Summary
Bu protokol, bitki apoplastı içinde yetiştirilen Pseudomonas şırıngası popülasyonları üzerinde tek hücreli gen ekspresyon analizine izin veren bir yöntemi açıklamaktadır.
Abstract
Patojenik mikroorganizmaların bolluğu sürekli olarak bitkilere saldırır. Pseudomonas syringae tür kompleksi, çok sayıda konakçı için özel öneme sahip Gram-negatif bitki-patojenik bakterileri kapsar. P. syringae bitkiye yaprak yüzeyinden girer ve apoplast içinde hızla çoğalarak hücreler arası boşluğu işgal eden mikrokoloniler oluşturur. Floresan proteinlerin bakteriler tarafından yapısal ekspresyonu, mikrokolonilerin görselleştirilmesine ve enfeksiyonun gelişiminin mikroskobik düzeyde izlenmesine izin verir. Tek hücreli analizdeki son gelişmeler, klonal izojenik bakteri popülasyonlarının ulaştığı büyük karmaşıklığı ortaya koymuştur. Fenotipik heterojenite olarak adlandırılan bu karmaşıklık, bakteri topluluğu arasındaki gen ekspresyonundaki (genetik farklılıklarla bağlantılı olmayan) hücreden hücreye farklılıkların sonucudur. Tek hücreli düzeyde bireysel lokusların ekspresyonunu analiz etmek için, floresan proteinlere transkripsiyonel füzyonlar yaygın olarak kullanılmaktadır. Bitki apoplastının kolonizasyonu sırasında meydana gelenler gibi stres koşulları altında, P. syringae , anahtar virülans genlerinin heterojen ekspresyonuna (yani, Hrp tip III sekresyon sistemi) dayanarak farklı alt popülasyonlara ayrılır. Bununla birlikte, bitki dokusundan geri kazanılan herhangi bir P. şırınga popülasyonunun tek hücreli analizi, aşılama ve bakteriyel ekstraksiyon işlemlerine özgü mekanik bozulma sırasında salınan hücresel enkaz nedeniyle zordur. Bu rapor, Arabidopsis ve fasulye bitkilerinin kolonizasyonu sırasında ilgilenilen P. syringae genlerinin ekspresyonunu tek hücre düzeyinde izlemek için geliştirilen bir yöntemi detaylandırmaktadır. Bitkilerin hazırlanması ve bir vakum odası kullanılarak aşılama için kullanılan bakteriyel süspansiyonlar açıklanmaktadır. Endofitik bakterilerin apoplastik sıvı ekstraksiyonu ile enfekte olmuş yapraklardan geri kazanımı da burada açıklanmaktadır. Hem bakteriyel aşılama hem de bakteriyel ekstraksiyon yöntemleri, bitki ve bakteri hücresi hasarını en aza indirmek için ampirik olarak optimize edilmiştir, bu da mikroskopi ve akış sitometri analizi için en uygun bakteriyel preparatlarla sonuçlanır.
Introduction
Patojenik bakteriler, çeşitli fenotiplerde farklılıklar göstererek, genetik olarak özdeş popülasyonlarda alt popülasyonların oluşumuna yol açar. Bu fenomen fenotipik heterojenite olarak bilinir ve bakteriyel-konakçı etkileşimleri sırasında bir adaptasyon stratejisi olarak önerilmiştir1. Konfokal mikroskopların, akış sitometrisinin ve mikroakışkanların optik çözünürlüğündeki son gelişmeler, floresan proteinlerle birleştiğinde, bakteri popülasyonlarının tek hücreli analizlerini teşvik etmiştir2.
Gram-negatif Pseudomonas şırıngası, hem akademik hem de ekonomik önemi nedeniyle arketipik bir bitki patojenik bakterisidir3. P. syringae'nin yaşam döngüsüsu döngüsü 4 ile bağlantılıdır. P. syringae, mezofil hücreleri, bitki yaprağı apoplastı arasındaki hücreler arası boşluklara, stoma veya yaralar gibi doğal açıklıklardan girer5. Apoplastın içine girdikten sonra, P. syringae, bitki bağışıklığını baskılamak ve patojen6'nın yararına bitki hücresel fonksiyonlarını manipüle etmek için tip III sekresyon sistemine (T3SS) ve tip III-translokasyonlu efektörlere (T3E) güvenir. T3SS ve T3E'nin ekspresyonu, hedef genlerinpromotör bölgesindeki hrp-box motiflerine bağlanan alternatif bir sigma faktörü olan ana düzenleyici HrpL'ye bağlıdır 7.
