Summary
ここでは、クレ マチディス・アルマンディ・カウリス とその偽和物の本物の品種を効果的に識別するための新しい戦略を提供する、化学的指紋マルチパターン認識と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を確立するためのプロトコルを提示します。
Abstract
漢方薬とその関連不純物を同定する方法は、 クレマチディス・アルマンディ・カリス (チュアンムトン、普遍的に使用されている伝統的な漢方薬)を例に構築されました。クラスター分析(CA)、主成分分析(PCA)、直交部分最小二乗弁別分析(OPLS-DA)を含むケモメトリックスと組み合わせた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)フィンガープリントに基づいて、本物のチュアンムトン品種の10バッチと関連する不純物の5バッチを分析および比較しました。さらに、β-シトステロールの含有量を測定した。チュアンムートンの対照化学的指紋が確立され、12の一般的なピークが特定されました。本物のチュアンムトン品種の10バッチの指紋と対照指紋の類似性は0.910〜0.989でしたが、5バッチの混入物の類似性はわずか0.133〜0.720でした。クロマトグラムの一般的なピークに基づいて、15バッチのサンプルがPCAによって3つの含有量レベルに分類され、CAによって4つのカテゴリに集約され、本物のチュアンムトンとチュアンムートンの不純物を明確に区別しました。さらに、OPLS-DAを通じて、本物のチュアンムトンとチュアンムトンの不純物を効果的に識別できる7つの差動成分が見つかりました。本物のチュアンムトン品種の10バッチのβ-シトステロール含有量は97.53-161.56μg / gでしたが、偽和物の5つのバッチのβ-シトステロール含有量は大きく異なり、その中で クレマチスペテラエ ハンドのβ-シトステロール含有量。と クレマチス・グリアナ・ ロクスブ。Var. finetii Rehd.エトウィルズ。チュアンムートンの本物の品種よりも大幅に低かった。本研究で確立されたHPLC指数成分含有量と化学指紋マルチパターン認識法は、本物の漢方薬材料および関連する不純物を効果的に識別するための新しい戦略を提供します。
Introduction
チュアンムトン、クレマチスアルマンディフランシュのドライカリス。またはクレマチスモンタナBuch.-Ham.は、クリニック1,2,3で一般的に使用される伝統的な漢方薬です。尿の問題、浮腫、舌や口の痛み、乳汁分泌の低下、関節のこわばり、湿った熱によって引き起こされる筋肉痛の治療に使用されます4。Chuanmutongは常に野生品種から得られており、主に中国南西部、特に四川省に分布しており、最高の品質が見られます5,6。本物の品種とそれらの密接に関連する不純物を区別することは困難です7,8,9,10。中国薬局方の2020年版のChuanmutongの品質基準は、含有量決定なしの特性、顕微鏡識別、および薄層識別のみを規定しており、偽和物を効果的に識別できないため、潜在的なリスクがあります。さらに、チュアンムトンと関連植物を比較および特定した報告はほとんどありません。したがって、チュアンムトンの信憑性を確保するための品質管理方法は、さらに研究する価値があります。
チュアンムートンの化学成分は、主にオレアナン型五環式トリテルペノイドとその配糖体、フラボノイド、および有機酸で構成されています11,12,13,14。その中で、オレアノール酸、β−シトステロール、スチグマステロール、およびエルゴステロールは、異なる強度の利尿作用を有し、これは、利尿を促進し、絞尿を緩和するための潜在的な薬力学的物質であり得る15,16。化学指紋は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ガスクロマトグラフィー(GC)などによってサンプルに含まれる多くの化学成分を分離して検出することによって得られます。Chuanmutongの特性を分析するために適切な統計分析方法を採用することで、伝統的な漢方薬の全体的な品質管理と科学的識別を決定できます17,18,19。
この研究では、チュアンムトン本物の品種の10バッチと偽和物の5バッチが収集されました。それらの品質は、クラスター分析(CA)、主成分分析(PCA)、直交部分最小二乗弁別分析(OPLS-CA)、および薬力学的成分の含有量決定を含むマルチパターン認識と組み合わせたHPLCフィンガープリント法によって比較および分析されました。このプロトコルは、高い特異性を持つ本物の品種を識別するための方法を確立し、本物の品種と中国の医薬品の不純物を科学的に識別するための新しい戦略を確立します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.化学的指紋検出方法
- クロマトグラフィー条件
- アセトニトリル(A)/水(B)移動相を準備します。HPLCソフトウェアで次のようにグラジエントプログラムを設定します:0-20分、3%A-10%A;20-25分、10%A-13%A;25-65分、13%A-25%A;65-75分、25%A-40%A;75-76分、40%A-3%A;76-85分、3%A-3%A。
- 移動相の流量を1.0 mL/分に維持します。
- 30°Cに維持したC18カラム(250 mm x 4.6 mm、5 μm)でクロマトグラフィー分離を行います。
- 注入量を10μLに設定します。
- 波長205nmのサンプルを検出します。
注意: クロマトグラフィー条件の具体的な設定については、高速液体クロマトグラフィーの作業ソフトウェアの操作手順(材料表)を参照してください。
- 試料溶液の調製
- 原材料を内径850μm±29μmのナイロンメッシュに通して均一な粒子サイズに粉砕します。
- 粉砕した原料2 g(正確に秤量)をストッパー付きの50 mLコニカルフラスコに入れ、50 mLのメタノールを加える。フラスコにストッパーを置き、超音波処理(600 W、40 kHz)を30分間行います。
- その後、フラスコを室温(RT)まで冷却する。サンプルを再度計量し、失われた抽出剤を交換して初期重量を補います。
