Summary
Le présent protocole décrit une méthode qui permet l’analyse de l’expression génique unicellulaire sur des populations de Pseudomonas syringae cultivées dans l’apoplaste végétal.
Abstract
Une pléthore de micro-organismes pathogènes attaquent constamment les plantes. Le complexe d’espèces Pseudomonas syringae englobe des bactéries phytopathogènes à Gram négatif d’une importance particulière pour un grand nombre d’hôtes. P. syringae pénètre dans la plante par la surface des feuilles et se multiplie rapidement dans l’apoplaste, formant des microcolonies qui occupent l’espace intercellulaire. L’expression constitutive des protéines fluorescentes par les bactéries permet de visualiser les microcolonies et de suivre le développement de l’infection au niveau microscopique. Les progrès récents dans l’analyse unicellulaire ont révélé la grande complexité atteinte par les populations bactériennes isogéniques clonales. Cette complexité, appelée hétérogénéité phénotypique, est la conséquence de différences intercellulaires dans l’expression des gènes (non liées aux différences génétiques) au sein de la communauté bactérienne. Pour analyser l’expression des loci individuels au niveau unicellulaire, les fusions transcriptionnelles avec des protéines fluorescentes ont été largement utilisées. Dans des conditions de stress, comme celles qui se produisent lors de la colonisation de l’apoplaste végétal, P. syringae se différencie en sous-populations distinctes en fonction de l’expression hétérogène de gènes clés de virulence (c.-à-d. le système de sécrétion Hrp de type III). Cependant, l’analyse unicellulaire d’une population donnée de P. syringae récupérée à partir de tissus végétaux est difficile en raison des débris cellulaires libérés lors de la perturbation mécanique intrinsèque aux processus d’inoculation et d’extraction bactérienne. Le présent rapport décrit en détail une méthode mise au point pour surveiller l’expression des gènes d’intérêt de P. syringae au niveau unicellulaire pendant la colonisation d’Arabidopsis et de haricots. La préparation des plantes et les suspensions bactériennes utilisées pour l’inoculation à l’aide d’une chambre à vide sont décrites. La récupération des bactéries endophytes à partir de feuilles infectées par extraction de liquide apoplastique est également expliquée ici. Les méthodes d’inoculation bactérienne et d’extraction bactérienne sont optimisées empiriquement pour minimiser les dommages aux cellules végétales et bactériennes, ce qui donne des préparations bactériennes optimales pour la microscopie et l’analyse par cytométrie en flux.
Introduction
Les bactéries pathogènes présentent des différences dans divers phénotypes, ce qui donne lieu à la formation de sous-populations au sein de populations génétiquement identiques. Ce phénomène est connu sous le nom d’hétérogénéité phénotypique et a été proposé comme stratégie d’adaptation lors des interactions bactérien-hôte1. Les progrès récents dans la résolution optique des microscopes confocaux, la cytométrie en flux et la microfluidique, combinés aux protéines fluorescentes, ont favorisé les analyses unicellulaires des populations bactériennes2.
La Pseudomonas syringae à Gram négatif est une bactérie phytopathogène archétypale en raison de son importance académique et économique3. Le cycle de vie de P. syringae est lié au cycle de l’eau4. P. syringae pénètre dans les espaces intercellulaires entre les cellules mésophylles, l’apoplaste foliaire de la plante, par des ouvertures naturelles telles que les stomates ou les plaies5. Une fois dans l’apoplaste, P. syringae s’appuie sur le système de sécrétion de type III (T3SS) et les effecteurs transloqués de type III (T3E) pour supprimer l’immunité des plantes et manipuler les fonctions cellulaires des plantes au profit de l’agent pathogène6. L’expression de T3SS et T3E dépend du régulateur maître HrpL, un facteur sigma alternatif qui se lie aux motifs hrp-box dans la région promotrice des gènes cibles7.