İlgili genin aşağı yönündeki floresan protein genlerine kromozom yerleşimli transkripsiyonel füzyonlar üreterek, tek hücreli seviye8'de yayılan floresan seviyelerine dayanarak gen ekspresyonunu izleyebiliriz. Bu yöntem kullanılarak, hrpL ekspresyonunun hem laboratuvarda yetiştirilen bakteri kültürlerinde hem de apoplast 8,9 bitkisinden elde edilen bakteri popülasyonlarında heterojen olduğu tespit edilmiştir. Tek hücreli düzeyde gen ekspresyon analizi tipik olarak laboratuvar ortamında yetiştirilen bakteri kültürlerinde yapılmasına rağmen, bu tür analizler bitki içinde büyüyen bakteri popülasyonları üzerinde de gerçekleştirilebilir, böylece doğal bağlamda alt popülasyonların oluşumu hakkında değerli bilgiler sağlanır. Bitkiden ekstrakte edilen bakteri popülasyonlarının analizi için potansiyel bir sınırlama, apoplasta şırınga basıncı infiltrasyonu ile klasik aşılama yöntemlerinin, ardından yaprak dokusunun maserasyonu ile bakteriyel ekstraksiyonun tipik olarak aşağı akış analizine müdahale eden büyük miktarda hücresel bitki kalıntısı oluşturmasıdır10. Çoğu hücresel enkaz, GFP floresansı ile örtüşen ve yanıltıcı sonuçlara neden olan otofloresan kloroplast parçalarından oluşur.
Mevcut protokol, iki model patosistemde tek hücreli gen ekspresyon heterojenitesini analiz etme sürecini açıklamaktadır: P. syringae pv tarafından oluşturulan. domates suşu DC3000 ve Arabidopsis thaliana (Col-0), diğeri ise P. syringae pv. phaseolicola suşu 1448A ve fasulye bitkileri (Phaseolus vulgaris çeşidi Kanada Harikası). Bir vakum odası ve bir pompa kullanılarak vakum infiltrasyonuna dayanan bir aşılama yöntemi önerilmiştir, bu da tüm yapraklara sızmak için hızlı ve hasarsız bir yöntemle sonuçlanır. Ayrıca, geleneksel protokollerde bir gelişme olarak, bakteri popülasyonunu apoplasttan çıkarmak için, bir şırınga içinde az miktarda hacim kullanarak pozitif ve negatif basınç döngüleri uygulayarak apoplastik sıvının ekstraksiyonuna dayanarak, doku bozulmasını önemli ölçüde azaltan daha yumuşak bir yöntem kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bitki hazırlama
- Aşağıdaki adımları izleyerek Arabidopsis Col-0 tesislerini hazırlayın.
- 10 cm çapında bir tencereyi, daha önce sulanmış 1:3 vermikülit-bitki substrat karışımı ile doldurun (bkz. Malzeme Tablosuna bakınız) ve tencereyi 1,6 mm x 1,6 mm deliklere sahip 15 cm x 15 cm metal bir ağ ile örtün. Metal ağı bir lastik bant kullanarak ıslak toprağa ayarlayın (Şekil 1A).
- Islak bir kürdanla, Arabidopsis tohumlarını metal ağın deliklerine ekin. Üç ila dört tohumu saksı içinde uzak konumlara yerleştirin (Şekil 1B, C).
- Yüksek bağıl nemi korumak için saksıları plastik bir kubbe ile örtün ve tabakalaşma için 4 ° C'de 72 saat boyunca inkübe edin.
NOT: Tabakalaşma (tarif edildiği gibi yüksek nem ve düşük sıcaklıkta inkübasyon), tohumların çimlenme hızını ve senkronizasyonunu arttırır. - Saksıları kısa gün koşullarında bir bitki büyüme odasına aktarın (21 °C'de 8 saat ışık/16 saat karanlık, ışık yoğunluğu: 100 μmol·m−2·s−1, bağıl nem: %70).
- Tohum çimlenmesinden sonra (8-10 gün), fidelerin çoğunu çıkarmak için cımbız kullanın, saksının her bir pozisyonunda (altı fide / saksı) bir fide tutun (Şekil 1D). Saksıları ortaya çıkarmak için plastik kubbeyi çıkarın.
NOT: Bitkiler çimlenmeden 4-5 hafta sonra kullanıma hazır olacaktır.
- Phaseolus vulgaris fasulyesi (çeşit Kanada Harikası) bitkilerini hazırlayın.
