листьев путем экстракции апопластической жидкости. Методы бактериальной инокуляции и бактериальной экстракции эмпирически оптимизированы для минимизации повреждения растений и бактериальных клеток, в результате чего получаются бактериальные препараты, оптимальные для микроскопии и анализа проточной цитометрии.
Introduction
Патогенные бактерии проявляют различия в различных фенотипах, что приводит к образованию субпопуляций в генетически идентичных популяциях. Это явление известно как фенотипическая гетерогенность и было предложено в качестве стратегии адаптации во время взаимодействия бактерий с хозяином1. Последние достижения в области оптического разрешения конфокальных микроскопов, проточной цитометрии и микрофлюидики в сочетании с флуоресцентными белками способствовали одноклеточному анализу бактериальных популяций2.
Грамотрицательная синегнойная палочка Pseudomonas syringae является архетипической патогенной бактерией растений из-за ее академического и экономического значения3. Жизненный цикл P. syringae связан с водным циклом4. P. syringae проникает в межклеточные промежутки между клетками мезофилла, апопластом листа растения, через естественные отверстия, такие как устьица или раны5. Попав в апопласт, P. syringae полагается на систему секреции III типа (T3SS) и транслоцированные эффекторы III типа (T3E) для подавления иммунитета растений и манипулирования клеточными функциями растений в интересах патогена6. Экспрессия T3SS и T3E зависит от главного регулятора HrpL, альтернативного сигма-фактора, который связывается с мотивами hrp-бокса в промоторной области генов-мишеней7.
Генерируя расположенные в хромосомах слияния транскрипции с генами флуоресцентных белков ниже по течению от интересующего гена, можно контролировать экспрессию генов на основе уровней флуоресценции, испускаемых на уровне8 отдельных клеток. С помощью этого метода установлено, что экспрессия hrpL неоднородна как в бактериальных культурах, выращенных в лаборатории, так и в бактериальных популяциях, извлеченных из растительного апопласта 8,9. Хотя анализ экспрессии генов на уровне отдельных клеток обычно проводится в бактериальных культурах, выращенных в лабораторных средах, такие анализы также могут проводиться на бактериальных популяциях, растущих внутри растения, что дает ценную информацию о формировании субпопуляций в естественном контексте. Потенциальным ограничением для анализа бактериальных популяций, извлеченных из растения, является то, что классические методы инокуляции путем инфильтрации под давлением шприца в апопласт с последующей бактериальной экстракцией путем мацерации ткани листа обычно генерируют большое количество клеточных растительных остатков, которые мешают последующему анализу10. Большая часть клеточного мусора состоит из автофлуоресцентных фрагментов хлоропластов, которые перекрываются флуоресценцией GFP, что приводит к вводящим в заблуждение результатам.
Настоящий протокол описывает процесс анализа гетерогенности экспрессии одноклеточных генов в двух модельных патосистемах: той, которая сформирована P. syringae pv. штамм томатов DC3000 и Arabidopsis thaliana (Col-0), а другой - P. syringae pv. фазоликола штамма 1448А и бобовые растения (сорт Phaseolus vulgaris Canadian Wonder). Предложен метод инокуляции, основанный на вакуумной инфильтрации с использованием вакуумной камеры и насоса, что позволяет быстро и без повреждений проникать в целые листья. Кроме того, в качестве улучшения по сравнению с традиционными протоколами используется более щадящий метод извлечения бактериальной популяции из апопласта, который значительно уменьшает разрушение тканей, основанный на извлечении апопластической жидкости путем применения циклов положительного и отрицательного давления с использованием небольшого объема в шприце.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка растений
- Подготовьте растения Arabidopsis Col-0, выполнив следующие действия.
- Заполните горшок диаметром 10 см предварительно политой смесью субстрата из вермикулита и растений (см. Таблицу материалов) и накройте горшок металлической сеткой размером 15 см х 15 см с отверстиями 1,6 мм х 1,6 мм. Приспособьте металлическую сетку к влажной почве с помощью резинки (рис. 1А).
