Summary
本协议描述了一种方法，该方法允许对植物质外体内生长的丁 香假单胞菌 种群进行单细胞基因表达分析。
Abstract
大量的病原微生物不断攻击植物。 丁香假单胞 菌物种复合体包括与多种宿主特别相关的革兰氏阴性植物致病菌。 丁香假单胞 菌从叶表面进入植物，并在质外体内迅速繁殖，形成占据细胞间隙的微菌落。细菌对荧光蛋白的组成性表达允许微菌落的可视化和在微观水平上监测感染的发展。单细胞分析的最新进展揭示了克隆同基因细菌群体所达到的巨大复杂性。这种复杂性被称为表型异质性，是细菌群落之间基因表达的细胞间差异（与遗传差异无关）的结果。为了在单细胞水平上分析单个位点的表达，荧光蛋白的转录融合已被广泛使用。在胁迫条件下，例如在植物质外体定植期间发生的条件， 丁香假单胞菌 根据关键毒力基因（即 Hrp III 型分泌系统）的异质表达分化为不同的亚群。然而，由于接种和细菌提取过程中固有的机械破坏过程中释放的细胞碎片，因此对从植物组织回收的任何给定丁 香假单胞菌 种群的单细胞分析具有挑战性。本报告详细介绍了一种在拟南芥和豆类植物定植期间在单细胞水平上监测感兴趣的 丁香假单胞菌 基因表达的方法。描述了植物的制备和用于使用真空室接种的细菌悬浮液。这里还解释了通过质外体液提取从感染叶片中回收内生细菌的方法。细菌接种和细菌提取方法均经过经验优化，以最大限度地减少植物和细菌细胞损伤，从而产生最适合显微镜和流式细胞术分析的细菌制剂。
Introduction
致病菌在不同表型中表现出差异，导致在基因相同的种群中形成亚群。这种现象被称为表型异质性，并已被提出作为细菌-宿主相互作用期间的适应策略1。共聚焦显微镜、流式细胞术和微流体的光学分辨率与荧光蛋白相结合的最新进展促进了细菌种群的单细胞分析2。
革兰氏阴性丁香假单胞菌是一种原型植物致病菌，由于其学术和经济重要性3。丁香假单胞菌的生命周期与水循环4有关。丁香假单胞菌通过气孔或伤口等自然孔径进入叶肉细胞之间的细胞间空间，即植物叶质外体5。一旦进入质外体，丁香假单胞菌依靠III型分泌系统（T3SS）和III型易位效应器（T3E）来抑制植物免疫并操纵植物细胞功能以造福病原体6。T3SS和T3E的表达取决于主调节因子HrpL，这是一种与靶基因7启动子区域中hrp盒基序结合的替代西格玛因子。
通过产生与目的基因下游荧光蛋白基因的染色体定位转录融合，可以根据单细胞水平8发射的荧光水平监测基因表达。使用这种方法，已经确定 hrpL 的表达在实验室中生长的细菌培养物和从植物质外体8，9中回收的细菌种群中都是异质的。虽然单细胞水平的基因表达分析通常在实验室培养基中生长的细菌培养物中进行，但这种分析也可以对植物内生长的细菌种群进行，从而为自然环境中亚群的形成提供有价值的信息。分析从植物中提取的细菌种群的潜在限制是，经典的接种方法通过注射器压力浸润到质外体中，然后通过浸渍叶组织进行细菌提取，通常会产生大量干扰下游分析的细胞植物碎片10。大多数细胞碎片由叶绿体的自发荧光片段组成，这些片段与GFP荧光重叠，导致误导性结果。
本协议描述了分析两个模型病理系统中单细胞基因表达异质性的过程：由 丁香假单胞菌 pv形成的病理系统。番茄菌株DC3000和 拟南芥 （Col-0），另一种由 丁香假单胞 菌PV组成。菜豆菌株1448A和豆类植物（菜豆 品种加拿大奇迹）。提出了一种基于真空渗透的接种方法，利用真空室和泵，形成了一种快速、无损的全叶浸润方法。此外，作为对传统方案的改进，使用一种更温和的方法从质外体中提取细菌群，从而显着减少组织破坏，基于通过在注射器内使用少量体积施加正压和负压循环来提取质外体液。
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Protocol
1. 植物准备
- 按照以下步骤准备拟南芥 Col-0 植物。
- 用先前浇水的1：3蛭石 - 植物基质混合物（见 材料表）填充直径10厘米的花盆，并用15厘米x 15厘米的金属网覆盖花盆，并带有1.6毫米x 1.6毫米的孔。使用橡皮筋将金属网调整到潮湿的土壤上（图1A）。