- Bir Petri kabının altını ıslak bir havlu kağıdı ile örtün ve fasulye tohumlarını üstüne yerleştirin. Petri kabını cerrahi bantla kapatın ve 3-4 gün boyunca 28 ° C'de inkübe edin (Şekil 2A).
- Çimlenmiş tohumları ıslak 1: 3 vermikülit-bitki substrat karışımı ile doldurulmuş 10 cm çapında bir tencereye aktarın.
- Uzun gün ayarlarında bir bitki büyüme odasında kuluçkaya yatın (23 °C'de 16 saat ışık/8 saat karanlık, ışık yoğunluğu: 100 μmol·m−2·s−1, bağıl nem: %70).
NOT: Bitkiler çimlenmeden 10 gün sonra kullanıma hazır olacaktır (Şekil 2B).
2. Arabidopsis ve fasulye bitkilerinin aşılanması
NOT: Bu çalışmada P. syringae pv. domates DC3000 ve P. şırınga, pv. phaseolicola 1448A kullanıldı.
- P. syringae inoculum'u hazırlayın.
- İlgilenilen P. syringae suşunu -80 ° C'lik bir gliserol stoğundan, uygun antibiyotiklerle desteklenmiş bir LB plakasına (10 g / L tripton, 5 g / L NaCl, 5 g / L maya ekstresi ve 16 g / L bakteriyolojik agar, Malzeme Tablosuna bakınız) çizin. 40-48 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edin.
NOT: İlgilenilen suş bir plazmid veya genomik direnç geni taşıyorsa antibiyotik kullanımı önerilir. P. syringae için önerilen antibiyotik konsantrasyonları aşağıdaki gibidir: kanamisin (15 μg / mL), gentamisin (10 μg / mL), ampisilin (300 μg / mL) ( bakınız Malzeme Tablosu). - Bakteriyel biyokütleyi kazıyın ve 5 mL'de 10 mM MgCl2'de yeniden askıya alın. OD600'ü ölçün ve 10 mM MgCl2 ekleyerek 0,1'e ayarlayın.
NOT: Bir P. syringae kültürünün 0,1'lik bir OD 600'ü 5 x10 7 CFU·mL−1'e karşılık gelir. - 5 x 105 CFU·mL−1 nihai inokülum konsantrasyonuna ulaşmak için 10 mM MgCl2'ye seri seyreltmeler gerçekleştirin. Arabidopsis bitkileri için 200 mL ve fasulye bitkileri için 50 mL inokulum hazırlayın.
- Aşılamadan hemen önce, yüzey aktif madde Silwett L-77'yi ( bakınız Malzeme Tablosu) fasulye aşılaması için% 0.02 ve Arabidopsis için% 0.01'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Silwett'in Arabidopsis dokusuna biraz zararlı olduğunu unutmayın.
- İlgilenilen P. syringae suşunu -80 ° C'lik bir gliserol stoğundan, uygun antibiyotiklerle desteklenmiş bir LB plakasına (10 g / L tripton, 5 g / L NaCl, 5 g / L maya ekstresi ve 16 g / L bakteriyolojik agar, Malzeme Tablosuna bakınız) çizin. 40-48 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edin.
- Vakum infiltrasyonu gerçekleştirin.
- Arabidopsis infiltrasyonu için, tencerenin üzerine bir X oluşturan iki tahta çubuk yerleştirin (Şekil 1E) ve tencereyi 200 mL inokulum içeren 14 cm çapında bir Petri kabının üzerine aşağı bakacak şekilde yerleştirin (Şekil 1F).
- Fasulye yapraklarının aşılanması için, yaprağı inokulumu içeren 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne sokun (Şekil 2C).
- İnokulum çözeltisine batırılmış bitkileri bir vakum odasına yerleştirin (Şekil 1G ve Şekil 2D) ve yapraklara sızması için 30 s boyunca 500 mbar'lık bir darbe verin. Yaprak tamamen sızana kadar vakum darbesini 2-3 kez tekrarlayın (Şekil 1H ve Şekil 2E).
- Fazla inokülum çözeltisini bir parça kağıtla boşaltın ve bitkileri karşılık gelen büyüme odalarına geri getirin.
3. Apoplasttan bakteri ekstraksiyonu
- Aşılamadan dört gün sonra, Arabidopsis bitkisinin hava kısmını veya fasulye bitkisinden aşılanmış yaprağı kesin ve iğnesiz 20 mL'lik bir şırıngaya yerleştirin (Şekil 2G). Fasulye yaprakları için, yaprağı kendi üzerine yuvarlayın, Şekil 2F'de gösterildiği gibi abaksiyel yüzü dışa doğru bırakın.