- 薬用抽出物を含むメタノール溶液4 mLを10 mLメスフラスコに注ぎます。6mLのH2Oを加えて混合し、10分間沈降させます。
- 最後に、上清を0.45μmのフィルターメンブレンでろ過し、スタンバイ状態にします。
- 指紋検出方法の検証
- 上記のようにサンプルを調製し(ステップ1.2)、1日6回HPLC分析(ステップ1.1)にかけます。精度を評価するには、ステップ1.3.5の説明に従って、相対保持時間と相対ピーク面積の相対標準偏差(RSD)を計算します。
- RTで0、2、4、6、8、12、および24時間保存された同じサンプル溶液を分析してサンプル溶液の安定性を評価し、ステップ1.3.5の説明に従って相対保持時間と相対ピーク面積のRSDを計算します。
- 同じサンプル(CMT-4)の6回の反復を取り、上記の手順に従ってサンプル溶液を調製し(ステップ1.2)、ステップ1.1に続いてHPLCでその指紋を検出します。相対保持時間と相対ピーク面積のRSDを計算し、ステップ1.3.5の説明に従ってその再現性を評価します。
- 次に、 図1B のピーク数10を基準ピークとして使用し、ステップ1.3.5で説明したように、各共通ピークの相対保持時間と相対ピーク面積のRSDを計算します。
- 以下の式を使用して、各共通ピークの相対保持時間と相対ピーク面積を計算します。
T re = T 特性/T参考
A re = A 特性/Aリファレンス
ここで、T re = 相対保持時間、T 特性 = 特性ピーク保持時間、T 基準 = 基準ピーク保持時間、A re = 相対ピーク面積、A 特性 = 特性ピーク面積、および A 基準 = 基準ピーク面積。
注:伝統的な漢方薬の指紋を確立するには、通常、取得が容易で高分解能のクロマトグラフィーピークを選択する必要があります。これは、指紋を識別し、その安定性と再現性を調べるための基準ピークとして使用されます。
2.チュアンムートンの指紋と類似性分析の確立
- 本物のサンプルの10バッチと、 クレマチス・アルゼンティルシア (Levl. et Vant.) W. T. Wang(CC)、 Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehdなどの偽和物の5バッチを使用してください。エトウィルズ。(DC)、 クレマチスペテラエ ハンド。(DE)、 クレマチス・グリアナ・ ロクスブ。Var. finetii Rehd.et Wils (XS)、および Clematis finetiana Levl.et Vaniot.(SMT)を指紋分析用のサンプルとして使用します。
- 手順 1.2 の説明に従ってサンプル溶液を調製します。ステップ1.1に記載されている条件に従って、HPLCによるすべてのサンプル溶液の指紋分析を実行します。
- 関連データを漢方薬のクロマトグラフィー指紋の類似性評価システムにインポートします(SESCF-TCM、2012年版)。システムは、すべてのサンプルのクロマトグラムで妥当な高さと良好な分解能を持つピークを共通のピークとして指定します。
注:SESCF-TCMソフトウェアは、中国薬局方委員会(http://114.247.108.158:8888/login)のウェブサイトで登録後にダウンロードできます。- ソフトウェアで、メニューの [参照スペクトルの設定 ]ボタンをクリックします。
- 次に、[パラメータ設定] ウィンドウで、[タイム ウィンドウ幅] を 0.5 に設定し、[中央値手法] として [スペクトル生成方法を制御] を選択します。
- メインメニューの[マルチポイントキャリブレーション]をクリックし、[フルスペクトルピークマッチング]として[ピークマッチング]を選択します。
- 最後に、[ コントロールの生成 ]をクリックして、チュアンムトンの本物の種の参照クロマトグラフィーフィンガープリントを生成します。
- 分析のために、本物のチュアンムトンサンプル10バッチと不純物混入物5バッチの保持時間とピーク面積をSESCF-TCMにインポートします。具体的な操作は次のとおりです。
- ソフトウェアで、メインメニューの[ 基準スペクトルの設定 ]ボタンをクリックします。
- [パラメータ設定]ウィンドウで、チュアンムトンの本物の種の参照クロマトグラフィーフィンガープリントを基準として設定し、[中央値法]として[制御スペクトル生成方法]を選択し、[タイムウィンドウ幅]を0.5に設定します。
- メインメニューの[マルチポイントキャリブレーション]をクリックし、[フルスペクトルピークマッチング]として[ピークマッチング]を選択します。
- 最後に、[ 類似度の計算 ]をクリックして、Chuanmutongの参照クロマトグラムフィンガープリントに基づいて類似度を計算します。最後に、漢方薬クロマトグラフィー指紋評価システム(2012年版)を使用して指紋の類似性を計算します。
注意: 特定の操作については、漢方薬クロマトグラフィー指紋評価システム(2012年版)の動作仕様を参照してください。
3. チュアンムトン指紋のマルチパターン認識解析
- クラスター分析 (CA)
- 本物のChuanmutongサンプルの10バッチとその5バッチの偽和物のフィンガープリントの12の一般的なピークのピーク領域を変数として使用し、それらを統計分析ソフトウェアに入力して体系的なクラスター分析(CA)を行います。
- グループ間法を選択し、ピアソン相関係数を分類基準として使用して、チュアンムトンとその不純物のクラスター分析図を作成します。具体的な操作は次のとおりです。
- 統計分析ソフトウェアで、[ファイル]をクリックしてデータをインポートします。
- メニューの[分析]をクリックし、[分類]の[システムクラスタリング]をクリックします。
- 共通ピーク面積を変数として選択し、クラスター数を4に設定します。
- [方法]をクリックし、[クラスタリング 方法]を [グループ間接続]として選択し、[測定間隔]を [ピアソン相関]として選択し、[ OK ]をクリックしてCAマップを描画します。
- 主成分分析(PCA)
