Summary
本プロトコルは、植物アポプラスト内で増殖した シュードモナス・シリンガエ 集団の単一細胞遺伝子発現解析を可能にする方法を記載する。
Abstract
多数の病原性微生物が絶えず植物を攻撃しています。 シュードモナス・シリンガエ 種複合体は、多数の宿主に特に関連するグラム陰性植物病原性細菌を包含する。 P. syringae は葉の表面から植物に入り、アポプラスト内で急速に増殖し、細胞間空間を占める微小コロニーを形成します。細菌による蛍光タンパク質の構成的発現は、微小コロニーの可視化および顕微鏡レベルでの感染の発生のモニタリングを可能にする。シングルセル解析の最近の進歩により、クローン同質遺伝子細菌集団が到達する大きな複雑さが明らかになりました。表現型の不均一性と呼ばれるこの複雑さは、細菌群集間の遺伝子発現の細胞間の違い(遺伝的差異とは関連していない)の結果です。個々の遺伝子座の発現を単一細胞レベルで解析するために、蛍光タンパク質への転写融合が広く用いられている。植物アポプラストのコロニー形成中に発生するようなストレス条件下では、 P. syringae は、主要な病原性遺伝子(すなわち、HrpタイプIII分泌系)の不均一な発現に基づいて、異なる亜集団に分化します。しかし、植物組織から回収された P. syringae 集団の単一細胞分析は、接種および細菌抽出プロセスに固有の機械的破壊中に放出される細胞破片のために困難です。本報告では、シロイヌナズナとマメのコロニー形成中に関心のある P. syringae 遺伝子の発現を単一細胞レベルでモニタリングするために開発された方法について詳述する。真空チャンバーを用いた接種に使用される植物および細菌懸濁液の調製について説明する。アポプラスチック流体抽出による感染葉からの内生細菌の回収についてもここで説明します。細菌接種法と細菌抽出法の両方が、植物および細菌細胞の損傷を最小限に抑えるように経験的に最適化されているため、顕微鏡検査およびフローサイトメトリー分析に最適な細菌調製物が得られます。
Introduction
病原性細菌は多様な表現型に違いを示し、遺伝的に同一の集団内に亜集団の形成を引き起こします。この現象は表現型不均一性として知られており、細菌と宿主の相互作用における適応戦略として提案されています1。共焦点顕微鏡、フローサイトメトリー、マイクロフルイディクスの光学分解能の最近の進歩は、蛍光タンパク質と組み合わせて、細菌集団の単一細胞分析を促進しました2。
グラム陰性 シュードモナス・シリンガエ は、その学術的および経済的重要性の両方のために、典型的な植物病原菌です3。 P. syringae の生活環は水循環4と関連している。 P. syringae は、葉肉細胞間の細胞間空間に入り、植物の葉アポプラスト、気孔または創傷などの自然の開口部を通って入る5。アポプラスト内に入ると、 P. syringae はIII型分泌系(T3SS)とIII型転座エフェクター(T3E)に依存して植物の免疫を抑制し、病原体の利益のために植物の細胞機能を操作します6。T3SSおよびT3Eの発現は、標的遺伝子のプロモーター領域における hrp-box モチーフに結合する代替シグマ因子であるマスターレギュレーターHrpLに依存する7。
染色体に位置する転写融合を目的の遺伝子の下流にある蛍光タンパク質遺伝子に生成することにより、単一細胞レベルで放出される蛍光レベルに基づいて遺伝子発現をモニターすることができます8。この方法を使用すると、hrpLの発現は、実験室で増殖した細菌培養物内および植物アポプラストから回収された細菌集団内の両方で不均一であることが確立されました8,9。単一細胞レベルでの遺伝子発現解析は、通常、実験室培地で増殖した細菌培養物で行われますが、このような解析は、植物内で増殖する細菌集団に対しても実施できるため、自然界での亜集団の形成に関する貴重な情報が得られます。植物から抽出された細菌集団の分析の潜在的な制限は、アポプラストへの注射器圧浸潤による古典的な接種方法、それに続く葉組織の浸軟による細菌抽出が、典型的には、下流の分析を妨げる大量の細胞植物残渣を生成することである10。ほとんどの細胞破片は、GFP蛍光と重なる葉緑体の自己蛍光断片で構成されており、誤解を招く結果をもたらします。
本プロトコルは、2つのモデル病理系における単一細胞遺伝子発現不均一性を分析するプロセスを記載している: P. syringae pvによって形成されるもの。トマト株DC3000と シロイヌナズ ナ(Col-0)、その他は P. syringae pvによる。ファセオリコラ株1448Aおよび豆植物(フェイセオラス・ブルガリス 品種カナディアンワンダー)。真空チャンバーとポンプを用いた真空浸透に基づく接種方法を提案し、葉全体を迅速かつダメージフリーに浸透させる方法を提供します。さらに、従来のプロトコルの改善として、注射器内の少量の容量を使用して正負の圧力のサイクルを適用することによるアポプラストの抽出に基づいて、組織破壊を大幅に減少させるより穏やかな方法を使用して、組織破壊を大幅に減少させます。
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Protocol
1.植物の準備
- 以下の手順に従ってシロイヌナズナCol-0植物を準備します。
- 直径10 cmのポットに、事前に水をやった1:3のバーミキュライトと植物の基質混合物( 材料の表を参照)を入れ、ポットを1.6 mm x 1.6 mmの穴のある15 cm x 15 cmの金属メッシュで覆います。輪ゴムを使用して、金属メッシュを湿った土に調整します(図1A)。
- 濡れたつまようじで、シロイヌナズナの種を金属メッシュの穴にまきます。ポット内の離れた位置に3〜4個の種子を置きます(図1B、C)。
- ポットをプラスチックドームで覆い、相対湿度を高く保ち、成層のために4°Cで72時間インキュベートします。
注:成層化(説明されているように、高湿度および低温でのインキュベーション)は、種子の発芽率と同期を改善します。 - 短日条件(21°Cで8時間明/16時間暗、光強度:100μmol・m−2・s−1、相対湿度:70%)で鉢を植物成長室に移します。
- 種子の発芽後(8〜10日)、ピンセットを使用してほとんどの苗を取り除き、ポットの各位置に1本の苗(6本の苗/ポット)を保持します(図1D)。プラスチック製のドームを取り外して、ポットのカバーを外します。
注:植物は発芽後4〜5週間で使用できるようになります。
- Phaseolus vulgaris bean(品種カナディアンワンダー)植物を準備します。
- ペトリ皿の底を濡れたタオル紙で覆い、その上に豆の種を置きます。シャーレをサージカルテープで密封し、28°Cで3〜4日間インキュベートします(図2A)。
- 発芽した種子を、湿った1:3バーミキュライト-植物基質混合物で満たされた直径10cmのポットに移します。
- 植物成長チャンバーで、長日設定(23°Cで16時間明/ 8時間暗、光強度:100 μmol・m−2・s−1、相対湿度:70%)でインキュベートします。
注:植物は発芽後10日で使用できるようになります(図2B)。
2. シロイヌナズナと豆類の接種
注:この研究では、株 P.シリンガエ pv。トマトDC3000と P.シリンガエ PV。フェイソリコラ1448Aを用いた。
- P.シリンガエ接種材料を準備します。
- 目的の P. syringae 株を-80°CのグリセロールストックからLBプレート(10 g / Lトリプトン、5 g / L NaCl、5 g / L酵母エキス、および16 g / L細菌寒天培地、材料 表を参照)にストリークします。28°Cで40〜48時間インキュベートします。
注:目的の株がプラスミドまたはゲノム耐性遺伝子を持っている場合は、抗生物質の使用をお勧めします。 P. syringae の推奨抗生物質濃度は次のとおりです:カナマイシン(15 μg / mL)、ゲンタマイシン(10 μg / mL)、アンピシリン(300 μg / mL)( 材料の表を参照)。. - 細菌バイオマスを掻き取り、5 mLの10 mM MgCl2に再懸濁します。OD600を測定し、10 mM MgCl2を加えて0.1に調整します。
注:P. syringae培養物のOD600 0.1は、5 x 107 CFU·mL−1に相当します。 - 10 mM MgCl2に段階希釈を行い、最終接種材料濃度5 x 105 CFU·mL−1に到達します。シロイヌナズナ植物用に200 mL、豆植物用に50 mLの接種材料を準備します。
- 接種直前に、界面活性剤Silwett L-77( 材料表参照)を、豆接種の場合は0.02%、シロイヌナズナの場合は0.01%の最終濃度に添加します。シルウェットはシロイヌナズナ組織にやや有害であることに注意してください。
- 目的の P. syringae 株を-80°CのグリセロールストックからLBプレート(10 g / Lトリプトン、5 g / L NaCl、5 g / L酵母エキス、および16 g / L細菌寒天培地、材料 表を参照)にストリークします。28°Cで40〜48時間インキュベートします。
