Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

HPLC kombineret med kemisk fingeraftryk til genkendelse af flere mønstre til identifikation af ægtheden af Clematidis Armandii Caulis

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64690
Automatic Translation
*1, *1, *2, 2, 2, 2, 1
1School of Pharmacy, The Second Class Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmaceutics, National Administration of Traditional Chinese Medicine, Chengdu Medical College, 2Pengzhou Second People's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi en protokol til etablering af højtydende væskekromatografi (HPLC) kombineret med kemisk fingeraftryksgenkendelse af flere mønstre, hvilket giver en ny strategi til effektivt at identificere de ægte sorter af Clematidis Armandii Caulis og dets forfalskningsmidler.

Abstract

En metode til identifikation af kinesiske medicinske materialer og deres relaterede forfalskninger blev konstrueret ved at tage Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, en universelt anvendt traditionel kinesisk medicin) som et eksempel. Ti batcher af ægte Chuanmutong-sorter og fem batcher af relaterede forfalskningsmidler blev analyseret og sammenlignet baseret på højtydende væskekromatografi (HPLC) fingeraftryk kombineret med kemometri, herunder klyngeanalyse (CA), hovedkomponentanalyse (PCA) og ortogonal delvis mindste kvadratdiskriminationsanalyse (OPLS-DA). Derudover blev indholdet af β-sitosterol bestemt. Chuanmutongs kontrolkemiske fingeraftryk blev etableret, og 12 almindelige toppe blev identificeret. Ligheden mellem fingeraftrykket af 10 partier ægte Chuanmutong-sorter og kontrolfingeraftrykket var 0,910-0,989, mens ligheden mellem fem batcher af forfalskningsmidler kun var 0,133-0,720. Baseret på de almindelige toppe i kromatogrammet blev 15 batcher af prøver klassificeret i tre indholdsniveauer af PCA og blev aggregeret i fire kategorier af CA, hvilket opnåede en klar sondring mellem autentisk Chuanmutong og forfalskninger af Chuanmutong. Desuden blev syv differentielle komponenter, der effektivt kan identificere autentiske Chuanmutong og forfalskninger af Chuanmutong, fundet gennem OPLS-DA. Det β-sitosterol indhold af 10 partier ægte Chuanmutong sorter var 97,53-161,56 μg/g, mens indholdet af β-sitosterol i de fem partier af forfalskninger varierede meget, blandt hvilke β-sitosterol indholdet af Clematis peterae Hand.-Mazz. og Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils. var betydeligt lavere end for autentiske sorter af Chuanmutong. HPLC-indekskomponentindholdet og den kemiske fingeraftryksgenkendelsesmetode med flere mønstre, der er etableret i denne undersøgelse, giver en ny strategi til effektivt at identificere autentiske kinesiske medicinske materialer og relaterede forfalskningsmidler.

Introduction

Chuanmutong, tør Caulis af Clematis armandii Franch. eller Clematis montana Buch.-Ham., er en traditionel kinesisk medicin, der almindeligvis anvendes i klinikker 1,2,3. Det bruges til behandling af urinproblemer, ødem, sår på tungen og munden, nedsat mælkesekretion, ledstivhed og muskelsmerter forårsaget af fugtig varme4. Chuanmutong er altid opnået fra vilde sorter, hovedsageligt fordelt i det sydvestlige Kina, især i Sichuan, hvor den bedste kvalitet kan findes 5,6. Det er vanskeligt at skelne mellem autentiske sorter og deres nært beslægtede forfalskninger på grund af deres lignende egenskaber 7,8,9,10. Kvalitetsstandarden for Chuanmutong i 2020-udgaven af kinesisk farmakopé fastsætter kun egenskaber, mikroskopisk identifikation og tyndlagsidentifikation uden indholdsbestemmelse, som ikke effektivt kan identificere forfalskninger og derfor har potentielle risici. Desuden er der få rapporter, der sammenligner og identificerer Chuanmutong og beslægtede planter. Derfor er en kvalitetskontrolmetode for at sikre ægtheden af Chuanmutong værd at undersøge yderligere.

De kemiske bestanddele af Chuanmutong består hovedsageligt af pentacykliske triterpenoider af oleanan-typen og deres glycosider, flavonoider og organiske syrer11,12,13,14. Blandt dem har oleanolsyre, β-sitosterol, stigmasterol og ergosterol vanddrivende virkninger af forskellig intensitet, hvilket kan være potentielle farmakodynamiske stoffer til fremme af diurese og lindring af stranguri15,16. Kemiske fingeraftryk opnås ved at adskille og detektere mange kemiske komponenter indeholdt i prøver ved højtydende væskekromatografi (HPLC), gaskromatografi (GC) osv. Vedtagelse af passende statistiske analysemetoder til analyse af Chuanmutongs egenskaber kan bestemme den overordnede kvalitetskontrol og videnskabelige identifikation af traditionel kinesisk medicin17,18,19.

I denne undersøgelse blev 10 partier Chuanmutong autentiske sorter og fem partier af forfalskningsmidler indsamlet. Deres kvalitet blev sammenlignet og analyseret ved HPLC-fingeraftryksmetoden kombineret med multimønstergenkendelse, herunder klyngeanalyse (CA), hovedkomponentanalyse (PCA), ortogonal delvis mindste kvadraters diskriminationsanalyse (OPLS-CA) og indholdsbestemmelse af den farmakodynamiske komponent. Denne protokol fastlægger en metode til identifikation af autentiske sorter med høj specificitet, en ny strategi for videnskabelig identifikation af autentiske sorter og forfalskninger af kinesiske lægemidler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Metoder til detektion af kemiske fingeraftryk

