Summary
Здесь мы представляем протокол для создания высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании с химическим распознаванием отпечатков пальцев с несколькими образами, который обеспечивает новую стратегию эффективной идентификации подлинных сортов Clematidis Armandii Caulis и его фальсификаторов.
Abstract
Метод идентификации китайских лекарственных материалов и связанных с ними фаяльсий был построен на примере Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, повсеместно используемая традиционная китайская медицина). Десять партий подлинных сортов Чуаньмутонг и пять партий родственных фальсификатов были проанализированы и сопоставлены на основе высокоэффективных отпечатков пальцев жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании с хемометрией, включая кластерный анализ (CA), анализ главных компонентов (PCA) и ортогональный частичный анализ дискриминации наименьших квадратов (OPLS-DA). Кроме того, определяли содержание β-ситостерина. Контрольный химический отпечаток Чуаньмутонга был установлен, и было идентифицировано 12 общих пиков. Сходство между отпечатком пальца 10 партий подлинных разновидностей Chuanmutong и контрольным отпечатком пальца составляло 0,910-0,989, в то время как сходство пяти партий фальсификатов составляло всего 0,133-0,720. Основываясь на общих пиках в хроматограмме, 15 партий образцов были классифицированы по трем уровням содержания PCA и были агрегированы в четыре категории CA, что позволило провести четкое различие между подлинными chuanmutong и фальсификатами Chuanmutong. Кроме того, семь дифференциальных компонентов, которые могут эффективно идентифицировать подлинный Чуаньмутонг и фальсификаторы Чуаньмутонга, были обнаружены с помощью OPLS-DA. Содержание β-ситостерина в 10 партиях подлинных сортов Чуаньмутонг составляло 97,53-161,56 мкг/г, в то время как содержание β-ситостерола в пяти партиях фальсификатов сильно варьировалось, среди которых содержание β-ситостерола в Клематис петера Хэнд.-Мазз. и Клематис гуриана Роксб. Var. finetii Rehd. и Уилс. был значительно ниже, чем у аутентичных сортов Чуаньмутонг. Содержание компонентов индекса ВЭЖХ и химический метод распознавания нескольких образов отпечатков пальцев, установленный в этом исследовании, обеспечивают новую стратегию эффективной идентификации подлинных китайских лекарственных материалов и связанных с ними фальсификатов.
Introduction
Чуаньмутонг, сухой каулис клематиса армандии Франч. или Clematis montana Buch.-Ham., является традиционной китайской медициной, обычно используемой в клиниках 1,2,3. Он используется для лечения проблем с мочеиспусканием, отеков, язв на языке и во рту, снижения секреции молока, жесткости суставов и мышечной боли, вызваннойвлажным теплом 4. Чуаньмутонг всегда получали из диких сортов, в основном распространенных на юго-западе Китая, особенно в провинции Сычуань, где лучшее качество можно найти 5,6. Трудно отличить аутентичные сорта от их близкородственных фальсификаторов из-за их схожих характеристик 7,8,9,10. Стандарт качества Chuanmutong в издании Китайской фармакопеи 2020 года предусматривает только свойства, микроскопическую идентификацию и тонкослойную идентификацию без определения содержания, которая не может эффективно идентифицировать фальсификаторов и, следовательно, имеет потенциальные риски. Кроме того, существует мало сообщений, сравнивающих и идентифицирующих Чуаньмутонг и родственные растения. Следовательно, метод контроля качества для обеспечения подлинности Chuanmutong заслуживает дальнейшего изучения.
Химические компоненты Chuanmutong в основном состоят из пентациклических тритерпеноидов типа олеана и их гликозидов, флавоноидов и органических кислот 11,12,13,14. Среди них олеаноловая кислота, β-ситостерин, стигмастерин и эргостерин обладают мочегонным действием различной интенсивности, которые могут быть потенциальными фармакодинамическими веществами для стимулирования диуреза и облегчения странгурии15,16. Химические отпечатки пальцев получают путем разделения и обнаружения многих химических компонентов, содержащихся в образцах, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), газовой хроматографии (ГХ) и т.д. Принятие соответствующих методов статистического анализа для анализа характеристик Chuanmutong может определить общий контроль качества и научную идентификацию традиционной китайской медицины 17,18,19.
В этом исследовании было собрано 10 партий аутентичных сортов Чуаньмутонг и пять партий фальсификатов. Их качество сравнивалось и анализировалось методом отпечатков пальцев ВЭЖХ в сочетании с распознаванием нескольких образов, включая кластерный анализ (CA), анализ главных компонентов (PCA), ортогональный частичный анализ дискриминации наименьших квадратов (OPLS-CA) и определение содержания фармакодинамического компонента. Этот протокол устанавливает метод идентификации аутентичных сортов с высокой специфичностью, новую стратегию научной идентификации аутентичных сортов и фальсификатов китайских лекарственных материалов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Методы химического обнаружения отпечатков пальцев
- Хроматографические условия
- Подготовьте подвижную фазу ацетонитрила (А)/воды (В). Установите градиентную программу следующим образом в программном обеспечении ВЭЖХ: 0-20 мин, 3%А-10%А; 20-25 мин, 10%А-13%А; 25-65 мин, 13%А-25%А; 65-75 мин, 25%А-40%А; 75-76 мин, 40%А-3%А; 76-85 мин, 3%А-3%А.
- Поддерживать скорость потока подвижной фазы на уровне 1,0 мл/мин.