- 用湿牙签将拟南芥种子播种到金属网的孔中。将三到四颗种子放在花盆内远处（图1B，C）。
- 用塑料圆顶覆盖花盆以保持高相对湿度，并在4°C下孵育72小时以进行分层。
注意：分层（如上所述在高湿度和低温下孵育）提高了种子的发芽率和同步性。 - 在短日照条件下（21°C下8小时光照/ 16小时黑暗，光强度：100μmol·m−2·s-1，相对湿度：70%）将花盆转移到植物生长室中。
- 种子发芽（8-10天）后，使用镊子去除大部分幼苗，在花盆的每个位置保留一株幼苗（六株/盆）（图1D）。取下塑料圆顶以揭开花盆。
注意：植物将在发芽后 4-5 周即可使用。
- 准备 菜豆 （品种加拿大奇迹）植物。
- 用一张湿毛巾纸盖住培养皿的底部，然后将豆子放在上面。用手术胶带密封培养皿，并在28°C孵育3-4天（图2A）。
- 将发芽的种子转移到直径10厘米的盆中，盆中装满湿的1：3蛭石 - 植物基质混合物。
- 在植物生长室中孵育，在长日照设置下（23°C下16小时光照/ 8小时黑暗，光强度：100μmol·m−2·s-1，相对湿度：70%）。
注意：植物将在发芽后 10 天即可使用（图 2B）。
2. 拟南芥和豆类植物的接种
注意：在本研究中，菌株 P. 丁香科 pv. 番茄DC3000和 丁香假单 胞菌 pv.使用菜豆1448A。
- 准备 丁香假单胞菌 接种物。
- 将感兴趣的 丁香假单胞菌菌 株从-80°C甘油原液中划出到补充有适当抗生素的LB平板（10 g / L胰蛋白胨，5 g / L NaCl，5 g / L酵母提取物和16 g / L细菌琼脂，参见 材料表）上。在28°C孵育40-48小时。
注意：如果感兴趣的菌株携带质粒或基因组抗性基因，则建议使用抗生素。 丁香假单胞 菌的推荐抗生素浓度如下：卡那霉素（15微克/毫升）、庆大霉素（10微克/毫升）、氨苄青霉素（300微克/毫升）（见 材料表）。 - 刮出细菌生物质并重悬于 5 mL 的 10 mM MgCl2 中。测量OD600并通过添加10 mM MgCl2调整为0.1。
注意：丁香假单胞菌培养物的 OD600 为 0.1 对应于 5 x 107 CFU·mL−1。 - 连续稀释到 10 mM MgCl2 中，以达到 5 x 105 CFU·mL−1 的最终接种物浓度。为拟南芥植物准备 200 mL 接种物，为豆类植物准备 50 mL 接种物。
- 在接种前，加入表面活性剂Silwett L-77（见 材料表），豆类接种的终浓度为0.02%，拟南芥的终浓度为0.01%。请注意，Silwett对拟南芥组织有些有害。
- 将感兴趣的 丁香假单胞菌菌 株从-80°C甘油原液中划出到补充有适当抗生素的LB平板（10 g / L胰蛋白胨，5 g / L NaCl，5 g / L酵母提取物和16 g / L细菌琼脂，参见 材料表）上。在28°C孵育40-48小时。
- 进行真空渗透。
- 对于拟南芥浸润，将两根形成X的木棍放在锅上（图1E），并将锅朝下放在含有200mL接种物的14厘米直径培养皿上（图1F）。
- 对于豆叶接种，将叶子引入含有接种物的 50 mL 锥形离心管中（图 2C）。
- 将浸入接种液中的植物插入真空室（图1G 和 图2D），并给予500毫巴的脉冲30秒以渗透叶子。重复真空脉冲2-3次，直到叶子完全浸润（图1H 和 图2E）。
- 用一张纸排出多余的接种液，然后将植物放回相应的生长室。
3. 从质外体中提取细菌
- 接种四天后，切下拟南芥植物的地上部分或从豆类植物接种的叶子，并将其放入没有针头的20mL注射器中（图2G）。对于豆叶，将叶子卷在自己身上，使远轴面向外，如图 2F所示。
- 加入足够体积的蒸馏水以覆盖组织（通常为 10-15 mL）。
- 插入柱塞，并将注射器置于垂直位置，尖端朝上，通过轻轻敲击桶直到所有空气都位于尖端附近，去除注射器内多余的空气和气泡。然后滑动柱塞以排出空气。一旦注射器内的空气尽可能少，用石蜡膜覆盖注射器桶的尖端。
- 小心地按压柱塞以产生正压，直到组织变暗（图1I 和 图2H）。然后，拉动柱塞以产生负压（图1J 和 图2I）。重复此步骤 3-5 次。
