Summary
Aquí, presentamos un protocolo para establecer la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), junto con el reconocimiento químico de huellas dactilares multipatrón, que proporciona una nueva estrategia para identificar eficazmente las variedades genuinas de Clematidis Armandii Caulis y sus adulterantes.
Abstract
Un método para identificar los materiales medicinales chinos y sus adulterantes relacionados se construyó tomando como ejemplo Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, una medicina tradicional china universalmente utilizada). Se analizaron y compararon diez lotes de variedades genuinas de Chuanmutong y cinco lotes de adulterantes relacionados con la base de las huellas dactilares de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) combinadas con quimiometría, incluido el análisis de conglomerados (CA), el análisis de componentes principales (PCA) y el análisis ortogonal de discriminación parcial de mínimos cuadrados (OPLS-DA). Además, se determinó el contenido de β-sitosterol. Se estableció la huella dactilar química de control de Chuanmutong y se identificaron 12 picos comunes. La similitud entre la huella digital de 10 lotes de variedades genuinas de Chuanmutong y la huella digital de control fue de 0.910-0.989, mientras que la similitud de cinco lotes de adulterantes fue de solo 0.133-0.720. Sobre la base de los picos comunes en el cromatograma, 15 lotes de muestras se clasificaron en tres niveles de contenido por PCA, y se agregaron en cuatro categorías por CA, logrando una clara distinción entre Chuanmutong auténtico y adulterantes de Chuanmutong. Además, se encontraron siete componentes diferenciales que pueden identificar efectivamente Chuanmutong auténtico y adulterantes de Chuanmutong a través de OPLS-DA. El contenido de β-sitosterol de 10 lotes de variedades genuinas de Chuanmutong fue de 97.53-161.56 μg / g, mientras que el contenido de β-sitosterol de los cinco lotes de adulterantes varió mucho, entre los cuales el contenido de β-sitosterol de Clematis peterae Hand.-Mazz. y Clematis gouriana Roxb. var. finetii Rehd. et Wils. fue significativamente menor que la de las variedades auténticas de Chuanmutong. El contenido del componente del índice HPLC y el método de reconocimiento de huellas dactilares químicas de múltiples patrones establecido en este estudio proporcionan una nueva estrategia para identificar eficazmente los materiales medicinales chinos auténticos y los adulterantes relacionados.
Introduction
Chuanmutong, Caulis seco de Clematis armandii Franch. o Clematis montana Buch.-Ham., es una medicina tradicional china comúnmente utilizada en clínicas 1,2,3. Se utiliza para tratar problemas urinarios, edema, llagas en la lengua y la boca, disminución de la secreción de leche, rigidez articular y dolor muscular causado por el calor húmedo4. Chuanmutong siempre se ha obtenido a partir de variedades silvestres, distribuidas principalmente en el suroeste de China, especialmente en Sichuan, donde la mejor calidad se puede encontrar 5,6. Es difícil distinguir entre variedades auténticas y sus adulterantes estrechamente relacionados debido a sus características similares 7,8,9,10. El estándar de calidad de Chuanmutong en la edición 2020 de la Farmacopea China solo estipula las propiedades, la identificación microscópica y la identificación en capa delgada sin determinación de contenido, que no pueden identificar eficazmente los adulterantes y, por lo tanto, tienen riesgos potenciales. Además, hay pocos informes que comparen e identifican Chuanmutong y plantas relacionadas. En consecuencia, un método de control de calidad para garantizar la autenticidad de Chuanmutong es digno de estudio adicional.
Los componentes químicos de Chuanmutong están compuestos principalmente de triterpenoides pentacíclicos de tipo oleanano y sus glucósidos, flavonoides y ácidos orgánicos11,12,13,14. Entre ellos, el ácido oleanólico, el β-sitosterol, el estigmasterol y el ergosterol tienen efectos diuréticos de diferentes intensidades, que pueden ser sustancias farmacodinámicas potenciales para promover la diuresis y aliviar la estranguria15,16. Las huellas químicas se obtienen separando y detectando muchos componentes químicos contenidos en las muestras mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía de gases (GC), etc. La adopción de métodos de análisis estadístico apropiados para analizar las características de Chuanmutong puede determinar el control de calidad general y la identificación científica de la medicina tradicional china17,18,19.
En este estudio, se recolectaron 10 lotes de variedades auténticas de Chuanmutong y cinco lotes de adulterantes. Su calidad se comparó y analizó mediante el método de huellas dactilares HPLC combinado con el reconocimiento de patrones múltiples, incluido el análisis de conglomerados (AC), el análisis de componentes principales (PCA), el análisis ortogonal de discriminación parcial de mínimos cuadrados (OPLS-CA) y la determinación del contenido del componente farmacodinámico. Este protocolo establece un método para identificar variedades auténticas con alta especificidad, una nueva estrategia para la identificación científica de variedades auténticas y adulterantes de materiales medicinales chinos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Métodos de detección química de huellas dactilares
- Condiciones cromatográficas
- Preparar la fase móvil acetonitrilo (A)/agua (B). Establezca un programa de degradado de la siguiente manera en el software HPLC: 0-20 min, 3%A-10%A; 20-25 min, 10%A-13%A; 25-65 min, 13%A-25%A; 65-75 min, 25%A-40%A; 75-76 min, 40%A-3%A; 76-85 min, 3%A-3%A.
- Mantener el caudal de la fase móvil a 1,0 mL/min.
- Realizar la separación cromatográfica en una columna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) mantenida a 30 °C.
- Ajuste el volumen de inyección a 10 μL.