  1. Kromatografiske forhold
    1. Forbered acetonitril (A) / vand (B) mobil fase. Indstil et gradientprogram som følger i HPLC-softwaren: 0-20 min, 3% A-10%A; 20-25 min, 10%A-13%A; 25-65 min, 13%A-25%A; 65-75 minutter, 25%A-40%A; 75-76 min, 40%A-3%A; 76-85 min, 3%A-3%A.
    2. Hold strømningshastigheden for den mobile fase på 1,0 ml/min.
    3. Den kromatografiske adskillelse udføres på en C18-søjle (250 mm x 4,6 mm, 5 μm), der holdes ved 30 °C.
    4. Indstil injektionsvolumen til 10 μL.
    5. Prøverne detekteres ved en bølgelængde på 205 nm.
      BEMÆRK: For de specifikke indstillinger af kromatografiske tilstande henvises til driftsprocedurerne for arbejdssoftwaren til højtydende væskekromatografi (materialetabel).
  2. Fremstilling af prøveopløsningen
    1. Slib råmaterialerne til ensartet partikelstørrelse ved at føre dem gennem et nylonnet med en indvendig diameter på 850 μm ± 29 μm.
    2. Anbring 2 g af det malede råmateriale (nøjagtigt vejet) i en 50 ml konisk kolbe med en prop og tilsæt 50 ml methanol. Placer proppen på kolben og ultralyd (600 W, 40 kHz) i 30 min.
    3. Derefter afkøles kolben til stuetemperatur (RT). Prøverne vejes igen, og kompenserer for den oprindelige vægt ved at udskifte det tabte ekstraktionsmiddel.
    4. Hæld 4 ml af methanolopløsningen indeholdende de medicinske ekstrakter i en 10 ml målekolbe. Tilsæt 6 ml H2O, bland, og lad det sætte sig i 10 minutter.
    5. Til sidst filtreres supernatanten gennem en 0,45 μm filtermembran og sættes den på standby.
  3. Validering af metoder til registrering af fingeraftryk
    1. Prøven klargøres som beskrevet ovenfor (trin 1.2), og HPLC-analyse (trin 1.1) underkastes HPLC-analyse seks gange dagligt. For at evaluere præcisionen beregnes den relative standardafvigelse (RSD) for relativ retentionstid og relative topområder som beskrevet i trin 1.3.5.
    2. Prøveopløsningens stabilitet evalueres ved at analysere den samme prøveopløsning, der er lagret ved RT i 0, 2, 4, 6, 8, 12 og 24 timer, og RSD for relativ retentionstid og relative topområder beregnes som beskrevet i trin 1.3.5.
    3. Der udtages seks replikater af den samme prøve (CMT-4), prøveopløsningen fremstilles i overensstemmelse med ovennævnte procedure (trin 1.2), og fingeraftryk detekteres i HPLC efter trin 1.1. Beregn RSD for relativ retentionstid og relative topområder, og evaluer dens repeterbarhed som beskrevet i trin 1.3.5.
    4. Brug derefter top nummer 10 i figur 1B som referencetop, og beregn RSD for den relative retentionstid og det relative topareal for hver fælles top som beskrevet i trin 1.3.5.
    5. Brug formlerne nævnt nedenfor til at beregne den relative retentionstid og det relative topareal for hver fælles top:
      T re = T karakteristik/Thenvisning
      A re = Enkarakteristik/A-reference
      Hvor T re = relativ retentionstid, T karakteristisk = karakteristisk topretentionstid, T-reference = referencetopretentionstid, A re = relativ topareal, A karakteristisk = karakteristisk topområde og Areference = referencetopområde.
      BEMÆRK: Etablering af traditionelle kinesiske medicinfingeraftryk kræver generelt, at der vælges en kromatografisk top, der er let at opnå og har høj opløsning. Dette bruges som en referencetop til at identificere fingeraftrykkene og undersøge deres stabilitet og reproducerbarhed.

2. Etablering af Chuanmutong fingeraftryk og lighedsanalyse

  1. Brug 10 batcher af autentiske prøver og fem partier af forfalskninger såsom Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang (CC), Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. (DC), Clematis peterae Hand.-Mazz. (DE), Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils (XS) og Clematis finetiana Levl. et Vaniot. (SMT) som prøver til fingeraftryksanalyse.
  2. Prøveopløsningerne klargøres som beskrevet i trin 1.2. Der udføres fingeraftryksanalyse af alle prøveopløsninger ved hjælp af HPLC i overensstemmelse med de betingelser, der er beskrevet under trin 1.1.
  3. Importer de relevante data til lighedsevalueringssystemet for kromatografiske fingeraftryk af traditionel kinesisk medicin (SESCF-TCM, 2012-version). Systemet vil udpege toppe med rimelig højde og god opløsning i kromatogrammerne af alle prøver som almindelige toppe.
    BEMÆRK: SESCF-TCM-softwaren kan downloades efter registrering på webstedet for den kinesiske farmakopékommission (http://114.247.108.158:8888/login).
    1. I softwaren skal du klikke på knappen Indstil referencespektrum i menuen.
    2. Indstil derefter tidsvinduets bredde til 0,5 i vinduet Parameterindstillinger, og vælg Control Spectrum Generation Method som medianmetode.
    3. Klik på Multi-point Calibration i hovedmenuen, og vælg derefter Peak Matching som Full Spectrum Peak Matching.
    4. Til sidst skal du klikke på Generer kontrol for at generere referencekromatografisk fingeraftryk af de autentiske arter af Chuanmutong.
  4. Importér opbevaringstiden og topområdet for 10 batcher autentiske Chuanmutong-prøver og fem batcher af forfalskningsmidler til SESCF-TCM til analyse. De specifikke foranstaltninger er som følger:
    1. I softwaren skal du klikke på knappen Indstil referencespektrum i hovedmenuen.
    2. I vinduet Parameterindstillinger skal du indstille referencekromatografisk fingeraftryk af de autentiske arter af Chuanmutong som reference, vælge Control Spectrum Generation Method som medianmetode og indstille tidsvinduets bredde til 0,5.
    3. Klik på Multi-point Calibration i hovedmenuen, og vælg derefter Peak Matching som Full Spectrum Peak Matching.
    4. Til sidst skal du klikke på Beregn lighed for at beregne ligheden baseret på Chuanmutongs referencekromatogramfingeraftryk. Endelig skal du beregne ligheden mellem fingeraftryk ved hjælp af det kinesiske medicinkromatografiske fingeraftryksevalueringssystem (2012-version).
      BEMÆRK: For de specifikke operationer henvises til driftsspecifikationerne for det kinesiske medicinkromatografiske fingeraftryksevalueringssystem (2012-version).

