Summary
본 프로토콜은 식물 아포플라스트 내에서 성장한 슈도모나스 시린지와 집단에 대한 단일 세포 유전자 발현 분석을 허용하는 방법을 설명합니다.
Abstract
과다한 병원성 미생물이 지속적으로 식물을 공격합니다. 슈도모나스 주사기 종 복합체는 다양한 숙주와 특별한 관련이 있는 그람 음성 식물 병원성 박테리아를 포함합니다. P. syringae 는 잎 표면에서 식물로 들어가 아포플라스트 내에서 빠르게 증식하여 세포간 공간을 차지하는 미세 콜로니를 형성합니다. 박테리아에 의한 형광 단백질의 구성적 발현은 미세 콜로니의 시각화와 현미경 수준에서 감염의 발달을 모니터링할 수 있게 합니다. 단일 세포 분석의 최근 발전은 클론 동종 박테리아 집단이 도달하는 큰 복잡성을 밝혀냈습니다. 표현형 이질성(phenotypic heterogeneity)이라고 하는 이러한 복잡성은 박테리아 군집 간의 유전자 발현(유전적 차이와 관련이 없음)의 세포 간 차이의 결과입니다. 단일 세포 수준에서 개별 유전자좌의 발현을 분석하기 위해 형광 단백질에 대한 전사 융합이 널리 사용되었습니다. 식물 아포플라스트의 집락화 동안 발생하는 것과 같은 스트레스 조건에서 P. syringae 는 주요 독성 유전자(즉, Hrp 유형 III 분비 시스템)의 이질적인 발현을 기반으로 별개의 하위 집단으로 분화됩니다. 그러나 식물 조직에서 회수된 P. syringae 개체군의 단일 세포 분석은 접종 및 박테리아 추출 공정에 내재된 기계적 파괴 중에 방출되는 세포 파편으로 인해 어렵습니다. 본 보고서는 애기장대와 콩 식물의 집락화 동안 단일 세포 수준에서 관심 있는 P. syringae 유전자의 발현을 모니터링하기 위해 개발된 방법을 자세히 설명합니다. 식물의 제조 및 진공 챔버를 이용한 접종에 사용되는 박테리아 현탁액이 설명된다. 아포소성 유체 추출에 의한 감염된 잎에서 내생 박테리아의 회수도 여기에 설명되어 있습니다. 박테리아 접종 및 박테리아 추출 방법 모두 식물 및 박테리아 세포 손상을 최소화하도록 경험적으로 최적화되어 현미경 및 유세포 분석 분석에 최적의 박테리아 제제를 제공합니다.
Introduction
병원성 박테리아는 다양한 표현형의 차이를 나타내어 유전적으로 동일한 집단 내에서 하위 집단을 형성합니다. 이 현상은 표현형 이질성(phenotypic heterogeneity)으로 알려져 있으며, 박테리아-숙주 상호작용 중 적응 전략으로 제안되었다1. 형광 단백질과 결합된 컨포칼 현미경, 유세포 분석 및 미세 유체의 광학 해상도의 최근 발전은 박테리아 개체군에 대한 단일 세포 분석을 촉진했습니다2.
그람 음성균(Gram-negative Pseudomonas syringae)은 학문적, 경제적 중요성 때문에 전형적인 식물 병원성 박테리아이다3. P. syringae의 수명주기는 물 순환4과 관련이 있습니다. P. syringae는 기공이나 상처와 같은 자연적인 구멍을 통해 식물의 잎 아포플라스트인 중엽세포(mesophyll cell) 사이의 세포간 공간으로 들어간다5. 일단 아포플라스트에 들어가면, P. syringae는 III형 분비계(T3SS)와 III형-전위 이펙터(T3E)에 의존하여 식물 면역을 억제하고 병원체의 이익을 위해 식물 세포 기능을 조작한다6. T3SS 및 T3E의 발현은 표적 유전자7의 프로모터 영역에서 hrp-box 모티프에 결합하는 대체 시그마 인자인 마스터 조절인자 HrpL에 의존한다.