- Detectar las muestras a una longitud de onda de 205 nm.
NOTA: Para los ajustes específicos de las condiciones cromatográficas, consulte los procedimientos operativos del software de trabajo de cromatografía líquida de alta resolución (Tabla de materiales).
- Preparación de la solución de muestra
- Moler las materias primas a un tamaño de partícula uniforme pasándolas a través de una malla de nylon con un diámetro interior de 850 μm ± 29 μm.
- Introducir 2 g de materia prima molida (pesada con precisión) en un matraz cónico de 50 ml con un tapón y añadir 50 ml de metanol. Colocar el tapón en el matraz y ultrasonicar (600 W, 40 kHz) durante 30 min.
- A continuación, enfriar el matraz a temperatura ambiente (RT). Pese las muestras de nuevo y compense el peso inicial reemplazando el extractante perdido.
- Verter 4 ml de la solución de metanol que contiene los extractos medicinales en un matraz aforado de 10 ml. Agregue 6 ml deH2O, mezcle y deje que se asiente durante 10 minutos.
- Finalmente, filtre el sobrenadante a través de una membrana filtrante de 0,45 μm y colóquelo en modo de espera.
- Validación de los métodos de detección de huellas dactilares
- Preparar la muestra como se describe anteriormente (paso 1.2) y someterla al análisis de HPLC (paso 1.1) seis veces al día. Para evaluar la precisión, calcule la desviación típica relativa (RSD) del tiempo de retención relativo y las áreas de pico relativo, tal como se describe en el paso 1.3.5.
- Evaluar la estabilidad de la solución de muestra analizando la misma solución de muestra almacenada en RT durante 0, 2, 4, 6, 8, 12 y 24 h, y calcular la DSR del tiempo de retención relativo y las áreas de pico relativo como se describe en el paso 1.3.5.
- Tome seis réplicas de la misma muestra (CMT-4), prepare la solución de muestra de acuerdo con el procedimiento anterior (paso 1.2) y detecte su huella digital en HPLC siguiendo el paso 1.1. Calcule la DSR del tiempo de retención relativo y las áreas pico relativas, y evalúe su repetibilidad como se describe en el paso 1.3.5.
- A continuación, utilice el pico número 10 de la figura 1B como pico de referencia y calcule la DSR del tiempo de retención relativo y el área de pico relativo de cada pico común como se describe en el paso 1.3.5.
- Utilice las fórmulas mencionadas a continuación para calcular el tiempo de retención relativo y el área de pico relativo de cada pico común:
T re = característicaT/Treferencia
A re = Unacaracterística/Areferencia
Donde T re = tiempo de retención relativo, característica T = tiempo de retención de pico característico, referencia T = tiempo de retención de pico de referencia, A re = área de pico relativa, A característica = área de pico característica y Areferencia = área de pico de referencia.
NOTA: El establecimiento de huellas dactilares de la medicina tradicional china generalmente requiere seleccionar un pico cromatográfico que sea fácil de obtener y tenga alta resolución. Esto se utiliza como un pico de referencia para identificar las huellas dactilares y examinar su estabilidad y reproducibilidad.
2. Establecimiento de la huella dactilar Chuanmutong y análisis de similitud
- Use 10 lotes de muestras auténticas y cinco lotes de adulterantes como Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang (CC), Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. (DC), Clematis peterae Hand.-Mazz. (DE), Clematis gouriana Roxb. var. finetii Rehd. et Wils (XS), y Clematis finetiana Levl. y Vaniot. (SMT) como muestras para el análisis de huellas dactilares.
- Prepare las soluciones de ejemplo como se describe en el paso 1.2. Realice el análisis de huellas dactilares de todas las soluciones de muestra por HPLC de acuerdo con las condiciones descritas en el paso 1.1.
- Importar los datos relevantes en el sistema de evaluación de similitud de huellas cromatográficas de la medicina tradicional china (SESCF-TCM, versión 2012). El sistema designará los picos con altura razonable y buena resolución en los cromatogramas de todas las muestras como picos comunes.
NOTA: El software SESCF-TCM se puede descargar después de registrarse en el sitio web de la Comisión de la Farmacopea China (http://114.247.108.158:8888/login).- En el software, haga clic en el botón Establecer espectro de referencia en el menú.
- A continuación, en la ventana Configuración de parámetros , establezca el Ancho de ventana de tiempo en 0,5 y seleccione Método de generación de espectro de control como método mediano.
- Haga clic en Calibración multipunto en el menú principal, luego seleccione Coincidencia de picos como Coincidencia de pico de espectro completo.
- Finalmente, haga clic en Generar control para generar la huella cromatográfica de referencia de la especie auténtica de Chuanmutong.
- Importe el tiempo de retención y el área pico de 10 lotes de muestras auténticas de Chuanmutong y cinco lotes de adulterantes en SESCF-TCM para su análisis. Las operaciones específicas son las siguientes:
- En el software, haga clic en el botón Establecer espectro de referencia en el menú principal.
- En la ventana Configuración de parámetros , establezca la huella digital cromatográfica de referencia de la especie auténtica de Chuanmutong como referencia, seleccione el Método de generación del espectro de control como Método mediano y establezca el Ancho de ventana de tiempo en 0,5.
- Haga clic en Calibración multipunto en el menú principal, luego seleccione Coincidencia de picos como Coincidencia de pico de espectro completo.
- Finalmente, haga clic en Calcular similitud para calcular la similitud basada en las huellas dactilares del cromatograma de referencia de Chuanmutong. Finalmente, calcule la similitud de las huellas dactilares utilizando el Sistema de evaluación cromatográfica de huellas dactilares de medicina china (versión 2012).