3. Multi-mønster genkendelse analyse af Chuanmutong fingeraftryk

  1. Klyngeanalyse (CA)
    1. Brug topområderne for 12 almindelige toppe i fingeraftryk af 10 batcher af autentiske Chuanmutong-prøver og deres fem batcher af forfalskninger som variabler, og indtast dem i statistisk analysesoftware til systematisk klyngeanalyse (CA).
    2. Vælg metoden Mellem grupper , og brug Pearson-korrelationskoefficienten som klassifikationsgrundlag til at tegne et klyngeanalysediagram over Chuanmutong og dets ægteskabsbrydere. De specifikke foranstaltninger er som følger:
      1. I den statistiske analysesoftware skal du klikke på Filer for at importere data.
      2. Klik på Analyse i menuen, og klik derefter på Systemklynger i klassificering.
      3. Vælg det fælles topområde som en variabel, og indstil antallet af klynger til fire.
      4. Klik på Metode, vælg klyngemetoden som Inter-Group Connection, vælg måleintervallet som Pearson Correlation, og klik på OK for at tegne CA-kortet.
  2. Analyse af hovedkomponenter (PCA)
    1. Importér det relative fælles topområde for de autentiske sorter og deres forfalskninger til analysesoftwaren til PCA-analyse, og brug PCA-scorekortet til at evaluere scorematrixkortet over prøveforskelle. De specifikke foranstaltninger er som følger:
      1. Åbn dataanalysesoftwaren, klik på Filer i menuen og opret et nyt almindeligt projekt. Importér topområdet på 12 almindelige toppe i et regneark (f.eks. Excel-format) fra HPLC-systemet. Klik derefter på Udfør for at fuldføre dataimporten.
      2. Klik på Ny for at oprette en ny model for at indstille modeltypen med PCA. Klik på Autofit og Tilføj for at passe til dataene, og klik derefter på Scores for at få PCA-scorekortet.
  3. Ortogonal delvis diskriminationsanalyse af mindste kvadrater (OPLS-DA)
    1. Brug den ortogonale delvise diskriminationsanalysemetode med overvågningstilstand til yderligere at analysere de relative fælles topområdetoppe for de autentiske Chuanmutong-sorter og forfalskninger og tegne et OPLS-DA-klassificeringsscorekort over alle prøver. De specifikke foranstaltninger er som følger:
      1. I dataanalysesoftware skal du klikke på Filer i menuen for at importere en fil og oprette et nyt almindeligt projekt. Importer topområdet for 12 almindelige toppe i et regneark fra HPLC-systemet, og klik derefter på Udfør for at fuldføre dataimporten.
      2. Klik på Ny for at oprette en ny model for at indstille modeltypen med PCA. Klik på Autofit og Tilføj for at passe til dataene. Klik derefter på Scores for at få PCA-scorekortet.
      3. Klik på Ny, og vælg Ny som model et for at indstille modeltypen med OPLS-DA.
      4. Klik på Skala og indstil type med Par for alle. Klik først på Autofit , og klik derefter på Scores for at få OPLS-DA-scorekortet.
    2. For at bestemme indflydelsen af hver fælles top i Chuanmutong på dens klassificeringsresultater og forskellen mellem autentiske Chuanmutong-materialer og relaterede forfalskningsmidler, skal du bruge den variable betydning i projektionen (VIP) til analyse.
    3. Tegn VIP-kortet over de forskellige komponenter i Chuanmutong. Brug det resulterende VIP-kort til at vurdere virkningen af hver variabel på klassificeringen og til at screene komponenter, der bidrager væsentligt til forskellene mellem grupper. De specifikke foranstaltninger er som følger:
      1. I dataanalysesoftwaren skal du klikke på Analyser i menuen og klikke på Permutationer, indstille antallet af permutationer til 200 og få R 2 og Q2 på OPLS-DA-scorekortet.
      2. Klik på VIP og vælg VIP Predictive for at få VIP-kortet.

