Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णन करता है जो पौधे के एपोप्लास्ट के भीतर उगाए गए स्यूडोमोनास सिरिंगे आबादी पर एकल-कोशिका जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण की अनुमति देता है।
Abstract
रोगजनक सूक्ष्मजीवों की अधिकता लगातार पौधों पर हमला करती है। स्यूडोमोनास सिरिंगे प्रजाति परिसर में मेजबानों की एक विस्तृत संख्या के लिए विशेष प्रासंगिकता के ग्राम-नकारात्मक पौधे-रोगजनक बैक्टीरिया शामिल हैं। सिरिंगे पत्ती की सतह से पौधे में प्रवेश करता है और एपोप्लास्ट के भीतर तेजी से बढ़ता है, जिससे माइक्रोकलोनियां बनती हैं जो अंतरकोशिकीय स्थान पर कब्जा कर लेती हैं। बैक्टीरिया द्वारा फ्लोरोसेंट प्रोटीन की संवैधानिक अभिव्यक्ति सूक्ष्म उपनिवेशों के विज़ुअलाइज़ेशन और सूक्ष्म स्तर पर संक्रमण के विकास की निगरानी की अनुमति देती है। एकल-कोशिका विश्लेषण में हालिया प्रगति ने क्लोनल इसोजेनिक जीवाणु आबादी द्वारा पहुंचने वाली बड़ी जटिलता का खुलासा किया है। यह जटिलता, जिसे फेनोटाइपिक विषमता के रूप में जाना जाता है, बैक्टीरिया समुदाय के बीच जीन अभिव्यक्ति (आनुवंशिक अंतर से जुड़ा नहीं) में सेल-टू-सेल अंतर का परिणाम है। एकल-कोशिका स्तर पर व्यक्तिगत लोकी की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के ट्रांसक्रिप्शनल संलयन का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। तनाव की स्थिति में, जैसे कि पौधे के एपोप्लास्ट के औपनिवेशीकरण के दौरान होने वाली, पी सिरिंगे प्रमुख विषाणु जीन (यानी, एचआरपी टाइप III स्राव प्रणाली) की विषम अभिव्यक्ति के आधार पर अलग-अलग उप-आबादी में अंतर करता है। हालांकि, पौधे के ऊतकों से बरामद किसी भी पी सिरिंगे आबादी का एकल-कोशिका विश्लेषण टीकाकरण और जीवाणु निष्कर्षण प्रक्रियाओं के लिए आंतरिक यांत्रिक व्यवधान के दौरान जारी सेलुलर मलबे के कारण चुनौतीपूर्ण है। वर्तमान रिपोर्ट में एराबिडोप्सिस और बीन पौधों के उपनिवेशीकरण के दौरान एकल-कोशिका स्तर पर रुचि के पी सिरिंगे जीन की अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए विकसित एक विधि का विवरण दिया गया है। वैक्यूम कक्ष का उपयोग करके टीकाकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले पौधों की तैयारी और जीवाणु निलंबन का वर्णन किया गया है। एपोप्लास्टिक द्रव निष्कर्षण द्वारा संक्रमित पत्तियों से एंडोफाइटिक बैक्टीरिया की वसूली भी यहां बताई गई है। बैक्टीरियल टीकाकरण और जीवाणु निष्कर्षण विधियों दोनों को पौधे और जीवाणु कोशिका क्षति को कम करने के लिए अनुभवजन्य रूप से अनुकूलित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए इष्टतम जीवाणु तैयारी होती है।
Introduction
रोगजनक बैक्टीरिया विभिन्न फेनोटाइप्स में अंतर प्रदर्शित करते हैं, जिससे आनुवंशिक रूप से समान आबादी के भीतर उप-आबादी के गठन को जन्म मिलता है। इस घटना को फेनोटाइपिक विषमता के रूप में जाना जाता है और इसे बैक्टीरिया-होस्ट इंटरैक्शन 1 के दौरान अनुकूलन रणनीतिके रूप में प्रस्तावित किया गया है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ संयुक्त कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप, फ्लो साइटोमेट्री और माइक्रोफ्लुइडिक्स के ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन में हालिया प्रगति ने बैक्टीरिया की आबादी के एकल-सेल विश्लेषण को बढ़ावा दियाहै।
ग्राम-नकारात्मक स्यूडोमोनास सिरिंगे अपने अकादमिक औरआर्थिक महत्व दोनों के कारण एक पुरातन पौधे रोगजनक बैक्टीरिया है। पी सिरिंगे का जीवन चक्र जल चक्र4 से जुड़ा हुआ है। सिरिंगे मेसोफिल कोशिकाओं, पौधे की पत्ती एपोप्लास्ट के बीच अंतरकोशिकीय रिक्त स्थान में प्रवेश करता है, प्राकृतिक एपर्चर जैसे स्टोमेटा या घाव5 के माध्यम से। एक बार एपोप्लास्ट के भीतर, पी सिरिंगे पौधे की प्रतिरक्षा को दबाने और रोगज़नक़6 के लाभ के लिए पौधे सेलुलर कार्यों में हेरफेर करने के लिए टाइप III स्राव प्रणाली (टी 3 एसएस) और टाइप III-ट्रांसलोकेटेड प्रभावकों (टी 3 ई) पर निर्भर करता है। टी 3 एसएस और टी 3 ई की अभिव्यक्ति मास्टर नियामक एचआरपीएल पर निर्भर करती है, एक वैकल्पिक सिग्मा कारक जो लक्ष्य जीन 7 के प्रमोटर क्षेत्र में एचआरपी-बॉक्स रूपांकनों को बांधताहै।