En générant des fusions transcriptionnelles situées sur les chromosomes vers des gènes de protéines fluorescentes en aval du gène d’intérêt, on peut surveiller l’expression des gènes en fonction des niveaux de fluorescence émis au niveauunicellulaire 8. En utilisant cette méthode, il a été établi que l’expression de hrpL est hétérogène tant au sein des cultures bactériennes cultivées en laboratoire qu’au sein des populations bactériennes récupérées de la plante apoplast 8,9. Bien que l’analyse de l’expression génique au niveau d’une seule cellule soit généralement effectuée dans des cultures bactériennes cultivées dans des milieux de laboratoire, de telles analyses peuvent également être effectuées sur des populations bactériennes qui se développent dans la plante, fournissant ainsi des informations précieuses sur la formation de sous-populations dans le contexte naturel. Une limitation potentielle pour l’analyse des populations bactériennes extraites de la plante est que les méthodes classiques d’inoculation par infiltration sous pression de seringue dans l’apapoplaste, suivie d’une extraction bactérienne par macération du tissu foliaire, génèrent généralement une grande quantité de débris cellulaires végétaux qui interfèrent avec l’analyse en aval10. La plupart des débris cellulaires sont constitués de fragments autofluorescents de chloroplastes qui chevauchent la fluorescence GFP, ce qui entraîne des résultats trompeurs.
Le présent protocole décrit le processus d’analyse de l’hétérogénéité de l’expression génique unicellulaire dans deux pathosystèmes modèles: celui formé par le P. syringae pv. souche de tomate DC3000 et Arabidopsis thaliana (Col-0), et l’autre par P. syringae pv. phaseolicola souche 1448A et plants de haricots (cultivar Phaseolus vulgaris Canadian Wonder). Une méthode d’inoculation est proposée basée sur l’infiltration sous vide à l’aide d’une chambre à vide et d’une pompe, ce qui permet d’obtenir une méthode rapide et sans dommage pour infiltrer les feuilles entières. En outre, comme amélioration par rapport aux protocoles conventionnels, une méthode plus douce est utilisée pour extraire la population bactérienne de l’apoplaste qui réduit considérablement la perturbation tissulaire, basée sur l’extraction du liquide apoplastique en appliquant des cycles de pression positive et négative en utilisant une petite quantité de volume dans une seringue.
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Protocol
1. Préparation des plantes
- Préparez les plantes d’Arabidopsis Col-0 en suivant les étapes ci-dessous.
- Remplissez un pot de 10 cm de diamètre avec un mélange de substrat vermiculite-plante de 1:3 (voir le tableau des matières), préalablement arrosé, et couvrez le pot d’un treillis métallique de 15 cm x 15 cm avec des trous de 1,6 mm x 1,6 mm. Ajustez le treillis métallique au sol humide à l’aide d’un élastique (figure 1A).
- Avec un cure-dent humide, semez les graines d’Arabidopsis dans les trous du treillis métallique. Placez trois à quatre graines à distance dans le pot (Figure 1B, C).
- Couvrir les pots d’un dôme en plastique pour maintenir une humidité relative élevée et les incuber pendant 72 h à 4 °C pour la stratification.
NOTE: La stratification (incubation à haute humidité et basse température, comme décrit) améliore le taux de germination et la synchronie des graines. - Transférer les pots dans une chambre de croissance des plantes dans des conditions de journées courtes (8 h de lumière/16 h d’obscurité à 21 °C, intensité lumineuse : 100 μmol·m−2·s−1, humidité relative : 70%).
- Après la germination des graines (8-10 jours), utilisez la pince à épiler pour enlever la plupart des plants, en gardant un plant dans chacune des positions du pot (six plants/pot) (Figure 1D). Retirez le dôme en plastique pour découvrir les pots.
REMARQUE: Les plantes seront prêtes à être utilisées 4-5 semaines après la germination.
- Préparer des plants de haricots Phaseolus vulgaris (cultivar Canadian Wonder).
