Summary
Nous présentons ici un protocole pour établir la chromatographie liquide à haute performance (HPLC), couplée à la reconnaissance multi-motifs d’empreintes chimiques par empreintes digitales, qui fournit une nouvelle stratégie pour identifier efficacement les variétés authentiques de Clematidis Armandii Caulis et de ses adultérants.
Abstract
Une méthode d’identification des matériaux médicinaux chinois et de leurs adultérants apparentés a été construite en prenant Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, une médecine traditionnelle chinoise universellement utilisée) comme exemple. Dix lots de variétés authentiques de Chuanmutong et cinq lots d’adultérants apparentés ont été analysés et comparés sur la base des empreintes digitales par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) combinées à la chimiométrie, y compris l’analyse en grappes (AC), l’analyse en composantes principales (ACP) et l’analyse orthogonale partielle des moindres carrés (OPLS-DA). En outre, la teneur en β-sitostérol a été déterminée. L’empreinte chimique de contrôle de Chuanmutong a été établie et 12 pics communs ont été identifiés. La similitude entre l’empreinte digitale de 10 lots de variétés authentiques de Chuanmutong et l’empreinte digitale de contrôle était de 0,910-0,989, tandis que la similitude de cinq lots d’adultérants n’était que de 0,133-0,720. Sur la base des pics communs dans le chromatogramme, 15 lots d’échantillons ont été classés en trois niveaux de teneur par PCA, et ont été agrégés en quatre catégories par CA, obtenant une distinction claire entre le Chuanmutong authentique et les adultérants de Chuanmutong. En outre, sept composants différentiels capables d’identifier efficacement les Chuanmutong authentiques et les adultérants de Chuanmutong ont été trouvés grâce à OPLS-DA. La teneur en β-sitostérol de 10 lots de variétés authentiques de Chuanmutong était de 97,53-161,56 μg/g, tandis que la teneur en β-sitostérol des cinq lots d’adultérants variait considérablement, parmi lesquels la teneur en β-sitostérol de Clematis peterae Hand.-Mazz. et Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils. était significativement inférieur à celui des variétés authentiques de Chuanmutong. La méthode de reconnaissance multimodèle par composants de l’indice HPLC et la méthode de reconnaissance multi-formes par empreintes chimiques établies dans cette étude fournissent une nouvelle stratégie pour identifier efficacement les matériaux médicinaux chinois authentiques et les adultérants associés.
Introduction
Chuanmutong, Caulis sec de Clematis armandii Franch. ou Clematis montana Buch.-Ham., est une médecine traditionnelle chinoise couramment utilisée dans les cliniques 1,2,3. Il est utilisé pour traiter les problèmes urinaires, l’œdème, les plaies sur la langue et la bouche, la diminution de la sécrétion de lait, la raideur articulaire et les douleurs musculaires causées par la chaleur humide4. Le Chuanmutong a toujours été obtenu à partir de variétés sauvages, principalement distribuées dans le sud-ouest de la Chine, en particulier dans le Sichuan, où la meilleure qualité peut être trouvée 5,6. Il est difficile de faire la distinction entre les variétés authentiques et leurs adultérants étroitement apparentés en raison de leurs caractéristiques similaires 7,8,9,10. La norme de qualité de Chuanmutong dans l’édition 2020 de la pharmacopée chinoise ne stipule que les propriétés, l’identification microscopique et l’identification sur couche mince sans détermination du contenu, qui ne peuvent pas identifier efficacement les adultérants et présentent donc des risques potentiels. De plus, il existe peu de rapports comparant et identifiant Chuanmutong et les plantes apparentées. Par conséquent, une méthode de contrôle de la qualité pour assurer l’authenticité de Chuanmutong mérite une étude plus approfondie.
Les constituants chimiques de Chuanmutong sont principalement composés de triterpénoïdes pentacycliques de type oléanane et de leurs glycosides, flavonoïdes et acides organiques11,12,13,14. Parmi eux, l’acide oléanolique, le β-sitostérol, le stigmastérol et l’ergostérol ont des effets diurétiques d’intensités différentes, qui peuvent être des substances pharmacodynamiques potentielles pour favoriser la diurèse et soulager la strangurie15,16. Les empreintes chimiques sont obtenues en séparant et en détectant de nombreux composants chimiques contenus dans les échantillons par chromatographie liquide à haute performance (CLHP), chromatographie en phase gazeuse (CG), etc. L’adoption de méthodes d’analyse statistique appropriées pour analyser les caractéristiques de Chuanmutong peut déterminer le contrôle de qualité global et l’identification scientifique de la médecine traditionnelle chinoise17,18,19.
Dans cette étude, 10 lots de variétés authentiques Chuanmutong et cinq lots d’adultérants ont été collectés. Leur qualité a été comparée et analysée par la méthode d’empreintes digitales HPLC combinée à la reconnaissance multi-formes, y compris l’analyse en grappes (AC), l’analyse en composantes principales (ACP), l’analyse orthogonale partielle des moindres carrés (OPLS-CA) et la détermination du contenu de la composante pharmacodynamique. Ce protocole établit une méthode d’identification des variétés authentiques à haute spécificité, une nouvelle stratégie pour l’identification scientifique des variétés authentiques et des adultérants des matières médicinales chinoises.