NOTA: Para las operaciones específicas, consulte las especificaciones operativas del Sistema de evaluación cromatográfica de huellas dactilares de medicina china (versión 2012).
3. Análisis de reconocimiento de patrones múltiples de la huella dactilar de Chuanmutong
- Análisis de conglomerados (CA)
- Utilice las áreas pico de 12 picos comunes en las huellas dactilares de 10 lotes de muestras auténticas de Chuanmutong y sus cinco lotes de adulterantes como variables, e introdúzcalos en el software de análisis estadístico para el análisis sistemático de conglomerados (CA).
- Elija el método entre grupos y utilice el coeficiente de correlación de Pearson como base de clasificación para dibujar un diagrama de análisis de conglomerados de Chuanmutong y sus adulterantes. Las operaciones específicas son las siguientes:
- En el software de análisis estadístico, haga clic en Archivo para importar datos.
- Haga clic en Análisis en el menú y luego haga clic en Agrupación de sistemas en Clasificación.
- Seleccione el área de pico común como variable y establezca el número de clústeres en cuatro.
- Haga clic en Método, seleccione el método de agrupación en clústeres como Conexión entre grupos, seleccione el intervalo de medición como Correlación de Pearson y haga clic en Aceptar para dibujar el mapa de CA.
- Análisis de componentes principales (PCA)
- Importe el área pico común relativa de las variedades auténticas y sus adulterantes en el software de análisis para el análisis PCA, y use el mapa de puntaje PCA para evaluar el mapa de matriz de puntaje de las diferencias de muestra. Las operaciones específicas son las siguientes:
- Abra el software de análisis de datos, haga clic en Archivo en el menú y cree un nuevo proyecto regular. Importe el área de pico de 12 picos comunes en una hoja de cálculo (por ejemplo, formato Excel) desde el sistema HPLC. Luego haga clic en Finalizar para completar la importación de datos.
- Haga clic en Nuevo para crear un nuevo modelo para establecer el tipo de modelo con PCA. Haga clic en Autoajustar y Agregar para ajustar los datos, luego haga clic en Puntajes para obtener el mapa de puntaje PCA.
- Importe el área pico común relativa de las variedades auténticas y sus adulterantes en el software de análisis para el análisis PCA, y use el mapa de puntaje PCA para evaluar el mapa de matriz de puntaje de las diferencias de muestra. Las operaciones específicas son las siguientes:
- Análisis ortogonal de discriminación parcial de mínimos cuadrados (OPLS-DA)
- Utilice el método de análisis de discriminación de mínimos cuadrados parciales ortogonales con modo de supervisión para analizar más a fondo los picos de área de pico comunes relativos de las variedades y adulterantes auténticos de Chuanmutong y dibujar un mapa de puntuación de clasificación OPLS-DA de todas las muestras. Las operaciones específicas son las siguientes:
- En el software de análisis de datos, haga clic en Archivo en el menú para importar un archivo y crear un nuevo proyecto regular. Importe el área máxima de 12 picos comunes en una hoja de cálculo desde el sistema HPLC y, a continuación, haga clic en Finalizar para completar la importación de datos.
- Haga clic en Nuevo para crear un nuevo modelo para establecer el tipo de modelo con PCA. Haga clic en Ajustar automáticamente y Agregar para ajustar los datos. Luego haga clic en Puntajes para obtener el mapa de puntaje de PCA.
- Haga clic en Nuevo y elija Nuevo como modelo uno para establecer el tipo de modelo con OPLS-DA.
- Haga clic en Escala y establezca el tipo con Par for All. Haga clic en Autoajustar primero y luego haga clic en Puntuaciones para obtener el mapa de puntuación OPLS-DA.
- Para determinar la influencia de cada pico común en Chuanmutong en sus resultados de clasificación y la diferencia entre los materiales auténticos de Chuanmutong y los adulterantes relacionados, use la variable importancia en la proyección (VIP) para el análisis.
- Dibuja el mapa VIP de los diferentes componentes de Chuanmutong. Utilice el mapa VIP resultante para evaluar el impacto de cada variable en la clasificación y para descartar los componentes que contribuyen significativamente a las diferencias entre los grupos. Las operaciones específicas son las siguientes:
- En el software de análisis de datos, haga clic en Analizar en el menú y haga clic en Permutaciones, establezca el número de permutaciones en 200 y obtenga la R 2 y la Q2 del mapa de puntuación OPLS-DA.
- Haga clic en VIP y elija VIP Predictive para obtener el mapa VIP.
- Utilice el método de análisis de discriminación de mínimos cuadrados parciales ortogonales con modo de supervisión para analizar más a fondo los picos de área de pico comunes relativos de las variedades y adulterantes auténticos de Chuanmutong y dibujar un mapa de puntuación de clasificación OPLS-DA de todas las muestras. Las operaciones específicas son las siguientes:
4. Determinación del β-sitosterol en Chuanmutong por HPLC
- Condiciones cromatográficas (consulte el paso 1.1)
- Preparar la fase móvil: metanol-agua (97:3).
- Ajuste el caudal de la fase móvil a 1,0 ml/min.
- Realizar la separación cromatográfica en una columna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) mantenida a 30 °C.
- Ajuste el volumen de inyección a 10 μL.
- Detecte el componente a una longitud de onda de 204 nm.
- Preparación de la solución de muestra
- Preparar la solución patrón madre de β-sitosterol (0,1 mg/ml) disolviendo una cantidad pesada con precisión del patrón de referencia correspondiente en metanol.