관심 유전자의 하류에 있는 형광 단백질 유전자에 염색체 위치 전사 융합체를 생성함으로써, 단일 세포 수준8에서 방출되는 형광 수준을 기반으로 유전자 발현을 모니터링할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 hrpL의 발현은 실험실에서 자란 박테리아 배양과 식물 아포플라스트 8,9에서 회수된 박테리아 개체군 내에서 이질적이라는 것이 확인되었습니다. 단일 세포 수준의 유전자 발현 분석은 일반적으로 실험실 배지에서 성장한 박테리아 배양에서 수행되지만, 이러한 분석은 식물 내에서 자라는 박테리아 개체군에 대해서도 수행될 수 있으므로 자연적 맥락에서 하위 개체군 형성에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 식물에서 추출한 박테리아 개체군 분석에 대한 잠재적인 한계는 아포플라스트에 주사기 압력 침투에 의한 고전적인 접종 방법에 이어 잎 조직의 침용에 의한 박테리아 추출이 일반적으로 다운스트림 분석을 방해하는 다량의 세포 식물 파편을 생성한다는것입니다 10. 대부분의 세포 파편은 GFP 형광과 겹치는 엽록체의 자가형광 단편으로 구성되어 있어 오해의 소지가 있는 결과를 초래합니다.
본 프로토콜은 2개의 모델 병리학에서 단세포 유전자 발현 이질성을 분석하는 과정을 설명한다: 하나는 P. syringae pv에 의해 형성된다. 토마토 균주는 DC3000 및 애기장대 탈리아나 (Col-0)이고, 다른 하나는 P. syringae pv에 의한 것이다. phaseolicola 균주 1448A 및 콩 식물 (Phaseolus vulgaris 품종 Canadian Wonder). 진공 챔버와 펌프를 이용한 진공 침투를 기반으로 한 접종 방법을 제안하여 잎 전체에 빠르고 손상없이 침투하는 방법을 제안합니다. 또한, 기존 프로토콜을 개선한 것으로, 주사기 내에서 소량의 부피를 사용하여 양압 및 음압 주기를 적용하여 아포성형액 추출을 기반으로 조직 파괴를 크게 줄이는 아포플라스트에서 박테리아 집단을 추출하는 더 부드러운 방법이 사용됩니다.
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Protocol
1. 식물 준비
- 아래 단계에 따라 Arabidopsis Col-0 식물을 준비하십시오.
- 직경 10cm의 화분에 1:3 질석-식물 기질 혼합물( 재료 표 참조)을 채우고 이전에 물을 주고 15mm x 15mm 구멍이 있는 1.6cm x 1.6cm 금속 메쉬로 화분을 덮습니다. 고무 밴드를 사용하여 젖은 토양에 금속 메쉬를 조정합니다(그림 1A).
- 젖은 이쑤시개로 애기장대 씨앗을 금속 메쉬의 구멍에 뿌립니다. 냄비 안의 먼 위치에 3-4 개의 씨앗을 놓습니다 (그림 1B, C).
- 높은 상대 습도를 유지하기 위해 플라스틱 돔으로 냄비를 덮고 성층화를 위해 4°C에서 72시간 동안 배양합니다.
참고: 층화(설명된 대로 높은 습도와 낮은 온도에서 배양)는 씨앗의 발아율과 동시성을 향상시킵니다. - 짧은 하루 조건(8°C에서 16시간 밝음/21시간 어두움, 광도: 100μmol·m-2·s-1, 상대 습도: 70%)에서 화분을 식물 성장 챔버로 옮깁니다.
- 종자 발아 후 (8-10 일), 핀셋을 사용하여 대부분의 묘목을 제거하고 냄비의 각 위치 (6 개의 묘목 / 냄비)에 하나의 묘목을 유지합니다 (그림 1D). 플라스틱 돔을 제거하여 냄비를 드러냅니다.
참고: 식물은 발아 후 4-5주 후에 사용할 준비가 됩니다.