रुचि के जीन के डाउनस्ट्रीम फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन के लिए क्रोमोसोम-स्थित ट्रांसक्रिप्शनल संलयन उत्पन्न करके, कोई एकल-कोशिका स्तर8 पर उत्सर्जित प्रतिदीप्ति स्तरों के आधार पर जीन अभिव्यक्ति की निगरानी कर सकता है। इस विधि का उपयोग करते हुए, यह स्थापित किया गया है कि एचआरपीएल की अभिव्यक्ति प्रयोगशाला में उगाई गई जीवाणु संस्कृतियों के भीतर और पौधे एपोप्लास्ट 8,9 से बरामद जीवाणु आबादी के भीतर विषम है। यद्यपि एकल-कोशिका स्तर पर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण आमतौर पर प्रयोगशाला मीडिया में उगाए गए जीवाणु संस्कृतियों में किया जाता है, इस तरह के विश्लेषण पौधे के भीतर बढ़ने वाली जीवाणु आबादी पर भी किए जा सकते हैं, इस प्रकार प्राकृतिक संदर्भ में उप-आबादी के गठन पर मूल्यवान जानकारी प्रदान करते हैं। पौधे से निकाली गई जीवाणु आबादी के विश्लेषण के लिए एक संभावित सीमा यह है कि एपोप्लास्ट में सिरिंज-दबाव घुसपैठ द्वारा क्लासिक टीकाकरण विधियां, इसके बाद पत्ती के ऊतकों के मैकेशन द्वारा जीवाणु निष्कर्षण, आमतौर पर बड़ी मात्रा में सेलुलर पौधे के मलबे उत्पन्न करता है जो डाउनस्ट्रीम विश्लेषण10 में हस्तक्षेप करता है। अधिकांश सेलुलर मलबे में क्लोरोप्लास्ट के ऑटोफ्लोरोसेंट टुकड़े होते हैं जो जीएफपी प्रतिदीप्ति के साथ ओवरलैप होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप भ्रामक परिणाम होते हैं।
वर्तमान प्रोटोकॉल दो मॉडल पैथोसिस्टम में एकल-सेल जीन अभिव्यक्ति विषमता का विश्लेषण करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है: पी सिरिंगे पीवी द्वारा गठित एक। टमाटर स्ट्रेन डीसी 3000 और एराबिडोप्सिस थैलियाना (कोल -0), और दूसरा पी सिरिंगे पीवी द्वारा। फेजोलिकोला स्ट्रेन 1448 ए और बीन पौधे (फेजोलस वल्गारिस कल्टीवेटर कैनेडियन वंडर)। वैक्यूम चैंबर और पंप का उपयोग करके वैक्यूम घुसपैठ के आधार पर एक टीकाकरण विधि प्रस्तावित की जाती है, जिसके परिणामस्वरूप पूरी पत्तियों में घुसपैठ करने के लिए एक तेज और क्षति मुक्त विधि होती है। इसके अलावा, पारंपरिक प्रोटोकॉल पर सुधार के रूप में, एपोप्लास्ट से बैक्टीरिया की आबादी को निकालने के लिए एक सौम्य विधि का उपयोग किया जाता है जो एक सिरिंज के भीतर मात्रा की थोड़ी मात्रा का उपयोग करके सकारात्मक और नकारात्मक दबाव के चक्रों को लागू करके एपोप्लास्टिक द्रव के निष्कर्षण के आधार पर ऊतक व्यवधान को काफी कम करता है।
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Protocol
1. पौधे की तैयारी
- नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए एराबिडोप्सिस कोल -0 पौधे तैयार करें।
- 10 सेमी व्यास के बर्तन को 1: 3 वर्मीक्यूलाइट-प्लांट सब्सट्रेट मिश्रण ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ भरें, पहले पानी पिलाया गया था, और बर्तन को 1.6 मिमी x 1.6 मिमी छेद के साथ 15 सेमी x 15 सेमी धातु जाल के साथ कवर करें। रबर बैंड (चित्रा 1 ए) का उपयोग करके गीली मिट्टी में धातु जाल को समायोजित करें।
- गीले टूथपिक के साथ, एराबिडोप्सिस के बीज को धातु जाल के छेद में बोएं। बर्तन के भीतर दूर की स्थिति में तीन से चार बीज रखें (चित्र 1 बी, सी)।
- उच्च सापेक्ष आर्द्रता बनाए रखने के लिए बर्तनों को प्लास्टिक गुंबद के साथ कवर करें और उन्हें स्तरीकरण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट: स्तरीकरण (उच्च आर्द्रता और कम तापमान पर इनक्यूबेशन, जैसा कि वर्णित है) बीजों के अंकुरण दर और सिंक्रनाइज़ में सुधार करता है। - गमलों को अल्पकालिक परिस्थितियों में पौधे के विकास कक्ष में स्थानांतरित करें (21 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे प्रकाश / 16 घंटे अंधेरा, प्रकाश तीव्रता: 100 μmol.m-2.s-1, सापेक्ष आर्द्रता: 70%)।
- बीज अंकुरण (8-10 दिन) के बाद, अधिकांश रोपाई को हटाने के लिए चिमटी का उपयोग करें, बर्तन की प्रत्येक स्थिति में एक अंकुर रखें (छह रोपाई / बर्तन) (चित्रा 1 डी)। बर्तनों को उजागर करने के लिए प्लास्टिक गुंबद को हटा दें।
नोट: पौधे अंकुरण के 4-5 सप्ताह बाद उपयोग करने के लिए तैयार होंगे।
- फेजोलस वल्गारिस बीन (कल्टीवर कैनेडियन वंडर) पौधे तैयार करें।
- तौलिया पेपर के गीले टुकड़े के साथ पेट्री डिश के निचले हिस्से को कवर करें, और इसके ऊपर बीन के बीज रखें। पेट्री डिश को सर्जिकल टेप के साथ सील करें और 3-4 दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (चित्रा 2 ए)।