- Moler la muestra de análisis de la materia prima hasta un tamaño de partícula uniforme pasando la muestra a través de la malla de nylon con un diámetro interior de 180 μm ± 7,6 μm.
- Introducir 2 g de materia prima molida (pesada con precisión) en un matraz de fondo redondo y añadirle 50 ml de cloroformo.
- Conecte el matraz a un condensador de reflujo y caliéntelo en un baño de agua hirviendo (ebullición moderada) durante 60 min. Filtrar la solución de extracción con un papel de filtro de 15-20 μm.
- Evaporar el filtrado hasta casi sequedad en un baño de agua hirviendo (ebullición moderada) durante unos 10 minutos.
- Disuelva el residuo y enrasar el volumen a 5 ml con metanol. Finalmente, pase el sobrenadante a través de una membrana de filtro de 0,45 μm y colóquelo en modo de espera.
- Validación de métodos
- Tomar la solución madre de β-sitosterol preparada en la subetapa 4.2.1, diluirla con metanol al 100% y preparar soluciones con concentraciones de 100 μg/ml, 80 μg/ml, 60 μg/ml, 50 μg/ml, 40 μg/ml, 30 μg/ml y 20 μg/ml.
- Inyectar las muestras bajo las condiciones cromatográficas descritas en el paso 4.1 para determinar el área de pico, realizar análisis de regresión con el área de pico al volumen de inyección y obtener la ecuación de regresión y el coeficiente de correlación para evaluar su linealidad.
- Preparar las muestras como se describe anteriormente (paso 4.2) y someterlas al análisis de HPLC (paso 4.1) seis veces el mismo día. Luego calcule el RSD de las áreas de pico para evaluar la precisión.
- Evalúe la estabilidad de la solución de muestra analizando las mismas soluciones de muestra almacenadas en RT durante 0, 2, 4, 6, 8, 12 y 24 h, como se describe en el paso 4.1. A continuación, calcule la DSR de las zonas de pico como se describe en el paso 1.3.5.
- Examinar la repetibilidad disolviendo la misma muestra (CMT-4) en sextuplicato, preparada como se describe en el paso 4.2, y sometiéndola al análisis de HPLC como se describe en el paso 4.1. Luego calcule la RSD del contenido de β-sitosterol en seis muestras.
- Evalúe la precisión del método empleando el método de adición estándar. Para esto, agregue soluciones de referencia de β-sitosterol a las muestras al 80%, 100% y 120% del contenido de β-sitosterol y repita cada condición tres veces como se describe en el paso 4.1. Evalúe la precisión del método calculando la recuperación promedio y la DSR.
NOTA: La fórmula de cálculo de la tasa de recuperación (RR) es la siguiente:
RR % = [(M t - M 0) / Ms] × 100
Donde M t = la calidad del β-sitosterol después de agregar el patrón, M 0 = la calidad de la solución de muestra y Ms = la calidad del β-sitosterol añadido.
- Determinación del contenido de β-sitosterol de las muestras
- Tome 10 lotes de materiales medicinales chinos auténticos y cinco lotes de adulterantes relacionados para preparar soluciones de muestra de acuerdo con el paso 4.2.
- A continuación, inyecte cada solución de muestra y cada solución de referencia de β-sitosterol para determinar el área de pico en las condiciones descritas en el paso 4.1, y calcule el contenido de β-sitosterol de cada muestra utilizando el método estándar externo de un punto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Huella cromatográfica de Chuanmutong y análisis de similitud (SA)
Los valores de RSD del tiempo de retención relativo de precisión, repetibilidad y estabilidad fueron inferiores a 0,46%, 1,65% y 0,53%, respectivamente; los valores de RSD del área pico relativa fueron inferiores a 4,23%, 3,56% y 3,96%, respectivamente. Como se muestra en las Figuras 1A, B, hubo 12 picos comunes distintos (desde el pico 1 hasta el pico 12) en las huellas dactilares de HPLC en las 10 muestras auténticas de Chuanmutong. Dado que el área máxima del número 10 era relativamente grande, la resolución era buena; Como era un componente presente en cada muestra, se utilizó como pico de referencia para investigar la estabilidad y reproducibilidad de la huella digital. Luego, se tomó el pico No. 10 como pico de referencia (S), y se calculó el tiempo de retención relativo de los 11 picos restantes.
En el análisis de similitud, cuanto más cercano esté el coeficiente de correlación a 1, mayor será la similitud entre las muestras. Como se muestra en la Tabla 1, los grados de similitud de 10 lotes de Chuanmutong fueron 0.910-0.989. Estos resultados mostraron que los 10 lotes de Chuanmutong tenían una alta similitud y buena consistencia, que se puede utilizar para evaluar la calidad general de Chuanmutong. Como se muestra en la Figura 1C, se obtuvieron las huellas dactilares de cinco lotes de sus adulterantes. La similitud entre las huellas dactilares de cinco lotes de adulterantes y las huellas dactilares de control de Chuanmutong fue de solo 0.133-0.720 (Tabla 1), lo que indica que existen diferencias obvias entre las muestras auténticas y los adulterantes relacionados. Las diferencias se concentraron principalmente en los números pico cromatográficos en el cromatograma a los 28-55 min. Por lo tanto, las huellas dactilares de control de Chuanmutong pueden distinguir efectivamente las muestras auténticas de los adulterantes relacionados.
En este experimento se utilizó el software estadístico SPSS 26 para el análisis de AC (Figura 2A); Se dividieron 15 lotes de muestras en dos categorías cuando la distancia de clasificación era de 20. La primera categoría fue 10 lotes de Chuanmutong y sus adulterantes habituales (CC). La segunda categoría fueron los adulterantes de Chuanmutong, incluidos DC, DE, XS y SMT. Cuando la distancia de clasificación era cuatro, todas las muestras se dividieron en cuatro categorías. La primera categoría fue 10 lotes de Chuanmutong, la segunda categoría fue CC, la tercera categoría fue SMT y XS, y la cuarta categoría fue DC y DE. Los resultados de la clasificación mostraron que la calidad de las variedades auténticas de Chuanmutong era básicamente la misma, y había diferencias obvias con todos los adulterantes. Al mismo tiempo, en comparación con otros adulterantes, CC estaba más cerca de la variedad auténtica de Chuanmutong, pero aún se puede distinguir cuando se reduce la distancia de clasificación.
Las áreas pico comunes de los 15 lotes de muestras se importaron al software de análisis de datos para el análisis de PCA, y la matriz de puntuación (R 2 x = 0.994, Q2 = 0.961) (Figura 2B) mostró que el efecto de agrupamiento de los 15 lotes de muestras fue pronunciado. En el lado derecho del eje Y había 10 lotes de Chuanmutong y CC. Entre ellos, CC se ubicó en el primer cuadrante, que es diferente de las variedades auténticas de Chuanmutong. El lado izquierdo del eje Y eran los adulterantes, incluidos SMT, XS, DE y DC. Entre ellos, SMT y XS se ubicaron en el segundo cuadrante, y DE y DC se ubicaron en el tercer cuadrante. Al comparar las variedades auténticas de Chuanmutong y los adulterantes convencionales, la diferencia entre CC y las variedades auténticas es relativamente pequeña, mientras que la diferencia entre los adulterantes auténticos y otros es obvia.
El área pico común de Chuanmutong y sus adulterantes se utilizó como variable, se importó al software de análisis de datos para OPLS-DA, y luego se dibujó la matriz de puntuación (Figura 3A). La R 2 x [1] del modelo OPLS-DA fue de 0.695, y la R 2 x [2] fue de 0.605, ambas mayores que 0.5, lo que indica que el modelo es estable y confiable y puede usarse para distinguir muestras auténticas de adulterantes.
Se puede ver en la Figura 3A que los puntos de muestra de los adulterantes auténticos y otros adulterantes estaban completamente separados, y no había intersección entre los puntos de muestra. Todas las muestras se dividieron en tres partes. Las variedades auténticas de Chuanmutong y CC eran similares. Las muestras de XS, DC y DE se agruparon en una clase, y la muestra de SMT fue la última clase. Además, se utilizó el método de juicio de importancia variable en la proyección (VIP) (Figura 3B) para examinar los picos de diferentes componentes en la huella digital de cada muestra. Se tomó el > VIP 1.0 como estándar para descartar variables seveb que contribuyeron en gran medida a la clasificación entre los grupos de muestra. De acuerdo con los resultados del cribado, los principales componentes marcadores que causaron la diferencia en la composición entre las muestras auténticas y los adulterantes fueron los picos No. 9, No. 5, No. 7, No. 6, No. 10, No. 3 y No. 2. El valor VIP de los picos restantes fue inferior a 1, lo que tuvo poco efecto en la discriminación de las muestras.
La relación lineal entre el área pico de β-sitosterol y su concentración de solución se encontró mediante análisis de regresión. Esta dependencia obedeció a una ecuación Y = 5.4918 X-4.5563, donde Y es el área pico de β-sitosterol y X es el contenido de β-sitosterol en μg/mL. Simultáneamente, el coeficiente de correlación r = 0.9995, que cumple con los requisitos. La DSR de la prueba de precisión, la prueba de estabilidad y la prueba de repetibilidad fueron 1,76%, 4,22% y 3,85%, respectivamente. Los resultados muestran que el método de determinación del contenido de β-sitosterol tuvo buena linealidad, precisión y repetibilidad, y la solución de la muestra fue estable dentro de las 24 h. El porcentaje medio de recuperación en tres niveles fue de 101,50 %, 101,90 % y 100,72 %; la DSR correspondiente fue de 2,56%, 1,56% y 1,68%, respectivamente. Las buenas concordancias entre los valores determinados teóricos y reales confirmaron la exactitud y aplicabilidad del método de análisis. El cromatograma líquido de β-sitosterol se muestra en la Figura 4, y se determinó el contenido de β-sitosterol en 15 lotes de muestras (Tabla 2). Los resultados mostraron que la concentración de β-sitosterol en 10 lotes de muestras auténticas estaba en el rango de 97.53-161.56 μg / g (relativamente estable). Este componente se detectó en los cinco lotes de adulterantes, pero el contenido varió mucho.