- 本物の品種とその混入物の相対的な共通ピーク面積をPCA分析用の分析ソフトウェアにインポートし、PCAスコアマップを使用してサンプル差のスコアマトリックスマップを評価します。具体的な操作は次のとおりです。
- データ分析ソフトウェアを開き、メニューの[ ファイル ]をクリックして、新しい通常のプロジェクトを作成します。HPLCシステムからスプレッドシート(Excel形式など)で12の一般的なピークのピーク面積をインポートします。次に、[ 完了] をクリックしてデータのインポートを完了します。
- [ 新規 ] をクリックして新しいモデルを作成し、PCA でモデル タイプを設定します。[ 自動調整 ]と [追加 ]をクリックしてデータを合わせ、[スコア]をクリックしてPCA スコア マップを取得します。
- 本物の品種とその混入物の相対的な共通ピーク面積をPCA分析用の分析ソフトウェアにインポートし、PCAスコアマップを使用してサンプル差のスコアマトリックスマップを評価します。具体的な操作は次のとおりです。
- 直交偏最小二乗判別分析 (OPLS-DA)
- 監督モードを使用した直交部分最小二乗識別分析法を使用して、本物のチュアンムトン品種と混入物の相対的な共通ピーク面積ピークをさらに分析し、すべてのサンプルのOPLS-DA分類スコアマップを作成します。具体的な操作は次のとおりです。
- データ解析ソフトで、メニューの「 ファイル 」をクリックしてファイルをインポートし、新しいレギュラープロジェクトを作成します。HPLCシステムからスプレッドシートに12の一般的なピークのピーク面積をインポートし、 完了 をクリックしてデータのインポートを完了します。
- [ 新規 ] をクリックして新しいモデルを作成し、PCA でモデル タイプを設定します。[ 自動調整 ] と [追加 ] をクリックして、データを合わせます。次に、[スコア ] をクリックしてPCAスコアマップを取得します。
- 新規をクリックし、モデル1として新規を選択して、OPLS-DAでモデルタイプを設定します。
- [スケール]をクリックし、タイプを[すべてにパー]で設定します。最初に[自動調整]をクリックし、次に[スコア]をクリックしてOPLS-DAスコアマップを取得します。
- チュアンムトンの各共通ピークが分類結果に与える影響、および本物のチュアンムトン材料と関連する不純物の違いを判断するには、分析に投影法(VIP)の変数重要度を使用します。
- チュアンムートンのさまざまなコンポーネントのVIPマップを描きます。結果のVIPマップを使用して、分類に対する各変数の影響を評価し、グループ間の差に大きく寄与するコンポーネントを選別します。具体的な操作は次のとおりです。
- データ分析ソフトウェアで、メニューの[分析]をクリックし、[順列]をクリックし、順列の数を200に設定して、OPLS-DAスコアマップのR2とQ2を取得します。
- [VIP] をクリックし、[VIP 予測] を選択して VIP マップを取得します。
- 監督モードを使用した直交部分最小二乗識別分析法を使用して、本物のチュアンムトン品種と混入物の相対的な共通ピーク面積ピークをさらに分析し、すべてのサンプルのOPLS-DA分類スコアマップを作成します。具体的な操作は次のとおりです。
4.HPLCによるチュアンムートン中のβ-シトステロールの測定
- クロマトグラフィー条件(ステップ1.1を参照)
- 移動相を準備します:メタノール-水(97:3)。
- 移動相の流量を1.0 mL/minに設定します。
- 30°Cに維持したC18カラム(250 mm x 4.6 mm、5 μm)でクロマトグラフィー分離を行います。
- 注入量を10μLに設定します。
- 波長204nmの成分を検出します。
- 試料溶液の調製
- β-シトステロール(0.1 mg/mL)の標準液は、対応する標準物質の正確な計量量をメタノールに溶解して調製します。
- 原料の分析試料を内径180μm±7.6μmのナイロンメッシュに通して均一な粒径に粉砕する。
- 粉砕した原料2 g(正確に秤量)を丸底フラスコに入れ、それに50 mLのクロロホルムを加える。
- フラスコを還流冷却器に接続し、沸騰水浴(中程度の沸騰)で60分間加熱します。抽出溶液を15〜20μmのろ紙でろ過します。
- ろ液を沸騰水浴(中程度の沸騰)で約10分間ほぼ乾くまで蒸発させます。
- 残渣を溶解し、メタノールを使用して容量を5 mLに構成します。最後に、上清を0.45μmのフィルター膜に通し、スタンバイ状態にします。
- メソッドバリデーション
- サブステップ4.2.1で調製したβ-シトステロールのストック溶液を取り、100%メタノールで希釈し、100 μg/mL、80 μg/mL、60 μg/mL、50 μg/mL、40 μg/mL、30 μg/mL、および20 μg/mLの濃度の溶液を調製します。
- ステップ4.1に記載のクロマトグラフィー条件でサンプルを注入してピーク面積を決定し、注入量に対するピーク面積で回帰分析を行い、回帰式と相関係数を取得してその直線性を評価します。
- 上記のようにサンプルを調製し(ステップ4.2)、同じ日に6回HPLC分析(ステップ4.1)に供します。次に、ピーク面積のRSDを計算して精度を評価します。
- ステップ4.1で説明したように、RTで0、2、4、6、8、12、および24時間保存された同じサンプル溶液を分析することにより、サンプル溶液の安定性を評価します。次に、ステップ1.3.5の説明に従ってピーク面積のRSDを計算します。
- 同じサンプル(CMT-4)を六重剤に溶解し、ステップ4.2の説明に従って調製し、ステップ4.1の説明に従ってHPLC分析にかけることにより、再現性を調べます。次に、6つのサンプルのβ-シトステロール含有量のRSDを計算します。
- 標準的な加算方法を使用して、メソッドの精度を評価します。このためには、β-シトステロール含有量の80%、100%、および120%でβ-シトステロール参照溶液をサンプルに追加し、手順4.1で説明されているように各条件を3回繰り返します。平均回収率とRSDを計算して、メソッドの精度を評価します。
注: 回復率 (RR) の計算式は次のとおりです。