- Влажной зубочисткой посейте семена арабидопсиса в отверстия металлической сетки. Поместите три-четыре семени в отдаленные места в горшке (рис. 1B, C).
- Накройте горшки пластиковым куполом для поддержания высокой относительной влажности и инкубируйте их в течение 72 ч при температуре 4 °C для стратификации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стратификация (инкубация при высокой влажности и низкой температуре, как описано) улучшает всхожесть и синхронность семян. - Перенесите горшки в камеру для выращивания растений в условиях короткого дня (8 ч света / 16 ч темноты при 21 ° C, интенсивность света: 100 мкмоль · м − 2 · с − 1, относительная влажность воздуха: 70 %).
- После прорастания семян (через 8-10 дней) пинцетом удалите большую часть рассады, держа по одному саженцу в каждом из положений горшка (шесть сеянцев/горшок) (рисунок 1D). Снимите пластиковый купол, чтобы открыть горшки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Растения будут готовы к употреблению через 4-5 недель после появления всходов.
- Подготовьте растения фасоли Phaseolus vulgaris (сорт канадского чуда).
- Накройте дно чашки Петри влажным куском бумаги для полотенец и положите на него семена фасоли. Запечатайте чашку Петри хирургической лентой и инкубируйте при 28 °C в течение 3-4 дней (рис. 2A).
- Переложите пророщенные семена в горшок диаметром 10 см, заполненный влажной смесью субстрата из вермикулита и растений в соотношении 1:3.
- Инкубация в камере для выращивания растений в условиях длительного дня (16 ч света / 8 ч темноты при 23 ° C, интенсивность света: 100 мкмоль · м − 2 · с − 1, относительная влажность: 70 %).
ПРИМЕЧАНИЕ: Растения будут готовы к использованию через 10 дней после появления всходов (рис. 2B).
2. Инокуляция арабидопсиса и бобовых растений
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании штаммы P. syringae pv. томат DC3000 и P. syringae pv. Использовались фазоликолы 1448А.
- Подготовьте посевной материал P. syringae.
- Выведите интересующий штамм P. syringae из запаса глицерина при температуре -80 °C на планшет LB (10 г/л триптона, 5 г/л NaCl, 5 г/л дрожжевого экстракта и 16 г/л бактериологического агара, см. Таблицу материалов) с добавлением соответствующих антибиотиков. Инкубировать при 28 °C в течение 40-48 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование антибиотиков рекомендуется, если интересующий штамм несет ген плазмиды или геномной резистентности. Рекомендуемые концентрации антибиотиков для P. syringae следующие: канамицин (15 мкг/мл), гентамицин (10 мкг/мл), ампициллин (300 мкг/мл) (см. Таблицу материалов). - Соскребите бактериальную биомассу и ресуспендируют в 5 мл 10 мМ MgCl2. Измерьте OD600 и отрегулируйте до 0,1, добавив 10 мМ MgCl2.
ПРИМЕЧАНИЕ: OD600 0,1 культуры P. syringae соответствует 5 x 107 КОЕ·мл-1. - Проводят серийные разведения в 10 мМ MgCl2 для достижения конечной концентрации инокулята 5 x 105 КОЕ·мл-1. Приготовьте 200 мл инокулята для растений арабидопсиса и 50 мл для бобовых.
- Непосредственно перед инокуляцией добавьте поверхностно-активное вещество Silwett L-77 (см. Таблицу материалов) до конечной концентрации 0,02% для инокуляции фасоли и 0,01% для арабидопсиса. Обратите внимание, что Silwett несколько вреден для тканей Arabidopsis.
- Выведите интересующий штамм P. syringae из запаса глицерина при температуре -80 °C на планшет LB (10 г/л триптона, 5 г/л NaCl, 5 г/л дрожжевого экстракта и 16 г/л бактериологического агара, см. Таблицу материалов) с добавлением соответствующих антибиотиков. Инкубировать при 28 °C в течение 40-48 часов.