Figura 1: Huellas dactilares de Chuanmutong y sus adulterantes. A) Huellas dactilares de 10 lotes de muestras auténticas de Chuanmutong (S1: CMT-1, S2: CMT-2, S3: CMT-3, S4: CMT-4, S5: CMT-5, S6: CMT-6, S7: CMT-7, S8: CMT-8, S9: CMT-9, S10: CMT-10). B) Las huellas dactilares cromatográficas de referencia de muestras auténticas de Chuanmutong; los tiempos de retención relativos fueron 0.18 (Pico No. 1), 0.22 (Pico No. 2), 0.29 (Pico No. 3), 0.72 (Pico No. 4), 0.75 (Pico No. 5), 0.82 (Pico No. 6), 0.86 (Pico No. 7), 0.92 (Pico No. 8), 0.96 (Pico No. 9), 1.00 (Pico No. 10), 1.02 (Pico No. 11), 1.37 (Pico No. 12). C) Huellas dactilares de cinco lotes de adulterantes Chuanmutong (S1: CC, S2: DC, S3: DE, S4: XS, S5: SMT). D) Comparación entre las huellas dactilares cromatográficas de referencia de muestras auténticas de Chuanmutong y los cinco lotes de sus adulterantes (S1: huellas dactilares de cromatograma de referencia, S2: CC, S3: DC, S4: DE, S5: XS, S6: SMT). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de AC y PCA de 10 lotes de muestras auténticas de Chuanmutong y cinco lotes de adulterantes. (A) Análisis de AC. (B) Análisis de PCA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Mapa de puntuación OPLS-DA y mapa de puntuación VIP de 10 lotes de muestras auténticas de Chuanmutong y cinco lotes de adulterantes. (A) Mapa de puntuación OPLS-DA. (B) Mapa de puntuación VIP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cromatograma líquido de β-sitosterol. S1: β-sitosterol, S2: CMT-4, S3: XS, S4: DC, S5: SMT, S6: CC, S7: DE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Muestras | Nombre | Similitud |
| las variedades genuinas de Chuanmutong | CMT-1 | 0.947 |
| CMT-2 | 0.910 | |
| CMT-3 | 0.989 | |
| CMT-4 | 0.937 | |
| CMT-5 | 0.989 | |
| CMT-6 | 0.988 | |
| CMT-7 | 0.956 | |
| CMT-8 | 0.959 | |
| CMT-9 | 0.939 | |
| CMT-10 | 0.966 | |
| Adulterantes | CC | 0.599 |
| DC | 0.720 | |
| DE | 0.133 | |
| XS | 0.694 | |
| SMT | 0.180 |
Tabla 1: Resultados de similitud de 10 lotes de muestras auténticas de Chuanmutong y sus adulterantes. Al importar los datos relevantes al Sistema de Evaluación Cromatográfica de Huellas Dactilares de Medicina China, se calculó la similitud de 10 lotes de muestras auténticas de Chuanmutong y cinco lotes de adulterantes.
| Muestras | Nombre | Contenido (μg/g) |
| las variedades genuinas de Chuanmutong | CMT-1 | 103.5 |
| CMT-2 | 124.6 | |
| CMT-3 | 131 | |
| CMT-4 | 121.1 | |
| CMT-5 | 97.5 | |
| CMT-6 | 113.8 | |
| CMT-7 | 105.6 | |
| CMT-8 | 161.6 | |
| CMT-9 | 118 | |
| CMT-10 | 123.5 | |
| Adulterantes | CC | 157.4 |
| DC | 165.6 | |
| DE | 32.9 | |
| XS | 69.7 | |
| SMT | 192.2 |
Tabla 2: Resultados de la determinación del contenido de β-sitosterol en las muestras auténticas de Chuanmutong y sus adulterantes.
Figura complementaria 1: Cromatografía líquida bajo diferentes condiciones de preparación de la muestra y diferentes condiciones cromatográficas. (A) Los sistemas de fase móvil (S1: solución de ácido fórmico acetonitrilo-0,1%, S2: solución de ácido acético acetonitrilo-0,5%, S3: agua pura de acetonitrilo, S4: solución de ácido fosfórico acetonitrilo-0,05%, S5: agua pura de metanol). (B) Las longitudes de onda de detección (S1: 205 nm, S2: 230 nm, S3: 250 nm, S4: 300 nm). (C) Las temperaturas de la columna (S1: 20 °C, S2: 30 °C, S3: 40 °C). (D) Los caudales (S1: 0,8 mL/min, S2: 0,9 mL/min, S3: 1,0 mL/min). (E) Los métodos de extracción (S1: extracción ultrasónica, S2: extracción por reflujo). (F) Los disolventes de extracción (S1: acetato de etilo, S2: etanol, S3: cloroformo, S4: n-butanol, S5: metanol). (G) El tiempo de extracción (S1: 15 min, S2: 30 min, S3: 60 min). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: El cromatograma líquido de ergosterol, estigmasterol y Chuanmutong auténtico. S1: estigmasterol, S2: ergosterol, S3: CMT-4. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La recolección de muestras para la investigación es el primer paso clave para construir el reconocimiento de múltiples patrones en la identificación de la autenticidad de los materiales medicinales chinos. A través de la investigación de mercado, descubrimos que Sichuan Ya'an, Liangshan y Leshan son las principales áreas de producción de recursos silvestres de Chuanmutong. Las variedades relacionadas del mismo género también tienen la misma distribución geográfica 6,20; CC, DC, DE, XS y SMT a menudo se usan mal como Chuangmutong16,21; por lo tanto, en este estudio, se recolectaron 10 lotes de Chuanmutong auténtico y cinco lotes de muestras mixtas en los lugares de origen mencionados anteriormente, y se confirmó la precisión de las variedades.