- Проводят хроматографическое разделение на колонке C18 (250 мм x 4,6 мм, 5 мкм), поддерживаемой при 30 °C.
- Установите объем инъекции на 10 мкл.
- Обнаружение образцов на длине волны 205 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для конкретных настроек хроматографических условий обратитесь к процедурам работы рабочего программного обеспечения высокоэффективной жидкостной хроматографии (Таблица материалов).
- Приготовление пробного раствора
- Измельчите сырье до однородного размера частиц, пропуская их через нейлоновую сетку с внутренним диаметром 850 мкм ± 29 мкм.
- Поместите 2 г измельченного сырья (точно взвешенного) в коническую колбу объемом 50 мл с пробкой и добавьте 50 мл метанола. Поместите пробку на колбу и ультразвук (600 Вт, 40 кГц) на 30 мин.
- Затем охладите колбу до комнатной температуры (RT). Снова взвесьте образцы и восполните первоначальный вес, заменив потерянный экстрагент.
- Перелейте 4 мл раствора метанола, содержащего лекарственные экстракты, в объемную колбу объемом 10 мл. Добавить 6 мл H2O, перемешать и дать ему отстояться в течение 10 мин.
- Наконец, отфильтруйте супернатант через фильтрующую мембрану 0,45 мкм и поместите его в режим ожидания.
- Валидация методов обнаружения отпечатков пальцев
- Подготовьте образец, как описано выше (этап 1.2), и подвергайте его анализу ВЭЖХ (этап 1.1) шесть раз в день. Для оценки точности рассчитайте относительное стандартное отклонение (RSD) относительного времени удержания и относительных пиковых областей, как описано в шаге 1.3.5.
- Оцените стабильность образца раствора путем анализа того же образца раствора, хранящегося в RT в течение 0, 2, 4, 6, 8, 12 и 24 ч, и рассчитайте RSD относительного времени удержания и относительных пиковых областей, как описано в шаге 1.3.5.
- Возьмите шесть реплик одного и того же образца (CMT-4), подготовьте образец раствора в соответствии с вышеуказанной процедурой (шаг 1.2) и обнаружите его отпечаток пальца в ВЭЖХ после шага 1.1. Рассчитайте RSD относительного времени удержания и относительных пиковых областей и оцените его повторяемость, как описано в шаге 1.3.5.
- Затем используйте пиковое число 10 на рисунке 1B в качестве эталонного пика и рассчитайте RSD относительного времени удержания и относительной пиковой области каждого общего пика, как описано в шаге 1.3.5.
- Используйте формулы, упомянутые ниже, чтобы рассчитать относительное время удержания и относительную пиковую площадь каждого общего пика:
Tre = Tхарактеристика/Tссылка
Are = Характеристика/Ссылка A
Где Tre = относительное время удержания, T-характеристика = характерное время удержания пика, Treference = контрольное время удержания пика, Are = относительная пиковая площадь, A характеристика = характерная пиковая область и Areference = опорная пиковая область.
ПРИМЕЧАНИЕ: Создание отпечатков пальцев традиционной китайской медицины обычно требует выбора хроматографического пика, который легко получить и имеет высокое разрешение. Это используется в качестве эталонного пика для идентификации отпечатков пальцев и изучения их стабильности и воспроизводимости.
2. Установление анализа отпечатков пальцев и сходства Chuanmutong
- Используйте 10 партий аутентичных образцов и пять партий фальсификатов, таких как Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang (CC), Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. и Уилс. (DC), Клематис петере Хэнд.-Мазз. (DE), Клематис гуриана Роксб. Var. finetii Rehd. et Wils (XS) и Clematis finetiana Levl. и Ваниот. (SMT) в качестве образцов для анализа отпечатков пальцев.
- Подготовьте образцы решений, как описано в шаге 1.2. Выполните анализ отпечатков пальцев всех образцов растворов методом ВЭЖХ в соответствии с условиями, описанными на этапе 1.1.
- Импорт соответствующих данных в систему оценки сходства хроматографических отпечатков пальцев традиционной китайской медицины (SESCF-TCM, версия 2012 года). Система будет обозначать пики с разумной высотой и хорошим разрешением в хроматограммах всех образцов как общие пики.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение SESCF-TCM можно загрузить после регистрации на веб-сайте Китайской фармакопейной комиссии (http://114.247.108.158:8888/login).- В программном обеспечении нажмите кнопку Установить опорный спектр в меню.
- Затем в окне Параметры параметров установите ширину временного окна равным 0,5 и выберите Метод генерации контрольного спектра в качестве Метода медианы.
- Нажмите « Многоточечная калибровка» в главном меню, затем выберите «Пиковое соответствие» как «Полное сопоставление пикового спектра».
- Наконец, нажмите «Создать элемент управления», чтобы сгенерировать эталонный хроматографический отпечаток аутентичного вида Chuanmutong.
- Импортируйте время хранения и пиковую область 10 партий подлинных образцов Chuanmutong и пяти партий фальсификатов в SESCF-TCM для анализа. Конкретные операции заключаются в следующем:
- В программном обеспечении нажмите на кнопку Установить опорный спектр в главном меню.
- В окне Параметры установите эталонный хроматографический отпечаток аутентичного вида Chuanmutong в качестве эталона, выберите Метод генерации контрольного спектра в качестве Медианного метода и установите ширину временного окна равным 0,5.
- Нажмите « Многоточечная калибровка» в главном меню, затем выберите «Пиковое соответствие» как «Полное сопоставление пикового спектра».