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Protocol
1. Méthodes de détection chimique des empreintes digitales
- Conditions chromatographiques
- Préparer la phase mobile acétonitrile (A)/eau (B). Définissez un programme de gradient comme suit dans le logiciel HPLC : 0-20 min, 3%A-10%A ; 20-25 min, 10%A-13%A; 25-65 min, 13%A-25%A; 65-75 min, 25%A-40%A; 75-76 min, 40%A-3%A; 76-85 min, 3%A-3%A.
- Maintenir le débit de la phase mobile à 1,0 mL/min.
- Effectuer la séparation chromatographique sur une colonne C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) maintenue à 30 °C.
- Réglez le volume d’injection sur 10 μL.
- Détecter les échantillons à une longueur d’onde de 205 nm.
REMARQUE: Pour les réglages spécifiques des conditions chromatographiques, reportez-vous aux modes opératoires du logiciel de travail de chromatographie liquide haute performance (Table des matériaux).
- Préparation de la solution échantillon
- Broyer les matières premières jusqu’à ce qu’elles atteignent une taille de particules uniforme en les faisant passer à travers un treillis en nylon d’un diamètre intérieur de 850 μm ± 29 μm.
- Placer 2 g de matière première broyée (pesée avec précision) dans une fiole conique de 50 ml munie d’un bouchon et ajouter 50 ml de méthanol. Placer le bouchon sur la fiole et ultrasons (600 W, 40 kHz) pendant 30 min.
- Ensuite, refroidir le ballon à température ambiante (RT). Pesez à nouveau les échantillons et rattrapez le poids initial en remplaçant l’extractant perdu.
- Verser 4 mL de la solution de méthanol contenant les extraits médicinaux dans une fiole jaugée de 10 mL. Ajouter 6 mL deH2O, mélanger et laisser reposer pendant 10 min.
- Enfin, filtrez le surnageant à travers une membrane filtrante de 0,45 μm et placez-le en veille.
- Validation des méthodes de détection des empreintes digitales
- Préparer l’échantillon comme décrit ci-dessus (étape 1.2) et le soumettre à une analyse CLHP (étape 1.1) six fois par jour. Pour évaluer la précision, calculez l’écart type relatif (DSR) du temps de rétention relatif et des zones de pics relatives comme décrit à l’étape 1.3.5.
- Évaluer la stabilité de la solution échantillon en analysant la même solution échantillon stockée à TA pendant 0, 2, 4, 6, 8, 12 et 24 h, et calculer la DSR du temps de rétention relatif et des zones de pics relatives comme décrit à l’étape 1.3.5.
- Prélever six répétitions du même échantillon (CMT-4), préparer la solution échantillon selon la procédure ci-dessus (étape 1.2) et détecter son empreinte dans la CLHP suivant l’étape 1.1. Calculer la DSR du temps de rétention relatif et des zones de pic relatives, et évaluer sa répétabilité comme décrit à l’étape 1.3.5.
- Utilisez ensuite le pic numéro 10 de la figure 1B comme pic de référence et calculez le DSR du temps de rétention relatif et de la surface relative des pics de chaque pic commun, comme décrit à l’étape 1.3.5.
- Utilisez les formules mentionnées ci-dessous pour calculer le temps de rétention relatif et la surface relative des pics de chaque pic commun :
T re = T caractéristique/Tréférence
Are = Une caractéristique/Uneréférence
Où T re = temps de rétention relatif, T caractéristique = temps de rétention du pic caractéristique, T référence = temps de rétention du pic de référence, A re = surface relative du pic, A caractéristique = surface du pic caractéristique et A référence = surface du pic de référence.
NOTE: L’établissement des empreintes digitales de la médecine traditionnelle chinoise nécessite généralement de sélectionner un pic chromatographique facile à obtenir et à haute résolution. Ceci est utilisé comme pic de référence pour identifier les empreintes digitales et examiner leur stabilité et leur reproductibilité.
2. Mise en place de l’analyse des empreintes digitales et de la similitude de Chuanmutong
- Utilisez 10 lots d’échantillons authentiques et cinq lots d’adultérants tels que Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang (CC), Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. (DC), Clematis peterae Hand.-Mazz. (DE), Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils (XS), et Clematis finetiana Levl. et Vaniot. (SMT) comme échantillons pour l’analyse des empreintes digitales.
- Préparez les exemples de solutions comme décrit à l’étape 1.2. Effectuer l’analyse des empreintes digitales de toutes les solutions d’échantillons par CLHP dans les conditions décrites à l’étape 1.1.
- Importer les données pertinentes dans le système d’évaluation de la similarité des empreintes chromatographiques de la médecine traditionnelle chinoise (SESCF-TCM, version 2012). Le système désignera les pics avec une hauteur raisonnable et une bonne résolution dans les chromatogrammes de tous les échantillons comme pics communs.
REMARQUE: Le logiciel SESCF-TCM peut être téléchargé après enregistrement sur le site Web de la Commission chinoise de pharmacopée (http://114.247.108.158:8888/login).- Dans le logiciel, cliquez sur le bouton Définir le spectre de référence dans le menu.