- Выполните вакуумную инфильтрацию.
- Для инфильтрации арабидопсиса поместите две деревянные палочки, образующие X, над горшком (рис. 1E) и поместите горшок лицевой стороной вниз на чашку Петри диаметром 14 см, содержащую инокулят объемом 200 мл (рис. 1F).
- Для инокуляции листьев фасоли вводите лист в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую инокулят (рис. 2C).
- Вставьте растения, погруженные в раствор инокулята, в вакуумную камеру (рис. 1G и рис . 2D) и дайте импульс 500 мбар в течение 30 с, чтобы проникнуть в листья. Повторите вакуумный импульс 2-3 раза до полного проникновения листа (рис. 1H и рис. 2E).
- Слейте излишки инокуляционного раствора с помощью листа бумаги и верните растения в соответствующую камеру роста.
3. Извлечение бактерий из апопласта
- Через четыре дня после инокуляции срежьте надземную часть растения Arabidopsis или привитый лист с растения фасоли и поместите его в шприц объемом 20 мл без иглы (рис. 2G). Для листьев фасоли сверните лист на себя, оставляя абаксиальную поверхность наружу, как показано на рисунке 2F.
- Добавьте достаточный объем дистиллированной воды, чтобы покрыть ткань (обычно 10-15 мл).
- Вставьте поршень и, установив шприц в вертикальном положении наконечником вверх, удалите лишний воздух и пузырьки воздуха внутри шприца, осторожно постукивая по стволу, пока весь воздух не окажется рядом с наконечником. Затем сдвиньте поршень, чтобы выпустить воздух. Как только внутри шприца останется как можно меньше воздуха, накройте наконечник цилиндра шприца парафиновой пленкой.
- Осторожно нажимайте на поршень, чтобы создать положительное давление, пока ткань не потемнеет (рис. 1I и рис. 2H). Затем потяните за поршень, чтобы создать отрицательное давление (рис. 1J и рис. 2I). Повторите этот шаг 3-5 раз.
- Удалите парафиновую пленку и поршень и соберите жидкость, содержащую бактерии, экстрагированные апопластом, как показано на рисунке 2J.
4. Одноклеточный анализ бактерий, экстрагированных апопластом
- Визуализируйте с помощью конфокальной микроскопии, выполнив следующие действия.
- Приготовьте 1,5%-ный раствор агарозы в дистиллированной воде. После плавления добавьте достаточно объема, чтобы заполнить пространство между двумя предметными стеклами микроскопии, установленными рядом, и поместите на него еще одно предметное стекло (рис. 3). Дайте им высохнуть в течение 15 минут и осторожно снимите горку, установленную сверху. С помощью лезвия разрежьте агарозную подушечку на кусочки размером 5 мм х 5 мм непосредственно перед использованием.
- Параллельно центрифугируют 1 мл экстрагированных апопластом бактерий в дозе 12 000 x g в течение 1 мин при комнатной температуре, осторожно удаляют надосадочную жидкость с помощью пипетки и ресуспендируют гранулу в 20 мкл воды для концентрации клеток. Поместите каплю концентрированных клеток объемом 2 мкл на покровное стекло толщиной 0,17 мм и накройте каплю кусочком агарозной прокладки размером 5 мм x 5 мм, ранее полученной на шаге 1, как показано на рисунке 3.
- Визуализируйте бактериальный препарат под конфокальным микроскопом (см. Таблицу материалов). Для идентификации зелено-флуоресцентных бактерий используют возбуждающий лазер на длине волны 488 нм и эмиссионный фильтр в диапазоне от 500 до 550 нм. Чтобы идентифицировать все бактерии, используйте светлое поле и объедините оба поля.
- Обработайте конфокальные изображения с помощью Фиджи (см. Таблицу материалов). Для этого используйте плагин MicrobeJ для определения контура бактериальной клетки и измерения интенсивности флуоресценции внутри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого анализа рекомендуется получение изображений от изолированных бактерий (не кластеризованных).