RR % = [(M t - M 0) / Ms] × 100
ここで、Mt=標準物質を添加した後のβ−シトステロールの品質、M0=試料溶液の品質、およびMs=添加したβ−シトステロールの品質。
- サンプルのβ-シトステロール含有量の測定
- 本物の漢方薬材料10バッチと関連する不純物の5バッチを取り、ステップ4.2に従ってサンプル溶液を調製します。
- 次に、各試料溶液およびβ−シトステロール参照溶液を注入して、ステップ4.1に記載の条件下でピーク面積を決定し、外部標準ワンポイント法を用いて各試料のβ−シトステロール含有量を算出する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
チュアンムートンのクロマトグラフィーフィンガープリントと類似性分析(SA)
精度、再現性、安定性の相対保持時間のRSD値は、それぞれ0.46%、1.65%、0.53%未満でした。相対ピーク面積のRSD値は、それぞれ4.23%、3.56%、3.96%未満でした。 図1A、Bに示すように、10個の本物のチュアンムトンサンプルのHPLCフィンガープリントには、12個の異なる共通ピーク(ピーク1からピーク12まで)がありました。No.10のピーク面積が比較的大きかったため、解像度は良好でした。各試料に存在する成分をそのまま、指紋の安定性や再現性を調べるための基準ピークとした。そして、ピークNo.10を基準ピーク(S)とし、残りの11個のピークの相対保持時間を算出した。
類似度分析では、相関係数が1に近いほど、サンプル間の類似度が高くなります。 表1に示すように、チュアンムトンの10バッチの類似度は0.910〜0.989であった。これらの結果は、チュアンムトンの10バッチが高い類似性と良好な一貫性を持ち、チュアンムトンの全体的な品質を評価するために使用できることを示しました。 図1Cに示すように、その混入物の5つのバッチの指紋が得られた。偽和物の5つのバッチの指紋とChuanmutongの対照指紋の類似性はわずか0.133-0.720であり(表1)、本物のサンプルと関連する偽和物の間に明らかな違いがあることを示しています。差は主に28〜55分のクロマトグラム上のクロマトグラフィーピーク数に集中していた。したがって、Chuanmutongの制御指紋は、本物のサンプルと関連する不純物を効果的に区別できます。
この実験では、SPSS 26統計ソフトウェアをCA分析に使用しました(図2A)。15バッチのサンプルは、分類距離が20の場合、2つのカテゴリに分けられました。最初のカテゴリーは、チュアンムトンとその習慣的な偽和物(CC)の10バッチでした。2番目のカテゴリーは、DC、DE、XS、SMTを含むチュアンムートンの偽和物でした。 分類距離が4の場合、すべてのサンプルは4つのカテゴリに分けられました。最初のカテゴリはチュアンムトンの10バッチ、2番目のカテゴリはCC、3番目のカテゴリはSMTとXS、4番目のカテゴリはDCとDEでした。分類結果は、チュアンムトンの本物の品種の品質は基本的に同じであり、すべての偽和物と明らかな違いがあることを示しました。同時に、他の混入物と比較して、CCはチュアンムートンの本物の品種に近かったが、分類距離を狭くしても区別できる。
15バッチのサンプルの共通ピーク面積をPCA分析用のデータ解析ソフトウェアにインポートし、スコアマトリックス(R2x = 0.994、Q2 = 0.961)(図2B)は、15バッチのサンプルのクラスタリング効果が顕著であることを示しました。Y軸の右側には、チュアンムトンとCCの10バッチがありました。その中で、CCはチュアンムトンの本物の品種とは異なる最初の象限に位置していました。Y軸の左側は、SMT、XS、DE、DCなどの不純物でした。その中で、SMTとXSは第2象限に位置し、DEとDCは第3象限に位置していました。チュアンムトンの本物の品種と従来の偽和物を比較すると、CCと本物の品種の違いは比較的小さいですが、本物の混和物と他の偽和物の違いは明らかです。
チュアンムトンとその不純物の共通ピーク面積を変数として使用し、OPLS-DAのデータ分析ソフトウェアにインポートしてから、スコアマトリックスを作成しました(図3A)。OPLS-DAモデルのR 2 x [1]は0.695、R 2 x [2]は0.605であり、どちらも0.5を超えており、モデルが安定して信頼性が高く、本物のサンプルと混入物を区別するために使用できることを示しています。
図3Aから、真正品と他の不純物のサンプルポイントは完全に分離されており、サンプルポイント間に交点がなかったことがわかります。すべてのサンプルは3つの部分に分けられました。チュアンムートンとCCの本物の品種は似ていました。XS、DC、およびDEのサンプルは1つのクラスにグループ化され、SMTのサンプルは最後のクラスでした。さらに、投影における可変重要度(VIP)の判定方法(図3B)を用いて、各試料の指紋における異なる成分のピークをスクリーニングした。VIP > 1.0は、サンプルグループ間の分類に大きく貢献するseveb変数を選別するための標準として採用されました。スクリーニング結果によると、真正試料と混入物との組成差を引き起こした主なマーカー成分は、ピーク9、5番、7番、6番、10番、3番、2番でした。残りのピークのVIP値は1未満であり、サンプルの識別にほとんど影響を与えませんでした。
β-シトステロールピーク面積とその溶液濃度との間の線形関係は、回帰分析を用いて見出された。この依存性は式Y = 5.4918 X-4.5563に従い、Yはβ-シトステロールピーク面積、Xはβ-シトステロール含有量(μg/mL)です。同時に、相関係数r=0.9995となり、要件を満たします。精度試験、安定性試験、再現性試験のRSDはそれぞれ1.76%、4.22%、3.85%でした。結果は、β-シトステロール含有量の測定方法は、良好な直線性、精度、および再現性を有し、サンプル溶液は24時間以内に安定していることを示しています。3つのレベルでの平均回復率は101.50%、101.90%、および100.72%でした。対応するRSDはそれぞれ2.56%、1.56%、1.68%であった。理論値と実際の決定値の間の良好な一致は、分析方法の精度と適用性を確認しました。β−シトステロールの液体クロマトグラムを図4に示し、15バッチのサンプル中のβ−シトステロールの含有量を測定した(表2)。結果は、本物のサンプルの10バッチ中のβ-シトステロールの濃度が97.53-161.56μg / g(比較的安定)の範囲にあることを示しました。この成分は、混入物の5つのバッチすべてで検出されましたが、含有量は大きく異なりました。