4. Bestemmelse af β-sitosterol i Chuanmutong af HPLC

  1. Kromatografiske forhold (se trin 1.1)
    1. Forbered den mobile fase: methanol-vand (97:3).
    2. Indstil strømningshastigheden for den mobile fase til 1,0 ml/min.
    3. Den kromatografiske adskillelse udføres på en C18-søjle (250 mm x 4,6 mm, 5 μm), der holdes ved 30 °C.
    4. Indstil injektionsvolumen til 10 μL.
    5. Detekter komponenten ved en bølgelængde på 204 nm.
  2. Fremstilling af prøveopløsningen
    1. Stamstandardopløsningen af β-sitosterol (0,1 mg/ml) fremstilles ved at opløse en nøjagtigt afvejet mængde af den tilsvarende referencestandard i methanol.
    2. Analyseprøven af råmaterialet formales til ensartet partikelstørrelse ved at føre prøven gennem nylonmasken med en indvendig diameter på 180 μm ± 7,6 μm.
    3. 2 g af det formalede råmateriale (nøjagtigt vejet) anbringes i en rundbundet kolbe, og der tilsættes 50 ml chloroform.
    4. Tilslut kolben til en reflukskondensator og opvarm den i et kogende vandbad (moderat kogning) i 60 min. Udsugningsopløsningen filtreres med et 15-20 μm filtrerpapir.
    5. Filtratet inddampes til næsten tørhed på et kogende vandbad (moderat kogning) i ca. 10 minutter.
    6. Remanensen opløses og volumenet fyldes op til 5 ml ved hjælp af methanol. Til sidst føres supernatanten gennem en 0,45 μm filtermembran, og den sættes på standby.
  3. Validering af metode
    1. Stamopløsningen af β-sitosterol fremstillet i undertrin 4.2.1 udbehandles, fortyndes med 100 % methanol, og der fremstilles opløsninger med 100 μg/ml, 80 μg/ml, 60 μg/ml, 50 μg/ml, 40 μg/ml, 30 μg/ml og 20 μg/ml koncentrationer.
    2. Prøverne injiceres under de kromatografiske betingelser, der er beskrevet i trin 4.1, for at bestemme toparealet, regressionsanalyse med toparealet til injektionsvolumenet og opnå regressionsligningen og korrelationskoefficienten for at evaluere dens linearitet.
    3. Prøverne forberedes som beskrevet ovenfor (trin 4.2), og de underkastes HPLC-analyse (trin 4.1) seks gange samme dag. Beregn derefter RSD for topområder for at evaluere præcisionen.
    4. Prøveopløsningens stabilitet evalueres ved at analysere de samme prøveopløsninger, der er lagret ved RT i 0, 2, 4, 6, 8, 12 og 24 timer, som beskrevet i trin 4.1. Beregn derefter RSD for topområder som beskrevet i trin 1.3.5.
    5. Repeterbarheden undersøges ved at opløse den samme prøve (CMT-4) i sextuplikat, fremstillet som beskrevet i trin 4.2, og underkaste dem HPLC-analyse som beskrevet i trin 4.1. Beregn derefter RSD af β-sitosterolindholdet i seks prøver.
    6. Vurder metodens nøjagtighed ved at anvende standardadditionsmetoden. Til dette formål tilsættes β-sitosterol-referenceopløsninger til prøverne ved 80 %, 100 % og 120 % af indholdet af β-sitosterol og hver tilstand gentages tre gange som beskrevet i trin 4.1. Evaluer metodens nøjagtighed ved at beregne den gennemsnitlige genopretning og RSD.
      BEMÆRK: Beregningsformlen for inddrivelsesgraden (RR) er som følger:
      RR % = [(M t - M 0) / Ms] × 100
      Hvor M t = kvaliteten af β-sitosterol efter tilsætning af standarden, M 0 = kvaliteten af prøveopløsningen og Ms = kvaliteten af β-sitosterol tilsat.
  4. Bestemmelse af indholdet af β-sitosterol i prøver
    1. Der udtages 10 batcher autentiske kinesiske lægemidler og fem batcher af beslægtede forfalskningsmidler for at fremstille prøveopløsninger i henhold til trin 4.2.
    2. Derefter injiceres hver prøveopløsning og β-sitosterolreferenceopløsning for at bestemme toparealet under de betingelser, der er beskrevet i trin 4.1, og β-sitosterolindholdet i hver prøve beregnes ved hjælp af den eksterne standard etpunktsmetode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kromatografisk fingeraftryk af Chuanmutong og lighedsanalyse (SA)
RSD-værdierne for den relative retentionstid for præcision, repeterbarhed og stabilitet var henholdsvis under 0,46%, 1,65% og 0,53%; RSD-værdierne for det relative topområde var henholdsvis under 4,23%, 3,56% og 3,96%. Som vist i figur 1A, B var der 12 forskellige fælles toppe (fra top 1 til top 12) i HPLC-fingeraftrykkene i de 10 autentiske Chuanmutong-prøver. Da topområdet i nr. 10 var relativt stort, var opløsningen god; Da det var en komponent, der var til stede i hver prøve, blev den brugt som en referencetop til at undersøge fingeraftrykkets stabilitet og reproducerbarhed. Derefter blev top nr. 10 taget som referencetop (S), og den relative retentionstid for de resterende 11 toppe blev beregnet.

I lighedsanalyse, jo tættere korrelationskoefficienten er på 1, jo højere er ligheden mellem prøverne. Som vist i tabel 1 var lighedsgraderne for 10 partier Chuanmutong 0,910-0,989. Disse resultater viste, at de 10 partier Chuanmutong havde høj lighed og god konsistens, som kan bruges til at evaluere den samlede kvalitet af Chuanmutong. Som vist i figur 1C blev fingeraftrykkene fra fem partier af dets forfalskningsmidler opnået. Ligheden mellem fingeraftrykkene fra fem partier af forfalskningsmidler og kontrolfingeraftrykkene fra Chuanmutong var kun 0,133-0,720 (tabel 1), hvilket indikerer, at der er åbenlyse forskelle mellem de autentiske prøver og de relaterede forfalskningsmidler. Forskellene var hovedsageligt koncentreret i de kromatografiske toptal på kromatogrammet ved 28-55 min. Således kan Chuanmutongs kontrolfingeraftryk effektivt skelne de autentiske prøver fra de relaterede forfalskninger.

SPSS 26 statistisk software blev brugt til CA-analyse i dette eksperiment (figur 2A); 15 partier prøver blev opdelt i to kategorier, når klassificeringsafstanden var 20. Den første kategori var 10 partier Chuanmutong og dets sædvanlige forfalskninger (CC). Den anden kategori var forfalskningerne af Chuanmutong, herunder DC, DE, XS og SMT. Da klassificeringsafstanden var fire, blev alle prøver opdelt i fire kategorier. Den første kategori var 10 partier Chuanmutong, den anden kategori var CC, den tredje kategori var SMT og XS, og den fjerde kategori var DC og DE. Klassificeringsresultaterne viste, at kvaliteten af de autentiske sorter af Chuanmutong stort set var den samme, og der var åbenlyse forskelle med alle ægteskabsbrydere. På samme tid, sammenlignet med andre forfalskninger, var CC tættere på den autentiske sort Chuanmutong, men det kan stadig skelnes, når klassificeringsafstanden indsnævres.