- Ensuite, dans la fenêtre Paramètres des paramètres , définissez la largeur de la fenêtre temporelle sur 0,5 et sélectionnez Méthode de génération du spectre de contrôle comme méthode médiane.
- Cliquez sur Étalonnage multipoint dans le menu principal, puis sélectionnez Correspondance des pics comme Correspondance des pics à spectre complet.
- Enfin, cliquez sur Générer le contrôle pour générer l’empreinte chromatographique de référence de l’espèce authentique de Chuanmutong.
- Importer le temps de rétention et la zone de pic de 10 lots d’échantillons authentiques de Chuanmutong et de cinq lots d’adultérants dans SESCF-TCM pour analyse. Les opérations spécifiques sont les suivantes :
- Dans le logiciel, cliquez sur le bouton Définir le spectre de référence dans le menu principal.
- Dans la fenêtre Paramètres des paramètres , définissez l’empreinte chromatographique de référence de l’espèce authentique de Chuanmutong comme référence, sélectionnez la méthode de génération du spectre de contrôle comme méthode médiane et définissez la largeur de la fenêtre temporelle sur 0,5.
- Cliquez sur Étalonnage multipoint dans le menu principal, puis sélectionnez Correspondance des pics comme Correspondance des pics à spectre complet.
- Enfin, cliquez sur Calculer la similarité pour calculer la similarité en fonction des empreintes digitales chromatogramme de référence de Chuanmutong. Enfin, calculez la similitude des empreintes digitales à l’aide du système d’évaluation chromatographique des empreintes digitales de la médecine chinoise (version 2012).
REMARQUE : Pour les opérations spécifiques, reportez-vous aux spécifications d’exploitation du système d’évaluation des empreintes digitales chromatographiques de la médecine chinoise (version 2012).
3. Analyse de reconnaissance multi-formes de l’empreinte digitale Chuanmutong
- Analyse par grappes (AC)
- Utilisez les zones de pics de 12 pics communs dans les empreintes digitales de 10 lots d’échantillons authentiques de Chuanmutong et de leurs cinq lots d’adultérants comme variables, et saisissez-les dans un logiciel d’analyse statistique pour une analyse systématique en grappes (AC).
- Choisissez la méthode entre les groupes et utilisez le coefficient de corrélation de Pearson comme base de classification pour dessiner un diagramme d’analyse en grappes de Chuanmutong et de ses adultérants. Les opérations spécifiques sont les suivantes :
- Dans le logiciel d’analyse statistique, cliquez sur Fichier pour importer des données.
- Cliquez sur Analyse dans le menu, puis sur Regroupement de systèmes dans Classification.
- Sélectionnez la zone de pic commune comme variable et définissez le nombre de clusters sur quatre.
- Cliquez sur Méthode, sélectionnez la méthode de clustering comme Connexion inter-groupes, sélectionnez l’intervalle de mesure comme Corrélation de Pearson, puis cliquez sur OK pour dessiner la carte de l’autorité de certification.
- Analyse en composantes principales (ACP)
- Importez la surface de pic commune relative des variétés authentiques et de leurs adultérants dans le logiciel d’analyse pour l’analyse PCA, et utilisez la carte de score PCA pour évaluer la carte matricielle de score des différences d’échantillon. Les opérations spécifiques sont les suivantes :
- Ouvrez le logiciel d’analyse de données, cliquez sur Fichier dans le menu et créez un nouveau projet régulier. Importez la zone des pics de 12 pics communs dans une feuille de calcul (par exemple, format Excel) à partir du système HPLC. Cliquez ensuite sur Terminer pour terminer l’importation des données.
- Cliquez sur Nouveau pour créer un nouveau modèle afin de définir le type de modèle avec PCA. Cliquez sur Autofit et Add pour ajuster les données, puis cliquez sur Scores pour obtenir la carte des scores PCA.
- Importez la surface de pic commune relative des variétés authentiques et de leurs adultérants dans le logiciel d’analyse pour l’analyse PCA, et utilisez la carte de score PCA pour évaluer la carte matricielle de score des différences d’échantillon. Les opérations spécifiques sont les suivantes :
- Analyse orthogonale partielle des moindres carrés (OPLS-DA)
- Utilisez la méthode d’analyse de discrimination des moindres carrés partiels orthogonaux avec mode supervision pour analyser plus en détail les pics de surface de pics communs relatifs des variétés authentiques de Chuanmutong et des adultérants et dessiner une carte de score de classification OPLS-DA de tous les échantillons. Les opérations spécifiques sont les suivantes :
- Dans un logiciel d’analyse de données, cliquez sur Fichier dans le menu pour importer un fichier et créer un nouveau projet régulier. Importez la zone de pics de 12 pics communs dans une feuille de calcul à partir du système HPLC, puis cliquez sur Terminer pour terminer l’importation des données.
- Cliquez sur Nouveau pour créer un nouveau modèle afin de définir le type de modèle avec PCA. Cliquez sur Autofit et Add pour ajuster les données. Cliquez ensuite sur Scores pour obtenir la carte des scores PCA.
- Cliquez sur Nouveau et choisissez Nouveau comme modèle un pour définir le type de modèle avec OPLS-DA.
- Cliquez sur Échelle et définissez le type avec Par pour tous. Cliquez d’abord sur Ajustement automatique , puis sur Scores pour obtenir la carte des scores OPLS-DA.
- Afin de déterminer l’influence de chaque pic commun à Chuanmutong sur ses résultats de classification et la différence entre les matériaux authentiques de Chuanmutong et les adultérants apparentés, utilisez l’importance variable dans la projection (VIP) pour l’analyse.
- Dessinez la carte VIP des différentes composantes de Chuanmutong. Utilisez la carte du PAAC qui en résulte pour évaluer l’incidence de chaque variable sur la classification et pour éliminer les composantes qui contribuent de façon significative aux différences entre les groupes. Les opérations spécifiques sont les suivantes :
- Dans le logiciel d’analyse de données, cliquez sur Analyse dans le menu et cliquez sur Permutations, définissez le nombre de permutations sur 200 et obtenez les R 2 et Q2 de la carte de score OPLS-DA.
- Cliquez sur VIP et choisissez VIP Predictive pour obtenir la carte VIP.
- Utilisez la méthode d’analyse de discrimination des moindres carrés partiels orthogonaux avec mode supervision pour analyser plus en détail les pics de surface de pics communs relatifs des variétés authentiques de Chuanmutong et des adultérants et dessiner une carte de score de classification OPLS-DA de tous les échantillons. Les opérations spécifiques sont les suivantes :
4. Dosage du β-sitostérol à Chuanmutong par CLHP
- Conditions chromatographiques (voir étape 1.1)
- Préparer la phase mobile : méthanol-eau (97:3).
- Réglez le débit de la phase mobile à 1,0 mL/min.
- Effectuer la séparation chromatographique sur une colonne C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) maintenue à 30 °C.
- Réglez le volume d’injection sur 10 μL.
- Détecter le composant à une longueur d’onde de 204 nm.
- Préparation de la solution échantillon
- Préparer la solution mère étalon de β-sitostérol (0,1 mg/mL) en dissolvant dans du méthanol une quantité pesée avec précision de l’étalon de référence correspondant.
- Broyer l’échantillon d’analyse de la matière première jusqu’à ce qu’il atteigne une taille de particules uniforme en faisant passer l’échantillon à travers le treillis en nylon d’un diamètre intérieur de 180 μm ± 7,6 μm.
- Placer 2 g de matière première broyée (pesée avec précision) dans une fiole à fond rond et y ajouter 50 ml de chloroforme.
- Connecter la fiole à un réfrigérant à reflux et la chauffer au bain-marie bouillant (ébullition modérée) pendant 60 min. Filtrer la solution d’extraction avec un papier filtre de 15-20 μm.
- Évaporer le filtrat jusqu’à quasi-sécheresse au bain-marie bouillant (ébullition modérée) pendant environ 10 min.
- Dissoudre le résidu et porter le volume à 5 mL avec du méthanol. Enfin, passez le surnageant à travers une membrane filtrante de 0,45 μm et placez-le en veille.
- Validation de la méthode
- Prélever la solution mère de β-sitostérol préparée à l’étape 4.2.1, la diluer avec du méthanol à 100 % et préparer des solutions à 100 μg/mL, 80 μg/mL, 60 μg/mL, 50 μg/mL, 40 μg/mL, 30 μg/mL et 20 μg/mL.
- Injecter les échantillons dans les conditions chromatographiques décrites à l’étape 4.1 pour déterminer la surface du pic, effectuer une analyse de régression avec la surface du pic au volume d’injection et obtenir l’équation de régression et le coefficient de corrélation pour évaluer sa linéarité.
- Préparer les échantillons comme décrit ci-dessus (étape 4.2) et les soumettre à une analyse CLHP (étape 4.1) six fois le même jour. Calculez ensuite le RSD des zones de pic pour évaluer la précision.
- Évaluer la stabilité de la solution échantillon en analysant les mêmes solutions d’échantillon stockées à TA pendant 0, 2, 4, 6, 8, 12 et 24 h, comme décrit à l’étape 4.1. Calculez ensuite la DSR des zones de crête comme décrit à l’étape 1.3.5.
- Examiner la répétabilité en dissolvant le même échantillon (CMT-4) dans un sextuplicate, préparé comme décrit à l’étape 4.2, et en le soumettant à une analyse CLHP comme décrit à l’étape 4.1. Calculez ensuite la DSR de la teneur en β-sitostérol dans six échantillons.
- Évaluer la précision de la méthode en utilisant la méthode d’addition standard. Pour cela, ajoutez des solutions de référence de β-sitostérol aux échantillons à 80%, 100% et 120% de la teneur en β-sitostérol et répétez chaque condition trois fois comme décrit à l’étape 4.1. Évaluer la précision de la méthode en calculant la récupération moyenne et la DSR.
NOTE: La formule de calcul du taux de récupération (RR) est la suivante:
RR % = [(M t - M 0) / Ms] × 100
Où M t = la qualité du β-sitostérol après addition de l’étalon, M 0 = la qualité de la solution échantillon et Ms = la qualité du β-sitostérol ajouté.
- Détermination de la teneur en β-sitostérol des échantillons
- Prélever 10 lots de matières médicinales chinoises authentiques et cinq lots d’adultérants apparentés pour préparer des solutions d’échantillon conformément à l’étape 4.2.
- Injecter ensuite chaque solution échantillon et solution de référence de β-sitostérol pour déterminer la surface du pic dans les conditions décrites à l’étape 4.1, et calculer la teneur en β-sitostérol de chaque échantillon en utilisant la méthode étalon externe en un point.
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Representative Results
Empreinte chromatographique de Chuanmutong et analyse de similarité (SA)
Les valeurs RSD du temps de rétention relatif de précision, de répétabilité et de stabilité étaient inférieures à 0,46 %, 1,65 % et 0,53 %, respectivement; les valeurs RSD de la zone de pointe relative étaient inférieures à 4,23%, 3,56% et 3,96%, respectivement. Comme le montrent les figures 1A, B, il y avait 12 pics communs distincts (du pic 1 au pic 12) dans les empreintes HPLC dans les 10 échantillons authentiques de Chuanmutong. Comme la zone de pointe du n° 10 était relativement grande, la résolution était bonne; Comme il s’agissait d’un composant présent dans chaque échantillon, il a été utilisé comme pic de référence pour étudier la stabilité et la reproductibilité de l’empreinte digitale. Ensuite, le pic n ° 10 a été pris comme pic de référence (S), et le temps de rétention relatif des 11 pics restants a été calculé.
Dans l’analyse de similarité, plus le coefficient de corrélation est proche de 1, plus la similitude entre les échantillons est élevée. Comme le montre le tableau 1, les degrés de similitude de 10 lots de Chuanmutong étaient de 0,910 à 0,989. Ces résultats ont montré que les 10 lots de Chuanmutong présentaient une grande similitude et une bonne cohérence, ce qui peut être utilisé pour évaluer la qualité globale du Chuanmutong. Comme le montre la figure 1C, les empreintes digitales de cinq lots de ses adultérants ont été obtenues. La similitude entre les empreintes digitales de cinq lots d’adultérants et les empreintes digitales de contrôle de Chuanmutong n’était que de 0,133-0,720 (tableau 1), ce qui indique qu’il existe des différences évidentes entre les échantillons authentiques et les adultérants apparentés. Les différences étaient principalement concentrées dans les nombres de pics chromatographiques sur le chromatogramme à 28-55 min. Ainsi, les empreintes digitales de contrôle de Chuanmutong peuvent distinguer efficacement les échantillons authentiques des adultérants apparentés.
Le logiciel statistique SPSS 26 a été utilisé pour l’analyse de l’AC dans cette expérience (figure 2A); 15 lots d’échantillons ont été divisés en deux catégories lorsque la distance de classification était de 20. La première catégorie était de 10 lots de Chuanmutong et de ses adultérants habituels (CC). La deuxième catégorie était les adultérants de Chuanmutong, y compris DC, DE, XS et SMT. Lorsque la distance de classification était de quatre, tous les échantillons ont été divisés en quatre catégories. La première catégorie était composée de 10 lots de Chuanmutong, la deuxième catégorie était CC, la troisième catégorie était SMT et XS, et la quatrième catégorie était DC et DE. Les résultats de la classification ont montré que la qualité des variétés authentiques de Chuanmutong était fondamentalement la même, et il y avait des différences évidentes avec tous les adultérants. Dans le même temps, comparé à d’autres adultérants, CC était plus proche de la variété authentique de Chuanmutong, mais il peut encore être distingué lorsque la distance de classification est réduite.
Les zones de pic communes des 15 lots d’échantillons ont été importées dans un logiciel d’analyse de données pour l’analyse de l’ACP, et la matrice de score (R 2 x = 0,994, Q2 = 0,961) (Figure 2B) a montré que l’effet de regroupement des 15 lots d’échantillons était prononcé. Sur le côté droit de l’axe Y se trouvaient 10 lots de Chuanmutong et de CC. Parmi eux, CC était situé dans le premier quadrant, ce qui est différent des variétés authentiques de Chuanmutong. Le côté gauche de l’axe des Y était les adultérants, y compris SMT, XS, DE et DC. Parmi eux, SMT et XS étaient situés dans le deuxième quadrant, et DE et DC étaient situés dans le troisième quadrant. En comparant les variétés authentiques de Chuanmutong et les adultérants conventionnels, la différence entre les variétés CC et authentiques est relativement faible, tandis que la différence entre les adultérants authentiques et autres est évidente.
La zone de pic commune de Chuanmutong et de ses adultérants a été utilisée comme variable, importée dans le logiciel d’analyse de données pour OPLS-DA, puis la matrice de score a été dessinée (Figure 3A). La R 2 x [1] du modèle OPLS-DA était de 0,695 et la R 2 x [2] était de 0,605, les deux étant supérieures à 0,5, ce qui indique que le modèle est stable et fiable et peut être utilisé pour distinguer les échantillons authentiques des adultérants.
On peut voir sur la figure 3A que les points d’échantillonnage des adultérants authentiques et autres étaient complètement séparés, et qu’il n’y avait pas d’intersection entre les points d’échantillonnage. Tous les échantillons ont été divisés en trois parties. Les variétés authentiques de Chuanmutong et CC étaient similaires. Les échantillons de XS, DC et DE ont été regroupés en une seule classe, et l’échantillon de SMT était la dernière classe. De plus, la méthode de jugement d’importance variable dans la projection (VIP) (figure 3B) a été utilisée pour examiner les pics des différentes composantes dans l’empreinte digitale de chaque échantillon. Le > 1.0 du PAAC a été pris comme norme pour éliminer les variables seveb contribuant grandement à la classification entre les groupes de l’échantillon. Selon les résultats du dépistage, les principaux marqueurs qui ont causé la différence de composition entre les échantillons authentiques et les adultérants étaient les pics n ° 9, n ° 5, n ° 7, n ° 6, n ° 10, n ° 3 et n ° 2. La valeur VIP des pics restants était inférieure à 1, ce qui a eu peu d’effet sur la discrimination des échantillons.
La relation linéaire entre la zone du pic de β-sitostérol et sa concentration en solution a été trouvée à l’aide d’une analyse de régression. Cette dépendance obéit à une équation Y = 5,4918 X-4,5563, où Y est la surface pic du β-sitostérol et X est la teneur en β-sitostérol en μg/mL. Simultanément, le coefficient de corrélation r = 0,9995, qui répond aux exigences. Les DSR de l’essai de précision, de l’essai de stabilité et de l’essai de répétabilité étaient respectivement de 1,76 %, 4,22 % et 3,85 %. Les résultats montrent que la méthode de détermination de la teneur en β-sitostérol avait une bonne linéarité, précision et répétabilité, et que la solution échantillon était stable en 24 heures. Le pourcentage moyen de récupération à trois niveaux était de 101,50 %, 101,90 % et 100,72 %; la DSR correspondante était de 2,56 %, 1,56 % et 1,68 %, respectivement. De bons accords entre les valeurs déterminées théoriques et réelles ont confirmé l’exactitude et l’applicabilité de la méthode d’analyse. Le chromatogramme liquide du β-sitostérol est illustré à la figure 4, et la teneur en β-sitostérol de 15 lots d’échantillons a été déterminée (tableau 2). Les résultats ont montré que la concentration de β-sitostérol dans 10 lots d’échantillons authentiques était comprise entre 97,53 et 161,56 μg/g (relativement stable). Ce composant a été détecté dans les cinq lots d’adultérants, mais le contenu variait considérablement.
Figure 1 : Empreintes digitales de Chuanmutong et de leurs adultérants. (A) Empreintes digitales de 10 lots d’échantillons authentiques de Chuanmutong (S1: CMT-1, S2: CMT-2, S3: CMT-3, S4: CMT-4, S5: CMT-5, S6: CMT-6, S7: CMT-7, S8: CMT-8, S9: CMT-9, S10: CMT-10). B) Les empreintes digitales chromatographiques de référence d’échantillons authentiques de Chuanmutong; les temps de rétention relatifs étaient de 0,18 (pic n° 1), 0,22 (pic n° 2), 0,29 (pic n° 3), 0,72 (pic n° 4), 0,75 (pic n° 5), 0,82 (pic n° 6), 0,86 (pic n° 7), 0,92 (pic n° 8), 0,96 (pic n° 9), 1,00 (pic n° 10), 1,02 (pic n° 11), 1,37 (pic n° 12). (C) Empreintes digitales de cinq lots d’adultérants Chuanmutong (S1: CC, S2: DC, S3: DE, S4: XS, S5: SMT). D) Comparaison entre les empreintes digitales chromatographiques de référence d’échantillons authentiques de Chuanmutong et les cinq lots de leurs adultérants (S1: empreintes digitales du chromatogramme de référence, S2: CC, S3: DC, S4: DE, S5: XS, S6: SMT). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Analyse CA et PCA de 10 lots d’échantillons authentiques de Chuanmutong et de cinq lots d’adultérants. (A) Analyse CA. (B) Analyse de l’APC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Carte de score OPLS-DA et carte de score VIP de 10 lots d’échantillons authentiques de Chuanmutong et de cinq lots d’adultérants. (A) Carte de score OPLS-DA. (B) Carte des scores VIP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Chromatogramme liquide du β-sitostérol. S1: β-sitostérol, S2: CMT-4, S3: XS, S4: DC, S5: SMT, S6: CC, S7: DE. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Échantillons | Nom | Similitude |
| les variétés authentiques de Chuanmutong | CMT-1 | 0.947 |
| CMT-2 | 0.910 | |
| CMT-3 | 0.989 | |
| CMT-4 | 0.937 | |
| CMT-5 | 0.989 | |
| CMT-6 | 0.988 | |
| CMT-7 | 0.956 | |
| CMT-8 | 0.959 | |
| CMT-9 | 0.939 | |
| CMT-10 | 0.966 | |
| adultérants | CC | 0.599 |
| Courant continu | 0.720 | |
| DE | 0.133 | |
| XS | 0.694 | |
| Le | 0.180 |
Tableau 1 : Résultats de la similarité de 10 lots d’échantillons authentiques de Chuanmutong et de leurs adultérants. En important les données pertinentes dans le système d’évaluation chromatographique des empreintes digitales de la médecine chinoise, la similarité de 10 lots d’échantillons authentiques de Chuanmutong et de cinq lots d’adultérants a été calculée.
| Échantillons | Nom | Teneur (μg/g) |
| les variétés authentiques de Chuanmutong | CMT-1 | 103.5 |
| CMT-2 | 124.6 | |
| CMT-3 | 131 | |
| CMT-4 | 121.1 | |
| CMT-5 | 97.5 | |
| CMT-6 | 113.8 | |
| CMT-7 | 105.6 | |
| CMT-8 | 161.6 | |
| CMT-9 | 118 | |
| CMT-10 | 123.5 | |
| adultérants | CC | 157.4 |
| Courant continu | 165.6 | |
| DE | 32.9 | |
| XS | 69.7 | |
| Le | 192.2 |
Tableau 2: Résultats de la détermination de la teneur en β-sitostérol dans les échantillons authentiques de Chuanmutong et de leurs adultérants.
Figure supplémentaire 1 : Chromatographie liquide dans différentes conditions de préparation des échantillons et dans différentes conditions chromatographiques. (A) Les systèmes en phase mobile (S1 : solution d’acide formique à 0,1 %, S2 : solution d’acide acétonitrile à 0,5 %, S3 : eau pure acétonitrile, S4 : solution d’acide phosphorique à 0,05 %, S5 : eau pure au méthanol). (B) Les longueurs d’onde de détection (S1: 205 nm, S2: 230 nm, S3: 250 nm, S4: 300 nm). C) Les températures de la colonne (S1: 20 °C, S2: 30 °C, S3: 40 °C). (D) Les débits (S1 : 0,8 mL/min, S2 : 0,9 mL/min, S3 : 1,0 mL/min). E) Les méthodes d’extraction (S1: extraction par ultrasons, S2: extraction par reflux). (F) Les solvants d’extraction (S1 : acétate d’éthyle, S2 : éthanol, S3 : chloroforme, S4 : n-butanol, S5 : méthanol). (G) Le temps d’extraction (S1: 15 min, S2: 30 min, S3: 60 min). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Le chromatogramme liquide de l’ergostérol, du stigmastérol et du Chuanmutong authentique. S1 : stigmastérol, S2 : ergostérol, S3 : CMT-4. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La collecte d’échantillons pour la recherche est la première étape clé de la construction de la reconnaissance multi-motifs dans l’identification de l’authenticité des matériaux médicinaux chinois. Grâce à des études de marché, nous avons constaté que Sichuan Ya’an, Liangshan et Leshan sont les principales zones de production des ressources sauvages de Chuanmutong. Les variétés apparentées d’un même genre ont également la même répartition géographique 6,20 ; CC, DC, DE, XS et SMT sont souvent utilisés à mauvais escient comme Chuangmutong 16,21; par conséquent, dans cette étude, 10 lots de Chuanmutong authentique et cinq lots d’échantillons mélangés ont été collectés dans les lieux d’origine susmentionnés, et l’exactitude des variétés a été confirmée.
La deuxième étape clé consiste à examiner les conditions de détection de l’empreinte HPLC, qui peut afficher autant d’informations que possible sur les composants chimiques. Dans cette étude, comme le montre la figure supplémentaire 1, le nombre et la surface des pics chromatographiques ont été obtenus dans différentes conditions de préparation, y compris les méthodes d’extraction, les solvants d’extraction et le temps d’extraction. La méthode de préparation optimale de la solution d’échantillon de Chuanmutong a été déterminée. D’autre part, le nombre et la résolution des pics chromatographiques des échantillons dans différentes conditions chromatographiques ont été comparés. Les systèmes en phase mobile, tels que la solution d’acide formique à 0,1 %, la solution d’acide acétonitrile à 0,5 %, l’eau pure à l’acétonitrile, la solution d’acide phosphorique à 0,05 % et l’eau pure au méthanol, les longueurs d’onde de détection, telles que 205 nm, 230 nm, 250 nm et 300 nm, les températures de la colonne, telles que 20 °C, 30 °C et 40 °C, et les débits, tels que 0,8-1,0 mL/min, ont fait l’objet d’une enquête. Les conditions chromatographiques optimales pour l’analyse des échantillons de Chuanmutong ont été déterminées. En outre, sa faisabilité a été confirmée par une validation méthodologique et la méthode de détection de l’empreinte HPLC de Chuanmutong a été construite avec succès.
La troisième étape clé consiste à analyser et à trouver les informations différentes dans les empreintes digitales de la médecine chinoise authentique et de ses adultérants. Dans cette étude, tout d’abord, la similitude des empreintes digitales a été analysée à l’aide de SESCF-TCM (version 2012). Il a été constaté que la similitude entre les empreintes digitales de 10 lots d’échantillons authentiques de Chuanmutong et l’empreinte digitale caractéristique de contrôle était très élevée. En comparaison, la similitude entre les empreintes digitales de cinq lots d’adultérants et l’empreinte digitale caractéristique de contrôle était significativement inférieure à celle des échantillons authentiques. L’AC, l’ACP et l’OPLS-DA ont ensuite été introduits pour analyser les informations de pointe communes des empreintes chimiques. Les résultats de l’AC et de l’ACP montrent que le CC adultérant couramment utilisé parmi différents adultérants est relativement plus proche de l’authentique, ce qui est difficile à distinguer. Cependant, lorsque la distance de classification de CA est modifiée à quatre, l’identification effective entre l’authentique et l’adultérant peut être atteinte. Sur la base des 12 pics communs des matériaux authentiques, les valeurs de contribution des pics différentiels des adultérants ont été évaluées quantitativement par OPLS-DA et ont obtenu sept pics chromatographiques différentiels, à savoir le pic n ° 9, le pic n ° 5, le pic n ° 7, le pic n ° 6, le pic n ° 10, le pic n ° 3 et le pic n ° 2. Ceux-ci peuvent être utilisés pour identifier efficacement les matériaux authentiques et faux de Chuanmutong, qui sont les principaux composants marqués de la différence entre l’authentique et l’adultérant.
La dernière édition de la pharmacopée chinoise n’a pas encore inclus la détermination du contenu des composants efficaces de Chuanmutong. Afin d’améliorer son contrôle de la qualité, cette étude a étudié les méthodes de détermination de la teneur en composants actifs tels que le β-sitostérol, l’ergostérol, le sitostérol et l’acide oléanolique liés à l’action diurétique dans les rapports précédents 22,23,24,25,26. Comme le montre la figure supplémentaire 2, l’ergostérol n’a pas été détecté dans le Chuanmutong authentique, et le stigmastérol était difficile à séparer dans le chromatogramme et n’a pas pu être quantifié avec précision. Enfin, la méthode de détermination de la teneur en β-sitostérol a été établie; les résultats de détection ont montré que le β-sitostérol a été trouvé dans 10 lots d’échantillons authentiques de Chuanmutong et cinq lots d’adultérants. Par conséquent, le β-sitostérol n’était pas unique aux matières médicinales authentiques. Bien que certaines informations sur la qualité de Chuanmutong puissent être fournies, il est encore nécessaire d’analyser davantage les pics chromatographiques différentiels dans les empreintes digitales à l’avenir pour voir si les composants spécifiques liés à l’efficacité de Chuanmutong peuvent être trouvés.
À l’heure actuelle, les médecines traditionnelles chinoises sont souvent identifiées par la similitude du spectre chimique des empreintes digitales. Cependant, cet indicateur est un paramètre basé sur les informations globales des pics chromatographiques de l’échantillon, qui ne peuvent pas fournir plus d’informations sur l’identification et les principales différences des différents échantillons. Par conséquent, cette étude a également utilisé CA, PCA et OPLS-DA pour identifier les informations de pic communes des empreintes chimiques, a trouvé les principaux pics chromatographiques différentiels entre les échantillons authentiques et frelatés de Chuanmutong et les a identifiés avec succès. Enfin, l’empreinte chimique couplée à la CLHP pour la reconnaissance multi-motifs a été construite.
Comme il n’est pas rare de mélanger des matières médicinales chinoises authentiques et leurs adultérants, tels que Fritillaria thunbergii, Herba Asari et Lonicera japonica, cette méthode fournira une nouvelle stratégie pour une identification claire et scientifique des matières médicinales chinoises authentiques et de leurs adultérants. Cette stratégie sera d’une grande importance pour assurer la qualité des matériaux médicinaux chinois dans l’application clinique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le projet de l’Administration de la médecine traditionnelle chinoise du Sichuan (n° 2020JC0088, n° 2021MS203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017381038 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD5243V | |
| β-Sitosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| C18 column | Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China | Welch Ultimate LP | |
| Chuanmutong | Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 19020103 | CMT-1 |
| Chuanmutong | Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-2 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-3 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-4 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210701 | CMT-5 |
| Chuanmutong | Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210401 | CMT-6 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-7 |
| Chuanmutong | Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China | 201201 | CMT-8 |
| Chuanmutong | Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 201001 | CMT-9 |
| Chuanmutong | Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210501 | CMT-10 |
| Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang | Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China | - | CC |
| Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. | Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China | - | DC |
| Clematis peterae Hand.-Mazz. | Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China | - | DE |
| Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils | Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | XS |
| Clematis finetiana Levl. et Vaniot. | Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | SMT |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Ergosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China | 20210201 | |
| Ethanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2021112602 | |
| Ethyl acetate | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017042043 | |
| Formic acid | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2016062901 | |
| High performance liquid chromatography | Agilent, USA. | 1260 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD6409V | |
| Methanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 202010302 | |
| n-butyl alcohol | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020071047 | |
| Petroleum ether | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020090125 | |
| Phosphoric acid | Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 20200110 | |
| SESCF-TCM version 2012 | National Pharmacopoeia Commission, China | - | http://114.247.108.158:8888/login |
| Stigmasterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China | 20200214 | |
| Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 | Umetrics, Sweden | - | https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download |
| Ultrapure water machine | Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China | UPH-II-10T | |
| Ultrasonic cleaner | Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China | KH3200E |
References
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