- Dokuyu örtmek için yeterli miktarda damıtılmış su ekleyin (genellikle 10-15 mL).
- Pistonu yerleştirin ve şırınga, ucu yukarı bakacak şekilde dikey konumdayken, tüm hava ucun yanına yerleştirilene kadar namluya hafifçe dokunarak şırınganın içindeki fazla hava ve hava kabarcıklarını çıkarın. Havayı dışarı çıkarmak için pistonu kaydırın. Şırınganın içinde mümkün olduğunca az hava olduğunda, şırınga namlusunun ucunu parafin filmi ile örtün.
- Doku koyulaşana kadar pozitif basınç oluşturmak için pistona dikkatlice bastırın (Şekil 1I ve Şekil 2H). Ardından, negatif basınç oluşturmak için pistonu çekin (Şekil 1J ve Şekil 2I). Bu adımı 3-5 kez tekrarlayın.
- Parafin filmi ve pistonu çıkarın ve Şekil 2J'de olduğu gibi apoplastla ekstrakte edilen bakterileri içeren sıvıyı toplayın.
4. Apoplastla ekstrakte edilen bakterilerin tek hücreli analizi
- Aşağıdaki adımları izleyerek konfokal mikroskopi ile görselleştirin.
- Damıtılmış suda% 1.5'lik bir agaroz çözeltisi hazırlayın. Eritildikten sonra, yan yana yerleştirilmiş iki mikroskopi slaytı arasındaki boşluğu doldurmak için yeterli hacim ekleyin ve üstüne başka bir slayt yerleştirin (Şekil 3). 15 dakika kurumasını bekleyin ve üstüne yerleştirilen slaytı dikkatlice çıkarın. Bir bıçak kullanarak, agaroz pedini kullanımdan hemen önce 5 mm x 5 mm parçalara ayırın.
- Buna paralel olarak, apoplastla ekstrakte edilen bakterilerin 1 mL'sini oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüjleyin, bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücreleri konsantre etmek için peleti 20 μL suya yeniden askıya alın. Konsantre hücrelerin 2 μL'lik bir damlasını 0,17 mm'lik bir kapak kayması üzerine yerleştirin ve damlayı, Şekil 3'te gösterildiği gibi, daha önce adım 1'de elde edilen 5 mm x 5 mm'lik agaroz pedi parçası ile örtün.
- Bakteriyel preparatı konfokal mikroskop altında görselleştirin (bakınız Malzeme Tablosu). Yeşil floresan bakterileri tanımlamak için, 488 nm'de uyarma lazerini ve 500 nm ila 550 nm arasında değişen bir emisyon filtresi kullanın. Tüm bakterileri tanımlamak için parlak alanı kullanın ve her iki alanı birleştirin.
- Fiji'yi kullanarak konfokal görüntüleri işleyin (bkz. Bunu yapmak için, bakteri hücresinin konturunu tanımlamak ve içindeki floresan yoğunluğunu ölçmek için MicrobeJ eklentisini kullanın.
NOT: Bu analiz için izole edilmiş bakterilerden (kümelenmemiş) görüntü elde edilmesi önerilir.
- Akış sitometrisi ile analiz yapın.
- Akış sitometresini kullanarak analiz etmek için apoplastla ekstrakte edilen bakteri süspansiyonlarının bir alikotunu alın. 100.000 etkinlik alın.