- Наконец, нажмите «Рассчитать сходство», чтобы рассчитать сходство на основе отпечатков пальцев эталонной хроматограммы Chuanmutong. Наконец, рассчитайте сходство отпечатков пальцев с помощью системы оценки хроматографических отпечатков пальцев китайской медицины (версия 2012 года).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для конкретных операций обратитесь к эксплуатационным спецификациям для системы оценки хроматографических отпечатков пальцев китайской медицины (версия 2012 года).
3. Мульти-распознавание образов отпечатка пальца Chuanmutong
- Кластерный анализ (CA)
- Используйте пиковые области 12 общих пиков в отпечатках пальцев 10 партий подлинных образцов Chuanmutong и их пяти партий фальсификатов в качестве переменных и введите их в программное обеспечение статистического анализа для систематического кластерного анализа (CA).
- Выберите метод between-Groups и используйте коэффициент корреляции Пирсона в качестве классификационной основы для построения диаграммы кластерного анализа Chuanmutong и его фальсификатов. Конкретные операции заключаются в следующем:
- В программном обеспечении для статистического анализа нажмите Файл, чтобы импортировать данные.
- Нажмите «Анализ » в меню, а затем выберите «Кластеризация системы в классификации».
- Выберите общую пиковую область в качестве переменной и установите число кластеров равным четырем.
- Щелкните Метод, выберите метод кластеризации как Межгрупповое соединение, выберите интервал измерения как Корреляция Пирсона и нажмите кнопку ОК , чтобы нарисовать карту ЦС.
- Анализ главных компонентов (PCA)
- Импортируйте относительную общую пиковую область аутентичных сортов и их фальсификатов в аналитическое программное обеспечение для анализа PCA и используйте карту баллов PCA для оценки матричной карты различий выборки. Конкретные операции заключаются в следующем:
- Откройте программное обеспечение для анализа данных, нажмите на Файл в меню и создайте новый обычный проект. Импортируйте пиковую область из 12 общих пиков в электронную таблицу (например, в формате Excel) из системы ВЭЖХ. Затем нажмите «Готово», чтобы завершить импорт данных.
- Нажмите кнопку Создать , чтобы создать новую модель, чтобы задать тип модели с помощью PCA. Нажмите «Автоподбор » и «Добавить », чтобы соответствовать данным, затем нажмите « Оценки», чтобы получить карту оценок PCA.
- Импортируйте относительную общую пиковую область аутентичных сортов и их фальсификатов в аналитическое программное обеспечение для анализа PCA и используйте карту баллов PCA для оценки матричной карты различий выборки. Конкретные операции заключаются в следующем:
- Ортогональный частичный анализ дискриминации наименьших квадратов (OPLS-DA)
- Используйте метод ортогонального частичного дискриминационного анализа наименьших квадратов с режимом наблюдения для дальнейшего анализа относительных пиковых пиковых пиков аутентичных разновидностей Чуаньмутонг и фальсификаторов и составления карты классификационных показателей OPLS-DA всех образцов. Конкретные операции заключаются в следующем:
- В программном обеспечении для анализа данных нажмите Файл в меню, чтобы импортировать файл и создать новый обычный проект. Импортируйте пиковую область из 12 распространенных пиков в электронную таблицу из системы ВЭЖХ, затем нажмите «Готово», чтобы завершить импорт данных.
- Нажмите кнопку Создать , чтобы создать новую модель, чтобы задать тип модели с помощью PCA. Нажмите «Автоподбор» и «Добавить », чтобы соответствовать данным. Затем нажмите « Баллы», чтобы получить карту баллов PCA.
- Нажмите « Создать» и выберите «Создать как модель один », чтобы задать тип модели с помощью OPLS-DA.
- Нажмите « Масштаб» и установите тип с помощью Par for All. Сначала нажмите «Автоподбор», а затем нажмите « Оценки», чтобы получить карту оценок OPLS-DA.
- Чтобы определить влияние каждого общего пика в Чуаньмутонге на результаты его классификации и разницу между подлинными материалами Чуаньмутонг и связанными с ними фальсификаторами, используйте переменную важность в проекции (VIP) для анализа.
- Нарисуйте VIP-карту различных компонентов Chuanmutong. Используйте полученную КАРТУ VIP для оценки влияния каждой переменной на классификацию и отсеивания компонентов, которые вносят значительный вклад в различия между группами. Конкретные операции заключаются в следующем:
- В программном обеспечении для анализа данных нажмите «Анализ» в меню и нажмите « Перестановки», установите число перестановок равным 200 и получите R2 и Q2 карты оценок OPLS-DA.
- Нажмите на VIP и выберите VIP Predictive , чтобы получить VIP-карту.
- Используйте метод ортогонального частичного дискриминационного анализа наименьших квадратов с режимом наблюдения для дальнейшего анализа относительных пиковых пиковых пиков аутентичных разновидностей Чуаньмутонг и фальсификаторов и составления карты классификационных показателей OPLS-DA всех образцов. Конкретные операции заключаются в следующем:
4. Определение β-ситостерина в Чуаньмутонге методом ВЭЖХ
- Хроматографические условия (см. шаг 1.1)
- Подготовьте подвижную фазу: метанол-вода (97:3).
- Установите скорость потока подвижной фазы на уровне 1,0 мл/мин.
- Проводят хроматографическое разделение на колонке C18 (250 мм x 4,6 мм, 5 мкм), поддерживаемой при 30 °C.
- Установите объем инъекции на 10 мкл.
- Обнаружение компонента на длине волны 204 нм.
- Приготовление пробного раствора
- Готовят стандартный раствор β-ситостерина (0,1 мг/мл) путем растворения точно взвешенного количества соответствующего эталона в метаноле.
- Измельчите анализируемый образец сырья до однородного размера частиц, пропуская образец через нейлоновую сетку с внутренним диаметром 180 мкм ± 7,6 мкм.
- Поместите 2 г измельченного сырья (точно взвешенного) в колбу с круглым дном и добавьте в нее 50 мл хлороформа.
- Подключите колбу к конденсатору рефлюкса и нагревайте ее на кипящей водяной бане (умеренное кипячение) в течение 60 мин. Процедите экстракционный раствор фильтровальной бумагой размером 15-20 мкм.
- Выпаривают фильтрат почти до сухости на кипящей водяной бане (умеренное кипячение) около 10 мин.
- Растворить остаток и восполнить объем до 5 мл с помощью метанола. Наконец, пропустите супернатант через фильтрующую мембрану 0,45 мкм и поместите его в режим ожидания.
- Проверка метода
- Возьмите готовый раствор β-ситостерина, приготовленного на подстадии 4.2.1, разбавьте его 100% метанолом и приготовьте растворы с концентрациями 100 мкг/мл, 80 мкг/мл, 60 мкг/мл, 50 мкг/мл, 40 мкг/мл, 30 мкг/мл и 20 мкг/мл.
- Вводят образцы в хроматографических условиях, описанных на этапе 4.1, для определения площади пика, выполняют регрессионный анализ с пиковой площадью к объему впрыска и получают уравнение регрессии и коэффициент корреляции для оценки его линейности.
- Подготовьте образцы, как описано выше (этап 4.2), и подвергните их анализу ВЭЖХ (этап 4.1) шесть раз в тот же день. Затем рассчитайте RSD пиковых областей для оценки точности.
- Оцените стабильность образца раствора путем анализа тех же образцов растворов, хранящихся в RT в течение 0, 2, 4, 6, 8, 12 и 24 ч, как описано на этапе 4.1. Затем рассчитайте RSD пиковых областей, как описано в шаге 1.3.5.
- Исследуют повторяемость путем растворения одного и того же образца (CMT-4) в секступликате, приготовленном, как описано на этапе 4.2, и подвергая их анализу ВЭЖХ, как описано на этапе 4.1. Затем рассчитайте RSD содержания β-ситостерина в шести образцах.
- Оцените точность метода, используя стандартный метод сложения. Для этого добавьте β-ситостериновые эталонные растворы к образцам на 80%, 100% и 120% от содержания β-ситостерина и повторите каждое состояние три раза, как описано на этапе 4.1. Оцените точность метода, рассчитав среднее извлечение и RSD.
ПРИМЕЧАНИЕ: Формула расчета коэффициента извлечения (РР) выглядит следующим образом:
RR % = [(Mt - M0) / Ms] × 100
Где Mt = качество β-ситостерина после добавления стандарта, M0 = качество пробного раствора, а M s = качество добавленного β-ситостерина.
- Определение содержания β-ситостерина в образцах
- Возьмите 10 партий аутентичных китайских лекарственных материалов и пять партий связанных фальсификатов для приготовления образцов растворов в соответствии с этапом 4.2.
- Затем вводят каждый образец раствора и β-ситостерола эталонным раствором для определения пиковой площади в условиях, описанных на этапе 4.1, и рассчитывают содержание β-ситостерина в каждом образце с использованием внешнего стандартного одноточечного метода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Хроматографический отпечаток чуаньмутонга и анализ подобия (SA)
Значения RSD относительного времени удержания точности, повторяемости и стабильности были ниже 0,46%, 1,65% и 0,53% соответственно; значения RSD относительной пиковой области были ниже 4,23%, 3,56% и 3,96% соответственно. Как показано на рисунках 1A, B, было 12 различных общих пиков (от пика 1 до пика 12) в отпечатках ВЭЖХ в 10 подлинных образцах Chuanmutong. Поскольку пиковая область No 10 была относительно большой, разрешение было хорошим; поскольку это был компонент, присутствующий в каждом образце, он использовался в качестве эталонного пика для исследования стабильности и воспроизводимости отпечатка пальца. Затем пик No 10 был взят за опорный пик (S), и было рассчитано относительное время удержания оставшихся 11 пиков.
При анализе подобия, чем ближе коэффициент корреляции к 1, тем выше сходство между выборками. Как показано в таблице 1, степени подобия 10 партий Chuanmutong составляли 0,910-0,989. Эти результаты показали, что 10 партий Chuanmutong имели высокое сходство и хорошую консистенцию, что может быть использовано для оценки общего качества Chuanmutong. Как показано на рисунке 1С, были получены отпечатки пальцев пяти партий его фальсификаторов. Сходство между отпечатками пальцев пяти партий фальсификаторов и контрольными отпечатками пальцев Чуаньмутонга составило всего 0,133-0,720 (таблица 1), что указывает на очевидные различия между подлинными образцами и родственными фальсификаторами. Различия были в основном сосредоточены в хроматографических пиковых числах на хроматограмме через 28-55 мин. Таким образом, контрольные отпечатки пальцев Chuanmutong могут эффективно отличать подлинные образцы от родственных фальсификаторов.
Статистическое программное обеспечение SPSS 26 использовалось для анализа ЦС в этом эксперименте (рисунок 2А); 15 партий образцов были разделены на две категории при классификационном расстоянии 20. Первой категорией было 10 партий Чуаньмутонг и его привычных фальсификаторов (КК). Второй категорией были фальсификаторы Чуаньмутонга, включая DC, DE, XS и SMT. Когда классификационное расстояние составляло четыре, все образцы были разделены на четыре категории. Первой категорией было 10 партий Chuanmutong, второй категорией был CC, третьей категорией были SMT и XS, а четвертой категорией были DC и DE. Результаты классификации показали, что качество аутентичных сортов Чуаньмутонг было в основном одинаковым, и были очевидные различия со всеми фальсификаторами. В то же время, по сравнению с другими фальсификаторами, CC был ближе к аутентичной разновидности Chuanmutong, но его все же можно отличить, когда классификационное расстояние сужается.
Общие пиковые области 15 партий образцов были импортированы в программное обеспечение для анализа данных для анализа PCA, а матрица баллов (R2x = 0,994, Q2 = 0,961) (рисунок 2B) показала, что эффект кластеризации 15 партий образцов был выражен. С правой стороны оси Y находились 10 партий Chuanmutong и CC. Среди них CC располагался в первом квадранте, который отличается от аутентичных сортов Chuanmutong. Левой стороной оси Y были фальсификаторы, включая SMT, XS, DE и DC. Среди них SMT и XS располагались во втором квадранте, а DE и DC располагались в третьем квадранте. При сравнении аутентичных сортов Chuanmutong и обычных фальсификатов разница между CC и аутентичными сортами относительно невелика, в то время как разница между аутентичными и другими фальсификатами очевидна.
Общая пиковая область Чуаньмутонг и ее фальсификаты были использованы в качестве переменной, импортированной в программное обеспечение для анализа данных для OPLS-DA, а затем была нарисована матрица баллов (рисунок 3A). R2x [1] модели OPLS-DA составлял 0,695, а R2x [2] — 0,605, оба из которых превышают 0,5, что указывает на то, что модель стабильна и надежна и может использоваться для отличия подлинных образцов от фальсификатов.
Из рисунка 3А видно, что точки выборки аутентичных и других фальсификаторов были полностью разделены, и не было пересечения между точками выборки. Все образцы были разделены на три части. Аутентичные сорта Chuanmutong и CC были похожи. Образцы XS, DC и DE были сгруппированы в один класс, и образец SMT был последним классом. Кроме того, метод суждения переменной важности в проекции (VIP) (рисунок 3B) использовался для скрининга пиков различных компонентов в отпечатке пальца каждого образца. VIP-> 1.0 был взят в качестве стандарта для отсеивания переменных севеба, вносящих большой вклад в классификацию между выборочными группами. Согласно результатам скрининга, основными маркерными компонентами, обусловившими разницу в составе между аутентичными образцами и фальсификатами, были пики No 9, No 5, No 7, No 6, No 10, No 3 и No 2. Значение VIP остальных пиков было меньше 1, что мало повлияло на дискриминацию образцов.
Линейная зависимость между пиковой областью β-ситостерина и концентрацией его раствора была обнаружена с помощью регрессионного анализа. Эта зависимость подчинялась уравнению Y = 5,4918 X-4,5563, где Y — пиковая область β-ситостерола, а X — содержание β ситостерола в мкг/мл. Одновременно коэффициент корреляции r = 0,9995, что соответствует требованиям. RSD прецизионного теста, теста стабильности и теста повторяемости составили 1,76%, 4,22% и 3,85% соответственно. Результаты показывают, что метод определения содержания β-ситостерина обладал хорошей линейностью, точностью и повторяемостью, а раствор образца был стабилен в течение 24 ч. Средний процент восстановления на трех уровнях составил 101,50 %, 101,90 % и 100,72 %; соответствующий RSD составил 2,56%, 1,56% и 1,68% соответственно. Хорошие соглашения между теоретическими и фактическими определяемыми значениями подтвердили точность и применимость метода анализа. Жидкая хроматограмма β-ситостерина показана на фиг.4, и определено содержание β-ситостерина в 15 партиях образцов (табл. 2). Результаты показали, что концентрация β-ситостерина в 10 партиях аутентичных образцов находилась в диапазоне 97,53-161,56 мкг/г (относительно стабильная). Этот компонент был обнаружен во всех пяти партиях фальсификатов, но содержание сильно варьировалось.
Рисунок 1: Отпечатки пальцев Чуаньмутонга и их фальсификаторов. (A) Отпечатки пальцев 10 партий подлинных образцов Chuanmutong (S1: CMT-1, S2: CMT-2, S3: CMT-3, S4: CMT-4, S5: CMT-5, S6: CMT-6, S7: CMT-7, S8: CMT-8, S9: CMT-9, S10: CMT-10). (B) контрольные отпечатки пальцев хроматограмм подлинных образцов Chuanmutong; относительное время удержания составило 0,18 (Пик No 1), 0,22 (Пик No 2), 0,29 (Пик No 3), 0,72 (Пик No 4), 0,75 (Пик No 5), 0,82 (Пик No 6), 0,86 (Пик No 7), 0,92 (Пик No 8), 0,96 (Пик No 9), 1,00 (Пик No 10), 1,02 (Пик No 11), 1,37 (Пик No 12). (C) Отпечатки пальцев пяти партий фальсификаторов Chuanmutong (S1: CC, S2: DC, S3: DE, S4: XS, S5: SMT). (D) Сопоставление отпечатков пальцев эталонной хроматограммы подлинных образцов Chuanmutong и пяти партий их фальсификатов (S1: отпечатки пальцев эталонной хроматограммы, S2: CC, S3: DC, S4: DE, S5: XS, S6: SMT). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Анализ CA и PCA 10 партий подлинных образцов Chuanmutong и пяти партий фальсификатов. (A) CA анализ. (B) Анализ PCA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Карта баллов OPLS-DA и карта баллов VIP из 10 партий подлинных образцов Chuanmutong и пяти партий фальсификаторов. (A) Score map OPLS-DA. (B) Карта баллов VIP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Жидкая хроматограмма β-ситостерина. S1: β-ситостерин, S2: CMT-4, S3: XS, S4: DC, S5: SMT, S6: CC, S7: DE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Образцы | Имя | Сходство |
| подлинные сорта Чуаньмутонг | СМТ-1 | 0.947 |
| СМТ-2 | 0.910 | |
| СМТ-3 | 0.989 | |
| СМТ-4 | 0.937 | |
| СМТ-5 | 0.989 | |
| СМТ-6 | 0.988 | |
| СМТ-7 | 0.956 | |
| СМТ-8 | 0.959 | |
| СМТ-9 | 0.939 | |
| СМТ-10 | 0.966 | |
| фальсификаторы | КУБОВЫЙ | 0.599 |
| Постоянный ток | 0.720 | |
| ДЕ | 0.133 | |
| ХС | 0.694 | |
| СМТ | 0.180 |
Таблица 1: Результаты сходства 10 партий подлинных образцов Чуаньмутонг и их фаялистов. Путем импорта соответствующих данных в систему оценки хроматографических отпечатков пальцев китайской медицины было рассчитано сходство 10 партий подлинных образцов Chuanmutong и пяти партий фальсификатов.
| Образцы | Имя | Содержание (мкг/г) |
| подлинные сорта Чуаньмутонг | СМТ-1 | 103.5 |
| СМТ-2 | 124.6 | |
| СМТ-3 | 131 | |
| СМТ-4 | 121.1 | |
| СМТ-5 | 97.5 | |
| СМТ-6 | 113.8 | |
| СМТ-7 | 105.6 | |
| СМТ-8 | 161.6 | |
| СМТ-9 | 118 | |
| СМТ-10 | 123.5 | |
| фальсификаторы | КУБОВЫЙ | 157.4 |
| Постоянный ток | 165.6 | |
| ДЕ | 32.9 | |
| ХС | 69.7 | |
| СМТ | 192.2 |
Таблица 2: Результаты определения содержания β-ситостерина в аутентичных пробах чуаньмутонг и их фальсификаторах.
Дополнительный рисунок 1: Жидкостная хроматография в различных условиях пробоподготовки и различных хроматографических условиях. (A) Системы подвижной фазы (S1: ацетонитрил-0,1% раствор муравьиной кислоты, S2: ацетонитрил-0,5% раствор уксусной кислоты, S3: ацетонитрил-чистая вода, S4: ацетонитрил-0,05% раствор фосфорной кислоты, S5: метанол-чистая вода). (B) Длины волн обнаружения (S1: 205 нм, S2: 230 нм, S3: 250 нм, S4: 300 нм). (C) Температура колонки (S1: 20 °C, S2: 30 °C, S3: 40 °C). D) расход (S1: 0,8 мл/мин, S2: 0,9 мл/мин, S3: 1,0 мл/мин). (E) Методы экстракции (S1: ультразвуковая экстракция, S2: экстракция рефлюкса). F) экстракционные растворители (S1: этилацетат, S2: этанол, S3: хлороформ, S4: н-бутанол, S5: метанол). (G) Время экстракции (S1: 15 мин, S2: 30 мин, S3: 60 мин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Жидкостная хроматограмма эргостерина, стигмастерина и аутентичного чуаньмутонга. S1: стигмастерин, S2: эргостерин, S3: CMT-4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сбор образцов для исследований является первым ключевым шагом к построению многоконтактного распознавания в определении подлинности китайских лекарственных материалов. Благодаря исследованию рынка мы обнаружили, что Сычуань Яань, Ляншань и Лэшань являются основными районами добычи диких ресурсов Чуаньмутуна. Родственные сорта одного рода также имеют одинаковое географическое распространение 6,20; CC, DC, DE, XS и SMT часто неправильно используются как Chuangmutong16,21; поэтому в данном исследовании в вышеупомянутых местах происхождения было собрано 10 партий подлинного чуаньмутонга и пять партий смешанных образцов, и точность сортов была подтверждена.
Вторым ключевым шагом является скрининг условий обнаружения отпечатка ВЭЖХ, который может отображать как можно больше информации о химических компонентах. В этом исследовании, как показано на дополнительном рисунке 1, количество и площадь хроматографических пиков были получены при различных условиях приготовления, включая методы экстракции, экстракционные растворители и время экстракции. Определен оптимальный способ приготовления пробного раствора Chuanmutong. С другой стороны, сравнивались количество и разрешение хроматографических пиков образцов при различных хроматографических условиях. Системы подвижной фазы, такие как ацетонитрил-0,1% раствор муравьиной кислоты, ацетонитрил-0,5% раствор уксусной кислоты, ацетонитрил-чистая вода, ацетонитрил-0,05% раствор фосфорной кислоты и метанол-чистая вода, длины волн обнаружения, такие как 205 нм, 230 нм, 250 нм и 300 нм, температура колонны, такая как 20 °C, 30 °C и 40 °C, и скорость потока, такая как 0,8-1,0 мл / мин, были расследованы. Определены оптимальные хроматографические условия анализа образцов Чуаньмутонга. Далее его целесообразность была подтверждена методологической валидацией, и успешно построен метод обнаружения отпечатка ВЭЖХ Чуаньмутуна.
Третьим ключевым шагом является анализ и поиск информации, различающейся в отпечатках пальцев подлинной китайской медицины и ее фальсификаторов. В этом исследовании, во-первых, сходство отпечатков пальцев было проанализировано с помощью SESCF-TCM (версия 2012 года). Было установлено, что сходство между отпечатками пальцев 10 партий подлинных образцов Chuanmutong и контрольным характерным отпечатком пальца было очень высоким. Для сравнения, сходство между отпечатками пальцев пяти партий фальсификаторов и контрольным характерным отпечатком пальца было значительно ниже, чем у подлинных образцов. Ca, PCA и OPLS-DA были затем введены для анализа общей пиковой информации химических отпечатков пальцев. Результаты CA и PCA показывают, что обычно используемый фальсифицированный CC среди различных фальсификаторов относительно ближе к аутентичному, который трудно различить. Однако, когда классификационное расстояние СА изменяется до четырех, может быть достигнута эффективная идентификация между аутентичным и фальсифицированным. На основе 12 общих пиков аутентичных материалов значения вклада дифференциальных пиков фальсификаторов были количественно оценены OPLS-DA и получены семь дифференциальных хроматографических пиков, а именно пик No 9, пик No 5, пик No 7, пик No 6, пик No 10, пик No 3 и пик No 2. Они могут быть использованы для эффективной идентификации аутентичных и поддельных материалов Chuanmutong, которые являются основными маркированными компонентами различия между аутентичным и фальсифицированным.
Последняя редакция Китайской фармакопеи еще не включила определение содержания эффективных компонентов Чуаньмутонга. Чтобы улучшить контроль качества, в этом исследовании были исследованы методы определения содержания активных компонентов, таких как β-ситостерин, эргостерин, ситостерин и олеаноловая кислота, связанные с мочегонным действием в предыдущих отчетах 22,23,24,25,26. Как показано на дополнительном рисунке 2, эргостерин не был обнаружен в подлинном Чуаньмутонге, а стигмастерин было трудно отделить в хроматограмме и не мог быть точно количественно определен. Наконец, был установлен метод определения содержания β-ситостерина; результаты обнаружения показали, что β-ситостерин был обнаружен в 10 партиях подлинных образцов Chuanmutong и пяти партиях фальсификатов. Поэтому β-ситостерин не был уникальным для подлинных лекарственных материалов. Хотя некоторая информация о качестве Chuanmutong может быть предоставлена, все же необходимо дополнительно проанализировать дифференциальные хроматографические пики в отпечатках пальцев в будущем, чтобы увидеть, можно ли найти конкретные компоненты, связанные с эффективностью Chuanmutong.
В настоящее время традиционные китайские лекарства часто идентифицируются по сходству химического спектра отпечатков пальцев. Однако этот показатель является параметром, основанным на общей информации образца о хроматографических пиках, который не может предоставить больше информации об идентификации и основных различиях различных образцов. Поэтому это исследование в дальнейшем использовало CA, PCA и OPLS-DA для идентификации общей пиковой информации химических отпечатков пальцев, обнаружило основные дифференциальные хроматографические пики между подлинными и фальсифицированными образцами Chuanmutong и успешно идентифицировало их. Наконец, была построена химическая дактилоскопия, связанная с ВЭЖХ, для распознавания нескольких образов.
Поскольку нередко смешиваются аутентичные китайские лекарственные материалы и их фальсификаторы, такие как Fritillaria thunbergii, Herba Asari и Lonicera japonica, этот метод обеспечит новую стратегию для четкой и научной идентификации аутентичных китайских лекарственных материалов и их фальсификаторов. Эта стратегия будет иметь большое значение для обеспечения качества китайских лекарственных материалов в клиническом применении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Проектом Администрации традиционной китайской медицины провинции Сычуань (No 2020JC0088, No 2021MS203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017381038 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD5243V | |
| β-Sitosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| C18 column | Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China | Welch Ultimate LP | |
| Chuanmutong | Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 19020103 | CMT-1 |
| Chuanmutong | Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-2 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-3 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-4 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210701 | CMT-5 |
| Chuanmutong | Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210401 | CMT-6 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-7 |
| Chuanmutong | Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China | 201201 | CMT-8 |
| Chuanmutong | Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 201001 | CMT-9 |
| Chuanmutong | Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210501 | CMT-10 |
| Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang | Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China | - | CC |
| Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. | Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China | - | DC |
| Clematis peterae Hand.-Mazz. | Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China | - | DE |
| Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils | Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | XS |
| Clematis finetiana Levl. et Vaniot. | Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | SMT |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Ergosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China | 20210201 | |
| Ethanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2021112602 | |
| Ethyl acetate | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017042043 | |
| Formic acid | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2016062901 | |
| High performance liquid chromatography | Agilent, USA. | 1260 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD6409V | |
| Methanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 202010302 | |
| n-butyl alcohol | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020071047 | |
| Petroleum ether | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020090125 | |
| Phosphoric acid | Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 20200110 | |
| SESCF-TCM version 2012 | National Pharmacopoeia Commission, China | - | http://114.247.108.158:8888/login |
| Stigmasterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China | 20200214 | |
| Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 | Umetrics, Sweden | - | https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download |
| Ultrapure water machine | Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China | UPH-II-10T | |
| Ultrasonic cleaner | Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China | KH3200E |
References
- Chen, C. R. Chinese Medicine Specimen Picture Book. , Shanghai World Book Company. Shanghai. 116 (1935).