De fælles topområder for de 15 batcher af prøver blev importeret til dataanalysesoftware til PCA-analyse, og scorematrixen (R 2 x = 0,994, Q2 = 0,961) (figur 2B) viste, at klyngeeffekten af de 15 batcher af prøver var udtalt. På højre side af Y-aksen var 10 partier Chuanmutong og CC. Blandt dem var CC placeret i den første kvadrant, som adskiller sig fra de autentiske sorter af Chuanmutong. Den venstre side af Y-aksen var ægteskabsbryderne, herunder SMT, XS, DE og DC. Blandt dem var SMT og XS placeret i den anden kvadrant, og DE og DC var placeret i den tredje kvadrant. Mens man sammenligner de autentiske sorter af Chuanmutong og de konventionelle forfalskningsmidler, er forskellen mellem CC og autentiske sorter relativt lille, mens forskellen mellem de autentiske og andre forfalskninger er indlysende.

Det fælles topområde for Chuanmutong og dets forfalskninger blev brugt som en variabel, importeret til dataanalysesoftwaren til OPLS-DA, og derefter blev scorematrixen tegnet (figur 3A). R 2 x [1] i OPLS-DA-modellen var 0,695, og R 2 x [2] var 0,605, som begge er større end 0,5, hvilket indikerer, at modellen er stabil og pålidelig og kan bruges til at skelne autentiske prøver fra forfalskninger.

Det fremgår af figur 3A , at prøvepunkterne for de autentiske og andre ægteskabsbrydere var fuldstændigt adskilt, og at der ikke var noget skæringspunkt mellem prøvepunkterne. Alle prøver blev opdelt i tre dele. De autentiske sorter af Chuanmutong og CC var ens. Prøverne af XS, DC og DE blev grupperet i en klasse, og prøven af SMT var den sidste klasse. Endvidere blev bedømmelsesmetoden af variabel betydning i projektionen (VIP) (figur 3B) brugt til at screene toppe af forskellige komponenter i fingeraftrykket af hver prøve. VIP > 1.0 blev taget som standard for at screene seveb-variabler, der i høj grad bidrog til klassificeringen mellem prøvegrupperne. Ifølge screeningsresultaterne var de vigtigste markørkomponenter, der forårsagede forskellen i sammensætning mellem autentiske prøver og forfalskningerne, toppe nr. 9, nr. 5, nr. 7, nr. 6, nr. 10, nr. 3 og nr. 2. VIP-værdien af de resterende toppe var mindre end 1, hvilket havde ringe effekt på forskelsbehandlingen af prøver.

Det lineære forhold mellem β-sitosterol-topområdet og dets opløsningskoncentration blev fundet ved hjælp af regressionsanalyse. Denne afhængighed adlød en ligning Y = 5,4918 X-4,5563, hvor Y er β-sitosterol-topområdet, og X er β-sitosterolindholdet i μg/ml. Samtidig er korrelationskoefficienten r = 0, 9995, som opfylder kravene. RSD for præcisionstesten, stabilitetstesten og repeterbarhedstesten var henholdsvis 1,76%, 4,22% og 3,85%. Resultaterne viser, at bestemmelsesmetoden for β-sitosterolindhold havde god linearitet, præcision og repeterbarhed, og prøveopløsningen var stabil inden for 24 timer. Den gennemsnitlige procentvise genopretning på tre niveauer var 101,50 %, 101,90 % og 100,72 %. den tilsvarende RSD var henholdsvis 2,56%, 1,56% og 1,68%. Gode aftaler mellem teoretiske og faktiske bestemte værdier bekræftede nøjagtigheden og anvendeligheden af analysemetoden. Det flydende kromatogram af β-sitosterol er vist i figur 4, og indholdet af β-sitosterol i 15 batcher af prøver blev bestemt (tabel 2). Resultaterne viste, at koncentrationen af β-sitosterol i 10 batcher af autentiske prøver lå i intervallet 97,53-161,56 μg/g (relativt stabil). Denne komponent blev påvist i alle fem partier af forfalskninger, men indholdet varierede meget.

Figure 1
Figur 1: Fingeraftryk af Chuanmutong og deres forfalskninger. (A) Fingeraftryk af 10 partier autentiske Chuanmutong-prøver (S1: CMT-1, S2: CMT-2, S3: CMT-3, S4: CMT-4, S5: CMT-5, S6: CMT-6, S7: CMT-7, S8: CMT-8, S9: CMT-9, S10: CMT-10). B) referencekromatogramfingeraftryk af autentiske Chuanmutong-prøver relative retentionstider var 0,18 (top nr. 1), 0,22 (top nr. 2), 0,29 (top nr. 3), 0,72 (top nr. 4), 0,75 (top nr. 5), 0,82 (top nr. 6), 0,86 (top nr. 7), 0,92 (top nr. 8), 0,96 (top nr. 9), 1,00 (top nr. 10), 1,02 (top nr. 11), 1,37 (top nr. 12). C) Fingeraftryk af fem partier af Chuanmutong-forfalskningsmidler (S1: CC, S2: DC, S3: DE, S4: XS, S5: SMT). D) Sammenligning mellem referencekromatogramfingeraftryk fra autentiske Chuanmutong-prøver og de fem partier af deres forfalskningsmidler (S1: referencekromatogramfingeraftryk, S2: CC, S3: DC, S4: DE, S5: XS, S6: SMT). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: CA- og PCA-analyse af 10 batcher autentiske Chuanmutong-prøver og fem batcher af forfalskninger. (A) CA-analyse. B) Analyse af partnerskabs- og samarbejdsaftaler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: OPLS-DA score kort og VIP score kort over 10 batches autentiske Chuanmutong prøver og fem batches af adulterants. (A) OPLS-DA score kort. (B) VIP-scorekort. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Det flydende kromatogram af β-sitosterol. S1: β-sitosterol, S2: CMT-4, S3: XS, S4: DC, S5: SMT, S6: CC, S7: DE. Klik her for at se en større version af denne figur.