- Couvrez le fond d’une boîte de Petri avec un morceau de papier serviette humide et placez les graines de haricots dessus. Sceller la boîte de Petri avec du ruban chirurgical et incuber à 28 °C pendant 3-4 jours (Figure 2A).
- Transférer les graines germées dans un pot de 10 cm de diamètre rempli d’un mélange humide de substrat vermiculite 1:3.
- Incuber dans une chambre de croissance des plantes pendant de longues journées (16 h de lumière/8 h d’obscurité à 23 °C, intensité lumineuse : 100 μmol·m−2·s−1, humidité relative : 70 %).
REMARQUE : Les plantes seront prêtes à l’emploi 10 jours après la germination (figure 2B).
2. Inoculation d’Arabidopsis et de plants de haricots
NOTE: Dans cette étude, les souches P. syringae pv. tomate DC3000 et P. syringae pv. phaseolicola 1448A ont été utilisés.
- Préparer l’inoculum de P. syringae.
- Étaler la souche d’intérêt de P. syringae à partir d’un stock de glycérol de -80 °C sur une plaque de LB (10 g/L de tryptone, 5 g/L de NaCl, 5 g/L d’extrait de levure et 16 g/L de gélose bactériologique, voir le tableau des matières) complétée par les antibiotiques appropriés. Incuber à 28 °C pendant 40-48 h.
REMARQUE : L’utilisation d’antibiotiques est recommandée si la souche d’intérêt porte un plasmide ou un gène de résistance génomique. Les concentrations d’antibiotiques recommandées pour P. syringae sont les suivantes : kanamycine (15 μg/mL), gentamycine (10 μg/mL), ampicilline (300 μg/mL) (voir le tableau des matières). - Gratter la biomasse bactérienne et remettre en suspension dans 5 mL de 10 mM de MgCl2. Mesurer le DO600 et ajuster à 0,1 en ajoutant 10 mM MgCl2.
NOTE: Une DO600 de 0,1 d’une culture de P. syringae correspond à 5 x 107 UFC·mL−1. - Effectuer des dilutions en série dans 10 mM de MgCl2 pour atteindre une concentration finale d’inoculum de 5 x 105 UFC-1. Préparer 200 mL d’inoculum pour les plants d’Arabidopsis et 50 mL pour les plants de haricots.
- Juste avant l’inoculation, ajouter le surfactant Silwett L-77 (voir le tableau des matières) à une concentration finale de 0,02 % pour l’inoculation des haricots et de 0,01 % pour Arabidopsis. Notez que Silwett est quelque peu préjudiciable au tissu d’Arabidopsis.
- Étaler la souche d’intérêt de P. syringae à partir d’un stock de glycérol de -80 °C sur une plaque de LB (10 g/L de tryptone, 5 g/L de NaCl, 5 g/L d’extrait de levure et 16 g/L de gélose bactériologique, voir le tableau des matières) complétée par les antibiotiques appropriés. Incuber à 28 °C pendant 40-48 h.
- Effectuer une infiltration de vide.
- Pour l’infiltration d’Arabidopsis, placer deux bâtons de bois formant un X sur le pot (figure 1E) et placer le pot face vers le bas sur une boîte de Petri de 14 cm de diamètre contenant l’inoculum de 200 ml (figure 1F).
- Pour l’inoculation des feuilles de haricot, introduire la feuille dans un tube à centrifuger conique de 50 ml contenant l’inoculum (figure 2C).
- Insérez les plantes immergées dans la solution d’inoculum dans une chambre à vide (Figure 1G et Figure 2D) et donnez une impulsion de 500 mbar pendant 30 s pour infiltrer les feuilles. Répétez l’impulsion de vide 2-3 fois jusqu’à ce que la feuille soit complètement infiltrée (Figure 1H et Figure 2E).
- Égoutter l’excès de solution d’inoculum avec un morceau de papier et remettre les plantes dans leur chambre de croissance correspondante.
