Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה המאפשרת ניתוח ביטוי גנים של תא בודד על אוכלוסיות מזרקי Pseudomonas הגדלות בתוך אפופלסט הצמח.
Abstract
שפע של מיקרואורגניזמים פתוגניים תוקפים כל הזמן צמחים. קומפלקס מיני מזרקי Pseudomonas כולל חיידקים גראם-שליליים צמחיים-פתוגניים בעלי רלוונטיות מיוחדת למספר רב של פונדקאים. מזרקי P . נכנסים לצמח מפני השטח של העלה ומתרבים במהירות בתוך האפופלסט, ויוצרים מיקרו-מושבות המאכלסות את החלל הבין-תאי. הביטוי המכונן של חלבונים פלואורסצנטיים על ידי החיידקים מאפשר הדמיה של המיקרוקולוניות ומעקב אחר התפתחות הזיהום ברמה המיקרוסקופית. ההתקדמות האחרונה באנליזה של תא בודד חשפה את המורכבות הגדולה שאליה מגיעות אוכלוסיות חיידקים איזוגניים משובטים. מורכבות זו, המכונה הטרוגניות פנוטיפית, היא תוצאה של הבדלים בין תאים בביטוי גנים (שאינם קשורים להבדלים גנטיים) בקרב קהילת החיידקים. כדי לנתח את הביטוי של אתרים בודדים ברמת התא היחיד, נעשה שימוש נרחב באיחוי שעתוק לחלבונים פלואורסצנטיים. בתנאי עקה, כמו אלה המתרחשים במהלך קולוניזציה של אפופלסט הצמח, מזרקי P. מתמיינים לתת-אוכלוסיות נפרדות בהתבסס על ביטוי הטרוגני של גנים אלימים מרכזיים (כלומר, מערכת ההפרשה מסוג Hrp III). עם זאת, ניתוח חד-תאי של כל אוכלוסיית מזרקי P . נתונה שהתאוששה מרקמת הצמח הוא מאתגר בשל הפסולת התאית המשתחררת במהלך השיבוש המכני המהותי לתהליכי החיסון ומיצוי החיידקים. הדו"ח הנוכחי מפרט שיטה שפותחה כדי לעקוב אחר ביטוי של גנים בעלי עניין של P. syringae ברמת התא הבודד במהלך ההתיישבות של Arabidopsis וצמחי שעועית. מתוארים הכנת הצמחים והתרחיפים החיידקיים המשמשים לחיסון באמצעות תא ואקום. ההתאוששות של חיידקים אנדופיטיים מעלים נגועים על ידי מיצוי נוזל אפופלסטי מוסברת גם כאן. הן שיטות החיסון החיידקי והן שיטות מיצוי החיידקים ממוטבות אמפירית כדי למזער את הנזק לצמחים ולתאי חיידקים, וכתוצאה מכך ההכנות החיידקיות אופטימליות למיקרוסקופיה ולניתוח ציטומטריית זרימה.
Introduction
חיידקים פתוגניים מציגים הבדלים בפנוטיפים מגוונים, מה שגורם להיווצרות תת-אוכלוסיות בתוך אוכלוסיות זהות גנטית. תופעה זו ידועה בשם הטרוגניות פנוטיפית והוצעה כאסטרטגיית הסתגלות במהלך אינטראקציות חיידקים-מארחים1. ההתקדמות האחרונה ברזולוציה האופטית של מיקרוסקופים קונפוקליים, ציטומטריית זרימה ומיקרופלואידיקה, בשילוב עם חלבונים פלואורסצנטיים, טיפחה אנליזות חד-תאיות של אוכלוסיות חיידקים2.
מזרקי Pseudomonas גראם-שליליים הם חיידקים פתוגניים צמחיים ארכיטיפיים בשל חשיבותם האקדמית והכלכלית3. מחזור החיים של מזרקי P. קשור למחזור המים4. מזרקי P. נכנסים לחללים הבין-תאיים שבין תאי המזופיל, אפופלסט עלה הצמח, דרך פתחים טבעיים כגון פיוניות או פצעים5. ברגע שהוא בתוך האפופלסט, מזרקי P. מסתמכים על מערכת ההפרשה מסוג III (T3SS) ועל המשפיעים המועתקים מסוג III (T3E) כדי לדכא את חסינות הצמח ולתפעל את תפקודי התא הצמחי לטובת הפתוגן6. הביטוי של T3SS ו-T3E תלוי בווסת הראשי HrpL, גורם סיגמא חלופי הנקשר למוטיבים של תיבת HRP באזור המקדם של גני המטרה7.