- Phaseolus vulgaris 콩 (품종 Canadian Wonder) 식물을 준비하십시오.
- 페트리 접시의 바닥을 젖은 수건 종이로 덮고 그 위에 콩씨를 놓습니다. 페트리 접시를 수술용 테이프로 밀봉하고 28°C에서 3-4일 동안 배양합니다(그림 2A).
- 발아 된 씨앗을 젖은 10 : 1 질석-식물 기질 혼합물로 채워진 직경 3cm 냄비에 옮깁니다.
- 장일 설정(23°C에서 16시간 밝음/8시간 어두움, 광도: 100μmol·m−2·s−1, 상대 습도: 70%)에서 식물 성장 챔버에서 배양합니다.
알림: 식물은 발아 후 10일 후에 사용할 준비가 됩니다(그림 2B).
2. 애기장대와 콩식물의 접종
참고: 이 연구에서 균주 P. syringae pv. 토마토 DC3000 및 P. syringae pv. phaseolicola 1448A를 사용하였다.
- P. syringae 접종물을 준비합니다.
- 적절한 항생제가 보충된 LB 플레이트(10g/L 트립톤, 5g/L NaCl, 5g/L 효모 추출물 및 16g/L 세균 한천, 표 참조)에 -80°C 글리세롤 스톡에서 관심 있는 P. syringae 균주를 줄무늬로 제거합니다. 28°C에서 40-48시간 동안 배양합니다.
참고: 관심 균주가 플라스미드 또는 게놈 내성 유전자를 가지고 있는 경우 항생제를 사용하는 것이 좋습니다. P. syringae 에 권장되는 항생제 농도는 다음과 같습니다: 카나마이신(15μg/mL), 겐타마이신(10μg/mL), 암피실린(300μg/mL)( 재료 표 참조). - 박테리아 바이오매스를 긁어내고 5mL의 10mMMgCl2에 재현탁합니다. OD600을 측정하고 10 mMMgCl2를 첨가하여 0.1로 조정한다.
참고: P. syringae 배양액의 OD600 0.1은 5 x 107 CFU·mL-1에 해당합니다. - 10mM MgCl2로 연속 희석을 수행하여 최종 접종물 농도 5 x 105 CFU·mL-1에 도달합니다. 애기장대 식물에 200mL, 콩 식물에 50mL의 접종물을 준비합니다.
- 접종 직전에 계면활성제인 Silwett L-77( 표 참조)을 최종 농도로 콩 접종의 경우 0.02%, 애기장대의 경우 0.01%로 첨가합니다. Silwett는 애기장대 조직에 다소 해롭습니다.
- 적절한 항생제가 보충된 LB 플레이트(10g/L 트립톤, 5g/L NaCl, 5g/L 효모 추출물 및 16g/L 세균 한천, 표 참조)에 -80°C 글리세롤 스톡에서 관심 있는 P. syringae 균주를 줄무늬로 제거합니다. 28°C에서 40-48시간 동안 배양합니다.
- 진공 침투를 수행합니다.
- 애기장대 침윤의 경우 냄비 위에 X를 형성하는 두 개의 나무 막대기를 놓고(그림 1E) 200mL 접종물이 들어 있는 직경 14cm의 페트리 접시 위에 냄비를 아래로 향하게 놓습니다(그림 1F).
- 콩 잎 접종의 경우 접종물이 들어 있는 50mL 원추형 원심분리기 튜브에 잎을 넣습니다(그림 2C).
- 접종 용액에 담근 식물을 진공 챔버 (그림 1G 및 그림 2D)에 넣고 30 초 동안 500mbar의 펄스를 주어 잎에 침투시킵니다. 잎이 완전히 침투 할 때까지 진공 펄스를 2-3 회 반복합니다 (그림 1H 및 그림 2E).
- 종이로 초과 접종 용액을 배출하고 식물을 해당 성장 챔버로 되돌립니다.