- 除去石蜡膜和柱塞，收集含有质外体提取细菌的液体，如图 2J所示。
4. 质外体提取细菌的单细胞分析
- 按照以下步骤通过共聚焦显微镜进行可视化。
- 在蒸馏水中制备1.5%琼脂糖溶液。融化后，添加足够的体积以填充并排放置的两个显微镜载玻片之间的空间，并将另一张载玻片放在其顶部（图3）。让它们干燥15分钟，然后小心地取出放置在顶部的载玻片。使用刀片，在使用前将琼脂糖垫切成 5 毫米 x 5 毫米的碎片。
- 同时，在室温下以 12，000 x g 离心 1 mL 的质外体提取的细菌 1 分钟，使用移液管小心地除去上清液，并将沉淀重悬于 20 μL 水中以浓缩细胞。将 2 μL 液滴浓缩细胞滴到 0.17 mm 盖玻片上，并用先前在步骤 1 中获得的 5 mm x 5 mm 琼脂糖垫片覆盖液滴，如图 3 所示。
- 在共聚焦显微镜下可视化细菌制备（见 材料表）。要识别绿色荧光细菌，请使用 488 nm 的激发激光和 500 nm 至 550 nm 的发射滤光片。要识别所有细菌，请使用明场并合并两个场。
- 使用斐济处理共聚焦图像（见 材料表）。为此，请使用MicrobeJ插件来识别细菌细胞的轮廓并测量其中的荧光强度。
注意：建议从分离的细菌（非聚集）采集图像以进行此分析。
- 通过流式细胞术进行分析。
- 取等分试样的质外体提取的细菌悬浮液，使用流式细胞仪进行分析。获取 100，000 个事件。
- 为了区分细菌和植物碎片，分析从未接种的植物中提取的质外体，并将显示其前向散射（FSC）细胞大小与侧向散射（SSC）细胞大小的点图与质外体提取的细菌悬浮液进行比较。为了鉴定非荧光细菌，请使用从接种非荧光等基因细菌的植物中提取的质外体并比较它们的荧光发射。
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Representative Results
III型分泌系统的表达对于植物内的细菌生长至关重要。T3SS基因的及时表达是通过复杂的调控实现的，其中心是卵胞浆外功能（ECF）西格玛因子HrpL，它是T3SS相关基因表达的关键激活因子11。先前使用染色体定位转录融合到下游无启动子gfp基因并通过共聚焦显微镜和流式细胞术9跟踪表达模式对hrpL的表达进行分析。这些融合是通过PCR和传统克隆产生的质粒编码构建体的同源重组介导整合产生的，并携带目的基因ORF的最后500个碱基对（包括STOP密码子）和序列的500个碱基对，紧邻要使用的核糖体结合位点和荧光报告基因的ORF（在这种情况下， GFP），然后是抗生素耐药盒（在这种情况下，NPT2基因赋予卡那霉素耐药性）。因此，确定质外体提取的丁香假单胞菌群体表达T3SS相关基因（包括hrpL）在植物9中是异质的。根据这一先例，在叶质外体定植后分别从豆或拟南芥的叶中提取的模型菌株 Pph 1448A （Pph） 和 Pto DC3000 （Pto） 的模型菌株 Pph 1448A （Pph） 和 Pto DC3000 （Pto） 的单个细菌细胞中显示了 hrpL 表达的共聚焦荧光显微镜和流式细胞术分析的代表性结果（图 4）。在每个菌株中，丁香假单胞菌染色体hrpL基因携带下游转录融合到无启动子gfp基因，该基因允许通过跟踪GFP表达水平8，9来监测hrpL天然启动子活性。
提取的质外体细菌可用于不同的分析。在这里，从受感染的拟南芥或豆类植物的质外体中提取300μL上述报告细菌菌株，并使用流式细胞仪系统进行数据采集（参见 材料表）。488 nm处的激光发射和FITC滤光片用于GFP检测。流式细胞术分析显示群体中单个细菌细胞中的荧光分布。通过流式细胞术可以清楚地观察到拟南芥质外体提取的Pto和豆质外体提取的Pph中 hrpL 的异质表达，包括HrpLOFF （不表达GFP）细菌，这些结果得到了相应样品的显微镜检查的支持（图4）。点阵图（左图）显示了群体中GFP的荧光强度与细胞大小的分布（图4A），而直方图显示了GFP的荧光强度与细胞计数的关系（图4B）。