図1:チュアンムトンとその偽和物の指紋。 (A)本物のチュアンムートンサンプルの10バッチの指紋(S1:CMT-1、S2:CMT-2、S3:CMT-3、S4:CMT-4、S5:CMT-5、S6:CMT-6、S7:CMT-7、S8:CMT-8、S9:CMT-9、S10:CMT-10)。(B)本物のチュアンムトンサンプルの参照クロマトグラムフィンガープリント。相対保持時間は、0.18(ピークNo.1)、0.22(ピークNo.2)、0.29(ピークNo.3)、0.72(ピークNo.4)、0.75(ピークNo.5)、0.82(ピークNo.6)、0.86(ピークNo.7)、0.92(ピークNo.8)、0.96(ピークNo.9)、1.00(ピークNo.10)、1.02(ピークNo.11)、1.37(ピークNo.12)であった。(C)チュアンムトン不純物の5つのバッチの指紋(S1:CC、S2:DC、S3:DE、S4:XS、S5:SMT)。(D)本物のチュアンムトンサンプルの参照クロマトグラムフィンガープリントとその混和物の5つのバッチ(S1:リファレンスクロマトグラムフィンガープリント、S2:CC、S3:DC、S4:DE、S5:XS、S6:SMT)の比較。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:本物のチュアンムトンサンプル10バッチと偽和物5バッチのCAおよびPCA分析 。 (A)CA分析。(B)PCA分析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:本物のチュアンムトンサンプルの10バッチと偽和物の5バッチのOPLS-DAスコアマップとVIPスコアマップ 。 (A) OPLS-DA スコア マップ。(B)VIPスコアマップ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:β-シトステロールの液体クロマトグラム。 S1: β-シトステロール, S2: CMT-4, S3: XS, S4: DC, S5: SMT, S6: CC, S7: DE. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| サンプル | 名前 | 相似 |
| チュアンムートンの本物の品種 | シーエムティー-1 | 0.947 |
| シーエムティー-2 | 0.910 | |
| CMT-3 | 0.989 | |
| シーエムエム-4 | 0.937 | |
| シーエムティー-5 | 0.989 | |
| CMT-6 | 0.988 | |
| CMT-7 | 0.956 | |
| CMT-8 | 0.959 | |
| CMT-9 | 0.939 | |
| シーエムティー-10 | 0.966 | |
| 偽和物 | ティッカー | 0.599 |
| 直流 | 0.720 | |
| デ | 0.133 | |
| ティッカー | 0.694 | |
| ティッカー | 0.180 |
表1:本物のチュアンムトンサンプルとその偽和物の10バッチの類似性の結果。 関連データを漢方薬クロマトグラフィー指紋評価システムにインポートすることにより、本物のChuanmutongサンプルの10バッチと偽和物の5バッチの類似性が計算されました。
| サンプル | 名前 | 内容量(μg/g) |
| チュアンムートンの本物の品種 | シーエムティー-1 | 103.5 |
| シーエムティー-2 | 124.6 | |
| CMT-3 | 131 | |
| シーエムエム-4 | 121.1 | |
| シーエムティー-5 | 97.5 | |
| CMT-6 | 113.8 | |
| CMT-7 | 105.6 | |
| CMT-8 | 161.6 | |
| CMT-9 | 118 | |
| シーエムティー-10 | 123.5 | |
| 偽和物 | ティッカー | 157.4 |
| 直流 | 165.6 | |
| デ | 32.9 | |
| ティッカー | 69.7 | |
| ティッカー | 192.2 |
表2:本物のチュアンムトンサンプル中のβ-シトステロール含有量とその混和物の測定結果。
補足図1:異なるサンプル調製条件および異なるクロマトグラフィー条件下での液体クロマトグラフィー。 (a)移動相系(S1:アセトニトリル-0.1%ギ酸溶液、S2:アセトニトリル-0.5%酢酸溶液、S3:アセトニトリル純水、S4:アセトニトリル-0.05%リン酸溶液、S5:メタノール純水)。(b)検出波長(S1:205nm、S2:230nm、S3:250nm、S4:300nm)。(c)カラム温度(S1:20°C、S2:30°C、S3:40°C)。(D)流量(S1:0.8mL/分、S2:0.9mL/分、S3:1.0mL/分)。(e)抽出方法(S1:超音波抽出、S2:還流抽出)。(f)抽出溶媒(S1:酢酸エチル、S2:エタノール、S3:クロロホルム、S4:ノルマルブタノール、S5:メタノール)。(g)抽出時間(S1:15分、S2:30分、S3:60分)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:エルゴステロール、スチグマステロール、および本物のチュアンムートンの液体クロマトグラム。 S1:スチグマステロール、S2:エルゴステロール、S3:CMT-4。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