3. 아포플라스트에서 박테리아 추출
- 접종 4일 후, 애기장대 식물의 공중 부분이나 콩 식물의 접종된 잎을 잘라내어 바늘 없이 20mL 주사기에 넣습니다(그림 2G). 콩 잎의 경우 그림 2F와 같이 잎을 굴리고 축면이 바깥쪽을 향하도록 합니다.
- 조직을 덮을 수 있도록 충분한 양의 증류수를 추가합니다(보통 10-15mL).
- 플런저를 삽입하고 팁이 위를 향하도록 주사기를 수직 위치에 놓고 모든 공기가 팁 근처에 위치할 때까지 배럴을 부드럽게 두드려 주사기 내부의 과도한 공기와 기포를 제거합니다. 그런 다음 플런저를 밀어 공기를 빼냅니다. 주사기 내부에 가능한 한 적은 공기가 있으면 주사기 배럴의 끝을 파라핀 필름으로 덮습니다.
- 조직이 어두워질 때까지 플런저를 조심스럽게 눌러 양압을 생성합니다(그림 1I 및 그림 2H). 그런 다음 플런저를 당겨 음압을 생성합니다(그림 1J 및 그림 2I). 이 단계를 3-5 번 반복하십시오.
- 파라핀 필름과 플런저를 제거하고 도 2J에서와 같이 아포플라스트 추출 박테리아를 포함하는 유체를 수집합니다.
4. 아포플라스트 추출 박테리아의 단세포 분석
- 아래 단계에 따라 컨포칼 현미경으로 시각화합니다.
- 증류수에 1.5% 아가로스 용액을 준비한다. 녹으면 나란히 놓인 두 현미경 슬라이드 사이의 공간을 채울 만큼 충분한 부피를 추가하고 그 위에 다른 슬라이드를 놓습니다(그림 3). 15분 동안 건조시킨 후 상단에 놓인 슬라이드를 조심스럽게 제거합니다. 칼날을 사용하여 사용 직전에 아가로스 패드를 5mm x 5mm 조각으로 자릅니다.
- 동시에, 실온에서 1분 동안 12,000 x g 에서 추출된 아포플라스트 박테리아 1mL를 원심분리하고, 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고, 펠릿을 물 20μL에 재현탁하여 세포를 농축합니다. 농축된 세포 2μL 방울을 0.17mm 커버슬립에 놓고 그림 3과 같이 이전에 1단계에서 얻은 5mm x 5mm 아가로스 패드 조각으로 방울을 덮습니다.
- 컨포칼 현미경으로 박테리아 준비를 시각화합니다( 재료 표 참조). 녹색 형광 박테리아를 식별하려면 488nm의 여기 레이저와 500nm에서 550nm 범위의 방출 필터를 사용하십시오. 모든 박테리아를 식별하려면 명시 필드를 사용하고 두 필드를 병합하십시오.
- Fiji를 사용하여 컨포칼 이미지를 처리합니다( 재료 표 참조). 이를 위해 MicrobeJ 플러그인을 사용하여 박테리아 세포의 윤곽을 식별하고 내부의 형광 강도를 측정합니다.
참고: 이 분석에는 분리된 박테리아(클러스터되지 않음)에서 이미지를 획득하는 것이 좋습니다.
- 유세포 분석에 의한 분석을 수행합니다.
- 아포플라스트에서 추출한 박테리아 현탁액의 분취량을 채취하여 유세포 분석기를 사용하여 분석합니다. 이벤트 100,000개를 획득합니다.
- 박테리아와 식물 파편을 구별하기 위해 접종하지 않은 식물에서 추출한 아포플라스트를 분석하고 전방 산란(FSC) 세포 크기와 측면 산란(SSC) 세포 크기를 보여주는 점도표를 아포플라스트에서 추출한 박테리아 현탁액의 세포 크기와 비교합니다. 비형광 박테리아를 식별하려면 비형광 동종 박테리아를 접종한 식물에서 추출한 아포플라스트를 사용하고 형광 방출을 비교하십시오.