Prøver Navn Lighed
de ægte sorter af Chuanmutong CMT-1 0.947
CMT-2 0.910
CMT-3 0.989
CMT-4 0.937
CMT-5 0.989
CMT-6 0.988
CMT-7 0.956
CMT-8 0.959
CMT-9 0.939
CMT-10 0.966
ægteskabsbrud CC 0.599
DC 0.720
DE 0.133
XS 0.694
SMT 0.180

Tabel 1: Resultater af lighed mellem 10 partier autentiske Chuanmutong-prøver og deres forfalskninger. Ved at importere de relevante data til det kinesiske medicinkromatografiske fingeraftryksevalueringssystem blev ligheden mellem 10 batcher af autentiske Chuanmutong-prøver og fem batcher af forfalskningsmidler beregnet.

Prøver Navn Indhold (μg/g)
de ægte sorter af Chuanmutong CMT-1 103.5
CMT-2 124.6
CMT-3 131
CMT-4 121.1
CMT-5 97.5
CMT-6 113.8
CMT-7 105.6
CMT-8 161.6
CMT-9 118
CMT-10 123.5
ægteskabsbrud CC 157.4
DC 165.6
DE 32.9
XS 69.7
SMT 192.2

Tabel 2: Bestemmelsesresultater af β-sitosterolindhold i de autentiske Chuanmutong-prøver og deres forfalskninger.

Supplerende figur 1: Væskekromatografi under forskellige prøveforberedelsesbetingelser og forskellige kromatografiske betingelser. (A) De mobile fasesystemer (S1: acetonitril-0,1% myresyreopløsning, S2: acetonitril-0,5% eddikesyreopløsning, S3: acetonitril-rent vand, S4: acetonitril-0,05% fosforsyreopløsning, S5: methanolrent vand). (B) Detektionsbølgelængderne (S1: 205 nm, S2: 230 nm, S3: 250 nm, S4: 300 nm). C) Søjletemperaturerne (S1: 20 °C, S2: 30 °C, S3: 40 °C). (D) Strømningshastighederne (S1: 0,8 ml/min, S2: 0,9 ml/min, S3: 1,0 ml/min). (E) Ekstraktionsmetoderne (S1: ultralydsekstraktion, S2: refluksekstraktion). F) Ekstraktionsmidlerne (S1: ethylacetat, S2: ethanol, S3: chloroform, S4: n-butanol, S5: methanol). (G) Ekstraktionstiden (S1: 15 min, S2: 30 min, S3: 60 min). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Det flydende kromatogram af ergosterol, stigmasterol og autentisk Chuanmutong. S1: stigmasterol, S2: ergosterol, S3: CMT-4. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Prøveindsamlingen til forskning er det første vigtige skridt til at konstruere multi-mønster genkendelse til at identificere ægtheden af kinesiske medicinske materialer. Gennem markedsundersøgelser fandt vi, at Sichuan Ya'an, Liangshan og Leshan er de vigtigste produktionsområder for vilde ressourcer i Chuanmutong. De beslægtede sorter af samme slægt har også samme geografiske udbredelse 6,20; CC, DC, DE, XS og SMT misbruges ofte som Chuangmutong16,21; derfor blev der i denne undersøgelse indsamlet 10 batcher af autentisk Chuanmutong og fem batcher blandede prøver på ovennævnte oprindelsessteder, og sorternes nøjagtighed blev bekræftet.

Det andet vigtige trin er at screene detektionsbetingelserne for HPLC-fingeraftrykket, som kan vise så mange oplysninger som muligt om de kemiske komponenter. I denne undersøgelse, som vist i supplerende figur 1, blev antallet og arealet af kromatografiske toppe opnået under forskellige præparationsbetingelser, herunder ekstraktionsmetoder, ekstraktionsopløsningsmidler og ekstraktionstid. Den optimale fremstillingsmetode for Chuanmutong-prøveopløsningen blev bestemt. På den anden side blev antallet og opløsningen af kromatografiske toppe af prøverne under forskellige kromatografiske betingelser sammenlignet. De mobile fasesystemer, såsom acetonitril-0,1% myresyreopløsning, acetonitril-0,5% eddikesyreopløsning, acetonitrilrent vand, acetonitril-0,05% fosforsyreopløsning og methanolrent vand, detektionsbølgelængderne, såsom 205 nm, 230 nm, 250 nm og 300 nm, søjletemperaturerne, såsom 20 ° C, 30 ° C og 40 ° C, og strømningshastighederne, såsom 0,8-1,0 ml / min, blev undersøgt. De optimale kromatografiske betingelser for analyse af prøverne af Chuanmutong blev bestemt. Endvidere blev dets gennemførlighed bekræftet ved metodologisk validering, og detektionsmetoden for Chuanmutongs HPLC-fingeraftryk blev konstrueret med succes.