细胞术数据的这两种不同的图形表示使研究人员能够建立微妙的视觉细微差别并提供补充信息。作为细菌自发荧光的对照，使用相应的非GFP野生型菌株（图 4A 中的上图和图 4B中的灰色直方图）。这允许识别显示种群中非GFP细菌的图形区域。流式细胞术分析也可生成定量数据。例如，在质外体提取的Pto和Pph群体中提取HrpLON （荧光）细胞的百分比。 图4C 显示了这些群体中HrpLON 百分比如何高于HrpLOFF （非荧光）细胞的相应百分比，特别是在PTO模型中。这些数据还可用于计算整个群体的平均或中位数荧光。在这个特殊的实验中，获得了平均GFP荧光强度，PTO群体的荧光强度高于Pph，与其较高的ON细胞百分比一致。平均水平构成与通过非单细胞技术（如RT-qPCR或RNAseq）获得的数据相当的群体水平数据。最后，还显示了鲁棒变异系数 （RCV）12，计算方法是第三个四分位数减去第一个四分位数除以中位数。RCV 通常用于流式细胞术研究，以估计数据离散（即群体中表达的异质性）13。在目前的研究中，Pph的RCV略高于Pto，尽管差异不足以将这两种菌株的群体中的表达分布描述为显着差异。 hrpL 表达的异质性可以通过共聚焦显微镜图像进行目视确认（图4D）。使用琼脂垫进行显微镜制备可以更容易地可视化和更高质量的单个细胞图像，因为它将细菌推到单层上并防止细菌移动。本协议中描述的接种和细菌提取程序最大限度地减少了细菌制剂中的植物碎片量，从而允许通过这些不同的技术分析细菌表达（图4）。
图1：使用拟南芥植物的细菌接种和质外体提取。（A）准备正确连接金属网的锅。（B）用牙签播种，按照（C）所示分发种子。（四）准备接种的拟南芥植株。（E）两根木棍便于将植物浸入细菌溶液中，而不会到达花盆或土壤（F）。（G）合奏可以放在真空室内。（H）从腔室释放真空后，浸润的叶子变暗。（I）将分离的叶子放入20mL注射器中并用水覆盖。（J）正压和负压循环导致质外体细菌的提取。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：使用豆类植物进行细菌接种和质外体提取。（A）用湿卫生纸衬里的培养皿中豆子种子的发芽。（B）准备接种的豆类植物。（C）将豆叶浸入50mL管中所含的细菌溶液中。（D）将叶子接种在真空室内，直到组织变暗（E）。（F）将豆叶卷起，放入20毫升注射器中，并用水（G）覆盖。（H）正压和负压循环（I）导致提取可以回收到管中的质外体细菌（J）。 请点击此处查看此图的大图。
图3：琼脂垫的设置和制备的示意图。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：分别接种丁香假单胞菌番茄 （Pto） 或丁香假单胞菌 pv. 菜豆 （Pph） 后 4 天从拟南芥或豆叶获得的质外体提取细菌的分析。 通过GFP荧光监测hrpL：：gfp的表达。（A）流式细胞术分析表示为点图（前向散射[细胞大小]与GFP荧光强度）。非GFP细菌表明野生型Pto或Pph菌株。垂直线划定了99%的非GFP人口。（B）流式细胞术分析表示为直方图（细胞计数与GFP荧光强度）。灰色直方图表示非 GFP 菌株。（C）从流式细胞术分析中生成定量数据。ON 和 OFF 单元格的百分比是根据点图中显示的分布计算的。平均值表示在实验中获得的平均荧光。稳健变异系数 （RCV） 的计算方法是第三个四分位数减去第一个四分位数除以中位数。（D）荧光显微镜图像显示与hrpL表达相关的GFP的异质水平。白色箭头突出显示显示低水平或无GFP荧光的细菌。比例尺：3 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