- अंकुरित बीजों को गीले 1: 3 वर्मीक्यूलाइट-प्लांट सब्सट्रेट मिश्रण से भरे 10 सेमी व्यास के बर्तन में स्थानांतरित करें।
- लंबे समय तक सेटिंग्स के तहत एक पौधे के विकास कक्ष में इनक्यूबेट करें (23 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे प्रकाश / 8 घंटे अंधेरा, प्रकाश तीव्रता: 100 μmol-m-2.s-1, सापेक्ष आर्द्रता: 70%)।
नोट: पौधे अंकुरण के 10 दिनों के बाद उपयोग करने के लिए तैयार होंगे (चित्रा 2 बी)।
2. एराबिडोप्सिस और बीन पौधों का टीकाकरण
नोट: इस अध्ययन में, उपभेद पी सिरिंगे पीवी। टमाटर डीसी 3000 और पी। फेजोलिकोला 1448 ए का उपयोग किया गया था।
- पी सिरिंगे इनोकुलम तैयार करें।
- -80 डिग्री सेल्सियस ग्लिसरॉल स्टॉक से रुचि के पी सिरिंगा तनाव को एलबी प्लेट (10 ग्राम / एल ट्रिप्टोन, 5 ग्राम / एल एनएसीएल, 5 ग्राम / एल खमीर निकालने, और 16 ग्राम / एल बैक्टीरियोलॉजिकल एगर, सामग्री की तालिका देखें) पर उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक करें। 40-48 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
नोट: एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग की सिफारिश की जाती है यदि रुचि का तनाव प्लास्मिड या जीनोमिक प्रतिरोध जीन को वहन करता है। सिरिंगे के लिए अनुशंसित एंटीबायोटिक सांद्रता निम्नानुसार हैं: कनामाइसिन (15 μg / mL), जेंटामाइसिन (10 μg / mL), एम्पीसिलीन (300 μg / mL) ( सामग्री की तालिका देखें)। - बैक्टीरियल बायोमास को स्क्रैप करें और 10 एमएम एमजीसीएल2 के 5 एमएल में फिर से निलंबित करें। OD 600 को मापें और 10 mM MgCl2 जोड़कर 0.1 में समायोजित करें।
नोट: पी सिरिंगे संस्कृति के 0.1 का एक ओडी600 5 x 107 CFU.mL-1 से मेल खाता है। - 5 x 105 CFU.mL−1 की अंतिम इनोकुलम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 10 mM MgCl2 में सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें। एराबिडोप्सिस पौधों के लिए 200 एमएल इनोकुलम और बीन पौधों के लिए 50 एमएल तैयार करें।
- टीकाकरण से ठीक पहले, सर्फेक्टेंट सिलवेट एल -77 ( सामग्री की तालिका देखें) को बीन टीकाकरण के लिए 0.02% और एराबिडोप्सिस के लिए 0.01% की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। ध्यान दें कि सिलवेट एराबिडोप्सिस ऊतक के लिए कुछ हद तक हानिकारक है।
- -80 डिग्री सेल्सियस ग्लिसरॉल स्टॉक से रुचि के पी सिरिंगा तनाव को एलबी प्लेट (10 ग्राम / एल ट्रिप्टोन, 5 ग्राम / एल एनएसीएल, 5 ग्राम / एल खमीर निकालने, और 16 ग्राम / एल बैक्टीरियोलॉजिकल एगर, सामग्री की तालिका देखें) पर उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक करें। 40-48 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- वैक्यूम घुसपैठ करें।
- एराबिडोप्सिस घुसपैठ के लिए, बर्तन के ऊपर एक एक्स बनाने वाली दो लकड़ी की छड़ें रखें (चित्र 1 ई), और बर्तन को 200 एमएल इनोकुलम (चित्रा 1 एफ) युक्त 14 सेमी व्यास पेट्री डिश के सामने रखें।
- बीन के पत्तों के टीकाकरण के लिए, पत्ती को 50 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पेश करें जिसमें इनोकुलम (चित्रा 2 सी) होता है।
- इनोकुलम घोल में डूबे पौधों को वैक्यूम कक्ष (चित्रा 1 जी और चित्रा 2 डी) में डालें और पत्तियों में घुसपैठ करने के लिए 30 सेकंड के लिए 500 एमबार की पल्स दें। वैक्यूम पल्स को 2-3 बार दोहराएं जब तक कि पत्ती पूरी तरह से घुसपैठ न हो जाए (चित्रा 1 एच और चित्रा 2 ई)।
- अतिरिक्त इनोकुलम घोल को कागज के एक टुकड़े के साथ निकालें और पौधों को उनके संबंधित विकास कक्ष में वापस लाएं।
3. एपोप्लास्ट से बैक्टीरिया का निष्कर्षण
- टीकाकरण के चार दिन बाद, एराबिडोप्सिस पौधे के हवाई हिस्से या बीन के पौधे से टीका लगाए गए पत्ते को काट लें और इसे सुई के बिना 20 एमएल सिरिंज में रखें (चित्रा 2 जी)। बीन के पत्तों के लिए, पत्ती को अपने आप रोल करें, अक्षीय चेहरे को बाहर की ओर छोड़ दें, जैसा कि चित्र 2 एफ में दिखाया गया है।
- ऊतक को कवर करने के लिए आसुत जल की पर्याप्त मात्रा जोड़ें (आमतौर पर 10-15 एमएल)।