3. Extraction des bactéries de l’apoplaste
- Quatre jours après l’inoculation, couper la partie aérienne de la plante Arabidopsis ou la feuille inoculée du haricot et la placer dans une seringue de 20 ml sans aiguille (figure 2G). Pour les feuilles de haricot, rouler la feuille sur elle-même, en laissant la face abaxiale vers l’extérieur, comme illustré à la figure 2F.
- Ajouter suffisamment d’eau distillée pour couvrir le tissu (habituellement 10-15 mL).
- Insérez le piston et, avec la seringue en position verticale avec l’embout pointé vers le haut, retirez l’excès d’air et les bulles d’air à l’intérieur de la seringue en tapotant doucement le canon jusqu’à ce que tout l’air soit situé près de l’embout. Faites glisser ensuite le piston pour évacuer l’air. Une fois qu’il y a le moins d’air possible à l’intérieur de la seringue, couvrez l’extrémité du corps de la seringue avec un film de paraffine.
- Appuyez délicatement sur le piston pour générer une pression positive jusqu’à ce que le tissu devienne plus foncé (Figure 1I et Figure 2H). Ensuite, tirez sur le piston pour générer une pression négative (Figure 1J et Figure 2I). Répétez cette étape 3 à 5 fois.
- Retirez le film de paraffine et le piston et recueillez le liquide contenant les bactéries extraites de l’apoplaste, comme dans la figure 2J.
4. Analyse unicellulaire de la bactérie extraite de l’apoplaste
- Visualisez par microscopie confocale en suivant les étapes ci-dessous.
- Préparer une solution d’agarose à 1,5% dans de l’eau distillée. Une fois fondue, ajoutez suffisamment de volume pour remplir l’espace entre deux lames de microscopie placées côte à côte et placez une autre lame sur le dessus (Figure 3). Laissez-les sécher pendant 15 minutes et retirez délicatement la lame placée sur le dessus. À l’aide d’une lame, couper le tampon d’agarose en morceaux de 5 mm x 5 mm juste avant utilisation.
- Parallèlement, centrifuger 1 mL de bactéries extraites de l’apoplaste à 12 000 x g pendant 1 min à température ambiante, retirer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension la pastille dans 20 μL d’eau pour concentrer les cellules. Déposer une goutte de 2 μL des cellules concentrées sur une lamelle de couverture de 0,17 mm et couvrir la goutte d’un morceau de 5 mm x 5 mm du tampon d’agarose préalablement obtenu à l’étape 1, comme le montre la figure 3.
- Visualisez la préparation bactérienne au microscope confocal (voir Tableau des matériaux). Pour identifier les bactéries fluorescentes vertes, utilisez le laser d’excitation à 488 nm et un filtre d’émission allant de 500 nm à 550 nm. Pour identifier toutes les bactéries, utilisez le champ lumineux et fusionnez les deux champs.
- Traiter les images confocales à l’aide de Fidji (voir le tableau des matériaux). Pour ce faire, utilisez le plugin MicrobeJ pour identifier le contour de la cellule bactérienne et mesurer l’intensité de fluorescence à l’intérieur.
REMARQUE : L’acquisition d’images à partir de bactéries isolées (non groupées) est recommandée pour cette analyse.
- Effectuer l’analyse par cytométrie de flux.
- Prenez une partie aliquote des suspensions de bactéries extraites d’apoplastes pour l’analyser à l’aide du cytomètre en flux. Acquérir 100 000 événements.
- Pour faire la distinction entre les bactéries et les débris végétaux, analysez l’apoplast extrait d’une plante non inoculée et comparez le diagramme à points montrant la taille de sa cellule de diffusion vers l’avant (FSC) par rapport à la taille de la cellule à diffusion latérale (SSC) avec celle de la suspension bactérienne extraite de l’apoplaste. Pour identifier les bactéries non fluorescentes, utilisez les apoplastes extraits des plantes inoculées avec des bactéries isogéniques non fluorescentes et comparez leurs émissions fluorescentes.