- Xiong, J., et al. Lignans from the stems of Clematis armandii ("Chuan-Mu-Tong") and their anti-neuroinflammatory activities. Journal of Ethnopharmacology. 153 (3), 737-743 (2014).
- Pan, L. L., et al. a lignan from the Chinese medicinal plant Clematis armandii, inhibits A431 cell growth via blocking p70S6/S6 kinase pathway. Integrative Cancer Therapies. 16 (3), 351-359 (2017).
- Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of The People's Republic of China: (Edition 2020). , The Medicine Science and Technology Press of China. China., Beijing. 38 (2020).
- Wang, D. G., Guo, J. L. Textual research on the materia medica and authenticity of Clematidis armandii. Lishizhen Medicine and Materia Medicine Research. 18 (11), 2696 (2007).
- Fang, Q. M., Zhang, M., Zhong, Y. Y. The natural resources and exploitation of Caulis Clematidis Armandii in Sichuan. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 20 (5), 404-406 (2005).
- Bai, M. N., Dai, Y. X., Wang, Y., Ren, Y. Y., Tan, R. Study on the identification of Caulis Clematidis Armandii. Research and Practice on Chinese Medicines. 31 (3), 13-16 (2017).
- Zhou, P. J., Li, X. F., Fu, D. H., Pu, X. Y., Zhu, G. Q. Pharmacognosy identification of Ethnomedicine Clematis ranunculoides Franchet. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. 34 (3), 432-436 (2017).
- Guo, J. L., Tang, Y., Pei, J., Wang, D. G. Study on random amplified polymorphic DNA and sequence characterized amplified regions of Caulis Clematidis Armandii. Journal of Chengdu Medical College. 6 (4), 283-286 (2011).
- Liu, M. Z., Li, M. N., Yao, H., Liu, P. Molecular identification of Clematidis Armandii Caulis and its adulterants and closely related species by ITS2 sequence. Global Traditional Chinese Medicine. 4 (6), 446-450 (2011).
- Liu, J. J., Chen, X., Wei, Z. Q., Li, B. Chemical constituents and identification of the caules of Clematis armandii Franch.and Clematis montana Buch.-Ham. Natural Product Research and Development. 22 (6), 998-1000 (2010).
- Yang, T. R., Xu, Z., Shi, Y. N. Studies on four compounds from Clematis Montana. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 10 (4), 142-143 (2008).
- Yan, L. H., Xu, L. Z., Zhou, Z. M., Yang, S. L. Chemical constituents from stems of Clematis armandii(I). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 38 (3), 340-342 (2007).
- Li, X., et al. Traditional uses, phytochemistry, pharmacology, and toxicology of Akebiae Caulis and its synonyms: A review. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114245 (2021).
- Ye, X., et al. Diuretic effect and material basis of Clematidis Armandii Caulis in rats. China Journal of Chinese Materia Medica. 44 (9), 1889-1894 (2019).
- Kuang, Y., et al. Consistency study of Caulis Clematidis Armandii and its traditionally used products and counterfeit species based on efficacy and pharmacognosy. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 36 (3), 115-121 (2020).
- Li, Y., et al. Quality assessment of Asarum heterotropoides var. mandshuricum based on HPLC multi-component determination and multiple pattern recognition method of fingerprint. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 238-243 (2022).
- Li, Y., et al. Determination of multi-components of Paeoniae Alba Radix based on fingerprints and chemical pattern recognition. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 231-237 (2022).
- Li, H. H., et al. Comparative investigation for raw and processed products of Euodiae Fructus based on high-performance liquid chromatography fingerprints and chemical pattern recognition. Chemistry & Biodiversity. 18 (8), 2100281 (2021).
- Dong, L. J., et al. Study on suitable distribution areas of Kawa Kimichi produced in Sichuan province-based on remote sensing and GIS-A case study of Clematis Armandii. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 17 (11), 2398-2404 (2015).
- Tang, S. W., Pei, J., Li, F. Y. Morphological and histological identification of Chuanmutong. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 15 (1), 19-21 (2000).
- Li, B., Chen, X., Fang, Q. M., Zhang, B. J., Wei, Z. Q. Quality Research of Chuanmutong. Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine. 27 (6), 58-60 (2009).
- Wu, W. J., Wan, M. M., Cao, Y. H., Tan, R., Song, L. K. Research on the Quality Standard of Chuanmutong. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 33 (2), 313-315 (2015).
- Wei, Z. Q., Chen, X., Li, B., Dong, X. P. Determination of stigmasterol in Clematis armandii Franch and Clematis montana Buch-Ham. by HPLC. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 20 (3), 574-575 (2009).
- Qing, L. S., et al. Determination of oleanolic acid in Caulis clematidis armandii by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (3), 273-274 (2006).
- Yang, S. D., Wang, R., Fu, D. Y., Guo, J. J., Tan, W. Y. Determination on oleanolic acid in caulis clematidis armandii by microwave assisted extraction-HPLC/MS. Anhui Academy of Agricultural Sciences. 38 (13), 6929-6931 (2010).