- Проведите анализ методом проточной цитометрии.
- Возьмите аликвоту суспензий бактерий, экстрагированных апопластом, для анализа с помощью проточного цитометра. Приобретите 100 000 событий.
- Чтобы различать бактерии и растительные остатки, проанализируйте апопласт, извлеченный из неинокулированного растения, и сравните точечную диаграмму, показывающую размер клеток прямого рассеяния (FSC) по сравнению с размером клеток бокового рассеяния (SSC) с размером бактериальной суспензии, экстрагированной апопластом. Для идентификации нефлуоресцентных бактерий используют апопласты, извлеченные из растений, инокулированных нефлуоресцентными изогенными бактериями, и сравнивают их флуоресцентные излучения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Экспрессия системы секреции III типа имеет важное значение для роста бактерий в растении. Своевременная экспрессия генов T3SS достигается за счет сложной регуляции, в центре которой находится экстрацитоплазматический функционал (ECF) сигма-фактор HrpL, ключевой активатор экспрессии генов, связанных с T3SS11. Ранее был проведен анализ экспрессии hrpL с использованием расположенного в хромосоме транскрипционного слияния с нижестоящим геном gfp без промотора и путем отслеживания паттернов экспрессии с помощью конфокальной микроскопии и проточной цитометрии9. Эти слияния генерируются путем гомологичной рекомбинационно-опосредованной интеграции плазмидно-кодируемых конструкций, генерируемых с помощью ПЦР и традиционного клонирования, и несут последние 500 пар оснований ORF интересующего гена (включая кодон STOP) и 500 пар оснований последовательности непосредственно ниже по течению, фланкируя сайт связывания рибосомы и ORF гена-репортера флуоресценции, который будет использоваться (в данном случае GFP), за которым следует кассета с устойчивостью к антибиотикам (в данном случае ген NPT2, придающий устойчивость к канамицину). Таким образом, установлено, что экстрагированные апопластом популяции P. syringae, экспрессирующие гены, связанные с T3SS, включая hrpL, неоднородны в planta9. На этом прецеденте репрезентативные результаты конфокальной флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии экспрессии hrpL показаны в отдельных бактериальных клетках модельных штаммов Pph 1448A (Pph) и Pto DC3000 (Pto), выделенных из листьев фасоли или арабидопсиса соответственно после колонизации листового апопласта (рис. 4). В каждом штамме хромосомный ген hrpL P. syringae осуществляет нисходящее транскрипционное слияние с геном gfp без промотора, что позволяет контролировать активность нативного промотора hrpL, следуя уровням экспрессии GFP 8,9.
Бактерии, экстрагированные апопластом, могут быть использованы для различных анализов. Здесь 300 мкл вышеупомянутых репортерных бактериальных штаммов были извлечены из апопласта инфицированных растений арабидопсиса или фасоли и использованы для сбора данных с помощью системы проточного цитометра (см. Таблицу материалов). Для детектирования GFP использовалось лазерное излучение на длине волны 488 нм и фильтр FITC. Анализ проточной цитометрии показывает распределение флуоресценции в отдельных бактериальных клетках в популяции. Гетерогенную экспрессию hrpL можно четко наблюдать с помощью проточной цитометрии в Pto, экстрагированном апопластом Arabidopsis, и в Pph, экстрагированном бобовым апопластом, включая бактерии HrpLOFF (не экспрессирующие GFP), и эти результаты подтверждаются микроскопическим исследованием соответствующих образцов (рис. 4). Точечные графики (левые панели) показывают распределение интенсивности флуоресценции GFP в зависимости от размера клеток в популяции (рис. 4A), а гистограммы показывают интенсивность флуоресценции GFP в зависимости от количества клеток (рис. 4B). Эти два различных графических представления данных цитометрии позволяют исследователю установить тонкие визуальные нюансы и предоставить дополнительную информацию. В качестве контроля бактериальной автофлуоресценции использовался соответствующий штамм дикого типа, не относящийся к GFP (верхняя панель на рисунке 4A и серая гистограмма на рисунке 4B). Это позволяет идентифицировать область графика, где отображаются бактерии, не относящиеся к GFP, в популяции. Анализы проточной цитометрии также генерируют