Summary

CLHP couplée à une empreinte chimique pour la reconnaissance multi-motifs afin d’identifier l’authenticité de Clematidis armandii caulis

Published: November 11, 2022
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Summary

Nous présentons ici un protocole pour établir la chromatographie liquide à haute performance (HPLC), couplée à la reconnaissance multi-motifs d’empreintes chimiques par empreintes digitales, qui fournit une nouvelle stratégie pour identifier efficacement les variétés authentiques de Clematidis Armandii Caulis et de ses adultérants.

Abstract

Une méthode d’identification des matériaux médicinaux chinois et de leurs adultérants apparentés a été construite en prenant Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, une médecine traditionnelle chinoise universellement utilisée) comme exemple. Dix lots de variétés authentiques de Chuanmutong et cinq lots d’adultérants apparentés ont été analysés et comparés sur la base des empreintes digitales par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) combinées à la chimiométrie, y compris l’analyse en grappes (AC), l’analyse en composantes principales (ACP) et l’analyse orthogonale partielle des moindres carrés (OPLS-DA). En outre, la teneur en β-sitostérol a été déterminée. L’empreinte chimique de contrôle de Chuanmutong a été établie et 12 pics communs ont été identifiés. La similitude entre l’empreinte digitale de 10 lots de variétés authentiques de Chuanmutong et l’empreinte digitale de contrôle était de 0,910-0,989, tandis que la similitude de cinq lots d’adultérants n’était que de 0,133-0,720. Sur la base des pics communs dans le chromatogramme, 15 lots d’échantillons ont été classés en trois niveaux de teneur par PCA, et ont été agrégés en quatre catégories par CA, obtenant une distinction claire entre le Chuanmutong authentique et les adultérants de Chuanmutong. En outre, sept composants différentiels capables d’identifier efficacement les Chuanmutong authentiques et les adultérants de Chuanmutong ont été trouvés grâce à OPLS-DA. La teneur en β-sitostérol de 10 lots de variétés authentiques de Chuanmutong était de 97,53-161,56 μg/g, tandis que la teneur en β-sitostérol des cinq lots d’adultérants variait considérablement, parmi lesquels la teneur en β-sitostérol de Clematis peterae Hand.-Mazz. et Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils. était significativement inférieur à celui des variétés authentiques de Chuanmutong. La méthode de reconnaissance multimodèle par composants de l’indice HPLC et la méthode de reconnaissance multi-formes par empreintes chimiques établies dans cette étude fournissent une nouvelle stratégie pour identifier efficacement les matériaux médicinaux chinois authentiques et les adultérants associés.

Introduction

Chuanmutong, Caulis sec de Clematis armandii Franch. ou Clematis montana Buch.-Ham., est une médecine traditionnelle chinoise couramment utilisée dans les cliniques 1,2,3. Il est utilisé pour traiter les problèmes urinaires, l’œdème, les plaies sur la langue et la bouche, la diminution de la sécrétion de lait, la raideur articulaire et les douleurs musculaires causées par la chaleur humide4. Le Chuanmutong a toujours été obtenu à partir de variétés sauvages, principalement distribuées dans le sud-ouest de la Chine, en particulier dans le Sichuan, où la meilleure qualité peut être trouvée 5,6. Il est difficile de faire la distinction entre les variétés authentiques et leurs adultérants étroitement apparentés en raison de leurs caractéristiques similaires 7,8,9,10. La norme de qualité de Chuanmutong dans l’édition 2020 de la pharmacopée chinoise ne stipule que les propriétés, l’identification microscopique et l’identification sur couche mince sans détermination du contenu, qui ne peuvent pas identifier efficacement les adultérants et présentent donc des risques potentiels. De plus, il existe peu de rapports comparant et identifiant Chuanmutong et les plantes apparentées. Par conséquent, une méthode de contrôle de la qualité pour assurer l’authenticité de Chuanmutong mérite une étude plus approfondie.

Les constituants chimiques de Chuanmutong sont principalement composés de triterpénoïdes pentacycliques de type oléanane et de leurs glycosides, flavonoïdes et acides organiques11,12,13,14. Parmi eux, l’acide oléanolique, le β-sitostérol, le stigmastérol et l’ergostérol ont des effets diurétiques d’intensités différentes, qui peuvent être des substances pharmacodynamiques potentielles pour favoriser la diurèse et soulager la strangurie15,16. Les empreintes chimiques sont obtenues en séparant et en détectant de nombreux composants chimiques contenus dans les échantillons par chromatographie liquide à haute performance (CLHP), chromatographie en phase gazeuse (CG), etc. L’adoption de méthodes d’analyse statistique appropriées pour analyser les caractéristiques de Chuanmutong peut déterminer le contrôle de qualité global et l’identification scientifique de la médecine traditionnelle chinoise17,18,19.

Dans cette étude, 10 lots de variétés authentiques Chuanmutong et cinq lots d’adultérants ont été collectés. Leur qualité a été comparée et analysée par la méthode d’empreintes digitales HPLC combinée à la reconnaissance multi-formes, y compris l’analyse en grappes (AC), l’analyse en composantes principales (ACP), l’analyse orthogonale partielle des moindres carrés (OPLS-CA) et la détermination du contenu de la composante pharmacodynamique. Ce protocole établit une méthode d’identification des variétés authentiques à haute spécificité, une nouvelle stratégie pour l’identification scientifique des variétés authentiques et des adultérants des matières médicinales chinoises.

Protocol

1. Méthodes de détection chimique des empreintes digitales Conditions chromatographiquesPréparer la phase mobile acétonitrile (A)/eau (B). Définissez un programme de gradient comme suit dans le logiciel HPLC : 0-20 min, 3%A-10%A ; 20-25 min, 10%A-13%A; 25-65 min, 13%A-25%A; 65-75 min, 25%A-40%A; 75-76 min, 40%A-3%A; 76-85 min, 3%A-3%A. Maintenir le débit de la phase mobile à 1,0 mL/min. Effectuer la séparation chromatographique sur une colonne C18 (250 mm x…

Representative Results

Empreinte chromatographique de Chuanmutong et analyse de similarité (SA)Les valeurs RSD du temps de rétention relatif de précision, de répétabilité et de stabilité étaient inférieures à 0,46 %, 1,65 % et 0,53 %, respectivement; les valeurs RSD de la zone de pointe relative étaient inférieures à 4,23%, 3,56% et 3,96%, respectivement. Comme le montrent les figures 1A, B, il y avait 12 pics communs distincts (du pic 1 au pic 12) dans les empreintes HPLC dans <strong class="…

Discussion

La collecte d’échantillons pour la recherche est la première étape clé de la construction de la reconnaissance multi-motifs dans l’identification de l’authenticité des matériaux médicinaux chinois. Grâce à des études de marché, nous avons constaté que Sichuan Ya’an, Liangshan et Leshan sont les principales zones de production des ressources sauvages de Chuanmutong. Les variétés apparentées d’un même genre ont également la même répartition géographique 6,20<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le projet de l’Administration de la médecine traditionnelle chinoise du Sichuan (n° 2020JC0088, n° 2021MS203).

Materials

Acetic acid Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2017381038
Acetonitrile Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, China WXBD5243V
β-Sitosterol Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China 20210201
 C18 column Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China Welch Ultimate LP
Chuanmutong Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China  19020103 CMT-1
Chuanmutong Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200701 CMT-2
Chuanmutong Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200701 CMT-3
Chuanmutong Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200901 CMT-4
Chuanmutong Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  210701 CMT-5
Chuanmutong Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  210401 CMT-6
Chuanmutong Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200901 CMT-7
Chuanmutong Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China  201201 CMT-8
Chuanmutong Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China  201001 CMT-9
Chuanmutong Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China 210501 CMT-10
Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China  CC
Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China  DC
Clematis peterae Hand.-Mazz. Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China  DE
Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China  XS
Clematis finetiana Levl. et Vaniot. Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China  SMT
Electronic balance Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai,  China  FA1204
Ergosterol Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China 20210201
Ethanol Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 2021112602
Ethyl acetate Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2017042043
Formic acid Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 2016062901
High performance liquid chromatography Agilent, USA. 1260
IBM SPSS Statistics version 26.0 International Business Machines Corporation, USA
Methanol Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, China WXBD6409V
Methanol Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 202010302
n-butyl alcohol Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2020071047
Petroleum ether Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2020090125
Phosphoric acid Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 20200110
SESCF-TCM version 2012 National Pharmacopoeia Commission, China http://114.247.108.158:8888/login
Stigmasterol Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China 20210201
Trichloromethane Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China 20200214
Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 Umetrics, Sweden https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download
Ultrapure water machine Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China UPH-II-10T
Ultrasonic cleaner Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China KH3200E

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Wang, F., Qian, Z., Liao, G., Zeng, J., Huang, D., Liu, Q., Xie, X. HPLC Coupled with Chemical Fingerprinting for Multi-Pattern Recognition for Identifying the Authenticity of Clematidis Armandii Caulis. J. Vis. Exp. (189), e64690, doi:10.3791/64690 (2022).

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