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Representative Results
L’expression du système de sécrétion de type III est essentielle à la croissance bactérienne au sein de la plante. L’expression opportune des gènes T3SS est obtenue grâce à une régulation complexe, au centre de laquelle se trouve le facteur sigma de la fonction extracytoplasmique (ECF) HrpL, l’activateur clé de l’expression des gènes liés à T3SS11. Une analyse de l’expression de hrpL a été précédemment réalisée en utilisant une fusion transcriptionnelle située par chromosome vers un gène gfp sans promoteur en aval et en suivant les schémas d’expression par microscopie confocale et cytométrie en flux9. Ces fusions sont générées par l’intégration par recombinaison homologue de constructions codées par plasmide générées par PCR et clonage traditionnel et portent les 500 dernières paires de bases de l’ORF du gène d’intérêt (y compris le codon STOP) et 500 paires de bases de la séquence immédiatement en aval, flanquant le site de liaison au ribosome et l’ORF du gène rapporteur de fluorescence à utiliser (dans ce cas, GFP), suivie d’une cassette de résistance aux antibiotiques (dans ce cas, le gène NPT2 conférant une résistance à la kanamycine). Ainsi, il a été établi que les populations de P. syringae extraites de l’apoplaste exprimant des gènes liés à la T3SS, y compris hrpL, sont hétérogènes chez planta9. Sur ce précédent, les résultats représentatifs de la microscopie confocale à fluorescence et de l’analyse par cytométrie en flux de l’expression hrpL sont présentés dans des cellules bactériennes individuelles des souches modèles Pph 1448A (Pph) et Pto DC3000 (Pto), extraites des feuilles du haricot ou d’Arabidopsis, respectivement, après colonisation de l’apoplast foliaire (Figure 4). Dans chaque souche, le gène hrpL chromosomique de P. syringae transporte une fusion transcriptionnelle en aval vers un gène gfp sans promoteur qui permet de surveiller l’activité du promoteur natif hrpL en suivant les niveaux d’expression GFP 8,9.
Les bactéries extraites d’Apoplast peuvent être utilisées pour différentes analyses. Ici, 300 μL des souches bactériennes rapporteures mentionnées ci-dessus ont été extraites de l’apoplaste d’Arabidopsis ou de plants de haricots infectés et utilisés pour l’acquisition de données à l’aide d’un système de cytomètre en flux (voir le tableau des matériaux). L’émission laser à 488 nm et le filtre FITC ont été utilisés pour la détection GFP. L’analyse par cytométrie en flux montre la distribution de fluorescence dans les cellules bactériennes individuelles de la population. L’expression hétérogène de hrpL peut être clairement observée par cytométrie de flux chez le Pto extrait d’Arabidopsis apoplast et dans le Pph extrait de l’apoplaste du haricot, y compris les bactéries HrpLOFF (n’exprimant pas la GFP), et ces résultats sont corroborés par un examen microscopique des échantillons correspondants (Figure 4). Les graphiques à points (panneaux de gauche) montrent la distribution de l’intensité de fluorescence de la GFP par rapport à la taille des cellules dans la population (figure 4A), tandis que les histogrammes montrent l’intensité de fluorescence de la GFP par rapport au nombre de cellules (figure 4B). Ces deux représentations graphiques différentes des données cytométriques permettent au chercheur d’établir des nuances visuelles subtiles et de fournir des informations complémentaires. Comme témoin de l’autofluorescence bactérienne, la souche de type sauvage non GFP correspondante a été utilisée (panneau supérieur de la figure 4A et histogramme gris de la figure 4B). Cela permet d’identifier la zone graphique où les bactéries non GFP au sein de la population sont affichées. Les analyses de cytométrie en flux génèrent également des données quantitatives. À titre d’exemple, les pourcentages de cellulesHrpL ON (fluorescentes) sont extraits dans les populations de Pto et de Pph extraites