количественные данные. Например, процентное содержание HrpLON (флуоресцентных) клеток экстрагируется в экстрагированных апопластами популяциях Pto и Pph. На рисунке 4C показано, как процентное содержание HrpLON было выше, чем соответствующее процентное содержание HrpLOFF (нефлуоресцентных) клеток в этих популяциях, особенно в модели Pto. Эти данные также могут быть использованы для расчета средней или медианной флуоресценции для всей популяции. В этом конкретном эксперименте была получена средняя интенсивность флуоресценции GFP, которая была выше для популяции Pto, чем для Pph, в соответствии с более высоким процентом клеток ON. Средние уровни представляют собой данные на уровне популяции, сопоставимые с данными, полученными с помощью неодноклеточных методов, таких как ПЦР RT-qили RNAseq. Наконец, также показан робастный коэффициент вариации (RCV)12, вычисляемый как третий квартиль минус первый квартиль, деленный на медиану. RCV часто используется в исследованиях проточной цитометрии для оценки дисперсии данных (т. е. гетерогенности экспрессии в популяции)13. В текущем исследовании RCV был несколько выше для Pph, чем для Pto, хотя разница была недостаточной, чтобы охарактеризовать распределение экспрессии в популяциях этих двух штаммов как значительно различающееся. Гетерогенность экспрессии hrpL может быть визуально подтверждена изображениями конфокальной микроскопии (рис. 4D). Использование агаровых подушечек для подготовки к микроскопии приводит к более легкой визуализации и более качественным изображениям отдельных клеток, поскольку они выталкивают бактерии на один слой и предотвращают движение бактерий. Процедуры инокуляции и бактериальной экстракции, описанные в этом протоколе, сводят к минимуму количество растительных остатков в бактериальном препарате, что позволяет анализировать экспрессию бактерий с помощью этих различных методов (рис. 4).
Рисунок 1: Бактериальная инокуляция и экстракция апопласта с использованием растений Arabidopsis. (А) Подготовка горшка с правильно прикрепленной металлической сеткой. (B) Посев семян с помощью зубочистки для их распределения, как указано в пункте (C). (D) Растения арабидопсиса, готовые к инокуляции. (E) Две деревянные палочки облегчают погружение растений в бактериальный раствор, не достигая горшка или почвы (F). (G) Ансамбль может быть помещен внутрь вакуумной камеры. (H) Инфильтрированные листья становятся темнее после высвобождения вакуума из камеры. (I) Отделенные листья помещают в шприц объемом 20 мл и заливают водой. (J) Циклы положительного и отрицательного давления приводят к экстракции апопластических бактерий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Бактериальная инокуляция и экстракция апопласта с использованием бобовых растений. (А) Проращивание семян фасоли в чашках Петри, выстланных влажной туалетной бумагой. (B) Бобовое растение готово к инокуляции. (C) Лист фасоли, погруженный в бактериальный раствор, содержащийся в пробирке объемом 50 мл. (D) Листья инокулируют в вакуумной камере до тех пор, пока ткань не станет темнее (E). (F) Лист фасоли сворачивают, помещают в шприц объемом 20 мл и заливают водой (G). (H) Циклы положительного и отрицательного давления (I) приводят к экстракции апопластических бактерий, которые могут быть извлечены в трубку (J). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Схематическое изображение установки и подготовки агаровой прокладки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ экстрагированных апопластом бактерий, полученных из листьев арабидопсиса или фасоли через 4 дня после инокуляции P. syringae pv. томат (Pto) или P. syringae pv. phaseolicola (Pph) соответственно. Экспрессия hrpL::gfp контролируется как флуоресценция GFP. (A) Анализ проточной цитометрии представлен в виде точечной диаграммы (прямое рассеяние [размер клетки] в зависимости от интенсивности флуоресценции GFP). Бактерии, не относящиеся к GFP, указывают на штамм дикого типа Pto или Pph. Вертикальная линия разграничивает 99% населения, не являющегося GFP. (B) Анализ проточной цитометрии представлен в виде гистограмм (количество клеток в зависимости от интенсивности флуоресценции GFP). Серая гистограмма представляет штамм, не относящийся к GFP. (C) Количественные данные были получены на основе анализа проточной цитометрии. Процентное соотношение ячеек ВКЛ и ВЫКЛ рассчитывается на основе распределения, показанного на точечной диаграмме. Среднее значение указывает на среднюю флуоресценцию, полученную в эксперименте. Робастный коэффициент вариации (RCV) рассчитывается как третий квартиль минус первый квартиль, деленный на медиану. (D) Изображения флуоресцентной микроскопии, показывающие гетерогенные уровни GFP, связанные с экспрессией hrpL. Белыми стрелками выделены бактерии, демонстрирующие низкий уровень или отсутствующие флуоресценцию GFP. Масштабная линейка: 3 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный здесь способ описывает неинвазивную процедуру, которая позволяет инфильтрации бактерий в ткани листвы растений, что позволяет быстро инокуляцию больших объемов, сводя к минимуму разрушение тканей. Одной из характеристик видового комплекса P. syringae является способность выживать и размножаться внутри апопласта растения и на поверхности растения в качестве эпифита14. Таким образом, нельзя исключать возможность того, что бактерии, извлеченные с использованием настоящего протокола, происходят только из растения апопласта. Однако ранее с помощью конфокальной микроскопии было продемонстрировано, что доля бактерий на поверхности листа заметно мала по сравнению с ростом бактерий внутри листа5 растения. Это можно проверить с помощью микроскопического исследования поверхности листа перед извлечением. Кроме того, было показано, что штаммы P. syringae , используемые в качестве модели в настоящем протоколе, Pto DC3000 и Pph 1448A, действуют как слабые эпифиты15, представляющие собой несущественную долю экстрагированных бактерий. Тем не менее, если метод должен быть адаптирован к другим патосистемам, в настоящий протокол, возможно, потребуется добавить предшествующий этап обеззараживания поверхности листьев.
Традиционные методы инокуляции, такие как инфильтрация листьев с помощью шприца16, вызывают более крупное, трудно поддающееся оценке повреждение тканей в месте инокуляции, что приводит к некрозу тканей. Более того, количество повреждений очень варьируется в зависимости от разных точек прививки. Кроме того, различные виды растений различаются по своей устойчивости к инфильтрации листьев. Например, листья арабидопсиса легко проникают, в то время как листья фасоли более непокорны. Условия произрастания также влияют на уровень толерантности к инфильтрации данного вида. Однако более щадящие традиционные методы инокуляции, такие как погружение листьев или опрыскивание листьев, приводящие к более естественному и свободному от повреждений проникновению бактерий и колонизации ткани, по своей сути ограничивают размер получаемых бактериальных популяций, часто ниже порога, необходимого для последующего анализа апопластических бактериальных образцов5 . Предлагаемый метод инокуляции значительно снижает активацию некроза в инокулированных участках, возникающую в результате давления шприца, избегая при этом ограничения размера бактериального образца, и обеспечивает простой, воспроизводимый и быстрый способ инокуляции значительных площадей листьев.
Некоторые методы, требующие инокуляции больших участков тканей, могут быть очень трудоемкими и трудоемкими, увеличивая вероятность повреждения тканей. Применяя этот метод, мы можем привить пять или более растений арабидопсиса или целый лист фасоли всего за один шаг без ущерба для целостности тканей. Этот метод может быть адаптирован для инокуляции большего числа растений или других видов растений, представляющих агрономический или академический интерес, таких как Nicotiana benthamiana, томат или соя. Концентрация поверхностно-активного вещества, используемого для снижения поверхностного натяжения воды для облегчения инфильтрации бактериальной суспензии, должна быть заранее скорректирована и протестирована в зависимости от вида растения, так как более высокие концентрации поверхностно-активного вещества могут в некоторых случаях привести к некрозу тканей. Кроме того, величина оказываемого давления и продолжительность процесса инокуляции должны быть отрегулированы в соответствии с сопротивлением, оказываемым листом растения у разных видов, чтобы обеспечить оптимальные результаты.