על ידי יצירת איחוי שעתוק הממוקם בכרומוזומים לגנים חלבוניים פלואורסצנטיים במורד הזרם של הגן המעניין, ניתן לעקוב אחר ביטוי גנים בהתבסס על רמות הפלואורסצנטיות הנפלטות ברמת התא הבודד8. בשיטה זו נקבע כי ביטוי HRPL הוא הטרוגני הן בתרביות חיידקים הגדלות במעבדה והן באוכלוסיות חיידקים שנמצאו מהצמח אפופלסט 8,9. למרות שניתוח ביטוי גנים ברמת התא הבודד מבוצע בדרך כלל בתרביות חיידקים הגדלות באמצעי מעבדה, ניתוחים כאלה יכולים להתבצע גם על אוכלוסיות חיידקים הגדלות בתוך הצמח, ובכך לספק מידע רב ערך על היווצרות תת-אוכלוסיות בהקשר הטבעי. מגבלה פוטנציאלית לניתוח אוכלוסיות חיידקים המופקות מהצמח היא ששיטות חיסון קלאסיות על ידי חדירת לחץ מזרק לאפופלסט, ואחריה מיצוי חיידקים על ידי השרייה של רקמת העלה, מייצרות בדרך כלל כמות גדולה של פסולת צמחית תאית המפריעה לניתוח במורד הזרם10. רוב פסולת התא מורכבת מקטעים אוטופלואורסצנטיים של כלורופלסטים החופפים לפלואורסצנטיות GFP, והתוצאה היא תוצאות מטעות.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את תהליך ניתוח ההטרוגניות של ביטוי גנים חד-תאיים בשתי מערכות מודל: זו שנוצרה על ידי מזרקי P. pv. זן עגבניות DC3000 ו Arabidopsis thaliana (Col-0), והשני על ידי P. מזרקים pv. זן פאזוליקולה 1448A וצמחי שעועית (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). שיטת חיסון מוצעת המבוססת על חדירת ואקום באמצעות תא ואקום ומשאבה, וכתוצאה מכך שיטה מהירה ונטולת נזקים לחדירת עלים שלמים. יתר על כן, כשיפור לפרוטוקולים הקונבנציונליים, משתמשים בשיטה עדינה יותר למיצוי אוכלוסיית החיידקים מהאפופלסט המפחיתה באופן משמעותי את הפרעה הרקמות, המבוססת על מיצוי נוזל אפופלסטי על ידי הפעלת מחזורים של לחץ חיובי ושלילי באמצעות כמות קטנה של נפח בתוך מזרק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת הצמח
- הכינו צמחי Arabidopsis Col-0 לפי השלבים הבאים.
- ממלאים עציץ בקוטר 10 ס"מ בתערובת מצע ורמיקוליט-צמח ביחס 1:3 (ראו טבלת חומרים), שהושקה בעבר, ומכסים את העציץ ברשת מתכת בגודל 15X15 ס"מ עם חורים בגודל 1.6 מ"מ x 1.6 מ"מ. התאימו את רשת המתכת לאדמה הרטובה באמצעות גומייה (איור 1A).
- בעזרת קיסם רטוב, זורעים זרעי Arabidopsis לתוך החורים של רשת המתכת. הניחו שלושה עד ארבעה זרעים במקומות מרוחקים בתוך הסיר (איור 1B, C).
- מכסים את הסירים בכיפת פלסטיק כדי לשמור על לחות יחסית גבוהה ודגרים עליהם במשך 72 שעות ב-4 מעלות צלזיוס לריבוד.
הערה: ריבוד (דגירה בלחות גבוהה ובטמפרטורה נמוכה, כמתואר) משפר את קצב הנביטה ואת הסנכרון של הזרעים. - מעבירים את העציצים לתא גידול צמחים בתנאים קצרים של יום (8 שעות בהירות/16 שעות כהות ב-21°C, עוצמת אור: 100 μmol·m−2·s−1, לחות יחסית: 70%).
- לאחר נביטת זרעים (8-10 ימים), השתמשו בפינצטה כדי להסיר את רוב השתילים, ושמרו שתיל אחד בכל אחד ממיקומי העציץ (שישה שתילים/עציץ) (איור 1D). הסירו את כיפת הפלסטיק כדי לחשוף את הסירים.
הערה: הצמחים יהיו מוכנים לשימוש 4-5 שבועות לאחר הנביטה.
- הכינו צמחי שעועית Phaseolus vulgaris (זן הפלא הקנדי).