Det tredje nøgletrin er at analysere og finde oplysningerne forskellige i fingeraftryk af autentisk kinesisk medicin og dens forfalskninger. I denne undersøgelse blev for det første ligheden mellem fingeraftryk analyseret ved hjælp af SESCF-TCM (2012-version). Det blev konstateret, at ligheden mellem fingeraftrykkene fra 10 partier autentiske Chuanmutong-prøver og kontrolkarakteristikken fingeraftryk var meget høj. Til sammenligning var ligheden mellem fingeraftrykkene fra fem partier af forfalskningsmidler og kontrolkarakteristikken fingeraftryk betydeligt lavere end for autentiske prøver. CA, PCA og OPLS-DA blev derefter yderligere introduceret for at analysere de fælles topoplysninger om de kemiske fingeraftryk. Både CA- og PCA-resultater viser, at den almindeligt anvendte forfalskningsmiddel CC blandt forskellige forfalskningsmidler er relativt tættere på den autentiske, hvilket er vanskeligt at skelne. Men når klassificeringsafstanden for CA ændres til fire, kan den effektive identifikation mellem den autentiske og den ægteskabstro opnås. Baseret på de 12 almindelige toppe af autentiske materialer blev bidragsværdierne for differentielle toppe af forfalskningsmidler kvantitativt evalueret af OPLS-DA og opnåede syv differentielle kromatografiske toppe, nemlig top nr. 9, top nr. 5, top nr. 7, top nr. 6, top nr. 10, top nr. 3 og top nr. 2. Disse kan bruges til effektivt at identificere de autentiske og falske materialer i Chuanmutong, som er de vigtigste markerede komponenter i forskellen mellem det autentiske og det utro.

Den seneste udgave af kinesisk farmakopé har endnu ikke inkluderet indholdsbestemmelse af de effektive komponenter i Chuanmutong. For at forbedre sin kvalitetskontrol undersøgte denne undersøgelse indholdsbestemmelsesmetoder for aktive komponenter såsom β-sitosterol, ergosterol, sitosterol og oleanolsyre relateret til diuretisk virkning i tidligere rapporter 22,23,24,25,26. Som vist i supplerende figur 2 blev ergosterol ikke påvist i autentisk Chuanmutong, og stigmasterol var vanskeligt at adskille i kromatogrammet og kunne ikke kvantificeres nøjagtigt. Endelig blev indholdsbestemmelsesmetoden for β-sitosterol etableret; detektionsresultaterne viste, at β-sitosterol blev fundet i 10 batcher af autentiske Chuanmutong-prøver og fem batcher af forfalskningsmidler. Derfor var β-sitosterol ikke unikt for ægte medicinske materialer. Selvom der kan gives nogle oplysninger om kvaliteten af Chuanmutong, er det stadig nødvendigt at analysere de differentielle kromatografiske toppe i fingeraftrykkene i fremtiden for at se, om de specifikke komponenter relateret til effekten af Chuanmutong kan findes.

På nuværende tidspunkt identificeres traditionelle kinesiske lægemidler ofte ved ligheden mellem det kemiske fingeraftryksspektrum. Denne indikator er imidlertid en parameter baseret på de samlede oplysninger om prøvekromatografiske toppe, som ikke kan give flere oplysninger om identifikationen og de vigtigste forskelle i forskellige prøver. Derfor brugte denne undersøgelse yderligere CA, PCA og OPLS-DA til at identificere den fælles topinformation om kemiske fingeraftryk, fandt de vigtigste differentielle kromatografiske toppe mellem autentiske og forfalskede prøver af Chuanmutong og identificerede dem med succes. Endelig blev HPLC-koblet kemisk fingeraftryk til genkendelse af flere mønstre konstrueret.