d’apoplastes. La figure 4C montre comment les pourcentagesd’HrpL ON étaient plus élevés que les pourcentages correspondants de cellules HrpLOFF (non fluorescentes) dans ces populations, en particulier dans le modèle Pto. Ces données peuvent également être utilisées pour calculer la fluorescence moyenne ou médiane pour l’ensemble de la population. Dans cette expérience particulière, l’intensité moyenne de fluorescence GFP a été obtenue, qui était plus élevée pour la population de Pto que pour Pph, conformément à son pourcentage plus élevé de cellules ON. Les niveaux moyens constituent des données au niveau de la population comparables aux données obtenues par des techniques non unicellulaires telles que la RT-qPCR ou RNAseq. Enfin, le coefficient de variation robuste (RCV)12, calculé comme le troisième quartile moins le premier quartile divisé par la médiane, est également présenté. Le RCV est souvent utilisé dans les études de cytométrie en flux pour estimer la dispersion des données (c.-à-d. l’hétérogénéité de l’expression au sein de la population)13. Dans la présente étude, la VCR était légèrement plus élevée pour Pph que pour Pto, bien que la différence n’ait pas été suffisante pour caractériser la distribution de l’expression au sein des populations de ces deux souches comme significativement différente. L’hétérogénéité de l’expression de hrpL peut être confirmée visuellement par les images de microscopie confocale (Figure 4D). L’utilisation de tampons gélose pour la préparation de la microscopie permet une visualisation plus facile et des images de meilleure qualité des cellules individuelles, car elle pousse les bactéries sur une seule couche et empêche le mouvement des bactéries. Les procédures d’inoculation et d’extraction bactérienne décrites dans ce protocole minimisent la quantité de débris végétaux dans la préparation bactérienne, permettant ainsi l’analyse de l’expression bactérienne par ces différentes techniques (Figure 4).
Figure 1 : Inoculation bactérienne et extraction d’apoplastes à l’aide de plantes d’Arabidopsis. (A) Préparation du pot avec le treillis métallique correctement attaché. (B) Semer des graines à l’aide d’un cure-dent pour les distribuer comme indiqué au point C). D) Plantes d’Arabidopsis prêtes à être inoculées. (E) Deux bâtons de bois facilitent l’immersion des plantes dans la solution bactérienne sans atteindre le pot ou le sol (F). (G) L’ensemble peut être placé à l’intérieur de la chambre à vide. (H) Les feuilles infiltrées deviennent plus sombres après avoir libéré le vide de la chambre. (I) Les feuilles détachées sont placées dans une seringue de 20 ml et recouvertes d’eau. (J) Les cycles de pression positive et négative entraînent l’extraction de la bactérie apoplasique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Inoculation bactérienne et extraction d’apoplastes à l’aide de plants de haricots. (A) Germination des graines de haricots dans des boîtes de Petri tapissées de papier hygiénique humide. (B) Plante de haricot prête à être inoculée. (C) Feuille de haricot immergée dans la solution bactérienne contenue dans un tube de 50 mL. (D) Les feuilles sont inoculées à l’intérieur d’une chambre à vide jusqu’à ce que le tissu devienne plus foncé (E). (F) La feuille de haricot est roulée, placée dans une seringue de 20 ml et recouverte d’eau (G). (H) Les cycles de pression positive et négative (I) entraînent l’extraction de la bactérie apoplasique qui peut être récupérée dans un tube (J). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Représentation schématique du réglage et de la préparation du tampon gélosé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse des bactéries extraites de l’apoplaste obtenues à partir d’Arabidopsis ou de feuilles de haricot 4 jours après l’inoculation avec P. syringae pv. tomate (Pto) ou P. syringae pv. phaseolicola (Pph), respectivement. L’expression de hrpL::gfp est surveillée sous forme de fluorescence GFP. (A) L’analyse par cytométrie en flux est représentée par un diagramme de points (diffusion vers l’avant [taille de la cellule] par rapport à l’intensité de fluorescence GFP). Les bactéries non GFP indiquent une souche de type sauvage de Pto ou de Pph. La ligne verticale délimite 99 % de la population non bénéficiaire de la GFP. (B) L’analyse par cytométrie en flux est représentée par des histogrammes (numération cellulaire par rapport à l’intensité de fluorescence GFP). L’histogramme gris représente la souche non-GFP. (C) Des données quantitatives ont été générées à partir de l’analyse de cytométrie en flux. Le pourcentage de cellules ON et OFF est calculé en fonction de la distribution indiquée dans le diagramme à points. La moyenne indique la fluorescence moyenne obtenue dans l’expérience. Le coefficient de variation robuste (RCV) est calculé comme le troisième quartile moins le premier quartile divisé par la médiane. (D) Images de microscopie à fluorescence montrant des niveaux hétérogènes de GFP associés à l’expression de hrpL. Les flèches blanches mettent en évidence les bactéries présentant de faibles niveaux ou aucune fluorescence GFP. Barre d’échelle: 3 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La méthode présentée ici décrit une procédure non invasive qui permet l’infiltration de bactéries dans le tissu foliaire de la plante, permettant l’inoculation rapide de grands volumes tout en minimisant la perturbation tissulaire. L’une des caractéristiques du complexe d’espèces P. syringae est sa capacité à survivre et à proliférer à l’intérieur de l’apoplaste de la plante et à la surface de la plante en tant qu’épiphyte14. Ainsi, la possibilité que les bactéries extraites à l’aide du présent protocole proviennent uniquement de l’apoplaste végétal ne peut être exclue. Cependant, il a déjà été démontré par microscopie confocale que la proportion de bactéries à la surface de la feuille est particulièrement mineure par rapport à la croissance bactérienne à l’intérieur de la feuillede plante 5. Ceci peut être vérifié par un examen microscopique de la surface de la feuille avant l’extraction. En outre, il a été démontré que les souches de P. syringae utilisées comme modèle dans le présent protocole, Pto DC3000 et Pph 1448A, fonctionnent comme des épiphites faibles15, représentant une proportion non pertinente des bactéries extraites. Néanmoins, si la méthode doit être adaptée à d’autres pathosystèmes, une étape préalable de décontamination de la surface des feuilles peut être ajoutée au présent protocole.
Les méthodes d’inoculation traditionnelles, telles que l’infiltration de feuilles à l’aide d’une seringue16, causent des lésions tissulaires plus importantes et difficiles à estimer au site d’inoculation, entraînant une nécrose tissulaire. De plus, l’ampleur des dommages est très variable entre les différents points d’inoculation. En outre, différentes espèces de plantes varient dans leur tolérance à l’infiltration des feuilles. Par exemple, les feuilles d’Arabidopsis sont faciles à infiltrer, tandis que les feuilles de haricot sont plus récalcitrantes. Les conditions de croissance affectent également le niveau de tolérance à l’infiltration d’une espèce donnée. Des méthodes d’inoculation traditionnelles plus douces, telles que le trempage des feuilles ou la pulvérisation de feuilles, entraînant une entrée bactérienne et une colonisation du tissu plus naturelles et sans dommages, limitent toutefois intrinsèquement la taille des populations bactériennes obtenues, souvent en dessous du seuil requis pour l’analyse ultérieure des échantillons bactériens apoplasiques5 . La méthode d’inoculation proposée réduit considérablement l’activation de la nécrose dans les zones inoculées résultant de la pression de la seringue tout en évitant la limitation de la taille de l’échantillon bactérien et fournit un moyen facile, reproductible et rapide d’inoculer des zones foliaires considérables.