这里介绍的方法描述了一种非侵入性程序，它允许细菌渗透到植物叶面组织中，允许快速接种大量，同时最大限度地减少组织破坏。 丁香假单胞菌 物种复合体的特征之一是能够在植物质外体内和植物表面作为附生植物14存活和增殖。因此，不能排除使用本协议提取的细菌仅来自植物质外体的可能性。然而，以前使用共聚焦显微镜证明，与植物叶片内的细菌生长相比，叶子表面的细菌比例明显较小5。这可以通过提取前对叶子表面的显微镜检查来检查。此外，在本协议中用作模型的 丁香假单胞菌菌 株Pto DC3000和Pph 1448A已被证明具有弱附生15的性能，代表了提取细菌的不相关比例。尽管如此，如果要使该方法适应其他病理系统，则可能必须在本协议中添加叶表面净化的先前步骤。
传统的接种方法，例如使用注射器16浸润叶片，在接种部位引起较大且难以估计的组织损伤，导致组织坏死。此外，不同接种点之间的损伤量差异很大。此外，不同的植物物种对叶片渗透的耐受性各不相同。例如，拟南芥叶容易渗透，而豆叶则更顽固。生长条件也会影响对特定物种渗透的耐受程度。更温和的传统接种方法，如叶浸或叶喷雾，导致更自然和无损伤的细菌进入和定植组织，然而，固有地限制了所获得的细菌种群的大小，通常低于随后分析质外体细菌样品所需的阈值5.所提出的接种方法显着减少了注射器压力引起的接种区域坏死的活化，同时避免了细菌样品量的限制，并提供了一种简单、可重复和快速的方法来接种相当大的叶区。
一些需要接种大面积组织区域的技术可能非常耗时和费力，增加了造成组织损伤的机会。通过应用这种方法，我们可以在一个步骤中接种五株或更多拟 南芥 植物或整个豆叶，而不会影响组织完整性。该技术可以适用于接种大量植物或其他农艺或学术兴趣的植物物种，例如 本氏烟草，番茄或大豆。表面活性剂的浓度用于降低地表水张力以促进细菌悬浮液的渗透，必须根据植物物种提前调整和测试，因为在某些情况下，较高浓度的表面活性剂会导致组织坏死。此外，施加的压力量和接种过程的持续时间必须根据不同物种的植物叶片提供的抗性进行调整，以确保最佳结果。
关于质外体提取，目前的方法还最大限度地减少了组织破坏，从而减少了提取样品中存在的植物碎片量。这样可以获得更清洁的样品，从而通过不同的技术（如RNA-seq、流式细胞术或显微镜）进行更有效的分析，如示例中所示。以最小的组织和植物细胞破坏从质外环境中恢复致病细菌种群具有挑战性。 丁香假单胞 菌定植于质外体的细胞间隙，形成微菌落。使用细胞外病原体，如 P. syringae，允许像这里介绍的方法，因为细菌恢复不需要组织和细胞破坏。一轮又一轮的正压和负压确实会破坏微菌落，分散细菌并允许它们通过自然开口（气孔）轻松快速地提取，避免可能伴随长孵育时间的基因表达的任何变化，例如更温和的质外体回收方法所需的变化。对剩余植物组织的显微镜检查确实支持去除大多数细菌种群。质外体液萃取方案已被广泛用于研究质外体液的复杂性17。这些方案包含离心的最后一步，以进一步清理回收的质外体液。在这里，使用注射器柱塞进行温和的正压和负压循环，从而减少了宿主细胞碎片的样品污染，同时对细菌回收效率的影响很小。一种经典的温和细菌提取方法包括将叶盘或幼苗与表面活性剂孵育1-2小时18。这种方法不如这里介绍的提取细菌的方法有效;然而，其基因表达分析的主要限制是所需孵育时间对群体表达谱的影响。本文提出的方法允许快速恢复和立即分析质外体群体，从而降低在细胞水平上绕过基因表达结果的风险。
致病菌的表型异质性已使用均质实验室培养基进行了广泛研究。由于技术障碍，研究在其自然生态位中生长的细菌种群通常受到限制，例如难以在不干扰下游单细胞分析的宿主细胞碎片过度污染的情况下恢复细菌种群。这种接种和提取的组合方法允许产生大量的细菌病原体质外体群以进行单细胞分析。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了由MCIN/AEI/10.13039/501100011033/资助的项目赠款RTI2018-095069-B-I00和“ERDP创造欧洲的方式”的支持。J.S.R.由安达卢兹调查、发展和创新计划（PAIDI 2020）资助。NLP由安达卢兹调查、发展和创新计划的P18-RT-2398项目资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
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