El segundo paso clave es examinar las condiciones de detección de la huella digital HPLC, que puede mostrar la mayor cantidad de información posible sobre los componentes químicos. En este estudio, como se muestra en la Figura Suplementaria 1, el número y el área de los picos cromatográficos se obtuvieron bajo diferentes condiciones de preparación, incluidos los métodos de extracción, los disolventes de extracción y el tiempo de extracción. Se determinó el método de preparación óptimo de la solución de muestra de Chuanmutong. Por otro lado, se comparó el número y la resolución de los picos cromatográficos de las muestras bajo diferentes condiciones cromatográficas. Los sistemas de fase móvil, como la solución de ácido fórmico acetonitrilo-0,1%, la solución de ácido acético de acetonitrilo-0,5%, agua pura de acetonitrilo, solución de ácido fosfórico de acetonitrilo-0,05% y agua pura de metanol, las longitudes de onda de detección, como 205 nm, 230 nm, 250 nm y 300 nm, las temperaturas de la columna, como 20 °C, 30 °C y 40 °C, y los caudales, como 0,8-1,0 ml/min, fueron investigados. Se determinaron las condiciones cromatográficas óptimas para analizar las muestras de Chuanmutong. Además, su viabilidad fue confirmada por validación metodológica, y el método de detección de la huella digital HPLC de Chuanmutong se construyó con éxito.
El tercer paso clave es analizar y encontrar la información diferente en las huellas dactilares de la auténtica medicina china y sus adulterantes. En este estudio, en primer lugar, se analizó la similitud de las huellas dactilares utilizando SESCF-TCM (versión 2012). Se encontró que la similitud entre las huellas dactilares de 10 lotes de muestras auténticas de Chuanmutong y la huella dactilar característica de control era muy alta. En comparación, la similitud entre las huellas dactilares de cinco lotes de adulterantes y la huella dactilar característica de control fue significativamente menor que la de las muestras auténticas. CA, PCA y OPLS-DA se introdujeron para analizar la información máxima común de las huellas químicas. Los resultados de CA y PCA muestran que el adulterante CC comúnmente utilizado entre diferentes adulterantes está relativamente más cerca del auténtico, lo cual es difícil de distinguir. Sin embargo, cuando la distancia de clasificación de AC se modifica a cuatro, se puede lograr la identificación efectiva entre el auténtico y el adulterante. Sobre la base de los 12 picos comunes de materiales auténticos, los valores de contribución de los picos diferenciales de adulterantes fueron evaluados cuantitativamente por OPLS-DA, y se obtuvieron siete picos cromatográficos diferenciales, a saber, pico No.9, pico No.5, pico No.7, pico No.6, pico No.10, pico No.3 y pico No.2. Estos se pueden utilizar para identificar eficazmente los materiales auténticos y falsos de Chuanmutong, que son los principales componentes marcados de la diferencia entre lo auténtico y lo adulterante.
La última edición de la Farmacopea China aún no ha incluido la determinación del contenido de los componentes efectivos de Chuanmutong. Con el fin de mejorar su control de calidad, este estudio investigó métodos de determinación de contenido de componentes activos como β-sitosterol, ergosterol, sitosterol y ácido oleanólico relacionados con la acción diurética en informes anteriores 22,23,24,25,26. Como se muestra en la Figura Suplementaria 2, no se detectó ergosterol en Chuanmutong auténtico, y el estigmasterol fue difícil de separar en el cromatograma y no se pudo cuantificar con precisión. Finalmente, se estableció el método de determinación del contenido de β-sitosterol; los resultados de la detección mostraron que se encontró β-sitosterol en 10 lotes de muestras auténticas de Chuanmutong y cinco lotes de adulterantes. Por lo tanto, el β-sitosterol no era exclusivo de los materiales medicinales genuinos. Aunque se puede proporcionar cierta información sobre la calidad de Chuanmutong, todavía es necesario analizar más a fondo los picos cromatográficos diferenciales en las huellas dactilares en el futuro para ver si se pueden encontrar los componentes específicos relacionados con la eficacia de Chuanmutong.
En la actualidad, las medicinas tradicionales chinas a menudo se identifican por la similitud del espectro químico de huellas dactilares. Sin embargo, este indicador es un parámetro basado en la información general de los picos cromatográficos de la muestra, que no puede proporcionar más información sobre la identificación y las principales diferencias de las diferentes muestras. Por lo tanto, este estudio utilizó CA, PCA y OPLS-DA para identificar la información de pico común de las huellas químicas, encontró los principales picos cromatográficos diferenciales entre muestras auténticas y adulteradas de Chuanmutong y los identificó con éxito. Finalmente, se construyó la huella digital química acoplada a HPLC para el reconocimiento de múltiples patrones.
Como no es raro mezclar materiales medicinales chinos auténticos y sus adulterantes, como Fritillaria thunbergii, Herba Asari y Lonicera japonica, este método proporcionará una nueva estrategia para la identificación clara y científica de los materiales medicinales chinos auténticos y sus adulterantes. Esta estrategia será de gran importancia para garantizar la calidad de los materiales medicinales chinos en aplicación clínica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Administración de Medicina Tradicional China de Sichuan (no. 2020JC0088, no. 2021MS203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017381038 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD5243V | |
| β-Sitosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| C18 column | Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China | Welch Ultimate LP | |
| Chuanmutong | Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 19020103 | CMT-1 |
| Chuanmutong | Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-2 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-3 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-4 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210701 | CMT-5 |
| Chuanmutong | Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210401 | CMT-6 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-7 |
| Chuanmutong | Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China | 201201 | CMT-8 |
| Chuanmutong | Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 201001 | CMT-9 |
| Chuanmutong | Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210501 | CMT-10 |
| Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang | Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China | - | CC |
| Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. | Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China | - | DC |
| Clematis peterae Hand.-Mazz. | Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China | - | DE |
| Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils | Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | XS |
| Clematis finetiana Levl. et Vaniot. | Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | SMT |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Ergosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China | 20210201 | |
| Ethanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2021112602 | |
| Ethyl acetate | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017042043 | |
| Formic acid | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2016062901 | |
| High performance liquid chromatography | Agilent, USA. | 1260 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD6409V | |
| Methanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 202010302 | |
| n-butyl alcohol | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020071047 | |
| Petroleum ether | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020090125 | |
| Phosphoric acid | Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 20200110 | |
| SESCF-TCM version 2012 | National Pharmacopoeia Commission, China | - | http://114.247.108.158:8888/login |
| Stigmasterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China | 20200214 | |
| Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 | Umetrics, Sweden | - | https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download |
| Ultrapure water machine | Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China | UPH-II-10T | |
| Ultrasonic cleaner | Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China | KH3200E |
References
- Chen, C. R. Chinese Medicine Specimen Picture Book. , Shanghai World Book Company. Shanghai. 116 (1935).