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Representative Results
III형 분비 시스템의 발현은 식물 내 박테리아 성장에 필수적입니다. T3SS 유전자의 적시 발현은 복잡한 조절을 통해 이루어지며, 그 중심에는 T3SS 관련 유전자 발현의 핵심 활성화인자인 세포외 기능(ECF) 시그마 인자 HrpL이 있다11. hrpL의 발현 분석은 이전에 하류 프로모터가 없는 gfp 유전자에 대한 염색체 위치 전사 융합을 사용하고 공초점 현미경 및 유세포 분석에 의한 발현 패턴을 추적하여 수행되었습니다9. 이들 융합체는 PCR 및 전통적인 클로닝을 통해 생성된 플라스미드-인코딩된 구축물의 상동성 재조합-매개 통합을 통해 생성되고, 관심있는 유전자 (STOP 코돈 포함)의 ORF의 마지막 500개 염기쌍 및 서열의 500개 염기쌍을 바로 하류에 운반하여, 사용될 형광 리포터 유전자의 리보솜-결합 부위 및 ORF를 측면화한다 (이 경우, GFP), 항생제 내성 카세트(이 경우 카나마이신에 대한 내성을 부여하는 NPT2 유전자)가 뒤따랐습니다. 따라서, hrpL을 포함한 T3SS 관련 유전자를 발현하는 아포플라스트(apoplast)가 추출한 P. syringae 개체군이 플란타(planta)에서 이질적이라는 것이 확인되었다 9. 이 선례에서 hrpL 발현에 대한 공초점 형광 현미경 및 유세포 분석 분석의 대표적인 결과는 잎 아포플라스트의 집락화 후 콩 또는 애기장대의 잎에서 각각 추출한 모델 균주 Pph 1448A(Pph) 및 Pto DC3000(Pto)의 개별 박테리아 세포에서 나타납니다(그림 4). 각 균주에서, P. syringae 염색체 hrpL 유전자는 GFP 발현 수준 8,9에 따라 hrpL 천연 프로모터 활성을 모니터링할 수 있는 프로모터가 없는 gfp 유전자에 대한 다운스트림 전사 융합을 운반합니다.
아포플라스트에서 추출한 박테리아는 다양한 분석에 사용할 수 있습니다. 여기서, 감염된 애기장대 또는 콩 식물의 아포플라스트로부터 상술한 리포터 박테리아 균주 300μL를 추출하여 유세포 분석기 시스템을 이용한 데이터 수집에 사용하였다( 재료 표 참조). 488nm에서의 레이저 방출 및 FITC 필터를 GFP 검출에 사용하였다. 유세포 분석은 집단 내 개별 박테리아 세포의 형광 분포를 보여줍니다. hrpL 의 이질적인 발현은 애기장대 아포플라스트 추출 Pto 및 HrpLOFF (GFP를 발현하지 않음) 박테리아를 포함한 콩 아포플라스트 추출 Pph에서 유세포 분석으로 명확하게 관찰할 수 있으며, 이러한 결과는 해당 샘플의 현미경 검사에 의해 뒷받침됩니다(그림 4). 도트 플롯 그래프(왼쪽 패널)는 모집단에서 GFP 대 세포 크기의 형광 강도 분포를 보여주고(그림 4A), 히스토그램은 GFP 대 세포 수의 형광 강도를 보여줍니다(그림 4B). 세포분석 데이터의 이 두 가지 다른 그래픽 표현을 통해 연구원은 미묘한 시각적 뉘앙스를 설정하고 보완적인 정보를 제공할 수 있습니다. 박테리아 자가형광에 대한 대조군으로서 상응하는 non-GFP 야생형 균주를 사용했습니다(그림 4A 의 상단 패널 및 그림 4B의 회색 히스토그램). 이를 통해 집단 내에서 비 GFP 박테리아가 표시되는 그래프 영역을 식별할 수 있습니다. 유세포 분석 분석은 정량적 데이터도 생성합니다. 예를 들어, HrpLON (형광) 세포의 백분율은 아포플라스트-추출된 Pto 및 Pph 집단에서 추출된다. 도 4C 는 HrpLON 백분율이 이들 집단에서, 특히 Pto 모델에서 HrpLOFF (비형광성) 세포의 상응하는 백분율보다 어떻게 더 높았는지를 보여준다. 이 데이터는 전체 모집단에 대한 평균 또는 중간 형광을 계산하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 특정 실험에서 평균 GFP 형광 강도가 얻어졌으며, 이는 ON 세포의 더 높은 비율을 유지하면서 Pph보다 Pto 집단에서 더 높았습니다. 평균 수준은 RT-q, PCR 또는 RNAseq와 같은 비단일 세포 기술을 통해 얻은 데이터와 유사한 모집단 수준 데이터를 구성합니다. 마지막으로, 제3 사분위수에서 제1 사분위수를 중앙값으로 나눈 값으로 계산된 견고한 변동 계수(RCV)12도 표시됩니다. RCV는 데이터 분산(즉, 모집단 내 발현의 이질성)을 추정하기 위해 유세포 분석 연구에서 자주 사용됩니다13. 현재 연구에서 RCV는 Pto보다 Pph에서 약간 더 높았지만, 그 차이는 이 두 균주의 집단 내 발현 분포를 유의하게 다른 것으로 특성화하기에 충분하지 않았습니다. hrpL 발현의 이질성은 컨포칼 현미경 이미지로 육안으로 확인할 수 있습니다(그림 4D). 현미경 준비에 한천 패드를 사용하면 박테리아를 단일 층으로 밀어내고 박테리아의 이동을 방지하기 때문에 개별 세포의 시각화가 더 쉽고 고품질 이미지를 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 접종 및 박테리아 추출 절차는 박테리아 제제 내의 식물 파편 양을 최소화하여 이러한 다양한 기술로 박테리아 발현을 분석할 수 있습니다(그림 4).
그림 1: 애기장대 식물을 이용한 박테리아 접종 및 아포플라스트 추출. (A) 금속 메쉬가 제대로 부착된 냄비의 준비. (B) (C)에 표시된대로 이쑤시개를 사용하여 종자를 파종합니다. (D) 접종 준비가 된 애기장대 식물. (E) 두 개의 나무 막대기는 화분이나 토양(F)에 도달하지 않고 식물을 박테리아 용액에 담그는 것을 용이하게 합니다. (G) 앙상블은 진공 챔버 내부에 넣을 수 있습니다. (H) 침투된 잎은 챔버에서 진공을 해제한 후 더 어두워집니다. (I) 떼어낸 잎을 20mL 주사기에 넣고 물로 덮습니다. (J) 양압과 음압의 주기는 아포형성 박테리아의 추출을 초래합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 콩 식물을 사용한 박테리아 접종 및 아포플라스트 추출. (A) 젖은 화장지가 늘어선 페트리 접시에서 콩씨의 발아. (B) 접종 준비가 된 콩 식물. (C) 콩 잎을 50 mL 튜브에 담긴 박테리아 용액에 담근다. (D) 조직이 어두워질 때까지 잎을 진공 챔버 내부에 접종합니다(E). (F) 콩잎을 말아서 20mL 주사기에 넣고 물(G)로 덮는다. (H) 양압 및 음압(I)의 주기는 튜브(J)로 회수할 수 있는 아포성형성 박테리아의 추출을 초래합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 한천 패드의 설정 및 준비에 대한 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 애기장대 또는 콩잎으로부터 얻어진 아포플라스트균 추출 4 일 후 P. syringae pv. tomato (Pto) 또는 P. syringae pv. phaseolicola (Pph)를 각각 분석. hrpL::gfp의 발현은 GFP 형광으로 모니터링됩니다. (A) 유세포 분석은 도트 플롯(전방 산란[세포 크기] 대 GFP 형광 강도)으로 표시됩니다. 비 GFP 박테리아는 Pto 또는 Pph의 야생형 균주를 나타냅니다. 수직선은 비 GFP 인구의 99%를 구분합니다. (B) 유세포 분석은 히스토그램(세포 수 대 GFP 형광 강도)으로 표시됩니다. 