研究用のサンプルコレクションは、漢方薬の真正性を特定する際のマルチパターン認識を構築するための最初の重要なステップです。市場調査を通じて、四川亜安、梁山、楽山が川和通の野生資源の主な生産地であることがわかりました。同じ属の関連品種も同じ地理的分布を持っています6,20;CC、DC、DE、XS、およびSMTは、チュアンムトン16,21として誤用されることがよくあります。そこで、本研究では、上記の原産地において、本物のチュアンムトン10バッチと混合サンプル5バッチを採取し、品種の正確性を確認した。
2番目の重要なステップは、化学成分に関する可能な限り多くの情報を表示できるHPLCフィンガープリントの検出条件をスクリーニングすることです。本研究では、 補足図1に示すように、抽出方法、抽出溶媒、抽出時間など、さまざまな調製条件下でクロマトグラフィーピークの数と面積を取得しました。チュアンムトン試料溶液の最適な調製方法が決定された。一方、異なるクロマトグラフィー条件下でのサンプルのクロマトグラフィーピークの数と分解能を比較した。アセトニトリル-0.1%ギ酸溶液、アセトニトリル-0.5%酢酸溶液、アセトニトリル-純水、アセトニトリル-0.05%リン酸溶液、メタノール-純水などの移動相系、205nm、230nm、250nm、300nmなどの検出波長、20°C、30°C、40°Cなどのカラム温度、0.8-1.0mL/minなどの流速、 調査した。チュアンムトンのサンプルを分析するための最適なクロマトグラフィー条件を決定した。さらに、方法論的検証によりその実現可能性が確認され、チュアンムトンのHPLC指紋の検出方法の構築に成功しました。
3番目の重要なステップは、本物の漢方薬とその偽和物の指紋で異なる情報を分析して見つけることです。本研究では、まず、SESCF-TCM(2012年版)を用いて指紋の類似性を分析した。本物のChuanmutongサンプルの10バッチの指紋と対照特性指紋の類似性は非常に高いことがわかりました。比較すると、偽和物の5つのバッチの指紋と対照特性指紋の類似性は、本物のサンプルのそれよりも有意に低かった。次に、CA、PCA、およびOPLS-DAをさらに導入して、化学指紋の一般的なピーク情報を分析しました。CAとPCAの両方の結果は、異なる不純物の中で一般的に使用される偽和CCが本物のものに比較的近いことを示しており、これは区別が困難です。しかし、CAの分類距離を4に変更すると、真正と偽和物を効果的に識別することができます。真正物質の12の一般的なピークに基づいて、不純物の差動ピークの寄与値をOPLS-DAで定量的に評価し、ピークNo.9、ピークNo.5、ピークNo.7、ピークNo.6、ピークNo.10、ピークNo.3、ピークNo.2の7つの差動クロマトグラフィーピークを取得しました。これらは、本物と偽物の違いの主要なマークされた要素であるチュアンムートンの本物と偽物を効果的に識別するために使用できます。
中国薬局方の最新版には、チュアンムトンの有効成分の含有量決定がまだ含まれていません。本研究では,その品質管理を改善するため,利尿作用に関連するβ-シトステロール,エルゴステロール,シトステロール,オレアノール酸などの有効成分の含有量決定法を先行報告22,23,24,25,26で検討した。補足図2に示すように、エルゴステロールは本物のチュアンムトンでは検出されず、スチグマステロールはクロマトグラムで分離することが困難であり、正確に定量することができませんでした。最後に、β-シトステロールの含有量決定方法が確立されました。検出結果は、β-シトステロールが本物のチュアンムトンサンプルの10バッチと偽和物の5バッチで見つかったことを示しました。したがって、β-シトステロールは本物の医薬品に固有のものではありませんでした。チュアンムトンの品質に関するいくつかの情報を提供できますが、チュアンムトンの有効性に関連する特定の成分が見つかるかどうかを確認するには、将来的に指紋の差動クロマトグラフィーピークをさらに分析する必要があります。
現在、伝統的な漢方薬は、化学的指紋スペクトルの類似性によって識別されることがよくあります。ただし、この指標はサンプルクロマトグラフィーピークの全体的な情報に基づくパラメータであり、異なるサンプルの同定と主な違いに関する詳細情報を提供することはできません。したがって、この研究ではさらに、CA、PCA、およびOPLS-DAを使用して、化学指紋の一般的なピーク情報を識別し、Chuanmutongの本物のサンプルと粗悪品サンプルの間の主要な差動クロマトグラフィーピークを見つけ、それらを首尾よく識別しました。最後に、マルチパターン認識のためのHPLC結合化学フィンガープリンティングを構築しました。
本物の漢方薬とその混和物(Fritillaria thunbergii、Herba Asari、Lonicera japonicaなど)を混合することは珍しくないため、この方法は、本物の漢方薬とその偽和物を明確かつ科学的に識別するための新しい戦略を提供します。この戦略は、臨床応用における漢方薬の品質を確保するために非常に重要です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、四川省中医薬管理局のプロジェクト(番号2020JC0088、番号2021MS203)によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017381038 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD5243V | |
| β-Sitosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| C18 column | Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China | Welch Ultimate LP | |
| Chuanmutong | Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 19020103 | CMT-1 |