- Xiong, J., et al. Lignans from the stems of Clematis armandii ("Chuan-Mu-Tong") and their anti-neuroinflammatory activities. Journal of Ethnopharmacology. 153 (3), 737-743 (2014).
- Pan, L. L., et al. a lignan from the Chinese medicinal plant Clematis armandii, inhibits A431 cell growth via blocking p70S6/S6 kinase pathway. Integrative Cancer Therapies. 16 (3), 351-359 (2017).
- Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of The People's Republic of China: (Edition 2020). , The Medicine Science and Technology Press of China. China., Beijing. 38 (2020).
- Wang, D. G., Guo, J. L. Textual research on the materia medica and authenticity of Clematidis armandii. Lishizhen Medicine and Materia Medicine Research. 18 (11), 2696 (2007).
- Fang, Q. M., Zhang, M., Zhong, Y. Y. The natural resources and exploitation of Caulis Clematidis Armandii in Sichuan. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 20 (5), 404-406 (2005).
- Bai, M. N., Dai, Y. X., Wang, Y., Ren, Y. Y., Tan, R. Study on the identification of Caulis Clematidis Armandii. Research and Practice on Chinese Medicines. 31 (3), 13-16 (2017).
- Zhou, P. J., Li, X. F., Fu, D. H., Pu, X. Y., Zhu, G. Q. Pharmacognosy identification of Ethnomedicine Clematis ranunculoides Franchet. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. 34 (3), 432-436 (2017).
- Guo, J. L., Tang, Y., Pei, J., Wang, D. G. Study on random amplified polymorphic DNA and sequence characterized amplified regions of Caulis Clematidis Armandii. Journal of Chengdu Medical College. 6 (4), 283-286 (2011).
- Liu, M. Z., Li, M. N., Yao, H., Liu, P. Molecular identification of Clematidis Armandii Caulis and its adulterants and closely related species by ITS2 sequence. Global Traditional Chinese Medicine. 4 (6), 446-450 (2011).
- Liu, J. J., Chen, X., Wei, Z. Q., Li, B. Chemical constituents and identification of the caules of Clematis armandii Franch.and Clematis montana Buch.-Ham. Natural Product Research and Development. 22 (6), 998-1000 (2010).
- Yang, T. R., Xu, Z., Shi, Y. N. Studies on four compounds from Clematis Montana. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 10 (4), 142-143 (2008).
- Yan, L. H., Xu, L. Z., Zhou, Z. M., Yang, S. L. Chemical constituents from stems of Clematis armandii(I). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 38 (3), 340-342 (2007).
- Li, X., et al. Traditional uses, phytochemistry, pharmacology, and toxicology of Akebiae Caulis and its synonyms: A review. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114245 (2021).
- Ye, X., et al. Diuretic effect and material basis of Clematidis Armandii Caulis in rats. China Journal of Chinese Materia Medica. 44 (9), 1889-1894 (2019).
- Kuang, Y., et al. Consistency study of Caulis Clematidis Armandii and its traditionally used products and counterfeit species based on efficacy and pharmacognosy. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 36 (3), 115-121 (2020).
- Li, Y., et al. Quality assessment of Asarum heterotropoides var. mandshuricum based on HPLC multi-component determination and multiple pattern recognition method of fingerprint. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 238-243 (2022).
- Li, Y., et al. Determination of multi-components of Paeoniae Alba Radix based on fingerprints and chemical pattern recognition. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 231-237 (2022).
- Li, H. H., et al. Comparative investigation for raw and processed products of Euodiae Fructus based on high-performance liquid chromatography fingerprints and chemical pattern recognition. Chemistry & Biodiversity. 18 (8), 2100281 (2021).
- Dong, L. J., et al. Study on suitable distribution areas of Kawa Kimichi produced in Sichuan province-based on remote sensing and GIS-A case study of Clematis Armandii. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 17 (11), 2398-2404 (2015).
- Tang, S. W., Pei, J., Li, F. Y. Morphological and histological identification of Chuanmutong. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 15 (1), 19-21 (2000).
- Li, B., Chen, X., Fang, Q. M., Zhang, B. J., Wei, Z. Q.
- Wu, W. J., Wan, M. M., Cao, Y. H., Tan, R., Song, L. K. Research on the Quality Standard of Chuanmutong. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 33 (2), 313-315 (2015).
- Wei, Z. Q., Chen, X., Li, B., Dong, X. P. Determination of stigmasterol in Clematis armandii Franch and Clematis montana Buch-Ham. by HPLC. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 20 (3), 574-575 (2009).
- Qing, L. S., et al. Determination of oleanolic acid in Caulis clematidis armandii by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (3), 273-274 (2006).
- Yang, S. D., Wang, R., Fu, D. Y., Guo, J. J., Tan, W. Y. Determination on oleanolic acid in caulis clematidis armandii by microwave assisted extraction-HPLC/MS. Anhui Academy of Agricultural Sciences. 38 (13), 6929-6931 (2010).