- Bakteriler ve bitki kalıntıları arasında ayrım yapmak için, aşılanmamış bir bitkiden ekstrakte edilen apoplastı analiz edin ve ileri saçılma (FSC) hücre boyutunu yan saçılma (SSC) hücre boyutuna karşı gösteren nokta grafiğini apoplastla ekstrakte edilen bakteriyel süspansiyonunkiyle karşılaştırın. Floresan olmayan bakterileri tanımlamak için, floresan olmayan izojenik bakterilerle aşılanmış bitkilerden ekstrakte edilen apoplastları kullanın ve floresan emisyonlarını karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tip III sekresyon sisteminin ekspresyonu, bitki içindeki bakteri büyümesi için gereklidir. T3SS genlerinin zamanında ekspresyonu, merkezinde T3SS ile ilişkili genlerin ekspresyonunun anahtar aktivatörü olan ekstrasitoplazmik fonksiyon (ECF) sigma faktörü HrpL olan karmaşık düzenleme yoluyla elde edilir11. HRPL ekspresyonunun bir analizi daha önce aşağı akış promotersiz gfp genine kromozom yerleşimli bir transkripsiyonel füzyon kullanılarak ve konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi9 ile ekspresyon kalıplarını takip ederek gerçekleştirilmiştir. Bu füzyonlar, PCR ve geleneksel klonlama yoluyla üretilen plazmid kodlu yapıların homolog rekombinasyon aracılı entegrasyonu yoluyla üretilir ve ilgili genin ORF'sinin son 500 baz çiftini (STOP kodonu dahil) ve dizinin 500 baz çiftini hemen aşağı doğru taşır, ribozom bağlanma bölgesini ve kullanılacak floresan muhabir geninin ORF'sini (bu durumda, GFP), ardından bir antibiyotik direnç kaseti (bu durumda, kanamisin'e direnç kazandıran NPT2 geni). Böylece, hrpL de dahil olmak üzere T3SS ile ilişkili genleri eksprese eden apoplast ekstrakte edilmiş P. syringae popülasyonlarının planta 9'da heterojen olduğu tespit edilmiştir. Bu emsal olarak, konfokal floresan mikroskobu ve hrpL ekspresyonunun akış sitometri analizinin temsili sonuçları, yaprak apoplastının kolonizasyonundan sonra sırasıyla fasulye veya Arabidopsis yapraklarından ekstrakte edilen Pph 1448A (Pph) ve Pto DC3000 (Pto) model suşlarının bireysel bakteri hücrelerinde gösterilmiştir (Şekil 4). Her suşta, P. syringae kromozomal hrpL geni, GFP ekspresyon seviyeleri 8,9'u takip ederek hrpL doğal promotör aktivitesini izlemeye izin veren promotersiz bir gfp genine aşağı akış transkripsiyonel füzyonu taşır.
Apoplast ile ekstrakte edilen bakteriler farklı analizler için kullanılabilir. Burada, yukarıda belirtilen muhabir bakteri suşlarının 300 μL'si, enfekte Arabidopsis veya fasulye bitkilerinin apoplastından ekstrakte edildi ve bir akış sitometre sistemi kullanılarak veri toplama için kullanıldı (bkz. GFP tespiti için 488 nm'de lazer emisyonu ve FITC filtresi kullanıldı. Akış sitometri analizi, popülasyondaki bireysel bakteri hücrelerinde floresan dağılımını gösterir. HRPL'nin heterojen ekspresyonu, Arabidopsis apoplastla ekstrakte edilen Pto'da ve HrpLOFF (GFP'yi eksprese etmeyen) bakterileri de dahil olmak üzere fasulye apoplastıyla ekstrakte edilen Pph'de akış sitometrisi ile açıkça gözlemlenebilir ve bu sonuçlar karşılık gelen örneklerin mikroskobik incelemesi ile desteklenir (Şekil 4). Nokta grafiği grafikleri (sol paneller), GFP'nin floresan yoğunluğunun popülasyondaki hücre boyutuna göre dağılımını gösterirken (Şekil 4A), histogramlar GFP'nin hücre sayımlarına karşı floresan yoğunluğunu gösterir (Şekil 4B). Sitometri verilerinin bu iki farklı grafik gösterimi, araştırmacının ince görsel nüanslar oluşturmasına ve tamamlayıcı bilgiler sağlamasına olanak tanır. Bakteriyel otofloresan için bir kontrol olarak, karşılık gelen GFP olmayan vahşi tip suş kullanıldı (Şekil 4A'da üst panel ve Şekil 4B'de gri histogram). Bu, popülasyondaki GFP olmayan bakterilerin görüntülendiği grafik alanını tanımlamaya izin verir. Akım sitometrisi analizleri de nicel veriler üretir. Örnek olarak,HrpL ON (floresan) hücrelerinin yüzdeleri, apoplastla ekstrakte edilen