회색 히스토그램은 비 GFP 균주를 나타냅니다. (c) 유세포 분석으로부터 정량적 데이터를 생성하였다. ON 및 OFF 셀의 백분율은 도트 플롯에 표시된 분포를 기반으로 계산됩니다. 평균은 실험에서 얻어진 평균 형광을 나타낸다. 강력한 변동 계수(RCV)는 제3 사분위수에서 제1 사분위수를 뺀 값을 중위수로 나눈 값으로 계산됩니다. (D) hrpL의 발현과 관련된 GFP의 이질적인 수준을 보여주는 형광 현미경 이미지. 흰색 화살표는 GFP 형광 수치가 낮거나 없는 박테리아를 강조 표시합니다. 스케일 바: 3μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 방법은 박테리아가 식물 잎 조직으로 침투할 수 있도록 하는 비침습적 절차를 설명하여 조직 파괴를 최소화하면서 대량의 신속한 접종을 가능하게 합니다. P. syringae 종 복합체의 특징 중 하나는 식물 아포플라스트 내부와 식물 표면에서 착생식물(epiphyte)로 생존하고 증식하는 능력이다14. 따라서 본 프로토콜을 사용하여 추출된 박테리아가 식물 아포플라스트에서만 나올 가능성을 배제할 수 없습니다. 그러나 이전에 공초점 현미경을 사용하여 잎 표면의 박테리아 비율이 식물 잎 내부의 박테리아 성장에 비해 현저히 미미하다는 것이 입증되었습니다5. 이것은 추출 전에 잎 표면을 현미경으로 검사하여 확인할 수 있습니다. 또한, 본 프로토콜에서 모델로 사용된 P. syringae 균주인 Pto DC3000 및 Pph 1448A는 추출된 박테리아의 무의미한 비율을 나타내는 약한 epiphites15로 수행하는 것으로 나타났습니다. 그럼에도 불구하고, 이 방법이 다른 병리 시스템에 적용되어야 한다면, 잎 표면 오염 제거의 이전 단계가 본 프로토콜에 추가되어야 할 수도 있습니다.
주사기를 이용한 잎 침투(16)와 같은 전통적인 접종 방법은 접종 부위에 더 크고 추정하기 어려운 조직 손상을 일으켜 조직 괴사를 일으킨다. 또한, 손상의 양은 접종 지점에 따라 매우 다양합니다. 또한 식물 종에 따라 잎 침투에 대한 내성이 다릅니다. 예를 들어, 애기장대 잎은 침투하기 쉬운 반면 콩 잎은 더 난해합니다. 성장 조건은 또한 주어진 종의 침투에 대한 내성 수준에 영향을 미칩니다. 잎 딥(leaf dip) 또는 잎 스프레이(leaf spray)와 같은 보다 부드러운 전통적인 접종 방법은 보다 자연스럽고 손상 없는 박테리아 유입 및 조직 집락화를 가져오지만, 본질적으로 얻어지는 박테리아 개체군의 크기를 제한하며, 종종 아포형성 박테리아 샘플의 후속 분석에 필요한 임계값 미만인 경우가 많다5 . 제안된 접종 방법은 박테리아 샘플 크기 제한을 피하면서 주사기 압력으로 인한 접종 부위의 괴사 활성화를 크게 감소시키고 상당한 잎 부위에 접종하는 쉽고 재현 가능하며 빠른 방법을 제공합니다.
큰 조직 부위에 접종해야 하는 일부 기술은 시간과 노동력이 많이 소요되어 조직 손상을 입힐 가능성이 높아집니다. 이 방법을 적용하면 조직 무결성을 손상시키지 않고 단 한 번에 5개 이상의 애기장 대 식물 또는 전체 콩잎을 접종할 수 있습니다. 이 기술은 더 많은 수의 식물 또는 니코티아나 벤타미아나, 토마토 또는 대두와 같은 농업 또는 학문적 관심의 다른 식물 종에 접종하는 데 적용될 수 있습니다. 박테리아 현탁액의 침투를 촉진하기 위해 지표수 장력을 감소시키는 데 사용되는 계면활성제의 농도는 경우에 따라 조직 괴사를 유발할 수 있으므로 식물 종에 따라 미리 조정하고 테스트해야 합니다. 또한 적용되는 압력의 양과 접종 과정의 지속 시간은 최적의 결과를 보장하기 위해 다른 종의 식물 잎이 제공하는 저항에 맞게 조정되어야 합니다.