| Chuanmutong | Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-2 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-3 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-4 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210701 | CMT-5 |
| Chuanmutong | Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210401 | CMT-6 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-7 |
| Chuanmutong | Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China | 201201 | CMT-8 |
| Chuanmutong | Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 201001 | CMT-9 |
| Chuanmutong | Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210501 | CMT-10 |
| Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang | Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China | - | CC |
| Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. | Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China | - | DC |
| Clematis peterae Hand.-Mazz. | Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China | - | DE |
| Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils | Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | XS |
| Clematis finetiana Levl. et Vaniot. | Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | SMT |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Ergosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China | 20210201 | |
| Ethanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2021112602 | |
| Ethyl acetate | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017042043 | |
| Formic acid | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2016062901 | |
| High performance liquid chromatography | Agilent, USA. | 1260 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD6409V | |
| Methanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 202010302 | |
| n-butyl alcohol | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020071047 | |
| Petroleum ether | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020090125 | |
| Phosphoric acid | Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 20200110 | |
| SESCF-TCM version 2012 | National Pharmacopoeia Commission, China | - | http://114.247.108.158:8888/login |
| Stigmasterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China | 20200214 | |
| Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 | Umetrics, Sweden | - | https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download |
| Ultrapure water machine | Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China | UPH-II-10T | |
| Ultrasonic cleaner | Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China | KH3200E |
References
- Chen, C. R. Chinese Medicine Specimen Picture Book. , Shanghai World Book Company. Shanghai. 116 (1935).
- Xiong, J., et al. Lignans from the stems of Clematis armandii ("Chuan-Mu-Tong") and their anti-neuroinflammatory activities. Journal of Ethnopharmacology. 153 (3), 737-743 (2014).
- Pan, L. L., et al. a lignan from the Chinese medicinal plant Clematis armandii, inhibits A431 cell growth via blocking p70S6/S6 kinase pathway. Integrative Cancer Therapies. 16 (3), 351-359 (2017).
- Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of The People's Republic of China: (Edition 2020). , The Medicine Science and Technology Press of China. China., Beijing. 38 (2020).
- Wang, D. G., Guo, J. L. Textual research on the materia medica and authenticity of Clematidis armandii. Lishizhen Medicine and Materia Medicine Research. 18 (11), 2696 (2007).
- Fang, Q. M., Zhang, M., Zhong, Y. Y. The natural resources and exploitation of Caulis Clematidis Armandii in Sichuan. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 20 (5), 404-406 (2005).
- Bai, M. N., Dai, Y. X., Wang, Y., Ren, Y. Y., Tan, R. Study on the identification of Caulis Clematidis Armandii. Research and Practice on Chinese Medicines. 31 (3), 13-16 (2017).
- Zhou, P. J., Li, X. F., Fu, D. H., Pu, X. Y., Zhu, G. Q. Pharmacognosy identification of Ethnomedicine Clematis ranunculoides Franchet. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. 34 (3), 432-436 (2017).
- Guo, J. L., Tang, Y., Pei, J., Wang, D. G. Study on random amplified polymorphic DNA and sequence characterized amplified regions of Caulis Clematidis Armandii. Journal of Chengdu Medical College. 6 (4), 283-286 (2011).
- Liu, M. Z., Li, M. N., Yao, H., Liu, P. Molecular identification of Clematidis Armandii Caulis and its adulterants and closely related species by ITS2 sequence. Global Traditional Chinese Medicine. 4 (6), 446-450 (2011).
- Liu, J. J., Chen, X., Wei, Z. Q., Li, B. Chemical constituents and identification of the caules of Clematis armandii Franch.and Clematis montana Buch.-Ham. Natural Product Research and Development. 22 (6), 998-1000 (2010).
- Yang, T. R., Xu, Z., Shi, Y. N. Studies on four compounds from Clematis Montana. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 10 (4), 142-143 (2008).
- Yan, L. H., Xu, L. Z., Zhou, Z. M., Yang, S. L. Chemical constituents from stems of Clematis armandii(I). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 38 (3), 340-342 (2007).
- Li, X., et al. Traditional uses, phytochemistry, pharmacology, and toxicology of Akebiae Caulis and its synonyms: A review. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114245 (2021).
- Ye, X., et al. Diuretic effect and material basis of Clematidis Armandii Caulis in rats. China Journal of Chinese Materia Medica. 44 (9), 1889-1894 (2019).
- Kuang, Y., et al. Consistency study of Caulis Clematidis Armandii and its traditionally used products and counterfeit species based on efficacy and pharmacognosy. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 36 (3), 115-121 (2020).
- Li, Y., et al. Quality assessment of Asarum heterotropoides var. mandshuricum based on HPLC multi-component determination and multiple pattern recognition method of fingerprint. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 238-243 (2022).
- Li, Y., et al. Determination of multi-components of Paeoniae Alba Radix based on fingerprints and chemical pattern recognition. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 231-237 (2022).
- Li, H. H., et al. Comparative investigation for raw and processed products of Euodiae Fructus based on high-performance liquid chromatography fingerprints and chemical pattern recognition. Chemistry & Biodiversity. 18 (8), 2100281 (2021).
- Dong, L. J., et al. Study on suitable distribution areas of Kawa Kimichi produced in Sichuan province-based on remote sensing and GIS-A case study of Clematis Armandii. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 17 (11), 2398-2404 (2015).
- Tang, S. W., Pei, J., Li, F. Y. Morphological and histological identification of Chuanmutong. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 15 (1), 19-21 (2000).
- Li, B., Chen, X., Fang, Q. M., Zhang, B. J., Wei, Z. Q. Quality Research of Chuanmutong. Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine. 27 (6), 58-60 (2009).
- Wu, W. J., Wan, M. M., Cao, Y. H., Tan, R., Song, L. K. Research on the Quality Standard of Chuanmutong. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 33 (2), 313-315 (2015).
- Wei, Z. Q., Chen, X., Li, B., Dong, X. P. Determination of stigmasterol in Clematis armandii Franch and Clematis montana Buch-Ham. by HPLC. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 20 (3), 574-575 (2009).
- Qing, L. S., et al. Determination of oleanolic acid in Caulis clematidis armandii by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (3), 273-274 (2006).
- Yang, S. D., Wang, R., Fu, D. Y., Guo, J. J., Tan, W. Y. Determination on oleanolic acid in caulis clematidis armandii by microwave assisted extraction-HPLC/MS. Anhui Academy of Agricultural Sciences. 38 (13), 6929-6931 (2010).