Pto ve Pph popülasyonlarında ekstrakte edilir. Şekil 4C,HrpL ON yüzdelerinin, bu popülasyonlarda, özellikle Pto modelinde, HrpLOFF (floresan olmayan) hücrelerin karşılık gelen yüzdelerinden nasıl daha yüksek olduğunu göstermektedir. Bu veriler, tüm popülasyon için ortalama veya medyan floresansı hesaplamak için de kullanılabilir. Bu özel deneyde, Pto popülasyonu için Pph'den daha yüksek olan ortalama GFP floresan yoğunluğu, daha yüksek ON hücresi yüzdesine uygun olarak elde edildi. Ortalama seviyeler, RT-q, PCR veya RNAseq gibi tek hücreli olmayan tekniklerle elde edilen verilerle karşılaştırılabilir popülasyon düzeyinde verileri oluşturur. Son olarak, üçüncü çeyrek eksi ilk çeyreğin medyana bölünmesiyle hesaplanan sağlam varyasyon katsayısı (RCV)12 de gösterilmiştir. RCV, akış sitometrisi çalışmalarında genellikle veri dağılımını (yani, popülasyon içindeki ekspresyonun heterojenliğini) tahmin etmek için kullanılır13. Bu çalışmada, RCV, Pph için Pto'dan biraz daha yüksekti, ancak fark, ekspresyonun bu iki suşun popülasyonları içindeki dağılımını anlamlı derecede farklı olarak karakterize etmek için yeterli değildi. HRPL ekspresyonunun heterojenliği, konfokal mikroskopi görüntüleri ile görsel olarak doğrulanabilir (Şekil 4D). Mikroskopi hazırlığı için agar pedlerinin kullanılması, bakterileri tek bir katmana ittiği ve bakteri hareketini önlediği için bireysel hücrelerin daha kolay görselleştirilmesi ve daha kaliteli görüntüleri ile sonuçlanır. Bu protokolde açıklanan aşılama ve bakteri ekstraksiyon prosedürleri, bakteri preparatı içindeki bitki artıklarının miktarını en aza indirir, böylece bakteri ekspresyonunun bu farklı tekniklerle analiz edilmesine izin verir (Şekil 4).
Resim 1: Arabidopsis bitkileri kullanılarak bakteri aşılaması ve apoplast ekstraksiyonu. (A) Tencerenin metal ağ düzgün bir şekilde takılı olarak hazırlanması. (B) Tohumları (C)'de belirtildiği gibi dağıtmak için kürdan kullanarak ekmek. (D) Aşılamaya hazır Arabidopsis bitkileri. (E) İki tahta çubuk, bitkilerin saksıya veya toprağa (F) ulaşmadan bakteriyel çözeltiye daldırılmasını kolaylaştırır. (G) Topluluk, vakum odasının içine yerleştirilebilir. (H) Sızan yapraklar, vakumu odadan serbest bıraktıktan sonra koyulaşır. (I) Ayrılan yapraklar 20 mL'lik bir şırıngaya yerleştirilir ve su ile kaplanır. (J) Pozitif ve negatif basınç döngüleri apoplastik bakterilerin ekstraksiyonu ile sonuçlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Fasulye bitkileri kullanılarak bakteri aşılaması ve apoplast ekstraksiyonu. (A) Islak tuvalet kağıdı ile kaplı Petri kaplarında fasulye tohumlarının çimlenmesi. (B) Aşılamaya hazır fasulye bitkisi. (C) 50 mL'lik bir tüp içinde bulunan bakteri çözeltisine batırılmış fasulye yaprağı. (D) Yapraklar, doku koyulaşana kadar bir vakum odası içinde aşılanır (E). (F) Fasulye yaprağı yuvarlanır, 20 mL'lik bir şırınganın içine konur ve su (G) ile kaplanır. (H) Pozitif ve negatif basınç döngüleri (I) bir tüpe (J) geri kazanılabilen apoplastik bakterilerin ekstraksiyonu ile sonuçlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Agar pedinin ayarlanması ve hazırlanmasının şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Aşılamadan 4 gün sonra Arabidopsis veya fasulye yapraklarından elde edilen apoplastla ekstrakte edilen bakterilerin sırasıyla P. syringae pv. domates (Pto) veya P. syringae pv. phaseolicola (Pph) ile analizi. hrpL::gfp ekspresyonu GFP floresan olarak izlenir. (A) Akış sitometrisi analizi bir nokta grafiği olarak temsil edilir (ileri saçılma [hücre boyutu] ve GFP floresan yoğunluğu). GFP olmayan bakteriler, Pto veya Pph'nin vahşi tip bir suşunu gösterir. Dikey çizgi, GFP olmayan popülasyonun% 99'unu sınırlar. (B) Akış sitometri analizi histogramlar olarak temsil edilir (hücre sayımlarına karşı GFP floresan yoğunluğu). Gri histogram, GFP olmayan suşu temsil eder. (C) Akış