- प्लंजर डालें, और सिरिंज को ऊर्ध्वाधर स्थिति में नोक के साथ इंगित करते हुए, बैरल को धीरे से टैप करके सिरिंज के अंदर अतिरिक्त हवा और हवा के बुलबुले को हटा दें जब तक कि सभी हवा नोक के पास स्थित न हो। हवा को बाहर निकालने के लिए फिर प्लंजर को स्लाइड करें। एक बार जब सिरिंज के अंदर जितना संभव हो उतना कम हवा हो, तो पैराफिन फिल्म के साथ सिरिंज बैरल की नोक को कवर करें।
- सकारात्मक दबाव उत्पन्न करने के लिए प्लंजर को ध्यान से दबाएं जब तक कि ऊतक गहरा न हो जाए (चित्रा 1 आई और चित्रा 2 एच)। फिर, नकारात्मक दबाव उत्पन्न करने के लिए प्लंजर को खींचें (चित्रा 1 जे और चित्रा 2 आई)। इस चरण को 3-5 बार दोहराएं।
- पैराफिन फिल्म और प्लंजर को हटा दें और एपोप्लास्ट-निकाले गए बैक्टीरिया युक्त तरल पदार्थ एकत्र करें, जैसा कि चित्रा 2 जे में है।
4. एपोप्लास्ट-निकाले गए बैक्टीरिया का एकल-कोशिका विश्लेषण
- नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना करें।
- आसुत जल में 1.5% अगारोस घोल तैयार करें। पिघलने के बाद, दो माइक्रोस्कोपी स्लाइडों के बीच की जगह को भरने के लिए पर्याप्त मात्रा जोड़ें और उस पर शीर्ष पर एक और स्लाइड रखें (चित्रा 3)। उन्हें 15 मिनट के लिए सूखने दें और शीर्ष पर रखी स्लाइड को ध्यान से हटा दें। ब्लेड का उपयोग करके, उपयोग करने से ठीक पहले अगारोस पैड को 5 मिमी x 5 मिमी टुकड़ों में काट लें।
- समानांतर रूप से, कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 12,000 x g पर एपोप्लास्ट-निकाले गए बैक्टीरिया के सेंट्रीफ्यूज 1 एमएल, पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक हटा दें, और कोशिकाओं को केंद्रित करने के लिए 20 μL पानी में गोली को फिर से निलंबित करें। 0.17 मिमी कवरस्लिप पर केंद्रित कोशिकाओं की 2 μL की बूंद रखें और चरण 1 में पहले प्राप्त अगारोस पैड के 5 मिमी x 5 मिमी टुकड़े के साथ बूंद को कवर करें, जैसा कि चित्र 3 में दर्शाया गया है।
- कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत बैक्टीरिया की तैयारी की कल्पना करें ( सामग्री की तालिका देखें)। हरे-फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए, 488 एनएम पर उत्तेजना लेजर और 500 एनएम से 550 एनएम तक के उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग करें। सभी बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए, उज्ज्वल क्षेत्र का उपयोग करें और दोनों क्षेत्रों को विलय करें।
- फिजी का उपयोग करके कॉन्फोकल छवियों को संसाधित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। ऐसा करने के लिए, बैक्टीरियल सेल के समोच्च की पहचान करने और भीतर प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए माइक्रोबजे प्लगइन का उपयोग करें।
नोट: इस विश्लेषण के लिए पृथक बैक्टीरिया (क्लस्टर नहीं) से छवि अधिग्रहण की सिफारिश की जाती है।
- प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करें।
- प्रवाह-साइटोमीटर का उपयोग करके विश्लेषण करने के लिए एपोप्लास्ट-निकाले गए बैक्टीरिया निलंबन का एक एलिकोट लें। 100,000 घटनाओं का अधिग्रहण करें।
- बैक्टीरिया और पौधे के मलबे के बीच भेदभाव करने के लिए, एक गैर-टीकाकृत पौधे से निकाले गए एपोप्लास्ट का विश्लेषण करें और इसके फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) सेल आकार बनाम साइड स्कैटर (एसएससी) सेल आकार को एपोप्लास्ट-निकाले गए बैक्टीरियल सस्पेंशन के साथ दिखाते हुए डॉट प्लॉट की तुलना करें। गैर-फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए, गैर-फ्लोरोसेंट इसोजेनिक बैक्टीरिया के साथ टीका लगाए गए पौधों से निकाले गए एपोप्लास्ट का उपयोग करें और उनके फ्लोरोसेंट उत्सर्जन की तुलना करें।
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Representative Results
पौधे के भीतर जीवाणु वृद्धि के लिए टाइप III स्राव प्रणाली की अभिव्यक्ति आवश्यक है। टी 3 एसएस जीन की समय पर अभिव्यक्ति जटिल विनियमन के माध्यम से प्राप्त की जाती है, जिसके केंद्र में एक्स्ट्रासाइटोप्लाज्मिक फ़ंक्शन (ईसीएफ) सिग्मा फैक्टर एचआरपीएल है, जो टी 3 एसएस से संबंधित जीन11 की अभिव्यक्ति का प्रमुख उत्प्रेरक है। एचआरपीएल की अभिव्यक्ति का विश्लेषण पहले क्रोमोसोम-स्थित ट्रांसक्रिप्शनल फ्यूजन का उपयोग करके डाउनस्ट्रीम प्रमोटरलेस जीएफपी जीन में किया गया था और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री 9 द्वारा अभिव्यक्ति पैटर्न का पालन करके कियागया था। ये संलयन पीसीआर और पारंपरिक क्लोनिंग के माध्यम से उत्पन्न प्लास्मिड-एन्कोडेड संरचनाओं के समरूप पुनर्संयोजन-मध्यस्थता एकीकरण के माध्यम से उत्पन्न होते हैं और रुचि के जीन (स्टॉप कोडन सहित) के ओआरएफ के अंतिम 500 बेस जोड़े और अनुक्रम के 500 बेस जोड़े को तुरंत नीचे की ओर ले जाते हैं, राइबोसोम-बाइंडिंग साइट और फ्लोरेसेंस रिपोर्टर जीन के ओआरएफ का उपयोग किया जाता है (इस मामले में, जीएफपी), इसके बाद एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट (इस मामले में, एनपीटी 2 जीन कनामाइसिन के प्रतिरोध को प्रदान करता है)। इस प्रकार, यह स्थापित किया गया था कि एचपीएल सहित टी 3 एसएस से संबंधित जीन को व्यक्त करने वाले एपोप्लास्ट-निकाले गए पी सिरिंगे आबादी प्लांटा9 में विषम हैं। इस मिसाल पर, कॉनफोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और एचआरपीएल अभिव्यक्ति के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम मॉडल उपभेदों पीपीएच 1448 ए (पीपीएच) और पीटीओ डीसी 3000 (पीटीओ) के व्यक्तिगत जीवाणु कोशिकाओं में दिखाए गए हैं, जो क्रमशः पत्ती एपोप्लास्ट के उपनिवेशीकरण के बाद बीन या एराबिडोप्सिस की पत्तियों से निकाले जाते हैं (चित्रा 4)। प्रत्येक तनाव में, पी सिरिंगे क्रोमोसोमल एचआरपीएल जीन एक प्रमोटरलेस जीएफपी जीन के लिए एक डाउनस्ट्रीम ट्रांसक्रिप्शनल संलयन करता है जो जीएफपी अभिव्यक्ति स्तर 8,9 का पालन करके एचआरपीएल मूल प्रमोटर गतिविधि की निगरानी करने की अनुमति देता है।
एपोप्लास्ट-निकाले गए बैक्टीरिया का उपयोग विभिन्न विश्लेषणों के लिए किया जा सकता है। यहां, उपर्युक्त रिपोर्टर बैक्टीरियल उपभेदों में से 300 μL संक्रमित एराबिडोप्सिस या बीन पौधों के एपोप्लास्ट से निकाले गए थे और प्रवाह साइटोमीटर प्रणाली का उपयोग करके डेटा अधिग्रहण के लिए उपयोग किए गए थे ( सामग्री की तालिका देखें)। 488 एनएम पर लेजर उत्सर्जन और एफआईटीसी फिल्टर का उपयोग जीएफपी का पता लगाने के लिए किया गया था। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण आबादी के भीतर व्यक्तिगत जीवाणु कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति वितरण को दर्शाता है। एचआरपीएल की विषम अभिव्यक्ति को एराबिडोप्सिस एपोप्लास्ट-निकाले गए पीटीओ में फ्लो साइटोमेट्री और बीन एपोप्लास्ट-निकाले गए पीपीएच में स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है, जिसमें एचआरपीएलऑफ (जीएफपी व्यक्त नहीं) बैक्टीरिया शामिल हैं, और ये परिणाम संबंधित नमूनों की सूक्ष्म परीक्षा द्वारा समर्थित हैं (चित्रा 4)। डॉट प्लॉट ग्राफ (बाएं पैनल) जनसंख्या में जीएफपी बनाम सेल आकार की प्रतिदीप्ति तीव्रता के वितरण को दिखाते हैं (चित्रा 4 ए), जबकि हिस्टोग्राम जीएफपी बनाम सेल गणना (चित्रा 4 बी) की प्रतिदीप्ति तीव्रता दिखाते हैं। साइटोमेट्री डेटा के ये दो अलग-अलग ग्राफिकल प्रतिनिधित्व शोधकर्ता को सूक्ष्म दृश्य बारीकियों को स्थापित करने और पूरक जानकारी प्रदान करने की अनुमति देते हैं। बैक्टीरियल ऑटोफ्लोरेसेंस के लिए एक नियंत्रण के रूप में, संबंधित गैर-जीएफपी जंगली-प्रकार के तनाव का उपयोग किया गया था ( चित्रा 4 ए में ऊपरी पैनल और चित्रा 4 बी में ग्रे हिस्टोग्राम)। यह ग्राफ क्षेत्र की पहचान करने की अनुमति देता है जहां आबादी के भीतर गैर-जीएफपी बैक्टीरिया प्रदर्शित होते हैं। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण मात्रात्मक डेटा भी उत्पन्न करते हैं। एक उदाहरण के रूप में, एचपीएलओएन (फ्लोरोसेंट) कोशिकाओं के प्रतिशत को एपोप्लास्ट-निकाले गए पीटीओ और पीपीएच आबादी में निकाला जाता है। चित्रा 4 सी दिखाता है कि एचआरपीएलऑन प्रतिशत इन आबादी में एचआरपीएलऑफ (गैर-फ्लोरोसेंट) कोशिकाओं के संबंधित प्रतिशत से अधिक थे, खासकर पीटीओ मॉडल में। इन आंकड़ों का उपयोग पूरी आबादी के लिए औसत या औसत प्रतिदीप्ति की गणना करने के लिए भी किया जा सकता है। इस विशेष प्रयोग में, औसत जीएफपी प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्त की गई थी, जो कि ओपीएच की तुलना में पीटीओ आबादी के लिए अधिक थी, ओएन कोशिकाओं के उच्च प्रतिशत को ध्यान में रखते हुए। औसत स्तर गैर-एकल सेल तकनीकों जैसे आरटी-क्यूपीसीआर या आरएनएसेक के माध्यम से प्राप्त डेटा के बराबर जनसंख्या-स्तर के डेटा का गठन करते हैं। अंत में, भिन्नता का मजबूत गुणांक (आरसीवी) 12, जिसे माध्य द्वारा विभाजित पहले चतुर्थक को घटाकर तीसरे चतुर्थक के रूप में गणना की जाती है, को भी दिखाया गया है। आरसीवी का उपयोग अक्सर डेटा फैलाव (यानी, आबादी के भीतर अभिव्यक्ति की विषमता) का अनुमान लगाने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री अध्ययन में किया जाता है। वर्तमान अध्ययन में, पीटीओ की तुलना में पीपीएच के लिए आरसीवी थोड़ा अधिक था, हालांकि अंतर इन दो उपभेदों की आबादी के भीतर अभिव्यक्ति के वितरण को काफी अलग करने के लिए पर्याप्त नहीं था। एचआरपीएल अभिव्यक्ति की विषमता को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों (चित्रा 4 डी) के साथ नेत्रहीन रूप से पुष्टि की जा सकती है। माइक्रोस्कोपी तैयार करने के लिए एगर पैड के उपयोग से आसान विज़ुअलाइज़ेशन और व्यक्तिगत कोशिकाओं की उच्च गुणवत्ता वाली छवियां होती हैं क्योंकि यह बैक्टीरिया को एक परत पर धकेलता है और बैक्टीरिया के आंदोलन को रोकता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित टीकाकरण और जीवाणु निष्कर्षण प्रक्रियाएं बैक्टीरिया की तैयारी के भीतर पौधे के मलबे की मात्रा को कम करती हैं, इस प्रकार इन विभिन्न तकनीकों द्वारा जीवाणु अभिव्यक्ति के विश्लेषण की अनुमति देती हैं (चित्रा 4)।
चित्र 1: एराबिडोप्सिस पौधों का उपयोग करके बैक्टीरियल टीकाकरण और एपोप्लास्ट निष्कर्षण। (ए) धातु जाल के साथ बर्तन की तैयारी ठीक से जुड़ी हुई है। (बी) बीजों को वितरित करने के लिए टूथपिक का उपयोग करके बीज बोना जैसा कि (सी) में दर्शाया गया है। (डी) एराबिडोप्सिस पौधे टीकाकरण के लिए तैयार हैं। (ई) दो लकड़ी की छड़ें बर्तन या मिट्टी (एफ) तक पहुंचने के बिना बैक्टीरिया के घोल में पौधों के विसर्जन की सुविधा प्रदान करती हैं। (जी) पहनावा वैक्यूम कक्ष के अंदर रखा जा सकता है। (एच) कक्ष से वैक्यूम छोड़ने के बाद घुसपैठ की गई पत्तियां गहरी हो जाती हैं। (I) अलग किए गए पत्तों को 20 एमएल सिरिंज में रखा जाता है और पानी से ढक दिया जाता है। (जे) सकारात्मक और नकारात्मक दबाव के चक्र के परिणामस्वरूप एपोप्लास्टिक बैक्टीरिया का निष्कर्षण होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: बीन पौधों का उपयोग करके बैक्टीरियल टीकाकरण और एपोप्लास्ट निष्कर्षण। (ए) गीले टॉयलेट पेपर के साथ पंक्तिबद्ध पेट्री व्यंजनों में सेम के बीज का अंकुरण। (बी) टीकाकरण के लिए तैयार बीन प्लांट। (सी) 50 एमएल ट्यूब में निहित जीवाणु समाधान में डूबी सेम की पत्ती। (डी) पत्तियों को वैक्यूम कक्ष के अंदर टीका लगाया जाता है जब तक कि ऊतक गहरा (ई) न हो जाए। (एफ) सेम की पत्ती को रोल किया जाता है, 20 एमएल सिरिंज के अंदर रखा जाता है, और पानी (जी) के साथ कवर किया जाता है। (एच) सकारात्मक और नकारात्मक दबाव (आई) के चक्रों के परिणामस्वरूप एपोप्लास्टिक बैक्टीरिया का निष्कर्षण होता है जिसे ट्यूब (जे) में पुनर्प्राप्त किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: एगर पैड की सेटिंग और तैयारी का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: एराबिडोप्सिस या बीन पत्तियों से प्राप्त एपोप्लास्ट-निकाले गए बैक्टीरिया का विश्लेषण क्रमशः पी. सिरिंगे पीवी टमाटर (पीटीओ) या पी. सिरिंगे पीवी. फेजोलिकोला (पीपीएच) के साथ टीकाकरण के 4 दिन बाद। एचआरपीएल की अभिव्यक्ति:: जीएफपी को जीएफपी फ्लोरेसेंस के रूप में मॉनिटर किया जाता है। (ए) फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण को डॉट प्लॉट (फॉरवर्ड स्कैटर [सेल आकार] बनाम जीएफपी फ्लोरेसेंस तीव्रता) के रूप में दर्शाया गया है। गैर-जीएफपी बैक्टीरिया पीटीओ या पीपीएच के जंगली प्रकार के तनाव का संकेत देते हैं। ऊर्ध्वाधर रेखा गैर-जीएफपी आबादी के 99% को सीमांकित करती है। (बी) फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण को हिस्टोग्राम (सेल काउंट बनाम जीएफपी फ्लोरेसेंस तीव्रता) के रूप में दर्शाया गया है। ग्रे हिस्टोग्राम गैर-जीएफपी तनाव का प्रतिनिधित्व करता है। (सी) फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण से मात्रात्मक डेटा उत्पन्न किया गया था। ऑन और ऑफ कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना डॉट प्लॉट में दिखाए गए वितरण के आधार पर की जाती है। औसत प्रयोग में प्राप्त औसत प्रतिदीप्ति को इंगित करता है। भिन्नता के मजबूत गुणांक (आरसीवी) की गणना तीसरे चतुर्थक के रूप में की जाती है जिसमें माध्य द्वारा विभाजित पहले चतुर्थक शामिल हैं। (डी) फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियां एचआरपीएल की अभिव्यक्ति से जुड़े जीएफपी के विषम स्तरों को दर्शाती हैं। सफेद तीर निम्न स्तर या कोई जीएफपी प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करने वाले बैक्टीरिया को उजागर करते हैं। स्केल पट्टी: 3 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
यहां प्रस्तुत विधि एक गैर-इनवेसिव प्रक्रिया का वर्णन करती है जो पौधे के पर्ण ऊतक में बैक्टीरिया की घुसपैठ की अनुमति देती है, जिससे ऊतक व्यवधान को कम करते हुए बड़ी मात्रा में तेजी से टीकाकरण की अनुमति मिलती है। सिरिंगे प्रजाति परिसर की विशेषताओं में से एक पौधे के एपोप्लास्ट के अंदर और एपिफाइट14 के रूप में पौधे की सतह पर जीवित रहने और प्रसार करने की क्षमता है। इस प्रकार, इस संभावना से इनकार नहीं किया जा सकता है कि वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके निकाले गए बैक्टीरिया केवल पौधे के एपोप्लास्ट से आते हैं। हालांकि, यह पहले कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया था कि पत्ती की सतह पर बैक्टीरिया का अनुपात पौधे की पत्ती5 के अंदर बैक्टीरिया के विकास की तुलना में विशेष रूप से मामूली है। निष्कर्षण से पहले पत्ती की सतह की सूक्ष्म परीक्षा द्वारा इसकी जांच की जा सकती है। इसके अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल में एक मॉडल के रूप में उपयोग किए जाने वाले पी सिरिंगे उपभेदों, पीटीओ डीसी 3000 और पीपीएच 1448 ए, को कमजोर एपिफाइट्स15 के रूप में प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है, जो निकाले गए बैक्टीरिया के अप्रासंगिक अनुपात का प्रतिनिधित्व करते हैं। बहरहाल, यदि विधि को अन्य पैथोसिस्टम के लिए अनुकूलित किया जाना है, तो पत्ती की सतह परिशोधन का एक पूर्व चरण वर्तमान प्रोटोकॉल में जोड़ा जा सकता है।
पारंपरिक टीकाकरण विधियां, जैसे कि सिरिंज16 का उपयोग करके पत्ती घुसपैठ, टीकाकरण स्थल पर बड़े, कठिन-से-अनुमानित ऊतक क्षति का कारण बनती हैं, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक परिगलन होता है। इसके अलावा, विभिन्न टीकाकरण बिंदुओं के बीच क्षति की मात्रा बहुत परिवर्तनशील है। इसके अलावा, विभिन्न पौधों की प्रजातियां पत्ती घुसपैठ के प्रति उनकी सहनशीलता में भिन्न होती हैं। उदाहरण के लिए, एराबिडोप्सिस के पत्तों में घुसपैठ करना आसान होता है, जबकि सेम के पत्ते अधिक उद्दंड होते हैं। विकास की स्थिति किसी दिए गए प्रजाति की घुसपैठ के लिए सहिष्णुता के स्तर को भी प्रभावित करती है। अधिक सौम्य पारंपरिक टीकाकरण विधियां, जैसे कि पत्ती की डुबकी या पत्ती स्प्रे, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक का अधिक प्राकृतिक और क्षति-मुक्त जीवाणु प्रवेश और उपनिवेशीकरण होता है, हालांकि, स्वाभाविक रूप से प्राप्त जीवाणु आबादी के आकार को सीमित करता है, अक्सर एपोप्लास्टिक जीवाणु नमूनों के बाद के विश्लेषण के लिए आवश्यक सीमा से नीचे। . प्रस्तावित टीकाकरण विधि बैक्टीरिया के नमूने के आकार की सीमा से बचते हुए सिरिंज दबाव के परिणामस्वरूप टीका क्षेत्रों में नेक्रोसिस की सक्रियता को काफी कम कर देती है और काफी पत्ती क्षेत्रों को टीका लगाने का एक आसान, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और त्वरित तरीका प्रदान करती है।
बड़े ऊतक क्षेत्रों के टीकाकरण की आवश्यकता वाली कुछ तकनीकें बहुत समय और श्रम लेने वाली हो सकती हैं, जिससे ऊतक क्षति होने की संभावना बढ़ जाती है। इस विधि को लागू करके, हम ऊतक अखंडता से समझौता किए बिना केवल एक चरण में पांच या अधिक एराबिडोप्सिस पौधों, या एक पूरे सेम पत्ती को टीका लगा सकते हैं। इस तकनीक को बड़ी संख्या में पौधों या कृषि संबंधी या अकादमिक रुचि के अन्य पौधों की प्रजातियों, जैसे निकोटियाना बेंथामियाना, टमाटर, या सोयाबीन को टीका लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। बैक्टीरिया निलंबन की घुसपैठ को सुविधाजनक बनाने के लिए सतह के पानी के तनाव को कम करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सर्फेक्टेंट की एकाग्रता को पौधे की प्रजातियों के आधार पर पहले से समायोजित और परीक्षण किया जाना चाहिए, क्योंकि सर्फेक्टेंट की उच्च सांद्रता के परिणामस्वरूप कुछ मामलों में ऊतक परिगलन हो सकता है। इसके अलावा, लागू दबाव की मात्रा और टीकाकरण प्रक्रिया की अवधि को इष्टतम परिणाम सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न प्रजातियों में पौधे की पत्ती द्वारा पेश किए गए प्रतिरोध में समायोजित किया जाना चाहिए।