Что касается экстракции апопластов, текущий метод также сводит к минимуму разрушение тканей, тем самым уменьшая количество растительных остатков, присутствующих в извлеченном образце. Это позволяет получать более чистые образцы, что приводит к более эффективному анализу с помощью различных методов, таких как секвенирование РНК, проточная цитометрия или микроскопия, как показано в примере. Восстановление популяции патогенных бактерий из апопластической среды с минимальным разрушением тканей и растительных клеток является сложной задачей. P. syringae колонизирует межклеточные пространства апопласта, образуя микроколонии. Использование внеклеточного патогена, такого как P. syringae, позволяет использовать методы, подобные представленному здесь, поскольку разрушение тканей и клеток не требуется для восстановления бактерий. Раунды положительного и отрицательного давления действительно разрушают микроколонии, рассеивая бактерии и позволяя их легко и быстро извлекать через естественные отверстия (устьица), избегая любых изменений в экспрессии генов, которые могут сопровождать длительное время инкубации, например, те, которые необходимы для более щадящих методов апопластического восстановления. Микроскопическое исследование остатков растительной ткани поддерживает удаление большей части бактериальной популяции. Протоколы экстракции апопластической жидкости широко используются для изучения сложности апопластической жидкости17. Эти протоколы содержат заключительный этап центрифугирования для дальнейшей очистки восстановленной апопластической жидкости. Здесь вместо этого использовались мягкие циклы положительного и отрицательного давления с использованием поршня шприца, что уменьшало загрязнение образца клеточным мусором, при этом оказывая очень незначительное влияние на эффективность восстановления бактерий. Один классический щадящий метод бактериальной экстракции заключается в инкубации листовых дисков или сеянцев с поверхностно-активным веществом в течение 1-2 ч18. Этот метод не так эффективен, как представленный здесь для извлечения бактерий; Однако его основным ограничением для анализа экспрессии генов является влияние требуемого времени инкубации на профиль экспрессии популяции. Представленный способ позволяет быстро восстановить и немедленно проанализировать апопластическую популяцию, тем самым снижая риск обхода результатов экспрессии генов на клеточном уровне.
Фенотипическая гетерогенность патогенных бактерий широко изучена с использованием однородных лабораторных сред. Изучение бактериальных популяций, выращенных в их естественной нише, часто ограничено из-за технических барьеров, таких как сложность восстановления бактериальных популяций без чрезмерного загрязнения обломками клеток-хозяев, которые мешают последующему анализу отдельных клеток. Этот комбинированный метод инокуляции и экстракции в целом позволяет генерировать большие апопластические популяции бактериальных патогенов для одноклеточного анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом проекта RTI2018-095069-B-I00, финансируемым MCIN/AEI/10.13039/501100011033/, и «ERDP: способ сделать Европу». J.S.R. финансировался Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. финансировался за счет гранта проекта P18-RT-2398 от Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
- Weigel, W. A., Dersch, P. Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy. Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).
- Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Morris, C. E., et al. The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle. The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).
- Rufián, J. S., et al. Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains. Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).
- Macho, A. P. Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity. New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).
- Xiao, Y., Hutcheson, S. W. A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae. Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).
- Rufián, J. S., et al. Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae. Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).
- Rufian, J. S., et al. Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host. Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
- Fouts, D. E., et al. Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).
- Huber, P. J. Robust Statistics. , Wiley. New York, NY. (1981).
- Freed, N. E., et al. A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise. PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).
- Hirano, S. S., Upper, C. D. Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).
- Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization. Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).
- Liu, X., et al. Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).
- O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example. Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).