sitometrisi analizinden nicel veriler oluşturulmuştur. AÇIK ve KAPALI hücrelerinin yüzdesi, nokta grafikte gösterilen dağılıma göre hesaplanır. Ortalama, deneyde elde edilen ortalama floresanı gösterir. Sağlam varyasyon katsayısı (RCV), üçüncü çeyrek eksi ilk çeyreğin medyana bölünmesiyle hesaplanır. (D) HRPL ekspresyonu ile ilişkili heterojen GFP seviyelerini gösteren floresan mikroskopi görüntüleri. Beyaz oklar, düşük seviyeler gösteren veya GFP floresansı göstermeyen bakterileri vurgular. Ölçek çubuğu: 3 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan yöntem, bakterilerin bitki yaprak dokusuna sızmasına izin veren, doku bozulmasını en aza indirirken büyük hacimlerin hızlı bir şekilde aşılanmasına izin veren invaziv olmayan bir prosedürü açıklamaktadır. P. syringae tür kompleksinin özelliklerinden biri, bitki apoplastının içinde ve bitki yüzeyinde epifit14 olarak hayatta kalma ve çoğalma yeteneğidir. Bu nedenle, mevcut protokol kullanılarak ekstrakte edilen bakterilerin sadece bitki apoplastından gelme olasılığı göz ardı edilemez. Bununla birlikte, daha önce konfokal mikroskopi kullanılarak, yaprak yüzeyindeki bakteri oranının, bitki yaprağı5 içindeki bakteri büyümesine kıyasla oldukça küçük olduğu gösterilmiştir. Bu, ekstraksiyondan önce yaprak yüzeyinin mikroskobik incelemesi ile kontrol edilebilir. Ayrıca, mevcut protokolde model olarak kullanılan P. syringae suşlarının, Pto DC3000 ve Pph 1448A'nın, ekstrakte edilen bakterilerin alakasız bir oranını temsil eden zayıf epifitler15 olarak performans gösterdiği gösterilmiştir. Bununla birlikte, yöntem diğer patosistemlere uyarlanacaksa, mevcut protokole yaprak yüzeyi dekontaminasyonunun önceki bir adımının eklenmesi gerekebilir.
Bir şırınga16 kullanılarak yaprak infiltrasyonu gibi geleneksel aşılama yöntemleri, aşılama bölgesinde daha büyük, tahmin edilmesi zor doku hasarına neden olur ve doku nekrozuna neden olur. Ayrıca, hasar miktarı farklı aşılama noktaları arasında çok değişkendir. Ayrıca, farklı bitki türleri yaprak infiltrasyonuna karşı toleranslarında farklılık gösterir. Örneğin, Arabidopsis yapraklarının sızması kolaydır, fasulye yaprakları ise daha inatçıdır. Büyüme koşulları ayrıca belirli bir türün infiltrasyonuna karşı tolerans seviyesini de etkiler. Bununla birlikte, yaprak daldırma veya yaprak spreyi gibi daha yumuşak geleneksel aşılama yöntemleri, daha doğal ve hasarsız bir bakteri girişi ve dokunun kolonizasyonu ile sonuçlanır, ancak doğal olarak, elde edilen bakteri popülasyonlarının boyutunu, genellikle apoplastik bakteri örneklerinin sonraki analizi için gereken eşiğin altında sınırlar5 . Önerilen aşılama yöntemi, şırınga basıncından kaynaklanan aşılanmış alanlarda nekroz aktivasyonunu önemli ölçüde azaltırken, bakteriyel numune boyutu sınırlamasını önler ve önemli yaprak alanlarını aşılamak için kolay, tekrarlanabilir ve hızlı bir yol sağlar.
Büyük doku alanlarının aşılanmasını gerektiren bazı teknikler çok zaman ve emek alıcı olabilir ve doku hasarına neden olma şansını artırabilir. Bu yöntemi uygulayarak, doku bütünlüğünden ödün vermeden beş veya daha fazla Arabidopsis bitkisini veya bütün bir fasulye yaprağını tek adımda aşılayabiliriz. Bu teknik, daha fazla sayıda bitkiyi veya Nicotiana benthamiana, domates veya soya fasulyesi gibi diğer tarımsal veya akademik ilgi çekici bitki türlerini aşılamak için uyarlanabilir. Bakteriyel süspansiyonun infiltrasyonunu kolaylaştırmak için yüzey suyu gerilimini azaltmak için kullanılan yüzey aktif maddenin konsantrasyonu, bitki türüne bağlı olarak önceden ayarlanmalı ve test edilmelidir, çünkü yüzey aktif maddenin daha yüksek konsantrasyonları bazı durumlarda doku nekrozuna neden olabilir. Ayrıca, uygulanan basınç miktarı ve aşılama işleminin süresi, optimum sonuçları sağlamak için bitki yaprağının farklı türlerde sunduğu dirence göre ayarlanmalıdır.