Da det ikke er ualmindeligt at blande autentiske kinesiske medicinske materialer og deres forfalskningsmidler, såsom Fritillaria thunbergii, Herba Asari og Lonicera japonica, vil denne metode give en ny strategi for klar og videnskabelig identifikation af autentiske kinesiske medicinske materialer og deres forfalskninger. Denne strategi vil være af stor betydning for at sikre kvaliteten af kinesiske lægemidler i klinisk anvendelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Project of Sichuan Traditional Chinese Medicine Administration (nr. 2020JC0088, nr. 2021MS203).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2017381038
Acetonitrile Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, China WXBD5243V
β-Sitosterol Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China 20210201
 C18 column Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China Welch Ultimate LP
Chuanmutong Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China  19020103 CMT-1
Chuanmutong Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200701 CMT-2
Chuanmutong Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200701 CMT-3
Chuanmutong Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200901 CMT-4
Chuanmutong Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  210701 CMT-5
Chuanmutong Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  210401 CMT-6
Chuanmutong Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200901 CMT-7
Chuanmutong Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China  201201 CMT-8
Chuanmutong Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China  201001 CMT-9
Chuanmutong Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China 210501 CMT-10
Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China  - CC
Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China  - DC
Clematis peterae Hand.-Mazz. Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China  - DE
Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China  - XS
Clematis finetiana Levl. et Vaniot. Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China  - SMT
Electronic balance Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai,  China  FA1204
Ergosterol Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China 20210201
Ethanol Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 2021112602
Ethyl acetate Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2017042043
Formic acid Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 2016062901
High performance liquid chromatography Agilent, USA. 1260
IBM SPSS Statistics version 26.0 International Business Machines Corporation, USA -
Methanol Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, China WXBD6409V
Methanol Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 202010302
n-butyl alcohol Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2020071047
Petroleum ether Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2020090125
Phosphoric acid Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 20200110
SESCF-TCM version 2012 National Pharmacopoeia Commission, China - http://114.247.108.158:8888/login
Stigmasterol Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China 20210201
Trichloromethane Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China 20200214
Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 Umetrics, Sweden - https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download
Ultrapure water machine Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China UPH-II-10T
Ultrasonic cleaner Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China KH3200E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, C. R. Chinese Medicine Specimen Picture Book. , Shanghai World Book Company. Shanghai. 116 (1935).
  2. Xiong, J., et al. Lignans from the stems of Clematis armandii ("Chuan-Mu-Tong") and their anti-neuroinflammatory activities. Journal of Ethnopharmacology. 153 (3), 737-743 (2014).
  3. Pan, L. L., et al. a lignan from the Chinese medicinal plant Clematis armandii, inhibits A431 cell growth via blocking p70S6/S6 kinase pathway. Integrative Cancer Therapies. 16 (3), 351-359 (2017).
  4. Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of The People's Republic of China: (Edition 2020). , The Medicine Science and Technology Press of China. China., Beijing. 38 (2020).
  5. Wang, D. G., Guo, J. L. Textual research on the materia medica and authenticity of Clematidis armandii. Lishizhen Medicine and Materia Medicine Research. 18 (11), 2696 (2007).
  6. Fang, Q. M., Zhang, M., Zhong, Y. Y. The natural resources and exploitation of Caulis Clematidis Armandii in Sichuan. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 20 (5), 404-406 (2005).
  7. Bai, M. N., Dai, Y. X., Wang, Y., Ren, Y. Y., Tan, R. Study on the identification of Caulis Clematidis Armandii. Research and Practice on Chinese Medicines. 31 (3), 13-16 (2017).
  8. Zhou, P. J., Li, X. F., Fu, D. H., Pu, X. Y., Zhu, G. Q. Pharmacognosy identification of Ethnomedicine Clematis ranunculoides Franchet. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. 34 (3), 432-436 (2017).
  9. Guo, J. L., Tang, Y., Pei, J., Wang, D. G. Study on random amplified polymorphic DNA and sequence characterized amplified regions of Caulis Clematidis Armandii. Journal of Chengdu Medical College. 6 (4), 283-286 (2011).
  10. Liu, M. Z., Li, M. N., Yao, H., Liu, P. Molecular identification of Clematidis Armandii Caulis and its adulterants and closely related species by ITS2 sequence. Global Traditional Chinese Medicine. 4 (6), 446-450 (2011).
  11. Liu, J. J., Chen, X., Wei, Z. Q., Li, B. Chemical constituents and identification of the caules of Clematis armandii Franch.and Clematis montana Buch.-Ham. Natural Product Research and Development. 22 (6), 998-1000 (2010).
  12. Yang, T. R., Xu, Z., Shi, Y. N. Studies on four compounds from Clematis Montana. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 10 (4), 142-143 (2008).
  13. Yan, L. H., Xu, L. Z., Zhou, Z. M., Yang, S. L. Chemical constituents from stems of Clematis armandii(I). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 38 (3), 340-342 (2007).
  14. Li, X., et al. Traditional uses, phytochemistry, pharmacology, and toxicology of Akebiae Caulis and its synonyms: A review. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114245 (2021).
  15. Ye, X., et al. Diuretic effect and material basis of Clematidis Armandii Caulis in rats. China Journal of Chinese Materia Medica. 44 (9), 1889-1894 (2019).
  16. Kuang, Y., et al. Consistency study of Caulis Clematidis Armandii and its traditionally used products and counterfeit species based on efficacy and pharmacognosy. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 36 (3), 115-121 (2020).
  17. Li, Y., et al. Quality assessment of Asarum heterotropoides var. mandshuricum based on HPLC multi-component determination and multiple pattern recognition method of fingerprint. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 238-243 (2022).
  18. Li, Y., et al. Determination of multi-components of Paeoniae Alba Radix based on fingerprints and chemical pattern recognition. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 231-237 (2022).
  19. Li, H. H., et al. Comparative investigation for raw and processed products of Euodiae Fructus based on high-performance liquid chromatography fingerprints and chemical pattern recognition. Chemistry & Biodiversity. 18 (8), 2100281 (2021).
  20. Dong, L. J., et al. Study on suitable distribution areas of Kawa Kimichi produced in Sichuan province-based on remote sensing and GIS-A case study of Clematis Armandii. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 17 (11), 2398-2404 (2015).
  21. Tang, S. W., Pei, J., Li, F. Y. Morphological and histological identification of Chuanmutong. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 15 (1), 19-21 (2000).
  22. Li, B., Chen, X., Fang, Q. M., Zhang, B. J., Wei, Z. Q. Quality Research of Chuanmutong. Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine. 27 (6), 58-60 (2009).
  23. Wu, W. J., Wan, M. M., Cao, Y. H., Tan, R., Song, L. K. Research on the Quality Standard of Chuanmutong. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 33 (2), 313-315 (2015).
  24. Wei, Z. Q., Chen, X., Li, B., Dong, X. P. Determination of stigmasterol in Clematis armandii Franch and Clematis montana Buch-Ham. by HPLC. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 20 (3), 574-575 (2009).
  25. Qing, L. S., et al. Determination of oleanolic acid in Caulis clematidis armandii by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (3), 273-274 (2006).
  26. Yang, S. D., Wang, R., Fu, D. Y., Guo, J. J., Tan, W. Y. Determination on oleanolic acid in caulis clematidis armandii by microwave assisted extraction-HPLC/MS. Anhui Academy of Agricultural Sciences. 38 (13), 6929-6931 (2010).

Tags

Kemi udgave 189 kemisk fingeraftryk multimønstergenkendelse klyngeanalyse hovedkomponentanalyse ortogonal delvis diskriminationsanalyse af mindste kvadrater kinesiske lægemidler Clematidis Armandii Caulis
HPLC kombineret med kemisk fingeraftryk til genkendelse af flere mønstre til identifikation af ægtheden af <em>Clematidis Armandii Caulis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, F., Qian, Z., Liao, G., Zeng,… More

Wang, F., Qian, Z., Liao, G., Zeng, J., Huang, D., Liu, Q., Xie, X. HPLC Coupled with Chemical Fingerprinting for Multi-Pattern Recognition for Identifying the Authenticity of Clematidis Armandii Caulis. J. Vis. Exp. (189), e64690, doi:10.3791/64690 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter