Summary
Burada, Akasit Armandii Caulis ve zina maddelerinin gerçek çeşitlerini etkili bir şekilde tanımlamak için yeni bir strateji sağlayan kimyasal parmak izi çoklu desen tanıma ile birlikte yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Çin tıbbi materyallerini ve ilgili zina maddelerini tanımlamak için bir yöntem, Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, evrensel olarak kullanılan geleneksel Çin tıbbı) örnek alınarak oluşturulmuştur. On parti gerçek Chuanmutong çeşidi ve beş parti ilgili zina yapan, küme analizi (CA), ana bileşen analizi (PCA) ve ortogonal kısmi en küçük kareler ayrım analizi (OPLS-DA) dahil olmak üzere kemometri ile birleştirilmiş yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) parmak izlerine dayanarak analiz edildi ve karşılaştırıldı. Ek olarak, β-sitosterol içeriği belirlendi. Chuanmutong'un kontrol kimyasal parmak izi kuruldu ve 12 ortak tepe noktası tespit edildi. 10 parti gerçek Chuanmutong çeşidinin parmak izi ile kontrol parmak izi arasındaki benzerlik 0.910-0.989 iken, beş parti zina yapanın benzerliği sadece 0.133-0.720 idi. Kromatogramdaki ortak zirvelere dayanarak, 15 parti numune PCA tarafından üç içerik seviyesine sınıflandırıldı ve CA tarafından dört kategoriye ayrıldı ve otantik Chuanmutong ile Chuanmutong'un zina maddeleri arasında net bir ayrım yapıldı. Ayrıca, otantik Chuanmutong'u ve Chuanmutong'un zina yapanlarını etkili bir şekilde tanımlayabilen yedi diferansiyel bileşen, OPLS-DA aracılığıyla bulundu. 10 parti gerçek Chuanmutong çeşidinin β-sitosterol içeriği 97.53-161.56 μg / g iken, beş zina partisinin β-sitosterol içeriği büyük ölçüde değişmiştir, bunların arasında Akasma peterae Hand'in β-sitosterol içeriği de bulunmaktadır.-Mazz. ve Akasma gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. ve Wils. otantik Chuanmutong çeşitlerinden önemli ölçüde daha düşüktü. Bu çalışmada oluşturulan HPLC indeks bileşeni içeriği ve kimyasal parmak izi çoklu desen tanıma yöntemi, otantik Çin tıbbi materyallerini ve ilgili zina maddelerini etkili bir şekilde tanımlamak için yeni bir strateji sunmaktadır.
Introduction
Chuanmutong, Akasma armandii Franch'ın kuru Caulis'i. veya Akasma montana Buch.-Ham.,kliniklerde yaygın olarak kullanılan geleneksel bir Çin tıbbıdır 1,2,3. İdrar problemlerinin, ödemin, dil ve ağızdaki yaraların, süt salgısının azalmasının, eklem sertliğinin ve nemli ısının neden olduğu kas ağrılarının tedavisinde kullanılır4. Chuanmutong her zaman, çoğunlukla güneybatı Çin'de, özellikle de en iyi kalitenin bulunabileceği Sichuan'da dağıtılan vahşi çeşitlerden elde edilmiştir 5,6. Otantik çeşitler ile yakından ilişkili zina yapanları, benzer özelliklerinden dolayı ayırt etmek zordur 7,8,9,10. Çin Farmakopesinin 2020 baskısındaki Chuanmutong'un kalite standardı, yalnızca içerik belirleme olmadan özellikleri, mikroskobik tanımlamayı ve ince tabaka tanımlamayı şart koşar, bu da zina yapanları etkili bir şekilde tanımlayamaz ve bu nedenle potansiyel riskleri vardır. Dahası, Chuanmutong ve ilgili bitkileri karşılaştıran ve tanımlayan az sayıda rapor vardır. Sonuç olarak, Chuanmutong'un özgünlüğünü sağlamak için bir kalite kontrol yöntemi daha fazla çalışmaya değer.
Chuanmutong'un kimyasal bileşenleri esas olarak oleanan tipi pentasiklik triterpenoidlerden ve bunların glikozitlerinden, flavonoidlerinden ve organik asitlerinden oluşur11,12,13,14. Bunlar arasında, oleanolik asit, β-sitosterol, stigmasterol ve ergosterol, diürezi teşvik etmek ve straanguriayı hafifletmek için potansiyel farmakodinamik maddeler olabilecek farklı yoğunluklarda diüretik etkilere sahiptir15,16. Kimyasal parmak izleri, numunelerde bulunan birçok kimyasal bileşenin yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), gaz kromatografisi (GC) vb. ile ayrılması ve algılanmasıyla elde edilir. Chuanmutong'un özelliklerini analiz etmek için uygun istatistiksel analiz yöntemlerinin benimsenmesi, geleneksel Çin tıbbının genel kalite kontrolünü ve bilimsel tanımlamasını belirleyebilir17,18,19.
Bu çalışmada, 10 parti Chuanmutong otantik çeşidi ve beş parti zina eden toplanmıştır. Kaliteleri, küme analizi (CA), ana bileşen analizi (PCA), ortogonal kısmi en küçük kareler ayrım analizi (OPLS-CA) ve farmakodinamik bileşenin içerik belirlemesi dahil olmak üzere çok desenli tanıma ile birleştirilmiş HPLC parmak izi yöntemi ile karşılaştırılmış ve analiz edilmiştir. Bu protokol, otantik çeşitleri yüksek özgüllükle tanımlamak için bir yöntem, otantik çeşitlerin ve Çin tıbbi malzemelerinin zina maddelerinin bilimsel olarak tanımlanması için yeni bir strateji oluşturur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kimyasal parmak izi algılama yöntemleri
- Kromatografik koşullar
- Asetonitril (A)/su (B) mobil fazını hazırlayın. HPLC yazılımında aşağıdaki gibi bir gradyan programı ayarlayın: 0-20 dakika,% 3 A-% 10 A; 20-25 dk, %10 A-%13 A; 25-65 dk, %13 A-%25 A; 65-75 dk, %25 A-%40 A; 75-76 dk, %40 A-%3 A; 76-85 dk, %3 A-%3 A.
- Mobil fazın akış hızını 1,0 mL/dak'da tutun.
- Kromatografik ayrımı, 30 °C'de tutulan bir C18 sütununda (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) gerçekleştirin.
- Enjeksiyon hacmini 10 μL'ye ayarlayın.
- Örnekleri 205 nm dalga boyunda tespit edin.
NOT: Kromatografik koşulların özel ayarları için, yüksek performanslı sıvı kromatografisinin çalışma yazılımının çalışma prosedürlerine bakın (Malzeme Tablosu).
- Numune çözeltisinin hazırlanması
- Hammaddeleri, iç çapı 850 μm ± 29 μm olan naylon bir ağdan geçirerek eşit parçacık boyutuna kadar öğütün.
- 2 g öğütülmüş hammaddeyi (doğru tartılmış) bir tıpa ile 50 mL'lik konik bir şişeye yerleştirin ve 50 mL metanol ekleyin. Durdurucuyu şişeye yerleştirin ve 30 dakika boyunca ultrasonicate (600 W, 40 kHz).
- Ardından, şişeyi oda sıcaklığına (RT) soğutun. Numuneleri tekrar tartın ve kaybedilen ekstraktanı değiştirerek ilk ağırlığı telafi edin.
- Tıbbi ekstraktları içeren metanol çözeltisinin 4 mL'sini 10 mL'lik hacimsel bir şişeye dökün. 6 mL H2O ekleyin, karıştırın ve 10 dakika boyunca yerleşmesine izin verin.
- Son olarak, süpernatantı 0,45 μm'lik bir filtre membranından süzün ve bekleme moduna alın.
- Parmak izi algılama yöntemlerinin doğrulanması
- Numuneyi yukarıda açıklandığı gibi hazırlayın (adım 1.2) ve günde altı kez HPLC analizine (adım 1.1) tabi tutun. Hassasiyeti değerlendirmek için, adım 1.3.5'te açıklandığı gibi göreli tutma süresinin ve göreli tepe alanlarının göreli standart sapmasını (RSD) hesaplayın.
- RT'de depolanan aynı örnek çözeltiyi 0, 2, 4, 6, 8, 12 ve 24 saat boyunca analiz ederek numune çözeltisinin kararlılığını değerlendirin ve adım 1.3.5'te açıklandığı gibi göreceli tutma süresinin ve göreceli tepe alanlarının RSD'sini hesaplayın.
- Aynı numunenin altı kopyasını (CMT-4) alın, numune çözeltisini yukarıdaki prosedüre göre hazırlayın (adım 1.2) ve adım 1.1'i izleyerek HPLC'de parmak izini tespit edin. Göreli bekletme süresinin ve göreli tepe alanlarının RSD'sini hesaplayın ve adım 1.3.5'te açıklandığı gibi tekrarlanabilirliğini değerlendirin.
- Ardından, referans tepe noktası olarak Şekil 1B'deki tepe numarası 10'u kullanın ve adım 1.3.5'te açıklandığı gibi her bir ortak tepe noktasının göreli tutma süresinin ve göreli tepe alanının RSD'sini hesaplayın.
- Her ortak tepe noktasının göreli bekletme süresini ve göreli tepe alanını hesaplamak için aşağıda belirtilen formülleri kullanın:
T re = T karakteristiği/Treferans
A re = A karakteristik/Areferansı
Burada T re = göreceli tutma süresi, T karakteristiği = karakteristik tepe tutma süresi, Treferansı = referans tepe tutma süresi, A re = göreceli tepe alanı, A karakteristik = karakteristik tepe alanı ve A referans = referans tepe alanı.
NOT: Geleneksel Çin tıbbı parmak izlerinin kurulması genellikle elde edilmesi kolay ve yüksek çözünürlüğe sahip bir kromatografik tepe noktası seçmeyi gerektirir. Bu, parmak izlerini tanımlamak ve kararlılıklarını ve tekrarlanabilirliklerini incelemek için bir referans tepe noktası olarak kullanılır.
2. Chuanmutong parmak izinin kurulması ve benzerlik analizi
- 10 parti otantik örnek ve Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang (CC), Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd gibi beş parti zina içeren kullanın. ve Wils. (DC), Akasma peterae El.-Mazz. (DE), Akasma gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils (XS) ve Clematis finetiana Levl. et Vaniot. (SMT) parmak izi analizi için örnek olarak.
- Örnek çözümleri adım 1.2'de açıklandığı gibi hazırlayın. Adım 1.1'de açıklanan koşullara göre HPLC ile tüm örnek çözümlerin parmak izi analizini gerçekleştirin.
- İlgili verileri geleneksel Çin tıbbının kromatografik parmak izlerinin benzerlik değerlendirme sistemine aktarın (SESCF-TCM, 2012 versiyonu). Sistem, tüm numunelerin kromatogramlarında makul yüksekliğe ve iyi çözünürlüğe sahip pikleri ortak pikler olarak belirleyecektir.
NOT: SESCF-TCM yazılımı, Çin Farmakope Komisyonu (http://114.247.108.158:8888/login) web sitesine kayıt olduktan sonra indirilebilir.- Yazılımda, menüdeki Referans Spektrumunu Ayarla düğmesini tıklatın.
- Ardından Parametre Ayarları penceresinde, Zaman Penceresi Genişliği'ni 0,5 olarak ayarlayın ve Medyan Yöntemi olarak Denetim Spektrumu Oluşturma Yöntemi'ni seçin.
- Ana menüde Çok Noktalı Kalibrasyon'a tıklayın, ardından Tam Spektrumlu Tepe Eşleştirme olarak Tepe Eşleştirme'yi seçin.
- Son olarak, otantik Chuanmutong türlerinin referans kromatografik parmak izini oluşturmak için Kontrol Oluştur'a tıklayın.
- 10 parti otantik Chuanmutong örneğinin ve beş parti zina yapanın tutma süresini ve tepe alanını analiz için SESCF-TCM'ye aktarın. Özel işlemler aşağıdaki gibidir:
- Yazılımda, ana menüdeki Referans Spektrumunu Ayarla düğmesine tıklayın.
- Parametre Ayarları penceresinde, otantik Chuanmutong türlerinin referans kromatografik parmak izini referans olarak ayarlayın, Medyan Yöntem olarak Kontrol Spektrumu Oluşturma Yöntemini seçin ve Zaman Penceresi Genişliğini 0,5 olarak ayarlayın.
- Ana menüde Çok Noktalı Kalibrasyon'a tıklayın, ardından Tam Spektrumlu Tepe Eşleştirme olarak Tepe Eşleştirme'yi seçin.
- Son olarak, Chuanmutong'un referans kromatogram parmak izlerine dayanarak benzerliği hesaplamak için Benzerliği Hesapla'ya tıklayın. Son olarak, Çin Tıbbı Kromatografik Parmak İzi Değerlendirme Sistemi'ni (2012 versiyonu) kullanarak parmak izlerinin benzerliğini hesaplayın.
NOT: Belirli işlemler için, Çin Tıbbı Kromatografik Parmak İzi Değerlendirme Sistemi'nin (2012 sürümü) çalışma özelliklerine bakın.
3. Chuanmutong parmak izinin çok desenli tanıma analizi
- Küme analizi (CA)
- 10 parti otantik Chuanmutong örneğinin parmak izlerinde 12 ortak zirvenin tepe alanlarını ve bunların beş parti zina maddesini değişken olarak kullanın ve bunları sistematik küme analizi (CA) için istatistiksel analiz yazılımına girin.
- Gruplar Arası yöntemini seçin ve Chuanmutong ve zina yapanların küme analizi diyagramını çizmek için sınıflandırma temeli olarak Pearson korelasyon katsayısını kullanın. Özel işlemler aşağıdaki gibidir:
- İstatistiksel analiz yazılımında, verileri içe aktarmak için Dosya'ya tıklayın.
- Menüde Analiz'e tıklayın ve ardından Sınıflandırma'da Sistem Kümeleme'ye tıklayın.
- Ortak tepe alanını değişken olarak seçin ve küme sayısını dört olarak ayarlayın.
- Yöntem'e tıklayın, kümeleme yöntemini Gruplar Arası Bağlantı olarak seçin, ölçüm aralığını Pearson Korelasyonu olarak seçin ve CA haritasını çizmek için Tamam'a tıklayın.
- Ana bileşen analizi (PCA)
- Otantik çeşitlerin ve zina maddelerinin göreceli ortak tepe alanını PCA analizi için analiz yazılımına aktarın ve örnek farklılıklarının puan matrisi haritasını değerlendirmek için PCA puan haritasını kullanın. Özel işlemler aşağıdaki gibidir:
- Veri analiz yazılımını açın, menüden Dosya'ya tıklayın ve yeni bir normal proje oluşturun. HPLC sisteminden bir elektronik tablodaki 12 yaygın tepe noktasının tepe alanını (örneğin, excel biçimi) içe aktarın. Ardından, veri içe aktarma işlemini tamamlamak için Son'a tıklayın.
- Model türünü PCA ile ayarlamak üzere yeni bir model oluşturmak için Yeni'ye tıklayın. Verileri sığdırmak için Otomatik Sığdır'a ve Ekle'ye tıklayın, ardından PCA puan haritasını almak için Puanlar'a tıklayın.
- Otantik çeşitlerin ve zina maddelerinin göreceli ortak tepe alanını PCA analizi için analiz yazılımına aktarın ve örnek farklılıklarının puan matrisi haritasını değerlendirmek için PCA puan haritasını kullanın. Özel işlemler aşağıdaki gibidir:
- Ortogonal kısmi en küçük kareler ayrımcılığı analizi (OPLS-DA)
- Otantik Chuanmutong çeşitlerinin ve zina yapanların göreceli ortak tepe alanı zirvelerini daha fazla analiz etmek ve tüm örneklerin OPLS-DA sınıflandırma puan haritasını çizmek için süpervizyon modu ile Ortogonal kısmi en küçük kareler ayrımcılığı analiz yöntemini kullanın. Özel işlemler aşağıdaki gibidir:
- Veri analiz yazılımında, bir dosyayı içe aktarmak ve yeni bir normal proje oluşturmak için menüdeki Dosya'ya tıklayın. HPLC sisteminden bir elektronik tablodaki 12 yaygın tepe noktasının tepe alanını içe aktarın, ardından veri içe aktarma işlemini tamamlamak için Son'a tıklayın.
- Model türünü PCA ile ayarlamak üzere yeni bir model oluşturmak için Yeni'ye tıklayın. Verileri sığdırmak için Otomatik Sığdır'a ve Ekle'ye tıklayın. Ardından PCA puan haritasını almak için Skorlar'a tıklayın.
- OPLS-DA ile model türünü ayarlamak için Yeni'ye tıklayın ve Model Bir olarak Yeni'yi seçin.
- Ölçek'e tıklayın ve türü Herkes için Par ile ayarlayın. Önce Otomatik Sığdır'a tıklayın ve ardından OPLS-DA puan haritasını almak için Puanlar'a tıklayın.
- Chuanmutong'daki her ortak zirvenin sınıflandırma sonuçları üzerindeki etkisini ve otantik Chuanmutong materyalleri ile ilgili zina maddeleri arasındaki farkı belirlemek için, analiz için projeksiyondaki değişken önemi (VIP) kullanın.
- Chuanmutong'un farklı bileşenlerinin VIP haritasını çizin. Her değişkenin sınıflandırma üzerindeki etkisini değerlendirmek ve gruplar arasındaki farklılıklara önemli ölçüde katkıda bulunan bileşenleri taramak için elde edilen VIP haritasını kullanın. Özel işlemler aşağıdaki gibidir:
- Veri analizi yazılımında, menüden Analiz Et'e tıklayın ve Permütasyonlar'a tıklayın, permütasyon sayısını 200 olarak ayarlayın ve OPLS-DA skor haritasının R2 ve Q2'sini alın.
- VIP haritasını almak için VIP'ye tıklayın ve VIP Tahmini'ni seçin.
- Otantik Chuanmutong çeşitlerinin ve zina yapanların göreceli ortak tepe alanı zirvelerini daha fazla analiz etmek ve tüm örneklerin OPLS-DA sınıflandırma puan haritasını çizmek için süpervizyon modu ile Ortogonal kısmi en küçük kareler ayrımcılığı analiz yöntemini kullanın. Özel işlemler aşağıdaki gibidir:
4. Chuanmutong'da HPLC ile β-sitosterol tayini
- Kromatografik koşullar (bkz. adım 1.1)
- Mobil fazı hazırlayın: metanol su (97:3).
- Mobil fazın akış hızını 1,0 mL/dk olarak ayarlayın.
- Kromatografik ayrımı, 30 °C'de tutulan bir C18 sütununda (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) gerçekleştirin.
- Enjeksiyon hacmini 10 μL'ye ayarlayın.
- Bileşeni 204 nm dalga boyunda tespit edin.
- Numune çözeltisinin hazırlanması
- Metanol içinde karşılık gelen referans standardının doğru tartılmış bir miktarını çözerek β-sitosterol (0.1 mg / mL) stok standardı çözeltisini hazırlayın.
- Hammaddenin analiz numunesini, 180 μm iç çapa 7,6 μm olan naylon ağdan geçirerek homojen parçacık boyutuna ±.
- 2 g öğütülmüş hammaddeyi (doğru tartılmış) yuvarlak tabanlı bir şişeye yerleştirin ve üzerine 50 mL kloroform ekleyin.
- Şişeyi bir reflü kondenserine bağlayın ve 60 dakika boyunca kaynar su banyosunda (orta kaynama) ısıtın. Ekstraksiyon çözeltisini 15-20 μm filtre kağıdı ile filtreleyin.
- Filtrasyonu yaklaşık 10 dakika boyunca kaynar su banyosunda (orta derecede kaynama) kuruluğa yakın bir şekilde buharlaştırın.
- Kalıntıyı çözün ve metanol kullanarak hacmi 5 mL'ye kadar yükseltin. Son olarak, süpernatantı 0,45 μm'lik bir filtre zarından geçirin ve bekleme moduna geçirin.
- Yöntem doğrulama
- Alt adım 4.2.1'de hazırlanan β-sitosterol stok çözeltisini alın,% 100 metanol ile seyreltin ve 100 μg / mL, 80 μg / mL, 60 μg / mL, 50 μg / mL, 40 μg / mL, 30 μg / mL ve 20 μg / mL konsantrasyonlarında çözeltiler hazırlayın.
- Pik alanı belirlemek için numuneleri adım 4.1'de açıklanan kromatografik koşullar altında enjekte edin, enjeksiyon hacmine tepe alanı ile regresyon analizi yapın ve doğrusallığını değerlendirmek için regresyon denklemini ve korelasyon katsayısını elde edin.
- Örnekleri yukarıda açıklandığı gibi hazırlayın (adım 4.2) ve aynı gün altı kez HPLC analizine (adım 4.1) tabi tutun. Ardından, hassasiyeti değerlendirmek için tepe alanlarının RSD'sini hesaplayın.
- Adım 4.1'de açıklandığı gibi RT'de 0, 2, 4, 6, 8, 12 ve 24 saat boyunca depolanan aynı örnek çözeltileri analiz ederek numune çözeltisinin kararlılığını değerlendirin. Ardından, adım 1.3.5'te açıklandığı gibi tepe alanlarının RSD'sini hesaplayın.
- Aynı numuneyi (CMT-4) adım 4.2'de açıklandığı gibi hazırlanmış seksuplikatta çözerek ve adım 4.1'de açıklandığı gibi HPLC analizine tabi tutarak tekrarlanabilirliği inceleyin. Ardından, altı örnekte β-sitosterol içeriğinin RSD'sini hesaplayın.
- Standart toplama yöntemini kullanarak yöntemin doğruluğunu değerlendirin. Bunun için, β-sitosterol içeriğinin% 80,% 100'ünde ve% 120'sinde numunelere β-sitosterol referans çözeltileri ekleyin ve her koşulu adım 4.1'de açıklandığı gibi üç kez tekrarlayın. Ortalama kurtarma ve RSD'yi hesaplayarak yöntemin doğruluğunu değerlendirin.
NOT: İyileşme oranının (RR) hesaplama formülü aşağıdaki gibidir:
RR % = [(M t - M 0) / Ms] × 100
Burada M t = standardı ekledikten sonra β-sitosterolün kalitesi, M 0 = numune çözeltisinin kalitesi ve Ms = eklenen β-sitosterolün kalitesi.
- Numunelerin β-sitosterol içeriğinin belirlenmesi
- Adım 4.2'ye göre numune çözeltileri hazırlamak için 10 parti otantik Çin tıbbi materyali ve beş parti ilgili zina maddesi alın.
- Daha sonra, adım 4.1'de açıklanan koşullar altında tepe alanını belirlemek için her bir numune çözeltisini ve β-sitosterol referans çözeltisini enjekte edin ve harici standart tek noktalı yöntemi kullanarak her numunenin β-sitosterol içeriğini hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chuanmutong'un kromatografik parmak izi ve benzerlik analizi (SA)
Hassasiyet, tekrarlanabilirlik ve kararlılığın nispi tutma süresinin RSD değerleri sırasıyla% 0.46,% 1.65 ve% 0.53'ün altındaydı; göreceli tepe bölgesinin RSD değerleri sırasıyla% 4.23,% 3.56 ve% 3.96'nın altındaydı. Şekil 1A, B'de gösterildiği gibi, 10 otantik Chuanmutong örneğinde HPLC parmak izlerinde 12 farklı ortak tepe noktası (tepe 1'den tepe 12'ye) vardı. 10 numaranın zirve alanı nispeten büyük olduğundan, çözünürlük iyiydi; Her numunede bulunan bir bileşen olduğu için, parmak izinin stabilitesini ve tekrarlanabilirliğini araştırmak için bir referans tepe noktası olarak kullanılmıştır. Daha sonra, 10 numaralı tepe noktası referans tepe noktası (S) olarak alındı ve kalan 11 zirvenin göreceli tutma süresi hesaplandı.
Benzerlik analizinde, korelasyon katsayısı 1'e ne kadar yakınsa, örnekler arasındaki benzerlik o kadar yüksek olur. Tablo 1'de gösterildiği gibi, 10 parti Chuanmutong'un benzerlik dereceleri 0.910-0.989 idi. Bu sonuçlar, Chuanmutong'un 10 partisinin, Chuanmutong'un genel kalitesini değerlendirmek için kullanılabilecek yüksek benzerliğe ve iyi tutarlılığa sahip olduğunu gösterdi. Şekil 1C'de gösterildiği gibi, zina yapanların beş partisinin parmak izleri elde edilmiştir. Beş parti zina yapanın parmak izleri ile Chuanmutong'un kontrol parmak izleri arasındaki benzerlik sadece 0.133-0.720 idi (Tablo 1), otantik örnekler ile ilgili zina yapanlar arasında belirgin farklılıklar olduğunu göstermektedir. Farklılıklar esas olarak 28-55 dakikada kromatogramdaki kromatografik tepe sayılarında yoğunlaştı. Böylece, Chuanmutong'un kontrol parmak izleri, otantik örnekleri ilgili zina yapanlardan etkili bir şekilde ayırt edebilir.
Bu deneyde CA analizi için SPSS 26 istatistik yazılımı kullanılmıştır (Şekil 2A); 15 parti numune, sınıflandırma mesafesi 20 olduğunda iki kategoriye ayrıldı. İlk kategori 10 parti Chuanmutong ve alışılmış zina yapanlarıydı (CC). İkinci kategori, DC, DE, XS ve SMT dahil olmak üzere Chuanmutong'un zina edenleriydi. sınıflandırma mesafesi dört olduğunda, tüm örnekler dört kategoriye ayrıldı. İlk kategori 10 parti Chuanmutong, ikinci kategori CC, üçüncü kategori SMT ve XS ve dördüncü kategori DC ve DE idi. Sınıflandırma sonuçları, otantik Chuanmutong çeşitlerinin kalitesinin temelde aynı olduğunu ve tüm zina yapanlarla bariz farklılıklar olduğunu gösterdi. Aynı zamanda, diğer zina yapanlarla karşılaştırıldığında, CC, Chuanmutong'un otantik çeşidine daha yakındı, ancak sınıflandırma mesafesi daraltıldığında hala ayırt edilebilir.
15 parti numunenin ortak tepe alanları PCA analizi için veri analiz yazılımına aktarıldı ve skor matrisi (R 2 x = 0.994, Q2 = 0.961) (Şekil 2B), 15 parti numunenin kümeleme etkisinin belirgin olduğunu gösterdi. Y ekseninin sağ tarafında 10 parti Chuanmutong ve CC vardı. Bunlar arasında CC, Chuanmutong'un otantik çeşitlerinden farklı olan ilk kadranda yer aldı. Y ekseninin sol tarafı, SMT, XS, DE ve DC dahil olmak üzere zina yapanlardı. Bunlar arasında, SMT ve XS ikinci kadranda, DE ve DC ise üçüncü kadranda yer aldı. Chuanmutong'un otantik çeşitlerini ve geleneksel zina yapanları karşılaştırırken, CC ve otantik çeşitler arasındaki fark nispeten küçükken, otantik ve diğer zina yapanlar arasındaki fark açıktır.
Chuanmutong ve zina maddelerinin ortak tepe alanı değişken olarak kullanılmış, OPLS-DA için veri analiz yazılımına aktarılmış ve daha sonra skor matrisi çizilmiştir (Şekil 3A). OPLS-DA modelinin R 2 x [1] değeri 0,695 ve R 2 x [2] 0,605 idi, her ikisi de 0,5'ten büyüktü, bu da modelin kararlı ve güvenilir olduğunu ve otantik örnekleri zina yapanlardan ayırt etmek için kullanılabileceğini gösteriyordu.
Şekil 3A'dan otantik ve diğer zina maddelerinin örneklem noktalarının tamamen ayrıldığı ve örneklem noktaları arasında kesişme olmadığı görülmektedir. Tüm örnekler üç bölüme ayrıldı. Chuanmutong ve CC'nin otantik çeşitleri benzerdi. XS, DC ve DE örnekleri bir sınıfa ayrıldı ve SMT örneği son sınıftı. Ayrıca, projeksiyonda değişken öneme sahip yargılama yöntemi (VIP) (Şekil 3B), her bir numunenin parmak izindeki farklı bileşenlerin zirvelerini taramak için kullanılmıştır. VIP > 1.0, örneklem grupları arasındaki sınıflandırmaya büyük katkıda bulunan seveb değişkenlerini elemek için standart olarak alınmıştır. Tarama sonuçlarına göre, otantik örnekler ile zina edilenler arasındaki bileşim farkına neden olan ana belirteç bileşenleri, 9, 5, 7, 6, 10, 3 ve 2 numaralı zirvelerdi. Kalan zirvelerin VIP değeri 1'den azdı ve bu da örneklerin ayrımcılığı üzerinde çok az etkisi oldu.
β-sitosterol pik alanı ile çözelti konsantrasyonu arasındaki doğrusal ilişki regresyon analizi kullanılarak bulunmuştur. Bu bağımlılık, Y = 5.4918 X-4.5563 denklemine uymuştur; burada Y, β-sitosterol tepe alanıdır ve X, μg / mL'deki β-sitosterol içeriğidir. Aynı zamanda, gereksinimleri karşılayan korelasyon katsayısı r = 0.9995. Hassasiyet testinin RSD'si, stabilite testi ve tekrarlanabilirlik testi sırasıyla% 1.76,% 4.22 ve% 3.85 idi. Sonuçlar, β-sitosterol içeriğinin belirleme yönteminin iyi doğrusallığa, hassasiyete ve tekrarlanabilirliğe sahip olduğunu ve numune çözeltisinin 24 saat içinde kararlı olduğunu göstermektedir. Ortalama iyileşme yüzdesi üç düzeyde% 101.50, % 101.90 ve% 100.72 idi; karşılık gelen RSD sırasıyla %2.56, %1.56 ve %1.68 idi. Teorik ve gerçek belirlenmiş değerler arasındaki iyi anlaşmalar, analiz yönteminin doğruluğunu ve uygulanabilirliğini doğruladı. β-sitosterolün sıvı kromatogramı Şekil 4'te gösterilmiştir ve 15 parti numunede β-sitosterol içeriği belirlenmiştir (Tablo 2). Sonuçlar, 10 parti otantik numunede β-sitosterol konsantrasyonunun 97.53-161.56 μg / g (nispeten kararlı) aralığında olduğunu göstermiştir. Bu bileşen, beş zina partisinin hepsinde tespit edildi, ancak içerik büyük ölçüde değişti.
Şekil 1: Chuanmutong ve zina yapanların parmak izleri. (A) 10 parti otantik Chuanmutong örneğinin parmak izleri (S1: CMT-1, S2: CMT-2, S3: CMT-3, S4: CMT-4, S5: CMT-5, S6: CMT-6, S7: CMT-7, S8: CMT-8, S9: CMT-9, S10: CMT-10). (B) Otantik Chuanmutong örneklerinin referans kromatogram parmak izleri; göreceli tutma süreleri 0,18 (Tepe No. 1), 0,22 (2 No'lu Zirve), 0,29 (3 No'lu Zirve), 0,72 (4 No'lu Zirve), 0,75 (5 No'lu Zirve), 0,82 (6 No'lu Zirve), 0,86 (7 No'lu Zirve), 0,92 (8 No'lu Zirve), 0,96 (9 No'lu Zirve), 1,00 (10 No'lu Zirve), 1,02 (11 No'lu Zirve), 1,37 (12 No'lu Zirve) idi. (C) Beş parti Chuanmutong zina yapanın parmak izleri (S1: CC, S2: DC, S3: DE, S4: XS, S5: SMT). (D) Otantik Chuanmutong örneklerinin referans kromatogram parmak izleri ile zina yapanların beş partisi arasındaki karşılaştırma (S1: referans kromatogram parmak izleri, S2: CC, S3: DC, S4: DE, S5: XS, S6: SMT). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 10 parti otantik Chuanmutong örneğinin CA ve PCA analizi ve beş parti zina yapan . (A) CA analizi. (B) PCA analizi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: OPLS-DA skor haritası ve 10 parti otantik Chuanmutong örneği ve beş parti zina yapan VIP puan haritası. (A) OPLS-DA skor haritası. (B) VIP puan haritası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: β-sitosterolün sıvı kromatogramı. S1: β-sitosterol, S2: CMT-4, S3: XS, S4: DC, S5: SMT, S6: CC, S7: DE. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Örnekleri | Ad | Benzerlik |
| Chuanmutong'un gerçek çeşitleri | CMT-1 | 0.947 |
| CMT-2 Serisi | 0.910 | |
| CMT-3 Serisi | 0.989 | |
| CMT-4 | 0.937 | |
| CMT-5 Serisi | 0.989 | |
| CMT-6 | 0.988 | |
| CMT-7 Serisi | 0.956 | |
| CMT-8 Serisi | 0.959 | |
| CMT-9 Serisi | 0.939 | |
| CMT-10 Serisi | 0.966 | |
| zina yapanlar | CC | 0.599 |
| DC | 0.720 | |
| DE | 0.133 | |
| XS | 0.694 | |
| SMT | 0.180 |
Tablo 1: 10 parti otantik Chuanmutong örneği ve bunların zina yapanların benzerliğinin sonuçları. İlgili veriler Çin Tıbbı Kromatografik Parmak İzi Değerlendirme Sistemi'ne aktarılarak, 10 parti otantik Chuanmutong örneği ve beş parti zina maddesinin benzerliği hesaplanmıştır.
| Örnekleri | Ad | İçerik (μg/g) |
| Chuanmutong'un gerçek çeşitleri | CMT-1 | 103.5 |
| CMT-2 Serisi | 124.6 | |
| CMT-3 Serisi | 131 | |
| CMT-4 | 121.1 | |
| CMT-5 Serisi | 97.5 | |
| CMT-6 | 113.8 | |
| CMT-7 Serisi | 105.6 | |
| CMT-8 Serisi | 161.6 | |
| CMT-9 Serisi | 118 | |
| CMT-10 Serisi | 123.5 | |
| zina yapanlar | CC | 157.4 |
| DC | 165.6 | |
| DE | 32.9 | |
| XS | 69.7 | |
| SMT | 192.2 |
Tablo 2: Otantik Chuanmutong örneklerinde β-sitosterol içeriğinin ve zina maddelerinin belirlenmesi sonuçları.
Ek Şekil 1: Farklı numune hazırlama koşulları ve farklı kromatografik koşullar altında sıvı kromatografisi. (A) Mobil faz sistemleri (S1: asetonitril-% 0.1 formik asit çözeltisi, S2: asetonitril-% 0.5 asetik asit çözeltisi, S3: asetonitril-saf su, S4: asetonitril-% 0.05 fosforik asit çözeltisi, S5: metanol-saf su). (B) Algılama dalga boyları (S1: 205 nm, S2: 230 nm, S3: 250 nm, S4: 300 nm). (C) Kolon sıcaklıkları (S1: 20 °C, S2: 30 °C, S3: 40 °C). (D) Akış hızları (S1: 0,8 mL/dak, S2: 0,9 mL/dak, S3: 1,0 mL/dak). (E) Ekstraksiyon yöntemleri (S1: ultrasonik ekstraksiyon, S2: reflü ekstraksiyonu). (F) Ekstraksiyon çözücüleri (S1: etil asetat, S2: etanol, S3: kloroform, S4: n-bütanol, S5: metanol). (G) Ekstraksiyon süresi (S1: 15 dakika, S2: 30 dakika, S3: 60 dakika). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Ergosterol, stigmasterol ve otantik Chuanmutong'un sıvı kromatogramı. S1: stigmasterol, S2: ergosterol, S3: CMT-4. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Araştırma için örnek koleksiyonu, Çin tıbbi malzemelerinin özgünlüğünü tanımlamada çok desenli tanıma oluşturmanın ilk önemli adımıdır. Pazar araştırması sayesinde, Sichuan Ya'an, Liangshan ve Leshan'ın Chuanmutong'un vahşi kaynaklarının ana üretim alanları olduğunu gördük. Aynı cinsin ilgili çeşitleri de aynı coğrafi dağılıma sahiptir 6,20; CC, DC, DE, XS ve SMT genellikle Chuangmutong16,21 olarak kötüye kullanılır; Bu nedenle, bu çalışmada, yukarıda belirtilen menşe yerlerinde 10 parti otantik Chuanmutong ve beş parti karışık numune toplandı ve çeşitlerin doğruluğu doğrulandı.
İkinci önemli adım, kimyasal bileşenler hakkında mümkün olduğunca fazla bilgi görüntüleyebilen HPLC parmak izinin algılama koşullarını taramaktır. Bu çalışmada, Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi, kromatografik piklerin sayısı ve alanı, ekstraksiyon yöntemleri, ekstraksiyon çözücüleri ve ekstraksiyon süresi dahil olmak üzere farklı hazırlama koşulları altında elde edilmiştir. Chuanmutong numune çözeltisinin optimal hazırlama yöntemi belirlendi. Öte yandan, farklı kromatografik koşullar altında örneklerin kromatografik piklerinin sayısı ve çözünürlüğü karşılaştırıldı. Asetonitril-%0,1 formik asit çözeltisi, asetonitril-%0,5 asetik asit çözeltisi, asetonitril-saf su, asetonitril-%0,05 fosforik asit çözeltisi ve metanol-saf su gibi mobil faz sistemleri, 205 nm, 230 nm, 250 nm ve 300 nm gibi algılama dalga boyları, 20 °C, 30 °C ve 40 °C gibi kolon sıcaklıkları ve 0,8-1,0 mL/dak gibi akış hızları, araştırıldı. Chuanmutong örneklerini analiz etmek için en uygun kromatografik koşullar belirlendi. Ayrıca, fizibilitesi metodolojik doğrulama ile doğrulandı ve Chuanmutong'un HPLC parmak izinin tespit yöntemi başarıyla inşa edildi.
Üçüncü önemli adım, otantik Çin tıbbının parmak izlerinde ve zina yapanlarda farklı bilgileri analiz etmek ve bulmaktır. Bu çalışmada öncelikle parmak izlerinin benzerliği SESCF-TCM (2012 versiyonu) kullanılarak analiz edilmiştir. 10 parti otantik Chuanmutong örneğinin parmak izleri ile kontrol karakteristik parmak izi arasındaki benzerliğin çok yüksek olduğu bulunmuştur. Buna karşılık, beş parti zina yapanın parmak izleri ile kontrol karakteristik parmak izi arasındaki benzerlik, otantik örneklerinkinden önemli ölçüde daha düşüktü. CA, PCA ve OPLS-DA daha sonra kimyasal parmak izlerinin ortak tepe bilgilerini analiz etmek için daha da tanıtıldı. Hem CA hem de PCA sonuçları, farklı zina yapanlar arasında yaygın olarak kullanılan zina CC'nin, ayırt edilmesi zor olan otantik olana nispeten daha yakın olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, CA'nın sınıflandırma mesafesi dörde değiştirildiğinde, otantik ve zina eden arasındaki etkili tanımlama sağlanabilir. Otantik materyallerin 12 ortak zirvesine dayanarak, katkıların diferansiyel piklerinin katkı değerleri OPLS-DA tarafından nicel olarak değerlendirildi ve yedi diferansiyel kromatografik pik, yani tepe No.9, tepe No.5, tepe No.7, tepe No.6, tepe No.10, tepe No.3 ve tepe No.2 elde edildi. Bunlar, otantik ve zina yapan arasındaki farkın ana belirgin bileşenleri olan Chuanmutong'un otantik ve sahte materyallerini etkili bir şekilde tanımlamak için kullanılabilir.
Çin Farmakopesinin son baskısı, Chuanmutong'un etkili bileşenlerinin içerik belirlemesini henüz içermemiştir. Kalite kontrolünü geliştirmek amacıyla, bu çalışmada diüretik etki ile ilişkili β-sitosterol, ergosterol, sitosterol ve oleanolik asit gibi aktif bileşenlerin içerik belirleme yöntemleri önceki raporlarda22,23,24,25,26 olarak incelenmiştir. Ek Şekil 2'de gösterildiği gibi, otantik Chuanmutong'da ergosterol tespit edilmedi ve stigmasterolün kromatogramda ayrılması zordu ve doğru bir şekilde ölçülemedi. Son olarak, β-sitosterolün içerik belirleme yöntemi oluşturulmuştur; Tespit sonuçları, β-sitosterolün 10 parti otantik Chuanmutong örneğinde ve beş parti zina maddesinde bulunduğunu gösterdi. Bu nedenle, β-sitosterol gerçek tıbbi malzemelere özgü değildi. Chuanmutong'un kalitesi hakkında bazı bilgiler sağlanabilse de, Chuanmutong'un etkinliği ile ilgili spesifik bileşenlerin bulunup bulunamayacağını görmek için gelecekte parmak izlerindeki diferansiyel kromatografik zirveleri daha fazla analiz etmek gerekir.
Şu anda, geleneksel Çin ilaçları genellikle kimyasal parmak izi spektrumunun benzerliği ile tanımlanmaktadır. Bununla birlikte, bu gösterge, numune kromatografik piklerinin genel bilgilerine dayanan ve farklı numunelerin tanımlanması ve temel farklılıkları hakkında daha fazla bilgi sağlayamayan bir parametredir. Bu nedenle, bu çalışma ayrıca kimyasal parmak izlerinin ortak tepe bilgilerini tanımlamak için CA, PCA ve OPLS-DA'yı kullandı, Chuanmutong'un otantik ve karıştırılmış örnekleri arasındaki ana diferansiyel kromatografik zirveleri buldu ve bunları başarıyla tanımladı. Son olarak, çok desenli tanıma için HPLC bağlantılı kimyasal parmak izi oluşturma yapıldı.
Otantik Çin tıbbi materyallerini ve Fritillaria thunbergii, Herba Asari ve Lonicera japonica gibi zina yapanları karıştırmak nadir olmadığından, bu yöntem otantik Çin tıbbi malzemelerinin ve zina maddelerinin açık ve bilimsel olarak tanımlanması için yeni bir strateji sağlayacaktır. Bu strateji, klinik uygulamada Çin tıbbi materyallerinin kalitesini sağlamak için büyük önem taşıyacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Sichuan Geleneksel Çin Tıbbı İdaresi Projesi (no. 2020JC0088, no. 2021MS203) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017381038 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD5243V | |
| β-Sitosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| C18 column | Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China | Welch Ultimate LP | |
| Chuanmutong | Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 19020103 | CMT-1 |
| Chuanmutong | Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-2 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-3 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-4 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210701 | CMT-5 |
| Chuanmutong | Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210401 | CMT-6 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-7 |
| Chuanmutong | Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China | 201201 | CMT-8 |
| Chuanmutong | Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 201001 | CMT-9 |
| Chuanmutong | Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210501 | CMT-10 |
| Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang | Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China | - | CC |
| Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. | Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China | - | DC |
| Clematis peterae Hand.-Mazz. | Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China | - | DE |
| Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils | Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | XS |
| Clematis finetiana Levl. et Vaniot. | Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | SMT |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Ergosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China | 20210201 | |
| Ethanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2021112602 | |
| Ethyl acetate | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017042043 | |
| Formic acid | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2016062901 | |
| High performance liquid chromatography | Agilent, USA. | 1260 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD6409V | |
| Methanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 202010302 | |
| n-butyl alcohol | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020071047 | |
| Petroleum ether | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020090125 | |
| Phosphoric acid | Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 20200110 | |
| SESCF-TCM version 2012 | National Pharmacopoeia Commission, China | - | http://114.247.108.158:8888/login |
| Stigmasterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China | 20200214 | |
| Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 | Umetrics, Sweden | - | https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download |
| Ultrapure water machine | Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China | UPH-II-10T | |
| Ultrasonic cleaner | Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China | KH3200E |
References
- Chen, C. R. Chinese Medicine Specimen Picture Book. , Shanghai World Book Company. Shanghai. 116 (1935).
- Xiong, J., et al. Lignans from the stems of Clematis armandii ("Chuan-Mu-Tong") and their anti-neuroinflammatory activities. Journal of Ethnopharmacology. 153 (3), 737-743 (2014).
- Pan, L. L., et al. a lignan from the Chinese medicinal plant Clematis armandii, inhibits A431 cell growth via blocking p70S6/S6 kinase pathway. Integrative Cancer Therapies. 16 (3), 351-359 (2017).
- Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of The People's Republic of China: (Edition 2020). , The Medicine Science and Technology Press of China. China., Beijing. 38 (2020).
- Wang, D. G., Guo, J. L. Textual research on the materia medica and authenticity of Clematidis armandii. Lishizhen Medicine and Materia Medicine Research. 18 (11), 2696 (2007).
- Fang, Q. M., Zhang, M., Zhong, Y. Y. The natural resources and exploitation of Caulis Clematidis Armandii in Sichuan. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 20 (5), 404-406 (2005).
- Bai, M. N., Dai, Y. X., Wang, Y., Ren, Y. Y., Tan, R. Study on the identification of Caulis Clematidis Armandii. Research and Practice on Chinese Medicines. 31 (3), 13-16 (2017).
- Zhou, P. J., Li, X. F., Fu, D. H., Pu, X. Y., Zhu, G. Q. Pharmacognosy identification of Ethnomedicine Clematis ranunculoides Franchet. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. 34 (3), 432-436 (2017).
- Guo, J. L., Tang, Y., Pei, J., Wang, D. G. Study on random amplified polymorphic DNA and sequence characterized amplified regions of Caulis Clematidis Armandii. Journal of Chengdu Medical College. 6 (4), 283-286 (2011).
- Liu, M. Z., Li, M. N., Yao, H., Liu, P. Molecular identification of Clematidis Armandii Caulis and its adulterants and closely related species by ITS2 sequence. Global Traditional Chinese Medicine. 4 (6), 446-450 (2011).
- Liu, J. J., Chen, X., Wei, Z. Q., Li, B. Chemical constituents and identification of the caules of Clematis armandii Franch.and Clematis montana Buch.-Ham. Natural Product Research and Development. 22 (6), 998-1000 (2010).
- Yang, T. R., Xu, Z., Shi, Y. N. Studies on four compounds from Clematis Montana. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 10 (4), 142-143 (2008).
- Yan, L. H., Xu, L. Z., Zhou, Z. M., Yang, S. L. Chemical constituents from stems of Clematis armandii(I). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 38 (3), 340-342 (2007).
- Li, X., et al. Traditional uses, phytochemistry, pharmacology, and toxicology of Akebiae Caulis and its synonyms: A review. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114245 (2021).
- Ye, X., et al. Diuretic effect and material basis of Clematidis Armandii Caulis in rats. China Journal of Chinese Materia Medica. 44 (9), 1889-1894 (2019).
- Kuang, Y., et al. Consistency study of Caulis Clematidis Armandii and its traditionally used products and counterfeit species based on efficacy and pharmacognosy. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 36 (3), 115-121 (2020).
- Li, Y., et al. Quality assessment of Asarum heterotropoides var. mandshuricum based on HPLC multi-component determination and multiple pattern recognition method of fingerprint. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 238-243 (2022).
- Li, Y., et al. Determination of multi-components of Paeoniae Alba Radix based on fingerprints and chemical pattern recognition. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 231-237 (2022).
- Li, H. H., et al. Comparative investigation for raw and processed products of Euodiae Fructus based on high-performance liquid chromatography fingerprints and chemical pattern recognition. Chemistry & Biodiversity. 18 (8), 2100281 (2021).
- Dong, L. J., et al. Study on suitable distribution areas of Kawa Kimichi produced in Sichuan province-based on remote sensing and GIS-A case study of Clematis Armandii. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 17 (11), 2398-2404 (2015).
- Tang, S. W., Pei, J., Li, F. Y. Morphological and histological identification of Chuanmutong. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 15 (1), 19-21 (2000).
- Li, B., Chen, X., Fang, Q. M., Zhang, B. J., Wei, Z. Q. Quality Research of Chuanmutong. Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine. 27 (6), 58-60 (2009).
- Wu, W. J., Wan, M. M., Cao, Y. H., Tan, R., Song, L. K. Research on the Quality Standard of Chuanmutong. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 33 (2), 313-315 (2015).
- Wei, Z. Q., Chen, X., Li, B., Dong, X. P. Determination of stigmasterol in Clematis armandii Franch and Clematis montana Buch-Ham. by HPLC. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 20 (3), 574-575 (2009).
- Qing, L. S., et al. Determination of oleanolic acid in Caulis clematidis armandii by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (3), 273-274 (2006).
- Yang, S. D., Wang, R., Fu, D. Y., Guo, J. J., Tan, W. Y. Determination on oleanolic acid in caulis clematidis armandii by microwave assisted extraction-HPLC/MS. Anhui Academy of Agricultural Sciences. 38 (13), 6929-6931 (2010).