아포플라스트 추출과 관련하여 현재의 방법은 조직 파괴를 최소화하여 추출된 샘플에 존재하는 식물 파편의 양을 줄입니다. 이를 통해 더 깨끗한 샘플을 얻을 수 있으며, 예제와 같이 RNA-seq, 유세포 분석 또는 현미경과 같은 다양한 기술을 통해 보다 효율적인 분석이 가능합니다. 조직 및 식물 세포 파괴를 최소화하면서 아포형성 환경에서 병원성 박테리아 개체군을 회수하는 것은 어려운 일입니다. P. syringae 는 아포 플라스트의 세포 간 공간을 식민지화하여 미세 식민지를 형성합니다. P. syringae와 같은 세포외 병원체를 사용하면 박테리아 회복을 위해 조직 및 세포 파괴가 필요하지 않기 때문에 여기에 제시된 것과 같은 방법이 가능합니다. 양압과 음압의 라운드는 미세 콜로니를 방해하여 박테리아를 분산시키고 자연 개구부(기공)를 통해 쉽고 빠르게 추출할 수 있도록 하여 보다 부드러운 아포형성 회복 방법에 필요한 것과 같이 긴 배양 시간을 수반할 수 있는 유전자 발현의 변화를 방지합니다. 남은 식물 조직의 현미경 검사는 대부분의 박테리아 개체군을 제거하는 데 도움이 됩니다. 아포소성 유체 추출 프로토콜은 아포플라스틱 유체의 복잡성을 연구하기 위해 널리 사용되어 왔다17. 이러한 프로토콜에는 회수된 아포소성 유체를 추가로 정화하기 위한 원심분리의 마지막 단계가 포함되어 있습니다. 여기서는 주사기 플런저를 사용하여 양압과 음압의 부드러운 사이클을 대신 사용하여 숙주 세포 파편으로 인한 시료 오염을 줄이면서 박테리아 회수 효율성에 거의 영향을 미치지 않았습니다. 고전적인 부드러운 박테리아 추출 방법 중 하나는 1-2 시간18 동안 계면 활성제와 함께 잎 디스크 또는 묘목을 배양하는 것입니다. 이 방법은 박테리아를 추출하기 위해 여기에 제시된 방법만큼 효율적이지 않습니다. 그러나, 유전자 발현 분석에 대한 이의 주요한 한계는 집단의 발현 프로파일에 대한 필요한 배양 시간의 영향이다. 본원에 제시된 방법은 아포형성 집단의 신속한 회복 및 즉각적인 분석을 가능하게 하여, 세포 수준에서 유전자 발현 결과를 우회할 위험을 감소시킨다.
병원성 박테리아의 표현형 이질성은 균질한 실험실 배지를 사용하여 널리 연구되었습니다. 자연 틈새 시장에서 자란 박테리아 개체군을 연구하는 것은 다운스트림 단일 세포 분석을 방해하는 숙주 세포 파편으로 인한 과도한 오염 없이 박테리아 개체군을 회수하는 어려움과 같은 기술적 장벽으로 인해 제한되는 경우가 많습니다. 이 결합된 접종 및 추출 방법을 통해 단일 세포 분석을 위한 박테리아 병원체의 대규모 아포형성 개체군을 생성할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 MCIN/AEI/10.13039/501100011033/가 자금을 지원하는 Project Grant RTI2018-095069-B-I00과 "ERDP: A way of making Europe"의 지원을 받았습니다. JSR은 Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020)의 자금 지원을 받았습니다. NLP는 Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación의 Project Grant P18-RT-2398에 의해 자금을 지원받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
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