- 真空浸透を行います。
- シロイヌナズナの浸潤には、X字を形成する2本の木の棒をポットの上に置き(図1E)、200 mLの接種材料が入った直径14 cmのシャーレの上にポットを下向きに置きます(図1F)。
- 豆の葉を接種する場合は、接種材料を含む50 mLの円錐形遠沈管に葉を導入します(図2C)。
- 接種材料溶液に浸した植物を真空チャンバーに挿入し(図1G および 図2D)、500 mbarのパルスを30秒間与えて葉に浸透させます。葉が完全に浸透するまで、真空パルスを2〜3回繰り返します(図1H および 図2E)。
- 一枚の紙で余分な接種材料を排出し、植物を対応する成長室に戻します。
3.アポプラストからの細菌の抽出
- 接種から4日後、シロイヌナズナの地上部または接種した豆の葉を切り取り、針のない20mLシリンジに入れます(図2G)。豆の葉の場合は、 図2Fに示すように、葉をそれ自体に転がし、軸方向の面を外側に残します。
- 組織を覆うのに十分な量の蒸留水を追加します(通常10〜15 mL)。
- プランジャーを挿入し、シリンジを垂直にして先端を上に向けて、すべての空気が先端近くになるまでバレルを軽くたたいて、シリンジ内の余分な空気と気泡を取り除きます。次にプランジャーをスライドさせて空気を取り除きます。シリンジ内の空気ができるだけ少なくなったら、シリンジバレルの先端をパラフィンフィルムで覆います。
- プランジャーを慎重に押して、組織が暗くなるまで陽圧を発生させます(図1I および 図2H)。次に、プランジャーを引いて負圧を発生させます(図1J および 図2I)。この手順を3〜5回繰り返します。
- パラフィンフィルムとプランジャーをはがし、 図2Jのようにアポプラスト抽出菌を含む液を採取する。
4. アポプラスト抽出細菌の1細胞解析
- 以下の手順に従って、共焦点顕微鏡で視覚化します。
- 蒸留水中の1.5%アガロース溶液を調製します。溶けたら、並べて置いた2枚の顕微鏡スライドの間のスペースを埋めるのに十分な量を加え、その上に別のスライドを置きます(図3)。それらを15分間乾燥させ、上部に置かれたスライドを慎重に取り外します。刃を使用して、使用直前にアガロースパッドを5 mm x 5 mmにカットします。
- 並行して、アポプラスト抽出菌1 mLを室温で12,000 x g で1分間遠心分離し、ピペットで上清を注意深く除去し、ペレットを20 μLの水に再懸濁して細胞を濃縮します。濃縮細胞2 μL滴を0.17 mmのカバーガラスに置き、 図3に示すように、ステップ1で入手した5 mm x 5 mmのアガロースパッドで滴を覆います。
- 共焦点顕微鏡で細菌製剤を視覚化します( 材料の表を参照)。緑色蛍光細菌を同定するには、488 nmの励起レーザーと500 nmから550 nmの範囲の発光フィルターを使用します。すべての細菌を識別するには、明視野を使用して両方のフィールドをマージします。
- フィジーを使用して共焦点画像を処理します( 材料表を参照)。これを行うには、MicrobeJプラグインを使用して細菌細胞の輪郭を特定し、その中の蛍光強度を測定します。
注:この分析には、単離された細菌(クラスター化されていない)からの画像取得をお勧めします。
- フローサイトメトリーによる解析を行います。
- アポプラストで抽出した細菌懸濁液のアリコートを取り、フローサイトメーターを使用して分析します。イベント100,000を獲得する。
- 細菌と植物の破片を区別するために、接種されていない植物から抽出されたアポプラストを分析し、その前方散乱(FSC)細胞サイズと側方散乱(SSC)細胞サイズを示すドットプロットをアポプラスト抽出細菌懸濁液の細胞サイズと比較します。非蛍光性細菌の同定には、非蛍光同質細菌を接種した植物から抽出したアポプラストを用いて、それらの蛍光発光を比較します。
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Representative Results
III型分泌系の発現は、植物内での細菌増殖に不可欠です。T3SS遺伝子のタイムリーな発現は複雑な調節によって達成され、その中心にはT3SS関連遺伝子の発現の重要な活性化因子である細胞質外機能(ECF)シグマ因子HrpLがあります11。hrpLの発現の分析は、染色体に位置する下流のプロモーターレスgfp遺伝子への転写融合を使用して、共焦点顕微鏡およびフローサイトメトリーによって発現パターンを追跡することによって以前に実行されました9。これらの融合は、PCRおよび従来のクローニングによって生成されたプラスミドコードコンストラクトの相同組換え媒介統合によって生成され、使用する蛍光レポーター遺伝子のリボソーム結合部位およびORFに隣接する、目的の遺伝子のORFの最後の500塩基対(STOPコドンを含む)および配列の500塩基対をすぐ下流に運びます(この場合、 GFP)、続いて抗生物質耐性カセット(この場合、カナマイシンに対する耐性を付与するNPT2遺伝子)が続く。したがって、hrpLを含むT3SS関連遺伝子を発現するアポプラスト抽出P.シリンガエ集団は、プランタ9において不均一であることが立証された。この先行例では、共焦点蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーによるhrpL発現の分析の代表的な結果が、アポプラストの葉にコロニー形成した後にそれぞれ豆またはシロイヌナズナの葉から抽出されたモデル株Pph 1448A(Pph)およびPto DC3000(Pto)の個々の細菌細胞において示されている(図4)。各株において、P. syringae染色体hrpL遺伝子は、GFP発現レベル8,9に従うことによってhrpL天然プロモーター活性をモニタリングすることを可能にするプロモーターレスgfp遺伝子への下流転写融合を運ぶ。
アポプラスト抽出細菌は、さまざまな分析に使用できます。ここでは、感染したシロイヌナズナまたはマメのアポプラストから上記のレポーター細菌株300μLを抽出し、フローサイトメーターシステムを用いたデータ取得に用いた(資料表参照)。GFP検出には、488nmでのレーザー発光とFITCフィルターを使用しました。フローサイトメトリー分析は、集団内の個々の細菌細胞における蛍光分布を示します。hrpLの不均一な発現は、シロイヌナズナのアポプラスト抽出PtoおよびHrpLOFF(GFPを発現していない)細菌を含むアポプラスト抽出されたPphのフローサイトメトリーによって明確に観察することができ、これらの結果は、対応するサンプルの顕微鏡検査によって裏付けられています(図4)。ドットプロットグラフ(左パネル)は、集団におけるGFPの蛍光強度対細胞サイズの分布を示し(図4A)、ヒストグラムはGFPの蛍光強度対細胞数(図4B)を示しています。サイトメトリーデータのこれら2つの異なるグラフィック表現により、研究者は微妙な視覚的ニュアンスを確立し、補完的な情報を提供することができます。細菌の自家蛍光の対照として、対応する非GFP野生型株を使用した(図4Aの上パネルおよび図4Bの灰色のヒストグラム)。これにより、集団内の非GFP細菌が表示されているグラフ領域を特定できます。フローサイトメトリー分析では、定量データも生成されます。一例として、HrpLON(蛍光)細胞の割合は、アポプラスト抽出されたPtoおよびPph集団において抽出される。図4Cは、特にPTOモデルにおいて、これらの集団において、HrpLONパーセンテージがHrpLOFF(非蛍光)細胞の対応するパーセンテージよりもどのように高かったかを示しています。これらのデータは、集団全体の蛍光の平均または中央値を計算するためにも使用できます。この特定の実験では、平均GFP蛍光強度が得られ、これは、ON細胞の割合が高いことと一致して、PphよりもPto集団の方が高かった。平均レベルは、RT-qPCRやRNAseqなどの非単一細胞技術によって得られたデータに匹敵する集団レベルのデータを構成します。最後に、第3四分位数から第1四分位数を中央値で割った値として計算されるロバスト変動係数(RCV)12も示されています。RCVは、フローサイトメトリー研究において、データの分散(すなわち、集団内での発現の不均一性)を推定するためによく使用されます13。現在の研究では、RCVはPphの方がPtoよりもわずかに高かったが、その差はこれら2つの株の集団内の発現の分布を有意に異なるものとして特徴付けるのに十分ではなかった。hrpL発現の不均一性は、共焦点顕微鏡画像で視覚的に確認することができる(図4D)。顕微鏡検査の準備に寒天パッドを使用すると、細菌を単層に押し出し、細菌の動きを防ぐため、個々の細胞の視覚化が容易になり、高品質の画像が得られます。このプロトコルに記載されている接種および細菌抽出手順は、細菌調製物内の植物破片の量を最小限に抑え、したがって、これらの異なる技術による細菌発現の分析を可能にします(図4)。
図1:シロイヌナズナ植物を用いた細菌接種とアポプラスト抽出。(A)金属メッシュをきちんと取り付けたポットの準備。(B)(C)に示すように、つまようじを使って種をまき、種を配る。(D)接種の準備ができているシロイヌナズナ植物。(E)2本の木の棒は、鉢や土壌(F)に到達することなく、植物を細菌溶液に浸すことを容易にします。(G)アンサンブルは真空チャンバー内に入れることができます。(H)チャンバーから真空を解放した後、浸透した葉は暗くなります。(i)剥離した葉を20mLシリンジに入れ、水で覆う。(J)正圧と負圧のサイクルにより、アポプラスチック細菌が抽出されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マメ植物を用いた細菌接種とアポプラスト抽出(A)湿ったトイレットペーパーで裏打ちされたペトリ皿での豆種子の発芽。(B)接種の準備ができている豆植物。(C)50mLチューブに収容した菌液に豆葉を浸漬する。(D)組織が暗くなるまで、葉を真空チャンバー内に接種する(E)。(F)豆の葉を丸め、20mLの注射器に入れ、水(G)で覆う。(H)正圧と負圧(I)のサイクルにより、チューブ(J)に回収できるアポプラスチック細菌が抽出されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:寒天パッドの設定と準備の概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:シロイヌナズナまたはマメの葉から得られたアポプラスト抽出菌に、それぞれP. syringae pv. トマト (Pto) または P. syringae pv. phaseolicola (Pph) を接種した。hrpL::gfpの発現はGFP蛍光としてモニターされる。(A)フローサイトメトリー分析はドットプロット(前方散乱[細胞サイズ]対GFP蛍光強度)で表されます。非GFP細菌は、PtoまたはPphのいずれかの野生株を示す。縦線は、非GFP集団の99%を区切っています。(B)フローサイトメトリー分析は、ヒストグラム(細胞数対GFP蛍光強度)で表されます。灰色のヒストグラムは非GFP株を表します。(C)定量データはフローサイトメトリー分析から生成した。オンセルとオフセルの割合は、ドットプロットに示されている分布に基づいて計算されます。平均は、実験で得られた平均蛍光を示す。ロバスト変動係数(RCV)は、第3四分位数から第1四分位数を中央値で割ったものとして計算されます。(D)hrpLの発現に関連するGFPの不均一レベルを示す蛍光顕微鏡画像。白い矢印は、低レベルまたはGFP蛍光を示さない細菌を強調しています。スケールバー:3μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで提示する方法は、植物の葉面組織への細菌の浸潤を可能にし、組織の破壊を最小限に抑えながら大量の迅速な接種を可能にする非侵襲的手順を説明しています。 P. syringae 種複合体の特徴の1つは、着生植物として植物のアポプラストの内部および植物表面で生き残り増殖する能力です14。したがって、本プロトコルを使用して抽出された細菌が植物のアポプラストからのみ来る可能性を排除することはできません。しかし、共焦点顕微鏡を用いて、葉表面上の細菌の割合が植物の葉の内部の細菌増殖と比較して著しく小さいことが以前に実証された5。これは、抽出前に葉の表面を顕微鏡で調べることで確認できます。さらに、本プロトコルでモデルとして使用される P. syringae 株、Pto DC3000およびPph 1448Aは、弱い着生植物として機能することが示されており15、抽出された細菌の無関係な割合を表しています。それにもかかわらず、この方法が他の病理系に適応されるのであれば、葉の表面除染の前のステップを本プロトコルに追加しなければならないかもしれない。
シリンジ16を用いた葉浸潤などの従来の接種方法は、接種部位においてより大きく、推定が困難な組織損傷を引き起こし、組織壊死をもたらす。さらに、損傷の量は異なる接種ポイント間で非常に変動します。また、植物種が異なれば、葉の浸潤に対する耐性も異なります。たとえば、シロイヌナズナの葉は浸透しやすく、豆の葉はより抵抗力があります。成長条件は、特定の種の侵入に対する耐性のレベルにも影響します。葉の浸しや葉のスプレーなどのより穏やかな伝統的な接種方法は、より自然で損傷のない細菌の侵入と組織のコロニー形成をもたらしますが、本質的に得られる細菌集団のサイズを制限し、多くの場合、その後の分析に必要な閾値を下回りますアポプラスチック細菌サンプル5.提案された接種方法は、細菌のサンプルサイズの制限を回避しながら、シリンジの圧力に起因する接種領域の壊死の活性化を大幅に減少させ、かなりの葉の領域に接種するための容易で再現性のある迅速な方法を提供します。
大きな組織領域の接種を必要とする一部の技術は、非常に時間と労力がかかり、組織に損傷を与える可能性が高くなります。この方法を適用することで、組織の完全性を損なうことなく、5つ以上の シロイヌ ナズナ植物、または豆の葉全体を1つのステップで接種することができます。この技術は、より多くの植物に接種するために、または ニコチアナベンサミアナ、トマト、またはダイズなどの農学的または学術的に関心のある他の植物種に接種するように適合され得る。界面活性剤の濃度が高いと組織壊死を引き起こす可能性があるため、細菌懸濁液の浸潤を促進するために表面水張力を低下させるために使用される界面活性剤の濃度は、植物種に応じて事前に調整および試験する必要があります。また、最適な結果を確実にするために、加えられる圧力の量と接種プロセスの期間は、異なる種の植物の葉によって提供される抵抗に調整する必要があります。
アポプラスト抽出に関しては、現在の方法では組織の破壊も最小限に抑えられ、抽出されたサンプルに存在する植物破片の量も減少します。これにより、よりクリーンなサンプルが可能になり、例に示すように、RNA-seq、フローサイトメトリー、顕微鏡などのさまざまな手法によるより効率的な分析が可能になります。組織と植物細胞の破壊を最小限に抑えて、その形成性環境から病原性細菌集団を回復することは困難です。 P. syringae はアポプラストの細胞間空間にコロニーを形成し、微小コロニーを形成する。 P. syringaeなどの細胞外病原体を使用すると、細菌の回復に組織や細胞の破壊が必要ないため、ここで紹介したような方法が可能になります。正圧と陰圧のラウンドはマイクロコロニーを破壊し、細菌を分散させ、自然な開口部(気孔)を通して簡単かつ迅速に抽出できるようにし、より穏やかなアポプラスチック回復方法に必要なような長いインキュベーション時間に伴う可能性のある遺伝子発現の変化を回避します。残った植物組織の顕微鏡検査は、細菌集団のほとんどの除去をサポートします。アポプラスチック流体抽出プロトコルは、アポプラスチック流体17の複雑さを研究するために広く使用されている。これらのプロトコルには、回収されたアポプラスティック流体をさらにクリーンアップするための遠心分離の最終ステップが含まれています。ここでは、代わりにシリンジプランジャーを使用した穏やかな正圧と負圧のサイクルが使用され、細菌回収の効率にほとんど影響を与えずに、宿主細胞の破片によるサンプル汚染を減らしました。1つの古典的な穏やかな細菌抽出方法は、1〜2時間18の間界面活性剤と葉の円盤または実生のインキュベーションからなる。この方法は、細菌を抽出するためにここで提示したものほど効率的ではありません。ただし、遺伝子発現解析の主な制限は、集団の発現プロファイルに対する必要なインキュベーション時間の影響です。ここに提示された方法は、アポプラスチック集団の迅速な回復および即時分析を可能にし、したがって、細胞レベルでの遺伝子発現結果をバイパスするリスクを低減する。
病原性細菌における表現型の不均一性は、均質な実験室培地を用いて広く研究されてきた。天然のニッチで増殖した細菌集団の研究は、下流の単一細胞分析を妨げる宿主細胞の破片による過剰な汚染なしに細菌集団を回収することの難しさなど、技術的な障壁のために制限されることがよくあります。接種と抽出を組み合わせたこの方法により、単一細胞分析のための細菌性病原体の大きなアポプラスチック集団の生成が可能になります。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この作業は、MCIN/AEI/10.13039/501100011033/が資金提供するプロジェクトグラントRTI2018-095069-B-I00と「ERDP A way of make Europe」の支援を受けました。J.S.R.は、Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación(PAIDI 2020)から資金提供を受けました。N.L.P.は、Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e InnovaciónのProject Grant P18-RT-2398によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
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