Certaines techniques nécessitant l’inoculation de grandes zones tissulaires peuvent prendre beaucoup de temps et de main-d’œuvre, ce qui augmente les risques d’infliger des lésions tissulaires. En appliquant cette méthode, nous pouvons inoculer cinq plantes d’Arabidopsis ou plus, ou une feuille de haricot entière, en une seule étape sans compromettre l’intégrité des tissus. Cette technique peut être adaptée pour inoculer un plus grand nombre de plantes ou à d’autres espèces végétales d’intérêt agronomique ou académique, telles que Nicotiana benthamiana, la tomate ou le soja. La concentration du tensioactif, utilisé pour réduire la tension de l’eau de surface afin de faciliter l’infiltration de la suspension bactérienne, doit être ajustée et testée à l’avance en fonction de l’espèce végétale, car des concentrations plus élevées du surfactant peuvent entraîner une nécrose tissulaire dans certains cas. De plus, la quantité de pression appliquée et la durée du processus d’inoculation doivent être ajustées à la résistance offerte par la feuille de la plante chez différentes espèces pour assurer des résultats optimaux.
En ce qui concerne l’extraction de l’apoplaste, la méthode actuelle minimise également la perturbation tissulaire, réduisant ainsi la quantité de débris végétaux présents dans l’échantillon extrait. Cela permet d’obtenir des échantillons plus propres, ce qui permet une analyse plus efficace grâce à différentes techniques telles que le séquençage de l’ARN, la cytométrie en flux ou la microscopie, comme indiqué dans l’exemple. Le rétablissement de la population bactérienne pathogène de son environnement apoplastique avec une perturbation minimale des tissus et des cellules végétales est difficile. P. syringae colonise les espaces intercellulaires de l’apoplaste, formant des microcolonies. L’utilisation d’un agent pathogène extracellulaire, tel que P. syringae, permet des méthodes comme celle présentée ici, car la perturbation des tissus et des cellules n’est pas nécessaire pour la récupération bactérienne. Les cycles de pression positive et négative perturbent les microcolonies, dispersant les bactéries et permettant leur extraction facile et rapide par des ouvertures naturelles (stomates), évitant ainsi tout changement dans l’expression des gènes pouvant accompagner de longues périodes d’incubation, telles que celles requises pour des méthodes plus douces de récupération apoplastique. L’examen microscopique des tissus végétaux restants permet d’éliminer la majeure partie de la population bactérienne. Les protocoles d’extraction du fluide apoplastique ont été largement utilisés pour étudier la complexité du fluide apoplastique17. Ces protocoles contiennent une dernière étape de centrifugation pour nettoyer davantage le liquide apoplastique récupéré. Ici, des cycles doux de pression positive et négative à l’aide du piston de seringue ont été utilisés à la place, réduisant ainsi la contamination de l’échantillon par des débris cellulaires hôtes tout en ayant très peu d’impact sur l’efficacité de la récupération bactérienne. Une méthode classique d’extraction bactérienne douce consiste en l’incubation de disques foliaires ou de plantules avec un tensioactif pendant 1-2 h18. Cette méthode n’est pas aussi efficace que celle présentée ici pour extraire les bactéries; Cependant, sa principale limite pour l’analyse de l’expression génique est l’effet du temps d’incubation requis sur le profil d’expression de la population. La méthode présentée ici permet la récupération rapide et l’analyse immédiate de la population apoplasique, réduisant ainsi le risque de contourner les résultats de l’expression génique au niveau cellulaire.
L’hétérogénéité phénotypique des bactéries pathogènes a été largement étudiée à l’aide de milieux de laboratoire homogènes. L’étude des populations bactériennes cultivées dans leur niche naturelle est souvent limitée en raison d’obstacles techniques, tels que la difficulté de récupérer les populations bactériennes sans contamination excessive par des débris de cellules hôtes qui interfèrent avec les analyses de cellules uniques en aval. Cette méthode combinée d’inoculation et d’extraction permet la génération de grandes populations apoplasiques de pathogènes bactériens pour des analyses unicellulaires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention Projet RTI2018-095069-B-I00 financée par MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ et par « ERDP A way to Making Europe ». J.S.R. a été financé par Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. a été financé par la subvention de projet P18-RT-2398 de Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
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