एपोप्लास्ट निष्कर्षण के संबंध में, वर्तमान विधि ऊतक व्यवधान को भी कम करती है, इस प्रकार निकाले गए नमूने में मौजूद पौधे के मलबे की मात्रा को कम करती है। यह क्लीनर नमूनों की अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप आरएनए-सेक, फ्लो साइटोमेट्री या माइक्रोस्कोपी जैसी विभिन्न तकनीकों के माध्यम से अधिक कुशल विश्लेषण होता है, जैसा कि उदाहरण में दिखाया गया है। न्यूनतम ऊतक और पौधे कोशिका व्यवधान के साथ अपने एपोप्लास्टिक वातावरण से रोगजनक जीवाणु आबादी की वसूली चुनौतीपूर्ण है। सिरिंगे एपोप्लास्ट के अंतरकोशिकीय रिक्त स्थान को उपनिवेशित करता है, जिससे माइक्रोकॉलोनियों का निर्माण होता है। सिरिंगे जैसे बाह्य रोगज़नक़ का उपयोग करना, यहां प्रस्तुत तरीकों की अनुमति देता है, क्योंकि बैक्टीरिया की वसूली के लिए ऊतक और कोशिका व्यवधान की आवश्यकता नहीं होती है। सकारात्मक और नकारात्मक दबाव के दौर माइक्रोकॉलोनियों को बाधित करते हैं, बैक्टीरिया को फैलाते हैं और प्राकृतिक उद्घाटन (स्टोमेटा) के माध्यम से उनके आसान और तेजी से निष्कर्षण की अनुमति देते हैं, जीन अभिव्यक्ति में किसी भी बदलाव से बचते हैं जो लंबे इनक्यूबेशन बार हो सकते हैं, जैसे कि एपोप्लास्टिक रिकवरी के अधिक सौम्य तरीकों के लिए आवश्यक। बचे हुए पौधे के ऊतकों की सूक्ष्म परीक्षा अधिकांश जीवाणु आबादी को हटाने का समर्थन करती है। एपोप्लास्टिक द्रव निष्कर्षण प्रोटोकॉल का व्यापक रूप से एपोप्लास्टिक द्रव17 की जटिलता का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है। इन प्रोटोकॉल में बरामद एपोप्लास्टिक द्रव को और साफ करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन का अंतिम चरण होता है। यहां, सिरिंज प्लंजर का उपयोग करके सकारात्मक और नकारात्मक दबाव के कोमल चक्रों का उपयोग किया गया था, इस प्रकार मेजबान-सेलुलर मलबे के साथ नमूना संदूषण को कम किया गया था, जबकि जीवाणु वसूली की दक्षता पर बहुत कम प्रभाव पड़ता है। एक क्लासिक सौम्य जीवाणु निष्कर्षण विधि में 1-2 घंटे18 के लिए सर्फेक्टेंट के साथ पत्ती डिस्क या रोपाई की इनक्यूबेशन होती है। यह विधि बैक्टीरिया को निकालने के लिए यहां प्रस्तुत की गई विधि के रूप में कुशल नहीं है; हालांकि, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए इसकी प्रमुख सीमा जनसंख्या की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल पर आवश्यक इनक्यूबेशन समय का प्रभाव है। इसके द्वारा प्रस्तुत विधि एपोप्लास्टिक आबादी की त्वरित वसूली और तत्काल विश्लेषण के लिए अनुमति देती है, इस प्रकार सेलुलर स्तर पर जीन अभिव्यक्ति परिणामों को दरकिनार करने के जोखिम को कम करती है।
रोगजनक बैक्टीरिया में फेनोटाइपिक विषमता का व्यापक रूप से सजातीय प्रयोगशाला मीडिया का उपयोग करके अध्ययन किया गया है। उनके प्राकृतिक आला में उगाई गई जीवाणु आबादी का अध्ययन अक्सर तकनीकी बाधाओं के कारण सीमित होता है, जैसे कि मेजबान सेल मलबे के साथ अतिरिक्त संदूषण के बिना बैक्टीरिया की आबादी को पुनर्प्राप्त करने में कठिनाई जो डाउनस्ट्रीम एकल-कोशिका विश्लेषण में हस्तक्षेप करती है। टीकाकरण और निष्कर्षण की यह संयुक्त विधि पूरी तरह से एकल-कोशिका विश्लेषण के लिए जीवाणु रोगजनकों की बड़ी एपोप्लास्टिक आबादी की पीढ़ी की अनुमति देती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस कार्य को MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ और "ERDP को यूरोप बनाने का एक तरीका" द्वारा वित्त पोषित प्रोजेक्ट ग्रांट RTI2018-095069-B-I00 द्वारा समर्थित किया गया था। जेएसआर को प्लान एंडालुज़ डी इन्वेस्टिगासिओन, डेसररोलो ई इनोवैसिओन (पेडी 2020) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। एनएलपी को प्रोजेक्ट ग्रांट पी 18-आरटी -2398 द्वारा प्लान एंडालुज़ डी इन्वेस्टिगासियोन, डेसररोलो ई इनोवासियोन से वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
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