- מכסים את תחתית צלחת פטרי בחתיכת נייר מגבת רטובה, ומניחים עליה את זרעי הפולים. אטמו את צלחת הפטרי בעזרת סרט כירורגי ודגרו בטמפרטורה של 28°C למשך 3-4 ימים (איור 2A).
- מעבירים את הזרעים המונבטים לעציץ בקוטר 10 ס"מ מלא בתערובת רטובה של מצע צמחי ורמיקוליט ביחס 1:3.
- יש לדגור בתא גידול של צמחים בסביבה של יום ארוך (16 שעות בהירות/8 שעות כהות ב-23°C, עוצמת אור: 100 μmol·m−2·s−1, לחות יחסית: 70%).
הערה: הצמחים יהיו מוכנים לשימוש 10 ימים לאחר הנביטה (איור 2B).
2. חיסון של Arabidopsis וצמחי שעועית
הערה: במחקר זה, הזנים P. מזרקים pv. עגבניות DC3000 ו P. מזרקים pv. נעשה שימוש בפאזוליקולה 1448A.
- הכינו את P. מזרקים inoculum.
- פזרו את זן מזרקי P . המעניין ממלאי גליצרול של -80°C על צלחת LB (10 גרם/ליטר טריפטון, 5 גרם/ליטר NaCl, תמצית שמרים 5 גרם/ליטר ואגר בקטריולוגי 16 גרם/ליטר, ראו טבלת חומרים) בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה. לדגור ב 28 ° C במשך 40-48 שעות.
הערה: השימוש באנטיביוטיקה מומלץ אם הזן המעניין נושא פלסמיד או גן עמידות גנומית. הריכוזים האנטיביוטיים המומלצים למזרקי P. הם כדלקמן: קנמיצין (15 מיקרוגרם/מ"ל), גנטמיצין (10 מק"ג/מ"ל), אמפיצילין (300 מק"ג/מ"ל) (ראו טבלת חומרים). - לגרד את הביומסה החיידקית ולהשהות מחדש ב 5 מ"ל של 10 mM MgCl2. מדוד את OD600 והתאם ל- 0.1 על-ידי הוספת 10 mM MgCl2.
הערה: OD600 של 0.1 של תרבית מזרקי P . מתאים ל- 5 x 107 CFU·mL−1. - בצע דילולים סדרתיים לתוך 10 mM MgCl2 כדי להגיע לריכוז החיסון הסופי של 5 x 105 CFU·mL−1. הכינו 200 מ"ל של חיסון עבור צמחי Arabidopsis ו 50 מ"ל עבור צמחי שעועית.
- ממש לפני החיסון, יש להוסיף את חומר פעילי השטח סילווט L-77 (ראו טבלת חומרים) לריכוז סופי של 0.02% לחיסון שעועית ו-0.01% לארבידופסיס. שימו לב שסילווט מזיק במידה מסוימת לרקמת הארבידופסיס.
- פזרו את זן מזרקי P . המעניין ממלאי גליצרול של -80°C על צלחת LB (10 גרם/ליטר טריפטון, 5 גרם/ליטר NaCl, תמצית שמרים 5 גרם/ליטר ואגר בקטריולוגי 16 גרם/ליטר, ראו טבלת חומרים) בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה. לדגור ב 28 ° C במשך 40-48 שעות.
- בצע חדירת ואקום.
- במקרה של חדירת ארבידופסיס, הניחו שני מקלות עץ שיוצרים X מעל הסיר (איור 1E), והניחו את הסיר כשהוא פונה כלפי מטה מעל צלחת פטרי בקוטר 14 ס"מ שמכילה את החיסון בנפח 200 מ"ל (איור 1F).
- לחיסון עלי שעועית, הכניסו את העלה לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי בנפח 50 מ"ל שמכיל את החיסון (איור 2C).
- הכניסו את הצמחים השקועים בתמיסת האינוקולום לתוך תא ואקום (איור 1G ואיור 2D) ותנו פולס של 500mbar למשך 30 שניות כדי לחדור לעלים. חזרו על פעימת הוואקום 2-3 פעמים עד שהעלה חודר לחלוטין (איור 1H ואיור 2E).
- מסננים את תמיסת החיסון העודפת בעזרת פיסת נייר ומחזירים את הצמחים לתא הגידול המתאים להם.
3. מיצוי חיידקים מהאפופלסט
- ארבעה ימים לאחר החיסון, חתכו את החלק האווירי של צמח הארבידופסיס או את העלה המחוסן מצמח השעועית והכניסו אותו למזרק בנפח 20 מ"ל ללא מחט (איור 2G). עבור עלי שעועית, גלגלו את העלה על עצמו, והשאירו את הפנים האבקסיאליות כלפי חוץ, כפי שמוצג באיור 2F.
- מוסיפים נפח מספיק של מים מזוקקים כדי לכסות את הרקמה (בדרך כלל 10-15 מ"ל).
- הכניסו את הבוכנה, וכשהמזרק במצב אנכי כשהקצה מצביע כלפי מעלה, הסירו את עודפי האוויר ובועות האוויר בתוך המזרק על ידי הקשה עדינה על החבית עד שכל האוויר ממוקם ליד הקצה. החלק ואז את הבוכנה כדי להוציא את האוויר החוצה. ברגע שיש כמה שפחות אוויר בתוך המזרק, מכסים את קצה חבית המזרק בסרט פרפין.
- לחצו בזהירות על הבוכנה כדי ליצור לחץ חיובי עד שהרקמה הופכת כהה יותר (איור 1I ואיור 2H). לאחר מכן, משכו את הבוכנה כדי ליצור לחץ שלילי (איור 1J ואיור 2I). חזור על שלב זה 3-5 פעמים.
- הסירו את סרט הפרפין ואת הבוכנה ואספו את הנוזל שמכיל את החיידקים שחולצו באמצעות אפופלסט, כמו באיור 2J.
4. אנליזה חד-תאית של החיידקים שחולצו על ידי אפופלסט
- דמיינו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לפי השלבים הבאים.
- מכינים תמיסת אגרוז 1.5% במים מזוקקים. לאחר ההתכה, הוסיפו מספיק נפח כדי למלא את החלל בין שתי שקופיות מיקרוסקופיות המונחות זו לצד זו והניחו עליהן שקופית נוספת (איור 3). תן להם להתייבש במשך 15 דקות בזהירות להסיר את המגלשה ממוקם על החלק העליון. בעזרת להב, חתכו את כרית האגרוז לחתיכות בגודל 5 מ"מ x 5 מ"מ ממש לפני השימוש.
- במקביל, צנטריפוגה 1 מ"ל של חיידקים שחולצו אפופלסט ב 12,000 x גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, בזהירות להסיר את supernatant באמצעות פיפטה, ולהשהות מחדש את הגלולה לתוך 20 μL של מים כדי לרכז את התאים. הניחו טיפה של 2 μL של התאים המרוכזים על משטח כיסוי של 0.17 מ"מ וכסו את הטיפה בחתיכה בגודל 5 מ"מ x 5 מ"מ של כרית האגרוז שהתקבלה קודם לכן בשלב 1, כפי שמיוצג באיור 3.
- דמיינו את תכשיר החיידקים תחת המיקרוסקופ הקונפוקלי (ראו טבלת חומרים). כדי לזהות חיידקים פלואורסצנטיים ירוקים, השתמש בלייזר עירור ב 488 ננומטר ומסנן פליטה הנע בין 500 ננומטר ל 550 ננומטר. כדי לזהות את כל החיידקים, השתמשו בשדה הבהיר ומיזגו את שני השדות.
- עבד את התמונות הקונפוקליות באמצעות פיג'י (ראה טבלת חומרים). כדי לעשות זאת, השתמש בתוסף MicrobeJ כדי לזהות את קווי המתאר של תא החיידק ולמדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות שבתוכו.
הערה: רכישת תמונה מחיידקים מבודדים (לא מקובצים) מומלצת לניתוח זה.
- בצע ניתוח לפי ציטומטריית זרימה.
- קח aliquot של תרחיפים חיידקים שחולצו אפופלסט לנתח באמצעות ציטומטר זרימה. לרכוש 100,000 אירועים.
- כדי להבחין בין חיידקים לפסולת צמחים, נתחו את האפופלסט המופק מצמח לא מחוסן והשוו את חלקת הנקודות המציגה את גודל תא הפיזור הקדמי (FSC) לעומת גודל תא הפיזור הצדדי (SSC) לזה של תרחיף החיידקים שחולץ אפופלסט. כדי לזהות חיידקים שאינם פלואורסצנטיים, השתמשו באפופלסטים המופקים מהצמחים שחוסנו בחיידקים איזוגניים שאינם פלואורסצנטיים והשוו את פליטות הפלואורסצנטיות שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ביטוי מערכת ההפרשה מסוג III חיוני לצמיחת חיידקים בתוך הצמח. הביטוי בזמן של גנים T3SS מושג באמצעות ויסות מורכב, שבמרכזו גורם הסיגמה של הפונקציה החוץ-ציטופלזמית (ECF) HrpL, המפעיל העיקרי של ביטוי גנים הקשורים ל- T3SS11. ניתוח הביטוי של hrpL בוצע בעבר באמצעות איחוי שעתוק הממוקם כרומוזום לגן gfp ללא מקדם במורד הזרם ועל ידי מעקב אחר דפוסי הביטוי על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי וציטומטריית זרימה9. איחויים אלה נוצרים באמצעות אינטגרציה הומולוגית בתיווך רקומינוס של מבנים מקודדי פלסמיד הנוצרים באמצעות PCR ושיבוט מסורתי, ונושאים את 500 זוגות הבסיס האחרונים של ה-ORF של הגן המעניין (כולל קודון STOP) ו-500 זוגות בסיסים של הרצף מיד במורד הזרם, כשהם מאגפים את אתר קשירת הריבוזום ואת ה-ORF של הגן המדווח הפלואורסצנטי לשימוש (במקרה זה, GFP), ואחריו קלטת עמידות לאנטיביוטיקה (במקרה זה, הגן NPT2 המקנה עמידות לקנמיצין). לפיכך, נקבע כי אוכלוסיות מזרקי P. המופקים על ידי אפופלסט המבטאים גנים הקשורים ל- T3SS, כולל hrpL, הם הטרוגניים בצמח9. על פי תקדים זה, התוצאות המייצגות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי וניתוח ציטומטריית זרימה של ביטוי hrpL מוצגות בתאי חיידקים בודדים מזני המודל Pph 1448A (Pph) ו-Pto DC3000 (Pto), שהופקו מעלים של שעועית או ארבידופסיס, בהתאמה, לאחר התיישבות של אפופלסט העלה (איור 4). בכל זן, הגן P. syringae chromosomal hrpL נושא איחוי שעתוק במורד הזרם לגן gfp חסר מקדם המאפשר ניטור פעילות מקדם hrpL טבעי על ידי מעקב אחר רמות ביטוי GFP 8,9.
חיידקים שחולצו על ידי אפופלסט יכולים לשמש לניתוחים שונים. כאן, 300 μL של זני חיידקי הכתב הנ"ל הופקו מהאפופלסט של צמחי ארבידופסיס או שעועית נגועים ושימשו לרכישת נתונים באמצעות מערכת ציטומטר זרימה (ראה טבלת חומרים). פליטת לייזר ב-488 ננומטר ומסנן FITC שימש לזיהוי GFP. ניתוח ציטומטריית זרימה מראה את התפלגות הפלואורסצנטיות בתאי חיידקים בודדים באוכלוסייה. ביטוי הטרוגני של hrpL ניתן לראות בבירור על-ידי ציטומטריית זרימה ב-Arabidopsis apoplast extracted Pto ובחיידקי Pph המופקים על ידי אפופלסט שעועית, כולל חיידקי HrpL OFF (שאינם מבטאים GFP), ותוצאות אלה נתמכות על-ידי בדיקה מיקרוסקופית של הדגימות המתאימות (איור 4). תרשימי תרשים הנקודות (לוחות שמאליים) מראים את ההתפלגות של עוצמת הפלואורסצנטיות של GFP לעומת גודל התא באוכלוסייה (איור 4A), בעוד שההיסטוגרמות מראות את עוצמת הפלואורסצנטיות של GFP לעומת ספירת תאים (איור 4B). שני ייצוגים גרפיים שונים אלה של נתוני ציטומטריה מאפשרים לחוקר לבסס ניואנסים חזותיים עדינים ולספק מידע משלים. כבקרה על אוטופלואורסצנטיות חיידקית, נעשה שימוש בזן הבר המתאים שאינו GFP (פאנל עליון באיור 4A והיסטוגרמה אפורה באיור 4B). זה מאפשר לזהות את אזור הגרף שבו מוצגים חיידקים שאינם GFP בתוך האוכלוסייה. ניתוחי ציטומטריה של זרימה מייצרים גם נתונים כמותיים. לדוגמה, האחוזים של תאי HrpLON (פלואורסצנטיים) מופקים באוכלוסיות Pto ו-Pph שחולצו על ידי אפופלסט. איור 4C מראה כיצד אחוזי HrpLON היו גבוהים יותר מהאחוזים המקבילים של תאי HrpLOFF (לא פלואורסצנטיים) באוכלוסיות אלה, במיוחד במודל Pto. נתונים אלה יכולים לשמש גם כדי לחשב את הפלואורסצנטיות הממוצעת או החציונית עבור כלל האוכלוסייה. בניסוי הספציפי הזה, התקבלה עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של GFP, שהייתה גבוהה יותר עבור אוכלוסיית Pto מאשר עבור Pph, בהתאם לאחוז הגבוה יותר של תאי ON. הרמות הממוצעות מהוות נתונים ברמת האוכלוסייה הניתנים להשוואה לנתונים המתקבלים באמצעות טכניקות שאינן של תא בודד כגון RT-q, PCR או RNAseq. לבסוף, מוצג גם מקדם השונות החזק (RCV)12, המחושב כרביעון השלישי פחות הרביעון הראשון חלקי החציון. RCV משמש לעתים קרובות במחקרי ציטומטריית זרימה כדי להעריך פיזור נתונים (כלומר, הטרוגניות של הביטוי בתוך האוכלוסייה)13. במחקר הנוכחי, RCV היה מעט גבוה יותר עבור Pph מאשר עבור Pto, אם כי ההבדל לא היה מספיק כדי לאפיין את התפלגות הביטוי בתוך האוכלוסיות של שני זנים אלה כשונה באופן משמעותי. ההטרוגניות של ביטוי hrpL יכולה להיות מאושרת חזותית באמצעות תמונות מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 4D). השימוש ברפידות אגר להכנת מיקרוסקופ מביא להדמיה קלה יותר ולתמונות באיכות גבוהה יותר של התאים הבודדים מכיוון שהוא דוחף את החיידקים לשכבה אחת ומונע תנועת חיידקים. הליכי החיסון ומיצוי החיידקים המתוארים בפרוטוקול זה ממזערים את כמות פסולת הצמחים בתוך ההכנה החיידקית, ובכך מאפשרים ניתוח של ביטוי חיידקים באמצעות השיטות השונות האלה (איור 4).
איור 1: חיסון חיידקים ומיצוי אפופלסט באמצעות צמחי Arabidopsis. (א) הכנת הסיר כשרשת המתכת מחוברת כראוי. (ב) זריעת זרעים באמצעות קיסם להפצתם כמצוין ב-(ג). (D) צמחי Arabidopsis מוכנים לחיסון. (E) שני מקלות עץ מאפשרים טבילה של הצמחים בתמיסה החיידקית מבלי להגיע לעציץ או לאדמה (F). (G) ניתן להכניס את האנסמבל לתוך תא הוואקום. (H) העלים המסתננים נעשים כהים יותר לאחר שחרור הוואקום מהחדר. (I) העלים המנותקים מוכנסים למזרק בנפח 20 מ"ל ומכוסים במים. (J) מחזורים של לחץ חיובי ושלילי גורמים למיצוי החיידקים האפלופלסטיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: חיסון חיידקים ומיצוי אפופלסט באמצעות צמחי שעועית. (A) נביטה של זרעי שעועית בצלחות פטרי מרופדות בנייר טואלט רטוב. (B) צמח שעועית מוכן לחיסון. (C) עלה שעועית שקוע בתמיסה חיידקית הכלולה בצינור של 50 מ"ל. (D) העלים מחוסנים בתוך תא ואקום עד שהרקמה נעשית כהה יותר (E). (F) מגלגלים את עלה הפוף, מכניסים אותו לתוך מזרק של 20 מ"ל ומכסים אותו במים (G). (H) מחזורים של לחץ חיובי ושלילי (I) גורמים למיצוי של חיידקים אפופלסטיים שניתן לשחזר לתוך צינור (J). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ייצוג סכמטי של ההגדרה וההכנה של משטח האגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח של חיידקים שחולצו על-ידי אפופלסט שהתקבלו מעלי ארבידופסיס או שעועית 4 ימים לאחר החיסון עם P. syringae pv. tomato (Pto) או P. syringae pv. phaseolicola (Pph), בהתאמה. ביטוי hrpL::gfp מנוטר כפלואורסצנטיות GFP. (A) ניתוח ציטומטריית זרימה מיוצג כתרשים נקודה (פיזור קדימה [גודל התא] לעומת עוצמת פלואורסצנטיות GFP). חיידקים שאינם GFP מצביעים על זן פראי של Pto או Pph. הקו האנכי תוחם 99% מהאוכלוסייה שאינה GFP. (B) ניתוח ציטומטריית זרימה מיוצג כהיסטוגרמות (ספירת תאים לעומת עוצמת פלואורסצנטיות GFP). ההיסטוגרמה האפורה מייצגת את הזן שאינו GFP. (C) נתונים כמותיים הופקו מניתוח ציטומטריית הזרימה. אחוז התאים ON ו- OFF מחושב בהתבסס על ההתפלגות המוצגת בתרשים הנקודות. הממוצע מציין את הפלואורסצנטיות הממוצעת שהתקבלה בניסוי. מקדם השונות החזק (RCV) מחושב כרביעון השלישי פחות הרביעון הראשון חלקי החציון. (D) תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית המראות רמות הטרוגניות של GFP הקשורות לביטוי של hrpL. החיצים הלבנים מדגישים חיידקים המציגים רמות נמוכות או ללא פלואורסצנטיות GFP. סרגל קנה מידה: 3 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המוצגת כאן מתארת הליך לא פולשני המאפשר חדירת חיידקים לרקמת העלווה של הצמח, ומאפשר חיסון מהיר של נפחים גדולים תוך מזעור הפרעה לרקמות. אחד המאפיינים של קומפלקס מיני מזרקי P . הוא היכולת לשרוד ולהתרבות בתוך אפופלסט הצמח ועל פני הצמח כאפיפיט14. לפיכך, לא ניתן לשלול את האפשרות שהחיידקים המופקים בפרוטוקול הנוכחי מגיעים רק מהצמח אפופלסט. עם זאת, בעבר הוכח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי כי שיעור החיידקים על פני העלה הוא מינורי באופן בולט בהשוואה לצמיחת החיידקים בתוך עלההצמח 5. ניתן לבדוק זאת על ידי בדיקה מיקרוסקופית של פני העלה לפני השאיבה. יתר על כן, זני מזרקי P . המשמשים כמודל בפרוטוקול הנוכחי, Pto DC3000 ו- Pph 1448A, הוכחו כמתפקדים כאפיפיטים חלשים15, המייצגים שיעור לא רלוונטי של החיידקים שחולצו. עם זאת, אם רוצים להתאים את השיטה לפתו-מערכות אחרות, ייתכן שיהיה צורך להוסיף שלב קודם של טיהור פני העלה לפרוטוקול הנוכחי.
שיטות חיסון מסורתיות, כגון חדירת עלים באמצעות מזרק16, גורמות נזק גדול יותר וקשה לאמוד לרקמות באתר החיסון, וכתוצאה מכך נמק רקמות. יתר על כן, מידת הנזק משתנה מאוד בין נקודות חיסון שונות. כמו כן, מיני צמחים שונים נבדלים זה מזה בסבילות שלהם לחדירת עלים. לדוגמה, עלי Arabidopsis קל לחדור, בעוד עלי שעועית הם עקשנים יותר. תנאי הגידול משפיעים גם על רמת הסובלנות לחדירה של מין נתון. שיטות חיסון מסורתיות עדינות יותר, כגון מטבל עלים או תרסיס עלים, וכתוצאה מכך כניסה והתיישבות חיידקית טבעית יותר ונטולת נזקים של הרקמה, עם זאת, מגבילות מטבען את גודל אוכלוסיות החיידקים המתקבלות, לעתים קרובות מתחת לסף הנדרש לניתוח עוקב של דגימות החיידקים האפופלסטיים5 . שיטת החיסון המוצעת מפחיתה משמעותית את הפעלת הנמק באזורים המחוסנים כתוצאה מלחץ מזרק תוך הימנעות ממגבלה בגודל דגימת חיידקים ומספקת דרך קלה, ניתנת לשחזור ומהירה לחיסון שטחי עלים ניכרים.
טכניקות מסוימות הדורשות חיסון של אזורי רקמות גדולים יכולות לגזול זמן רב ועבודה, מה שמגדיל את הסיכויים לגרימת נזק לרקמות. על ידי יישום שיטה זו, אנו יכולים לחסן חמישה או יותר צמחי Arabidopsis , או עלה שעועית שלם, בשלב אחד בלבד מבלי לפגוע בשלמות הרקמות. טכניקה זו עשויה להיות מותאמת לחיסון מספר גדול יותר של צמחים או למיני צמחים אחרים בעלי עניין אגרונומי או אקדמי, כגון ניקוטיאנה בנתמיאנה, עגבנייה או פולי סויה. ריכוז החומר פעילי השטח, המשמש להפחתת מתח המים העיליים כדי להקל על חדירת התרחיף החיידקי, חייב להיות מותאם ונבדק מראש בהתאם למין הצמח, שכן ריכוזים גבוהים יותר של חומר פעילי שטח יכולים לגרום לנמק רקמות במקרים מסוימים. כמו כן, יש להתאים את כמות הלחץ המופעל ואת משך תהליך החיסון להתנגדות שמציע עלה הצמח במינים שונים כדי להבטיח תוצאות אופטימליות.
באשר למיצוי אפופלסט, השיטה הנוכחית גם ממזערת את שיבוש הרקמות, ובכך מפחיתה את כמות פסולת הצמח הקיימת בדגימה המופקת. זה מאפשר דגימות נקיות יותר, וכתוצאה מכך ניתוח יעיל יותר באמצעות טכניקות שונות כגון RNA-seq, ציטומטריית זרימה, או מיקרוסקופיה, כפי שמוצג בדוגמה. התאוששות אוכלוסיית החיידקים הפתוגניים מהסביבה האפופלסטית שלה עם הפרעה מינימלית לרקמות ולתאי הצמח היא מאתגרת. P. מזרקים מאכלסים את החללים הבין-תאיים של האפופלסט, ויוצרים מיקרו-מושבות. שימוש בפתוגן חוץ-תאי, כגון מזרקי P, מאפשר שיטות כמו זו המוצגת כאן, שכן שיבוש רקמות ותאים אינו נדרש להתאוששות חיידקים. סבבי הלחץ החיובי והשלילי אכן משבשים את המיקרו-מושבות, מפזרים את החיידקים ומאפשרים מיצוי קל ומהיר שלהם דרך פתחים טבעיים (פיוניות), ומונעים כל שינוי בביטוי גנים שעלול להתלוות לזמני דגירה ארוכים, כמו אלה הנדרשים לשיטות עדינות יותר של התאוששות אפופלסטית. בדיקה מיקרוסקופית של שאריות רקמת הצמח אכן תומכת בסילוק רוב אוכלוסיית החיידקים. פרוטוקולים של מיצוי נוזל אפופלסטי היו בשימוש נרחב כדי לחקור את המורכבות של נוזל אפופלסטי17. פרוטוקולים אלה מכילים שלב אחרון של צנטריפוגה כדי לנקות עוד יותר את הנוזל האפופלסטי שנמצא. כאן, מחזורים עדינים של לחץ חיובי ושלילי באמצעות בוכנה מזרק שימשו במקום, ובכך להפחית את זיהום הדגימה עם פסולת התא המארח תוך השפעה קטנה מאוד על יעילות התאוששות חיידקים. אחת משיטות מיצוי החיידקים העדינה הקלאסית מורכבת מדגירה של דיסקיות עלים או שתילים עם חומר פעילי שטח למשך 1-2 שעות18. שיטה זו אינה יעילה כמו זו שהוצגה כאן למיצוי חיידקים; עם זאת, המגבלה העיקרית שלה לניתוח ביטוי גנים היא ההשפעה של זמן הדגירה הנדרש על פרופיל הביטוי של האוכלוסייה. השיטה המוצגת בזאת מאפשרת החלמה מהירה וניתוח מיידי של האוכלוסייה האפלופלסטית, ובכך מפחיתה את הסיכון לעקיפת תוצאות ביטוי גנים ברמה התאית.
הטרוגניות פנוטיפית בחיידקים פתוגניים נחקרה באופן נרחב באמצעות אמצעי מעבדה הומוגניים. חקר אוכלוסיות חיידקים הגדלות בנישה הטבעית שלהן מוגבל לעתים קרובות בשל מחסומים טכניים, כגון הקושי לשחזר אוכלוסיות חיידקים ללא זיהום עודף בפסולת תאים מארחים המפריע לאנליזות של תאים בודדים במורד הזרם. שיטה משולבת זו של חיסון ומיצוי מאפשרת יצירת אוכלוסיות אפופלסטיות גדולות של פתוגנים חיידקיים לאנליזה של תא יחיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט מענק RTI2018-095069-B-I00 במימון MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ ועל ידי "ERDP דרך לעשות אירופה". J.S.R. מומן על ידי Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. מומן על ידי פרויקט Grant P18-RT-2398 מ-Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
- Weigel, W. A., Dersch, P. Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy. Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).
- Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Morris, C. E., et al. The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle. The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).
- Rufián, J. S., et al. Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains. Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).
- Macho, A. P. Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity. New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).
- Xiao, Y., Hutcheson, S. W. A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae. Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).
- Rufián, J. S., et al. Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae. Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).
- Rufian, J. S., et al. Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host. Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
- Fouts, D. E., et al. Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).
- Huber, P. J. Robust Statistics. , Wiley. New York, NY. (1981).
- Freed, N. E., et al. A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise. PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).
- Hirano, S. S., Upper, C. D. Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).
- Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization. Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).
- Liu, X., et al. Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).
- O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example. Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).