Apoplast ekstraksiyonu ile ilgili olarak, mevcut yöntem aynı zamanda doku bozulmasını en aza indirir, böylece ekstrakte edilen numunede bulunan bitki kalıntılarının miktarını azaltır. Bu, daha temiz numunelere izin verir ve örnekte gösterildiği gibi RNA-seq, akış sitometrisi veya mikroskopi gibi farklı tekniklerle daha verimli analizlerle sonuçlanır. Patojenik bakteri popülasyonunun apoplastik ortamından minimal doku ve bitki hücresi bozulması ile geri kazanılması zordur. P. syringae , apoplastın hücreler arası boşluklarını kolonize ederek mikrokoloniler oluşturur. P. syrıngae gibi hücre dışı bir patojen kullanmak, burada sunulana benzer yöntemlere izin verir, çünkü bakteriyel iyileşme için doku ve hücre bozulması gerekli değildir. Pozitif ve negatif basınç turları mikrokolonileri bozar, bakterileri dağıtır ve doğal açıklıklar (stomalar) yoluyla kolay ve hızlı ekstraksiyonlarına izin verir, daha yumuşak apoplastik geri kazanım yöntemleri için gerekli olanlar gibi uzun inkübasyon sürelerine eşlik edebilecek gen ekspresyonundaki herhangi bir değişiklikten kaçınır. Artık bitki dokusunun mikroskobik incelemesi, bakteri popülasyonunun çoğunun uzaklaştırılmasını destekler. Apoplastik sıvı ekstraksiyon protokolleri, apoplastik sıvının karmaşıklığını incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır17. Bu protokoller, geri kazanılan apoplastik sıvıyı daha da temizlemek için son bir santrifüjleme adımı içerir. Burada, bunun yerine şırınga pistonu kullanılarak pozitif ve negatif basıncın nazik döngüleri kullanıldı, böylece bakteriyel geri kazanımın verimliliği üzerinde çok az etkiye sahipken, konakçı-hücresel enkaz ile numune kontaminasyonunu azalttı. Bir klasik yumuşak bakteri ekstraksiyon yöntemi, yaprak disklerinin veya fidelerin 1-2 saat18 boyunca bir yüzey aktif madde ile inkübasyonundan oluşur. Bu yöntem, bakterileri çıkarmak için burada sunulan yöntem kadar etkili değildir; Bununla birlikte, gen ekspresyon analizi için temel sınırlaması, gerekli inkübasyon süresinin popülasyonun ekspresyon profili üzerindeki etkisidir. Burada sunulan yöntem, apoplastik popülasyonun hızlı bir şekilde iyileşmesine ve anında analiz edilmesine izin verir, böylece hücresel düzeyde gen ekspresyon sonuçlarını atlama riskini azaltır.
Patojenik bakterilerde fenotipik heterojenite, homojen laboratuvar ortamları kullanılarak yaygın olarak incelenmiştir. Doğal nişlerinde yetişen bakteri popülasyonlarını incelemek, aşağı akış tek hücreli analizlere müdahale eden konakçı hücre kalıntıları ile aşırı kontaminasyon olmadan bakteri popülasyonlarını geri kazanmanın zorluğu gibi teknik engeller nedeniyle genellikle sınırlıdır. Bu kombine aşılama ve ekstraksiyon yöntemi, tek hücreli analizler için bakteriyel patojenlerin büyük apoplastik popülasyonlarının üretilmesine izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ tarafından finanse edilen RTI2018-095069-B-I00 Projesi Hibesi ve "ERDP: Avrupa'yı Yapmanın Bir Yolu" tarafından desteklenmiştir. J.S.R., Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020) tarafından finanse edildi. N.L.P., Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación'dan Project Grant P18-RT-2398 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
- Weigel, W. A., Dersch, P. Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy. Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).
- Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Morris, C. E., et al. The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle. The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).
- Rufián, J. S., et al. Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains. Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).
- Macho, A. P. Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity. New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).
- Xiao, Y., Hutcheson, S. W. A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae. Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).
- Rufián, J. S., et al. Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae. Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).
- Rufian, J. S., et al. Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host. Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
- Fouts, D. E., et al. Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).
- Huber, P. J. Robust Statistics. , Wiley. New York, NY. (1981).
- Freed, N. E., et al. A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise. PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).
- Hirano, S. S., Upper, C. D. Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).
- Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization. Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).
- Liu, X., et al. Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).
- O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example. Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).
